Procédé de préparation d'une nouvelle substance antibiotique. La présente invention est; relative à. un liroiédé de préparation d'une nouvelle subs- tiinee antibiotique, pour laquelle la titulaire propose la désignation Viomyein , qui a été enregistrée comme marque.
('e procédé est, caraetérisé en ce que le iiiiero-organisine Streptomyces puniceus est enltivé dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions d'aérobie et en profondeur.
Le micro-organisme Streptomyces puniceus n' < i pas encore été décrit jusqu'ici. Il a été isolé à partir d'un échantillon d'une terre qui se trouve près de Cienfuegos à Cuba.. La des cription d'une de ses souches, portant les nu- niéros 1q1-1-5, selon la méthode indiquée clans le Manuel de bactériologie détermina tive de Bergey, 6e édition, pages 929 à 933, est donnée dans le tableau ci-après.
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à l'emploi de cette souche particulière; elle englobe notam ment aussi l'utilisation d'organismes modifiés obtenus par des moyens de mutation tels que ces rayons X, des rayons ultraviolets, le chlorhydrate de 2,2'-diehloro-N-méthyl-di- éthylamine, ete.
Les caractéristiques du tableau ci-après sont. basées sur dix éprouvettes, à l'exception de celles utilisant des sucres (deux éprou vettes). Les couleurs à côté desquelles se trouve la lettre R sont désignées d'après Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
EMI0002.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> blycélium <SEP> aérien <SEP> et; <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> @'1LIC(lS(', <SEP> modérée <SEP> la <SEP> eouleui' <SEP> (le <SEP> la <SEP> partie <SEP> Spo- <SEP> alreuli <SEP> voloilie <SEP> (1ressée; <SEP> bord <SEP> lisse;
<tb> asparagine, <SEP> ridée <SEP> varie <SEP> depuis <SEP> le <SEP> gris <SEP> surface <SEP> rugueuse; <SEP> sporula agar <SEP> perle <SEP> et <SEP> le <SEP> brun <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> tion <SEP> bonne; <SEP> bouts <SEP> des <SEP> hyphes
<tb> ,itisqti'au <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (cil <SEP> et <SEP> ries <SEP> eollidiophores <SEP> rouges
<tb> ,-général) <SEP> et <SEP> au <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> ou <SEP> roses: <SEP> conidies <SEP> de <SEP> dimen @(R);
<SEP> celle <SEP> de <SEP> la <SEP> partie <SEP> ci- <SEP> lion <SEP> 0,65 <SEP> X <SEP> 1,30 <SEP> < c <SEP> oblongues
<tb> reuse <SEP> varie <SEP> etrire <SEP> le <SEP> rouge <SEP> et <SEP> Pu <SEP> chaînes; <SEP> pariai <SEP> environ
<tb> neutre <SEP> et. <SEP> le <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Co- <SEP> 1.10 <SEP> colonie:
<tb> rinthe <SEP> (R) <SEP> 1 <SEP> 2:5 <SEP> colonies <SEP> complètement
<tb> sporulées, <SEP> presque <SEP> gris <SEP> olive
<tb> pâle <SEP> (R.);
<tb> '_' <SEP> environ <SEP> 80 <SEP> colonies <SEP> avec
<tb> peu <SEP> de <SEP> sporulations, <SEP> blanc <SEP> à
<tb> brun <SEP> pâle <SEP> (R):
<SEP> niycéliuin
<tb> aérien <SEP> eouvert <SEP> de <SEP> gouttelet tes <SEP> incolores;
<tb> 3 <SEP> environ <SEP> 5 <SEP> colonies <SEP> ayant
<tb> une <SEP> surfaee <SEP> cireuse, <SEP> aucun
<tb> mycélium <SEP> aérien, <SEP> mais <SEP> des
<tb> structures <SEP> analogues <SEP> à <SEP> des
<tb> eorémies <SEP> et <SEP> dont <SEP> le <SEP> bout
<tb> porte <SEP> souvent <SEP> des <SEP> hyphes
<tb> sporulés.
