CH335488A - Verfahren zur Herstellung eines 14-Oxy-steroids - Google Patents

Description

  Zusatzpatent zum     Hauptpatent    Nr. 329194         Verfahren    zur Herstellung     eines        14-Oxy-steroids       Die Erfindung bezieht sich auf die Her  stellung eines neuen     Steroids,    das     14a,17a,21-          Trioxy-4-pregnen-3,20-dion    aus     17a,21-Dioxy-          4-pregnen-3,20-dion    oder dessen     21-Acylester     durch biochemische Oxydation mit Enzymen,  die von einem Pilz der     Gattung        Helicostyhtm,     welche der Ordnung     l@Iucorales    angehört, z. B.

         Helicostylum        piriforme,    erzeugt werden. Es  können die isolierten Enzyme der Pilze ver  wendet werden. Das bevorzugte Verfahren be  steht aber darin, die Oxydation unter     F'ermen-          tationsbedingungen    unter Verwendung eines  lebensfähigen Pilzes in Gegenwart einer Nähr  lösung zu leiten und hernach das     oxydierte-          Steroid    abzutrennen, wie im folgenden Bei  spiel eingehend erläutert     wird.     



  Das     7.4a,17a,21-Trioxy-4-pregneii-3,20-dion,          das    pharmakologische Wirkung zeigt, kann       mit        (",hromt.rioxyd    zu     14a-Oxy-4-androsten-          3,17-dion    mit einem Schmelzpunkt     j-on    259  bis 263  C oxydiert werden.  



       Beispiel.     Es wurde ein Nährmedium aus 20 g     Lact-           < il        biiminauszug    ( E     damin ,        enzy        mat.ischer        Lact-          albuminauszug),    3 g Maisquellwasser und 50 g  technischer Dextrose verdünnt in einem Liter  Leitungswasser, und auf einen     1),1-Wert        von     4,3 bis 4,5 gebracht, hergestellt..

   12 Liter des       Sterilisierten        Nährmediums    wurden mit Heli-         eostyliim        piriforme-Sporen        (ATCC    Nr. 8992)  beimpft. und 24 Stunden bei einer Tempera  tur von 28  C unter Belüftung     und    Rühren  bebrütet, so dass die Sauerstoffaufnahme 6,3  bis 7     Millimol    pro Liter und Stunde von       Na2803    entsprechend der Methode von Cooper,  Fernstrom und     Miller,        Ind.    Eng.     Chem.    36,  504 (1944) betrug.

   Zu diesem Medium, wel  ches eine 24 Stunden alte Kultur von     Heli-          costylum        piriforme    enthielt, wurden 2 g der  Verbindung S von     Reichstein        [17a,21-Dioxy-4-          pregnen-3,20-dion]    in einem Minimum von  Äthanol hinzugefügt, um eine Suspension des       Steroids    in der Kultur zu erhalten. Nach einer  weiteren Brutperiode von 24 Stunden unter       denselben    Temperatur- und Belüftungsbedin  gungen wurde die Würze und das     Mycel    extra  hiert.

   Das     Mycel    wurde     abfiltriert    und zwei  mal in je einem     annähernd    der     Mycelmenge     entsprechenden Volumen Aceton gewaschen  und dann zweimal     finit    einem annähernd der       Mycelmenge    entsprechenden     Volumen        Methy-          lenchlorid    extrahiert. Die Aceton- und     Methy-          lenchloridextrakte    wurden einschliesslich des  Lösungsmittels dein     Würzefiltrat    zugesetzt.

    Die gemischten Extrakte und die     'VGrürzefil-          trate    wurden nach und nach mit zwei ihrem  halben Volumen entsprechenden Volumen     Me-          thylenchlorid    und hierauf     finit    zwei einem  Viertel ihres Volumens entsprechenden Volu  men     Methylenchlorid    extrahiert.

   Die vereinig-           teil        ;1Iethylcncllloridetrakte        wurden    mit zwei  einem Zehntel ihres     Volumens    entsprechenden       Teilen        einer    2     %        igen        wässrigen        Natriumbicar-          bonatlösung    und hierauf mit zwei einem Zehn  tel ihres     Volumens    entsprechenden Teilen  Wasser gewaschen.

