CH357074A - Procédé pour l'obtention de y-glutamyl-peptides - Google Patents

Description

  



  Procédé pour l'obtention de   y-glutamyl-peptides   
 La présente invention est relative à un nouveau procédé pour l'obtention de   y-glutamyl-paeptides    par réaction directe d'un   aminoester    sur l'acide N-tritylglutamique ou un sel de celui-ci, en présence d'un carbodiimide   disubstitué.    On a, en effet,

   trouvé que le blocage par   tritylation    à l'azote de l'acide glutamique est favorable à la condensation sélective du carboxyle   y    dudit acide glutamique et de la fonction aminée des a-amino acides dans le cas d'une   conden-    sation peptidique réalisée en présence d'un carbodiimide   disubstitué.    Cette nouvelle voie d'accès aux y-glutamyl-peptides représente une amélioration considérale par rapport aux anciens procédés de préparation desdits y-glutamyl-peptides dont il   sera briè-    vement rappelé l'essentiel (voir aussi   :    G. Amiard,
R. Heymes et L. Velluz, Bull. Soc. Chim., 1956, p. 97).

   Dans le brevet suisse ? 348161, la titulaire avait décrit une voie d'accès aux   a-et    y-glutamylpeptides qui dérivent de l'acide glutamique, I,
EMI1.1     

Suivant le procède décrit dans ce brevet, on prépare les a-glutamyl-peptides par réaction d'un a-ou y-monoester glutamique N-tritylé avec l'ester d'un amino acide ou peptide, en présence de   dicyclo-    hexylcarbodiimide, saponification alcaline et   détri-      tylation    par l'acide acétique aqueux,

   alors que les   y-glutamyl-peptides sont obtenus    en faisant réagir le   N-trityl-glutamate d'a-benzyle    avec l'ester   benzylique    d'un amino acide ou peptide en présence de   dicyclo-    hexylcarbodiimide et on soumettant le dérivé N  tritylé    du   diester    benzylique   ou y-glutamyl-peptide    obtenu à   l'hydrogénolyse    sélective puis à la   détri-      tylation.    Ce procédé décrit dans le susdit brevet met à profit une observation suivant laquelle les diesters   benzyliques    de l'acide glutamique excellent par une stabilité très grande du groupe ester en   a,

      vis-à-vis des alcalis et des agents   d'alcoolyse    et permet l'obtention aisée de diesters   a-benzoyles      y-alcoylés    lesquels fournissaient le   monoester    a-benzylé par   monosaponification    ou le   monoester      y-alcoylé    par   hydrogénolyse.   



   Dans la mise en oeuvre du procédé précité, la titulaire avait observé que seul l'ester a-benzylglutamique était apte à la préparation des   y-glutamyl-    peptides purs puisque permettant d'éviter un traitement alcalin lors de la libération du carboxyle a, après formation du   y-peptide.    On avait en effet remarqué que le traitement alcalin   d'un    diester de
N-trityl-y-glutamyl-peptide de formule II, conduit surtout à   l'a-glutamyl-peptide    de formule IV, par l'intermédiaire vraisemblable du dérivé cyclique de formule III.
EMI1.2     




  Ri étant un reste alcoyle, aryle ou hétérocyclique,
R'un reste alcoyle, et   R"un    reste alcoyle identique ou non à R'.



   Dans le Bull. Soc. Chim. (1956) pages 698-70   G.    Amiard, R. Heymes et L. Velluz ont décrit une nouvelle voie d'accès à la   L-y-glutamyl¯L-cystéinyl-    glycine, la dernière étape de la synthèse tripeptidique    consistant à condenser le S-trityl-L-cystéinyl-glyci-    nate d'éthyle avec l'acide   N-trityl-glutamique    pour obtenir l'ester du S,   N-ditrityl-y-glutamyl-tripeptide    cherché. La présence du blocage par   tritylation    à l'azote de l'acide glutamique favorise dans ce cas la condensation sélective du carboxyle y et de la fonction aminée du   S-trityl-L-cystéinyl-glycinate d'éthyle.   



  Or, il a maintenant été trouvé que la sélectivité de la condensation en y précitée se manifeste également à   l'égard des a-amino acides    qui présentent   cepen-    dant un encombrement moléculaire bien inférieur à celui du   S-trityl-L-cystéinyl-glycinate    d'éthyle.

   Cette constatation surprenante a permis, suivant la présente invention, de généraliser l'emploi de l'acide   N-trityl-glutamique    pour   obtention    des   y-glutamyl-    peptides, en évitant l'utilisation intermédiaire de l'ester a-benzyl-glutamique   N-tritylé    obtenu par   monosaponification    du   N-trityl-glutamate      d'a-benzyle    et y-méthyle préparé selon le brevet suisse
No 344714.



   L'acide N-trityl-L-glutamique est aisément obtenu par hydrogénolyse du   N-trityl-L-glutamate    de dibenzyle qu'on prépare selon le brevet suisse
No 344714.