<tb> Toutes <SEP> les <SEP> colonies <SEP> compor tent <SEP> des <SEP> inycélia <SEP> végétatifs
<tb> très <SEP> semblables <SEP> au <SEP> pourpre
<tb> de <SEP> Corinthe <SEP> (R).
<tb> gélatine <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> à.
<SEP> chamois <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> aucun <SEP> forte <SEP> liquéfaction
<tb> (R.)
<tb> lait <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> anneau <SEP> brun <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> aucune <SEP> liplrolvse <SEP> ou <SEP> pepto tournesol <SEP> nisation: <SEP> le <SEP> pH <SEP> passe <SEP> de <SEP> 6,2 <SEP> à
<tb> 6,3 <SEP> à <SEP> 6,7
<tb> nialate <SEP> de <SEP> bonne <SEP> à <SEP> blanc <SEP> pour <SEP> quatre <SEP> éprouvet- <SEP> aucun <SEP> l'envers <SEP> est <SEP> blanc <SEP> dans <SEP> six
<tb> chaux <SEP> modérée <SEP> tes; <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> éprouvettes <SEP> et <SEP> jaunâtre <SEP> dans
<tb> pour <SEP> deux <SEP> éprouvettes;
<SEP> pour <SEP> les <SEP> quatre <SEP> autres <SEP> tubes
<tb> les <SEP> quatre <SEP> autres <SEP> épr <SEP> ouvet tes, <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> au <SEP> cen tre <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> et <SEP> presque
<tb> jaune <SEP> de <SEP> Chalcédoine <SEP> pâle
<tb> (R) <SEP> aux <SEP> bords
<tb> cellulose <SEP> très <SEP> faible
<tb> ou, <SEP> nulle
EMI0003.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> ATycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> -hu#ose, <SEP> bonne <SEP> blanc <SEP> à <SEP> iris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> brun <SEP> surface <SEP> plissée <SEP> et <SEP> craquelée;
<SEP> q
<tb> arar <SEP> envers <SEP> brun
<tb> l@ounnes <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> ou <SEP> taché <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> colonies <SEP> plissées
<tb> (le <SEP> terre <SEP> de <SEP> gris <SEP> pâle <SEP> (R <SEP> j <SEP> ; <SEP> surfaces <SEP> ci reuses <SEP> d'un <SEP> pourpre <SEP> livide
<tb> (R)
<tb> plaques <SEP> pauvre <SEP> de <SEP> lilas <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> à <SEP> gris <SEP> aucun <SEP> faiblement <SEP> hydrolysé;
<SEP> envers
<tb> d'amidon <SEP> de <SEP> fumée <SEP> pâle <SEP> et <SEP> gris <SEP> bru- <SEP> rouge <SEP> neutre <SEP> à <SEP> pourpre <SEP> de
<tb> nitre <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> Corinthe <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> agar <SEP> syti- <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> à <SEP> (gris <SEP> souris <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> livide <SEP> (R)
<tb> thétique <SEP> pâle <SEP> (R)
<tb> agas <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> laitritif
<tb> milieu <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R);
<SEP> parties <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> pourpre <SEP> vi d'Emerson <SEP> cireuses <SEP> presque <SEP> ;ris <SEP> vineux <SEP> neux <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> clair <SEP> (R)
<tb> (1-xylose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Corinthe
<tb> (R)
<tb> 1-arabinose <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> bris <SEP> cannelle <SEP> clair <SEP> ou
<tb> gris <SEP> vineux <SEP> (R)
<tb> l-rhamnose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> lévulose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Corinthe
<tb> (R)
<tb> ralaetose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R,)
<SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> vineux <SEP> foncé
<tb> (R)
<tb> sucrose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> maltose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> vineux <SEP> foncé
<tb> (R)
<tb> laetose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> raffinose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> iiiuliiie <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> (1-niannite <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> pourpre <SEP> vi nelix <SEP> foncé <SEP> (R)
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> ,
l-5orbite <SEP> pauvre <SEP> blaltc <SEP> < lllctltl <SEP> ctt@eï@ <SEP> blaw#
<tb> r1u1cite <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> itlosite <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aneth <SEP> @ncet@@ <SEP> blanc
<tb> salicine <SEP> pauvre <SEP> < Fris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aneltll <SEP> etlcer-# <SEP> @;
rïs <SEP> (le <SEP> cannelle <SEP> clair
<tb> lu <SEP> i