   Nach Trocknung der     Me-          thylenchloridextrakte    mit ungefähr 3-5 g  wasserfreiem Natriumsulfat pro Liter Lö  sungsmittel und     Abfiltrieren    wurde das Lö  sungsmittel durch Destillation entfernt.. Der  Rückstand wurde in einem Minimum 12ethv-         lenehlorid        gelöst,    filtriert und das     Lösungs-          mittel    verdampft. Die entstehenden Rohkri  stalle wurden getrocknet und dann fünfmal  mit. je 5     em3    Äther pro Gramm Rohkristalle  gewaschen.     Iss    ergab sich ein Rückstand von  4,354 g.

   Der Rückstand wurde in 10     em3          Äthylendichlorid    gelöst und über 350 g        Florisil ,    einem synthetischen     Magnesiumsili-          kat,    unter Verwendung von     550-cm3-Portionen     von     E,ntwieklungs    -     Lösungsmittelfraktionen     gemäss Tabelle     chromatographiert.     
EMI0002.0031     
  
    <I>Tabelle</I>
<tb>  Helicostylum <SEP> piriforme
<tb>  Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Ausbeute <SEP> in <SEP> mg
<tb>  1. <SEP> Ä <SEP> thylendichlorid <SEP> 479,5
<tb>  2 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> 403,0
<tb>  3 <SEP> Äthylendichlorid-Aeeton <SEP> 15:

  1 <SEP> 815,5
<tb>  4 <SEP>   <SEP> <B>15:1</B> <SEP> 36,5
<tb>  5 <SEP>   <SEP> 12:1 <SEP> 36,0
<tb>  6 <SEP>   <SEP> 12:1. <SEP> 50,0
<tb>  7 <SEP>   <SEP> 12:1 <SEP> 109,5
<tb>  8 <SEP>   <SEP> <B>10:1</B> <SEP> 159,0
<tb>  9 <SEP>   <SEP> <B>10:1</B> <SEP> 148,0
<tb>  10 <SEP>   <SEP> <B>8:1</B> <SEP> 145,0
<tb>  11 <SEP>   <SEP> <B>8:1</B> <SEP> 104,5
<tb>  12 <SEP>   <SEP> <B>8:1</B> <SEP> 98,0
<tb>  13 <SEP>   <SEP> <B>5:</B> <SEP> 1. <SEP> 170,0
<tb>  14 <SEP>   <SEP> <B>5:1-</B> <SEP> 123,0
<tb>  15 <SEP>    <SEP> :1 <SEP> 123,5
<tb>  16 <SEP>   <SEP> <I>3:1</I> <SEP> 1.27,5
<tb>  17 <SEP>   <SEP> <B>3:1</B> <SEP> 200,0
<tb>  1.8 <SEP>   <SEP> 1. <SEP> :1 <SEP> 456,0
<tb>  19 <SEP>   <SEP> 1 <SEP> :

  1 <SEP> 356,0
<tb>  20 <SEP> Aceton <SEP> 226,5       Die Fraktionen 13-16 inklusive, befreit  vom Lösungsmittel, wurden aus 10     cm3    Äther  umkristallisiert, indem der Äther langsam bei  Zimmertemperatur verdampft wurde. Die Kri  stallisation brachte 228,6 mg Kristalle mit  einem .Schmelzpunkt von 218 bis     2261'    C. Zwei  weitere Umkristallisationen, jede aus 10     em3          Äther-Aceton    im Verhältnis 1 :1 gewonnen,  ergaben Kristalle mit einem     Schmelzpunkt       von 232 bis 235  C.

   Die Umkristallisation einer  Probe dieser Substanz, 5 7 mg, aus 5     cm3     Methanol ergab     14a,17a,21-Trioxy-4-pregnen-          3,20-dion    mit einem Schmelzpunkt von 234  bis     237a    C, [a] D     +    155  (c =1,13 in     Methanol)     mit einem einheitlichen     Infrarotspektrum.     Analyse :        /o    berechnet für     C2111300,5    : C = 69,58     1I    = 8,34       o/0    gefunden: C . = 69.42     11    = 8,40      Die Verwendung eines     21-Aeylesters,    z. B.

    des Acetats, bringt dieselben Ergebnisse.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 14a,17a,21- Trioxy-4-pregnen-3,20-dion, dadurch gekenn zeichnet, dass man 17a,21-Dioxy-4-pregnen- 3,20-dion oder dessen 21-Acylester einer bio chemischen Oxydation mit Enzymen unter wirft, die von einem Pilz der Gattung Heli- eostylum erzeugt werden. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass als Pilz Helicosty- lum piriforme verwendet wird. 2. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass die Oxydation un ter Fermentationsbedingungen und unter Ver wendung eines lebensfähigen Pilzes in Gegen wart eines Nährmediums für den Pilz erfolgt.