   Le procédé faisant l'objet de là présente invention pour la préparation de   y-L-glutamyl-peptides    de formule :
EMI2.1     
 dans laquelle R est de l'hydrogène ou un reste alcoyle, aralcoyle, aryle ou hétérocyclique, ce dernier lié directement ou par un reste alcoylène à chaîne droite comportant de 1 à 8 atomes de carbone, tous ces restes pouvant comporter un groupe hydroxyle ou un reste contenant du soufre, carac  térisé    en ce qu'on fait réagir, dans un solvant et en présence   d'un carbodiimide disubstitué, l'acide    Ntrityl-L-glutamique ou un sel de celui-ci, avec un   aminoester    de formule :

  
EMI2.2     
 dans laquelle   tR'représente    un alcoyle inférieur, à une   tempórature comprise entre 0     C et le reflux du solvant utilisé, en ce qu'on élimine le carbodiimide par traitement acide, en ce qu'on saponifie par traitement alcalin, en ce qu'on isole le N  trityl-peptide que l'on détrityle.   



   Pour isoler le   N-trityl-peptide    de formule VII on peut mettre en oeuvre les procédés connus de lavages, extractions et purifications, alors que la   détritylation    de ce dernier peut se faire par chauffage en milieu acide aqueux ou alcoolique, les dif  forentes    réactions pouvant être illustrées par les équations suivantes :
EMI2.3     

 Un mode préfère dudit procédé peut être réalisé comme suit :

  
 On dissout l'acide N-trityl-L-glutamique, sous    s    forme de sel de   triéthylamine,    dans le chlorure de méthylène, ajoute rester de l'acide aminé qu'on veut condenser ainsi qu'une quantité équimoléculaire de   dicyclohexylcarbodiimide.    On abandonne à la température ambiante, traité à l'acide acétique et essore la   dicyclohexylurée    qui   s'est    formée. La solution, après lavages usuels, est évaporée à sec, le produit est saponifié par la soude alcoolique. On isole le   N-trityl-y-glutamyl    peptide de formule VII, qu'on   détrityle    ensuite par chauffage dans l'acide acétique aqueux ou alcoolique.



   Dans les exemples les points de fusion indiqués sont des points de fusion instantanés déterminés sur bloc de Maquenne.



   Exemple 1
 Préparation de la   y-L-glutamyl-L-tyrosine       (VIII, R=-CH2-C6H-OH)    a) Condensation du L-tyrosinate d'éthyle avec
 l'acide N-trityl-L-glutamique et saponification
 de la fonction ester :
 On dissout 3, 85 g de L-tyrosinate d'éthyle et 3, 8 g de   dicyclohexylcarbodiimide    dans 50   cm3    de chlorure de méthylène, ajoute 8, 8 g de sel de tri  éthylamine    de l'acide N-trityl-L-glutamique et abandonne une nuit à la température ambiante.

   On refroidit à 00 C, essore la   dicyclohexylurée    qu'on lave avec 10 cm3 de chlorure de méthylène, réunit le filtrat et le solvant de lavage, lave cette solution avec 45 cm3 d'acide chlorhydrique N/2, puis à l'eau, sèche sur sulfate de magnésium et évapore à sec sous vide à une température inférieure à   200    C. Le résidu obtenu est dissous dans 20   cm3      d'éthanol,    on ajoute 55   cm3    de soude N, chauffe dix minutes à   60     C, ajoute 70   cm3 d'eau glacée    puis   60 cm3 d'acide    chlorhydrique N, essore le produit formé, le lave à   l'eau    et le sèche sous vide.



   On obtient ainsi un produit qui, après cristallisation dans 25 cm3 d'alcool absolu, fournit la N  trityl-y-L-glutamyl-L-tyrosine    pure, F = 145¯ C,   [a]    = + 34¯ C ¯ 2 (c = 1 %, solution Ó 0,06 % de soude dans le méthanol à 75  /o). Le produit se présente sous forme de petits prismes incolores, insolubles dans l'eau, l'éther, l'acétone, le benzène, le chloroforme, très peu solubles dans l'alcool à froid.



  Il contient deux molécules d'Úthanol de cristallisation qu'il perd successivement par chauffage à 800 C et   110     C et n'a pas encore été décrit.



     Analyse du produit séché a 800 C :   
 C33H32O6N2C2H5OH = 598, 67
Calculé : C 70, 2 % H 6,4 % O 18,7 % N 4,7 %
Trouvé : C 70,   2 ouzo    H 6,   3  /o O    19, 1 % N 4,   9 O/o    b) DÚtrilylation
 de la   N-trityl-y-L-glutamyl-L-tyrosine    :
 On introduit 3, 5 g de N-trityl-y-L-glutamyl-Ltyrosine dans 20 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 % et chauffe au bain-marie pendant dix minutes. On essore le   triphényl-carbinol,    le lave à l'eau, adjoint les eaux de lavage ou filtrat et évapore à sec sous vide à une température n'excédant pas   30     C. On dissout le résidu dans 6 cm3 d'eau, ajoute progressivement 200 cm3 d'acétone et abandonne une nuit à la température ambiante.