<tb> citrate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R.) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> brun. <SEP> très <SEP> clair
<tb> sodium
<tb> succinate <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> etlcers <SEP> plaine
<tb> de <SEP> sodium
<tb> fer <SEP> de <SEP> bonne <SEP> milieu <SEP> lnellall-'e
<tb> hligler
<tb> tyroslnate, <SEP> llall@'l.'e <SEP> presque <SEP> -ris <SEP> brun <SEP> <B>(R.)</B> <SEP> aucun <SEP> eolotlte <SEP> tlltlwe, <SEP> elrellse, <SEP> plaie,
<tb> agas <SEP> translucide;
<SEP> envers, <SEP> brun <SEP> clan'
<tb> bouillon <SEP> de <SEP> modérée <SEP> nitrates <SEP> réflltits
<tb> nitrate
<tb> a@-ar <SEP> nutri- <SEP> altcune <SEP> en
<tb> tif, <SEP> éprou- <SEP> profondeur
<tb> tettes <SEP> se couées Le nouvel antibiotique appartient au groupe des antibiotiques basiques qui ne peu vent pas être extraits par des solvants orga niques.
Le nouvel antibiotique partage égale ment avec ce groupe la propriété de pouvoir être précipité par certains colorants acides, tels que le violet au chrome Erio, l'orange fixe Pontamine, le rouge d'aliaa.rine S, le bleu de sy nthracène, le bleu acier Pontamine, le vert Pontalnine et d'autres colorants sulfo- niques similaires. Ce groupe basique, auquel appartient le nouvel antibiotique,
est caracté risé par lin champ d'activité antibiotique étendu, plus particulièrement parmi les bac- téries -rani-négatices. Le tableau ci-après montre les champs d'activité comparés de la ehlorotétr acycline, de formule
EMI0004.0024
(lu chlora.mphénicol, de la streptottlyeitle, de la strept.othricine et du nouvel antibiotique.
EMI0005.0001
<I>Tableau <SEP> I:
</I>
<tb> lüc <SEP> rogrammes <SEP> d'antibiotique <SEP> par <SEP> cul, <SEP> nécessaires <SEP> pour <SEP> inhiber <SEP> la <SEP> croissance <SEP> des <SEP> organismes
<tb> suivants <SEP> sur <SEP> des <SEP> plaques <SEP> d'agar <SEP> nutritif.
<tb> Chlorotétra- <SEP> Chloram- <SEP> Strepto- <SEP> Strepto- <SEP> Nouvel
<tb> (Organisme <SEP> cycline <SEP> phénicol <SEP> mycine <SEP> thricine <SEP> antibiotique
<tb> (1<U>)</U> <SEP> (2) <SEP> <U>(3) <SEP> (4</U>) <SEP> (5)
<tb> ;
. <SEP> anren. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> Ô <SEP> 50
<tb> ,. <SEP> alblls <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> <B>100</B>
<tb> R. <SEP> subtilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7. <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 100
<tb> 13. <SEP> invedides <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb> 1 <SEP> li'@''aillsnle <SEP> (le <SEP> B0denllelnler <SEP> 1 <SEP> <B>500</B> <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> 10 <SEP> 500
<tb> S. <SEP> tYpho.5a <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> -1 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> pu] <SEP> lorttm <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> <B><U>'-#</U></B>. <SEP> paratvphi <SEP> .1. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> E <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> < i <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Ii. <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> Sl(. <SEP> paradvsenteriae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> soli <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> .1. <SEP> lterogelles <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,9 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> f's. <SEP> aeruginosa <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 3000
<tb> Protetls <SEP> sp. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 500
<tb> 11. <SEP> albieans <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 2000 <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 3000
<tb> (1) <SEP> Chlorhydrate <SEP> cristallisé
<tb> Cristallisé
<tb> (3) <SEP> Sulfate <SEP> à <SEP> 750 <SEP> unités/mg
<tb> (4) <SEP> Sulfate <SEP> à <SEP> 300 <SEP> unités/mg <SEP> (ex <SEP> hélianthate <SEP> cristallisé)
<tb> (5) <SEP> Sulfate <SEP> amorphe <SEP> brut, <SEP> préparé <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> III <SEP> ci-après Le nouvel antibiotique diffère en outre des antibiotiques connus et obtenus à partir d'au tres espèces de Streptomi-ces,
en ce qui con cerne l'activité des antibiotiques envers des eultnres de bactéries rendues résistantes à l'antibiotique par transfert successif dans des bouillons contenant des quantités progressi vement croissantes d'antibiotique, par rap port à la culture initiale, sensible à tous les antibiotiques. Le tableau ci-après, dans lequel. le dosage a été réduit à des unités de dilution E. soli par millilitre, montre Bette particu]a- i-il (-. L'efficacité de chaque antibiotique était.
d'abord établie en déterminant le vol-Lune to tal en millilitres d'un bouillon nutritif conte nant une culture de E. coli standardisée qui pouvait être gardé libre de croissance à l'aide d'un milligramme d'antibiotique pendant lune incubation de 18 heures à 37 C. Ce nombre de millilitres est. appelé la valeur UDC de cet, antibiotique.
Pour comparer ces antibioti ques au niveau de la même activité biologique, on a choisi pour tous des valeurs uniformes de 50 et 100 UDC/ml et on a. pris la quantité nécessaire de chaque antibiotique pour obtenir lesdites valeurs.
EMI0006.0001
<I>Tableau <SEP> II:</I>
<tb> Comparaison <SEP> de <SEP> l'activité <SEP> de <SEP> divers <SEP> antibiotiques <SEP> envers <SEP> différentes <SEP> souches <SEP> de <SEP> 1. <SEP> aero@;
enes.
<tb> Streptomycine <SEP> Streptothricine <SEP> Chloramphénieol <SEP> Nouvel
<tb> Souche <SEP> (LDC/ml) <SEP> (LDCJml) <SEP> (LDC,%ml) <SEP> antibiotique
<tb> (UDC'@m1)
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> <B>d,</B> <SEP> .- <SEP> ,-- <SEP> + <SEP> -_
<tb> _L <SEP> _ - <SEP> = <SEP> croissance <SEP> - <SEP> = <SEP> aucune <SEP> croi,sance
<tb> La <SEP> souche <SEP> A <SEP> est.
<SEP> sensible <SEP> à <SEP> <B>25</B> <SEP> UDC/ml <SEP> de <SEP> tons <SEP> les <SEP> antibiotiqne5 <SEP> @i-de"n,.
<tb> l'a <SEP> souche <SEP> D <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> ?00 <SEP> L'I)C/nll <SEP> de <SEP> ehloramphénicol.
<tb> La <SEP> souche <SEP> C" <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> -1400 <SEP> FDC/ml <SEP> de <SEP> streptomycine
<tb> et <SEP> à <SEP> environ <SEP> _5 <SEP> I?DC/lnl <SEP> de <SEP> streptotlir-icine.
<tb> La <SEP> souche <SEP> D <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> 7500 <SEP> L\DC/nil <SEP> de <SEP> streptothricine
<tb> et <SEP> à <SEP> environ <SEP> ?00 <SEP> b'DC/ml <SEP> de <SEP> streptomycine.
Le tableau II montre que le nouvel anti biotique est capable d'inhiber la croissance des souches de A. aerogenes rendues résistan tes à la streptomycine et au chloramphénicol, mais non celle des souches rendues résistantes à. la streptothricine. Ceci montre que le nou vel. antibiotique se distingue nettement de la streptomycine et du ehloramphénicol.
Le nouvel antibiotique se distingue de la. streptothricine et de la streptomycine par son comportement sur un papier chromat.ographi- que dans de l'eau saturée avec du n-butanol et contenant 9-11/ode pipéridine et ? /o d'acide p-toluène sulfonique. Les résultats ci-après se rapportent à un traitement de 96 heures à ?5 , en se servant du E.
subtili, comme orga nisme d'essai.
EMI0006.0024
Antibiotique <SEP> Rf.
<tb> streptonlveille <SEP> A <SEP> 0,3@
<tb> treptothricine <SEP> 0,0-1
<tb> -Nouvel <SEP> antibiotique <SEP> 0,06 Le nouvel antibiotique est stable quand on le fait bouillir pendant 15 minutes à une concentration de 500 m-7/rnl dans de l'eau ayant des pH de ?,0, 6,5 et 9,0.
La, toxicité du nouvel. antibiotique, com parée à celle de quelques autres antibiotiques, ressort du tableau III ci-après:
EMI0006.0029
<I>Tableau <SEP> III:</I>
<tb> <I>Toxicité <SEP> de <SEP> dirers <SEP> aritibiotiqrtes</I>
<tb> (mg <SEP> pour <SEP> ?0 <SEP> g <SEP> de <SEP> souris)
<tb> Antibiotique <SEP> Intraveineux <SEP> Sous-cutané <SEP> Par <SEP> la <SEP> bouche
<tb> LD, <SEP> LD,o <SEP> LD, <SEP> LD@" <SEP> LD" <SEP> LDSa
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> streptoniveine <SEP> '.#
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> streptothrieine <SEP> 4.0
<tb> C <SEP> hlora <SEP> mphénicol <SEP> <B>0,6</B>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétraey <SEP> eline <SEP> 1,5
<tb> qulfate <SEP> du <SEP> nouvel <SEP> antibiotique <SEP> (brut)
<SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 3.5 <SEP> >'?00 <SEP> indéter miné <B>La</B> culture du Streptoniy ces puniceus est effectuée clé préférence entre 24 et. 30 pen- < lant une période allant de ? jours à 1 se- niaine et avec agitation.
Le milieu nutritif eofient (le préférence: une source d'hydrates (le earbolie, telle que des sucres, de l'amidon, de la ,glycérine; une source .d'azote organique, telle que de la farine de soja ou du gluten de lité : une source de substances favorisant la i111 < ssance du micro-organisme, telle que la partie hydrosoluble du résidu de distillation (le l'alcool d'un mélange de fermentation, et cil outre du sel ordinaire et du carbonate de valcilini, utilisé comme agent tampon.
Quand lui croissance est. terminée, le mycélium est sé- li;iré et l'antibiotique peut être précipité hors (lu bouillon, par exemple par addition de co lorants sulfoniques, tels que le violet au elironie Trio, l'oran\re fixe Pontainine, etc. Le sel du colorant est ensuite décomposé pour ré- générer l'antibiotique.
On peut. en particulier exécuter le pro cédé comme suit Pour la culture initiale (inoculum) du micro-organisme, on emploie un milieu solide préparé selon la formule:
EMI0007.0034
Dextrose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> clé <SEP> viande <SEP> de <SEP> baeuf <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>2,5-</B>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1 <SEP> litre
<tb> On <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,0 <SEP> et
<tb> on <SEP> ajoute <SEP> agar <SEP> 30 <SEP> 0.
Cette culture initiale est utilisée pour ino- etiler des flacons secoués ou des cuves d'ino- euluin submergé. Dans un flacon secoué, la croissance atteint généralement son niaxiniuin ait bout. de 4 jours, alors que dans les euv es d.'inoculum submergé, la croissance la plus fa- %'o gable est atteinte en.
? jours. Depuis la, cuve cl'inoeuliim, le milieu de culture et le micro- oi-,,anisnie sont transférés dans l'appareil de fermentation, dans des conditions absolument stériles, et, la culture continue pendant une nouvelle période de 2 jours. A tout moment, on assure l'aération de la cuve de fermenta tion, en y introduisant de l'air stérile par un distributeur avec un débit de 0,5 à 2 volumes d'air par volume de bouillon et par minute, tout en maintenant l'agitation. Une stérilité complète doit être assurée et la température du bouillon est généralement maintenue entre ?4. et. 30 .
Le nouvel antibiotique peut être récupéré hors du bouillon de fermentation, dans lequel il est produit, par plusieurs méthodes diffé rentes. La précipitation au moyen de colo rants acides et la décomposition des sels de colorants ainsi formés a déjà été mentionnée. Parmi ces colorants, on préfère le violet au chrome Brio. Les sels de colorants précipités peuvent être convertis en d'autres sels de l'antibiotique, en traitant une suspension d'un sel de colorant, dans un solvant tel que le mé thanol ou un mélange de méthanol et d'acé tone, par exemple avec du sulfate de triéthyl- a.mine, ce qui fait précipiter le sulfate de l'antibiotique.
Suivant une variante, on peut traiter un sel de colorant. par un sel inorgani que tel que le chlorure de baryiun ou de cal cium, et séparer le sel métallique du colorant, ainsi précipité, d'avec la solution du sel anti biotique.
Une autre méthode générale pour récu pérer l'antibiotique consiste à utiliser des échangeurs de cations, de préférence des ré sines carboxylées, et notamment le produit marque Amberlite IRC 50 (Rohm R Haas Co.). Après que l'antibiotique a été adsorbé par la résine, il peut être élué au moyen d'un acide dilué et l'antibiotique solide peut être isolé de la solution aqueuse de -diverses ma nières.
Après réglage du pH à environ 6, la solution peut être séchée par congélation ou elle peut être concentrée et. traitée par un solvant, tel que le méthanol, ou par un mé lange de solvants, tels que le méthanol et le butanol, pour préparer un sel insoluble de l'antibiotique.
Si l'on se sert d'acide chlor- liy drique dilué pour éluer l'échangeur de ca tions, on peut ainsi préparer et isoler le chlorhydrate de l'antibiotique, lequel peut à son tour être converti en sulfate qui est pré cipité par du méthanol aqueux, par exemple par du méthanol contenant 20% d'eau.
Divers sels cristallisés de l'antibiotique peuvent être préparés, notamment le reine ekate, le pierate, le fl-naplrtalène-sulfonate, le sulfate et le chlorhydrate.
L'antibiotique et. les sels qu'on peut en préparer peuvent se présenter sous forme (le ïeurs solutions diluées, de concentrés bruits ou de cristaux purs.
Le nouvel antibiotique, tel qu'il est obtenu à partir des bouillons de fermentation, semble renfermer cieux constituants actifs, qui se distinguent par leur comportement sur du papier chroinatographique, en présence d'un système solvant formé de pipéridine. de bu- tanal et d'acide p-toluène sulfonique, comme décrit par Winsten, -Am. 8oe. 70, 3333 (1948).
Le nouvel antibiotique est une base orga nique forte constituée par les éléments car bone, hydrogène, azote et oxygène. Comme déjà dit, il forme des sels avec de nombreux acides organiques et. inorganiques. Le pouvoir rotatoire de son sulfate cristallisé,
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cor- respond à -31 3 (H.0, 1%).
Le spectre d'absorption ultraviolet de son sulfate cristallisé, en solution aqueuse, pré sente un maximum distinct et. unique
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@. 267,5 mlr, = 285. Le spectre infrarouge de son sulfate cristallisé, dans de l'huile miné rale, montre clés bandes d'absorption nettes et caractéristiques, à des fréquences de 3210, 1677 et 1228 cm-1, et une bande très large dont le maximum est, à environ 1081 em--1. Le chlorhydrate cristallisé fond en se décom posant à 265-266 C.
Le sulfate cristallisé n'a pas de point de fusion défini, il se décompose graduellement à température élevée.
Un échantillon du sulfate cristallisé, séché à 100 pendant trois heures dans le vide, a donné à l'analyse les résultats suivants: 36,73 /o clé carbone, 7.80% d'hpcll-og,ène. 21,12% d'azote, 17,53% (le l'ion sulfate et 18520,
!0 d'oxygène (par différence. Les sels de l'antibiotique avec clés acides inorganiques, tels que l'acide chlorhydrique ou sulfurique, sont. très solubles dans l'eau, mais seulement légèrement solubles dans des solvants tels que le méthanol, l'acétone et le inonoéther méthy lique de l'étlivlène-#-lycol.
L'activité clé l'antibiotique peut. être dé terminée par la méthode turbidimétrique, en se servant (le l'organisme hlebsiella pneunio- niae (PCI 602) et du milieu d'essai antibioti que du Laboratoire Biologique de Baltimore, préparé selon la formule de la Food and Drug Administration pour les bouillons pour l'ana lyse turbidimétrique de la streptomycine. La méthode d'essai est. celle de 11eMahan, .T. R.
(.T. Biol. Chem. 153, pages 2-19 à 258, avril 1911). Le sulfate cristallisé de l'antibiotique, avant les propriétés indiquées plus haut, est utilisé comme norme pour la comparaison des activités d'autres échantillons de l'antibioti que et. de ses solutions. L'activité attribuée au sulfate est de 765 ce qui donne à la base libre de l'antibiotique une activité écale à 1.000 Les exemples suivants illustrent l'inven tion.
On a utilisé pour tous ces exemples la rouelle de Streptoinvces puniceus portant les numéros 1311-5, telle qu'elle est décrite au début du présent. exposé.
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<I>L'xemy'ple <SEP> I:</I>
<tb> On. <SEP> prépare <SEP> un <SEP> milieu <SEP> (le <SEP> culture <SEP> ayant <SEP> la
<tb> composition <SEP> suivante:
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP> g;
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Partie <SEP> hydrosoluble <SEP> du <SEP> résidu <SEP> de <SEP> dis tillation <SEP> de <SEP> l'alcool <SEP> (1'111l <SEP> ulélarlloe
<tb> de <SEP> fermentation <SEP> O,:ï <SEP> g
<tb> l:
<SEP> au <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1 <SEP> litre
<tb> On <SEP> règle <SEP> le <SEP> vii <SEP> ;i <SEP> <B>7,0</B> <SEP> ave(# <SEP> -ho <SEP> >Il <SEP> et
<tb> on <SEP> ajoute
<tb> Carbonate <SEP> clé <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> @Y On introduit 500 71i1 (le ce milieu dans un flacon de Fernbaeli de '',@ 1 et oil stérilise pendant 30 min. à 121 .
Après refroidisse- ment, on inocule le milieu avec un inoculum (le S. puniceus, préparé comme indiqué plus haut. On secoue le flacon sur un appareil tournant ayant. un déplacement d'environ 62,5 nim et tournant à 200 t/min. pendant -1 jours et à 27 . On constate alors que le bouillon a une activité de 320 UDC par ml, avec 1111 pH égal à 7,3.
La solution de l'antibiotique ainsi obtenue peut. être utilisée comme suit, pour préparer, sons forme solide, le sulfate de l'antibiotique: Le hH est réglé à 2,0 avec H.SO.t, on ajoute une quantité réduite de produit marque Sul)ei@-eel et on filtre le mélange.
Le pH du mélange clarifié est réglé à 5,5 et on ajoute du violet au chrome Erio à raison de 2 g par litre, en a-itant. On continue l'agitation pen < lant une heure à la température ambiante et on ajoute assez de produit marque Super- ce] pour permettre la filtration.
Le gâteau est. séparé par filtration et est lavé avec une quantité d'eau correspondant à 201/o du vo lume initial. Quand. il est. sec, le gâteau est mis en suspension dans 1/i2 du volume origi- nal de méthanol à 80% et est décomposé à l'aide de 0,5 g de BaCL . 2H20 pour chaque gramme de colorant. en agitant pendant. 2 heures à la température ambiante.
Après fil tration, le filtrat méthanolique est décoloré à l'aide d'une petite quantité de charbon et est. filtré à nouveau. Au filtrat limpide comme de l'eau, on ajoute 2 volumes de méthanol absolu et 2 ml d'une solution à 50% de sulfate de triéthylamine dans du méthanol, pour chaque gramme de BaC12 . 2H20.
On sépare par fil tration un précipité de sulfate de baryum et de sulfate de l'antibiotique à l'aide de pro duit marque Super-eel . Le gâteau est lavé au méthanol absolu et secoué avec de l'eau pour dissoudre le sulfate de l'antibiotique, le sulfate de baryum et le produit marque .'#uper-eel étant. éliminés par filtration.
La solution aqueuse, limpide comme de l'eau, du sulfate de l'antibiotique ainsi obtenue est sé- ehée. La poudre blanche et amorphe, que l'on obtient, a une .activité de 40 UDC/mg. <I>Exemple II:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante: Gluten de blé 10 g Glycérine 10 g Caséine 5 g Mélasse de betteraves 2 g Liqueur de macération du maïs 2 g Partie hydrosoluble du résidu de dis tillation de l'alcool d'un mélange de fermentation 2 g On règle le PH à 7,0 avec KOH et on ajoute Carbonate de calcium 5 g <B>El</B> au pour faire 1 litre Huile de soja 1 ml On stérilise pendant 45 minutes à 121 .
On inocule environ 75 1 de ce milieu dans une cuve de 180 1 munie d'agitateur, avec 2 1 d'un inoculum préparé comme décrit. plus haut, par culture en profondeur du S. puni- cens. On maintient la température à 27 pen dant 24 heures avec agitation constante et in sufflation d'air stérile à raison de 1,0 à 1,5 volume < l'air par volume de bouillon et par minute. Au bout de 24 heures, la culture intermédiaire ainsi préparée est introduite, dans des conditions absolument stériles, dans 560 1 du même milieu de culture, contenu dans une cuve de fermentation de 9501.
L'agi tation et l'aération restent les mêmes et, au bout de 48 h. à 27 , le bouillon obtenu a une activité finale de 100 UDC/ml. <I>Exemple III:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante: Gluten de blé 10 g Glycérine 100, Caséine hydrolysée 5 g Mélasse de betteraves 2 g Liqueur de macération du maïs 2 g Partie hydrosoluble du résidu d e dis tillation de l'alcool d'un mélange de fermentation 2 g Eau pour faire 1 litre On règle le pH à 7,0 avec KOH et on ajoute Carbonate de calcium 5 g On stérilise quatre flacons de Fernbach de 2,8 1, contenant chacun 1 1 de ce milieu,
pendant 20 minutes à 1\31 . Après refroidis sement, ils sont inoculés avec une suspension de S. puniceus et. ils sont secoués dans un appareil tournant pendant. 4-8 heures à 28 . L'inoculum ainsi préparé est. utilisé pour ino- euler une cuve de fermentation de 180<B>1</B> con tenant 75 1 du milieu susdit, stérilisé pendant 20 minutes à 121 .
On remue avec un agita teur à hélice pendant que l'on maintient la cuve sous pression -et que l'on y introduit de l'air stérile à l'aide d'lin distributeur. Après 78 heures, le bouillon a une activité de 100 t DC/ml.
La solution de l'antibiotique ainsi obtenue peut. être utilisée comme suit. pour préparer, sous forme solide, le sulfate de l'antibiotique: Le bouillon, dont. la quantité correspond à 75 1, est séparé du my célium par filtration, son pH est réglé à 6,5 avec H.SO,l et on ,y- ajoute \?10 g d'oxalate d'ammonium pour pré cipiter le calcium à l'état d'oxalate, qui est éliminé par filtration.
Le pH du bouillon cla rifié est alors réglé à 5,5 avec I-I.SO.l et on ajoute 160 -- de violet. a.11 chrome Erio, après quoi le bouillon est agité pendant une heure et demie. Le sel du colorant est séparé par filtration à l'aide de produit marque Super eel .
Le gâteau de filtration est lavé avec 15 1 d'eau et séché par insufflation d'air dans le filtre-presse. Le produit sec est mis en sus- pension dans 3 1 d\un mélange de 80% de méthanol et de 20% d'acétone (en volumes)
et on ajoute<B>250</B> n11 d'une solution méthanolique à 50% de sulfate de triéthylamine, l'ensem- ble étant agité pendant une heure et demie. Le précipité comprenant le sulfate de l'anti biotique et le produit marque Super-cel est séparé par filtration et est lavé avec de l'acé tone et ensuite avec du méthanol.
Le gâteau séché est alors agité pendant une demi-heure clans deux litres d'eau distillée et le produit marque Super-eel est séparé de la solution de sulfate de l'antibiotique par filtration. La solution, limpide comme de l'eau, est séchée et en obtient une substance solide blanche et amorphe avec une activité de 370 I\DC/mg.