   On filtre, lave à l'acétone et à l'éther et obtient ainsi 1, 7 g   (97 O/o)    de   
Y-L-glutamyl-L-tyrosine, F = 265-270¯ C, [α]20/D =      + 260 + 2    (c =   2 : 0/o    eau). Le produit est identique à un échantillon authentique de   y-L-glutamyl-L-    tyrosine préparé selon G. Amiard, R, Heynes et L.



  Velluz, Bull. Soc. Chim., 1956, p. 97.



   Exemple 2
 Préparation de la y-L-glutamyl-L-leucine
EMI3.1     
 a)   Condensation de L-leucinate d'ethyle avec.   
 l'acide N-trityl-L-glutamique et saponification
 de la fonction ester :
 On dissout 1, 95 g de chlorhydrate de leucinate d'éthyle dans 3   cm3    de chloroforme, refroidit à   0     C, ajoute goutte à goutte de la   diéthylamine    jusqu'à pH 9 e, introduit dans le mélange ainsi obtenu,   30 cm3    d'éther sulfurique froid. On essore le chlorhydrate de   diéthylamine    et évapore le filtrat à sec sous vide sans chauffer.

   On reprend le résidu constitué par l'aminoester libre dans 10 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 4, 9 g de sel de   triéthylamine    de l'acide N-trityl-L-glutamique en solution dans 10 cm3 de chlorure de méthylène puis 2, 06 g de   dicyclo-    hexylcarbodiimide en solution dans 5 cm3 de chlorure de méthylène, abandonne une heure à la température ambiante, traite par 0, 5 cm3 d'acide acétique et sépare la dicyclohexylurée formée, par filtration. Le    e    filtrat est lavé à l'eau, à l'acide chlorhydrique-dilué, à l'eau, séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec sous vide sans chauffer.

   Pour la saponification, le résidu obtenu est dissous dans 5 cm3   d'éthanol,    on ajoute 15, 4 cm3 de soude N, chauffe dix minutes à   70OC,    ajoute 50 cm3 d'eau glacée puis 15, 4 cm3 d'acide chlorhydrique N, extrait au chloroforme le   N-trityl-dipeptide,    lave la solution   chloroformique    à l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évapore à sec sous vide. On obtient ainsi un résidu qui, après cristallisation dans 2, 5 cm3 d'alcool absolu, fournit la N-trityl-Y-L-glutamyl-L-leucine pure, F = 141  144¯ C, [α]20/D = - 35¯ ¯ 2 (c = 2 %,    chloroforme).



  Ce produit est nouveau.



     Analyse : C30H84OoN2    = 502, 59
Calculé : C 71,   69  /o H 6, 83  /o N 5, 57  /0   
Trouvé   : C    71,   4  /o    H 7, 0    /o    N 5, 8 % b)   Detritylation   
 de la   N-trityl-y-L-glutamyl-L-leucine    :
 On introduit 2, 8 g de   N-trityl-y-L-glutamyl-L-    leucine dans 10 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 % et chauffe au bain-marie bouillant pendant sept minutes. On essore le   ttiphénylcarbinol,    le lave à l'eau, adjoint les eaux de lavage au filtrat et concentre sous vide à une température n'excédant pas 40  C jusqu'à un volume d'environ 2 cm3. On ajoute 100 cm3 d'acétone, essore, lave à l'acétone et l'éther puis sèche sous vide.

   On obtient ainsi 1, 19 g   (83  /o)      de v-L-glutamyl-L-leucine,    F = 221-2220 C, [a]   2D0 =      -17  2 (c=2"/o,    eau). Le produit est identique à un échantillon de y-L-glutamyl-L-leucine préparé selon C. Amiard, R. Heymes et J. Velluz, Bull. Soc.



  Chim., 1956, p. 97.



   Exemple 3
 Préparation de la   γ-L-glutamyl-L-mÚthionine   
 (Vlll, R-CH2-CH2-S-CH3) a) Condensation de l'ester méthylique de la
   L-méthionine    avec l'acide N-trityl-L-gluta
 mique et saponification de la fonction ester :
 On dissout 0, 9 g de chlorhydrate de l'ester méthylique de la L-méthionine dans 3 cm3 de   chlo-    roforme, refroidit à   0O    C, ajoute goutte à goutte de la   diéthylamine    jusqu'à   PFE    9 et introduit 30 cm3 d'éther sulfurique froid. On essore le chlorhydrate de diéthylamine et évapore le filtrat à sec sous vide, sans chauffer.

   On reprend le résidu dans 3 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 2, 2 g de sel de tri  éthylamine    de l'acide N-trityl-L-glutamique en   solu-    tion dans 5   cm3    de chlorure de méthylène puis 0, 98 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 4 cm3 de chlorure de méthylène, abandonne trois heures à la température ambiante, traite par 0, 3 cm3 d'acide acétique et filtre. Le filtrat est lavé à l'eau, puis à l'acide chlorhydrique dilué, à l'eau, séché sur sulfate
 de magnésium et évaporé à sec sous vide, sans chauffer.

   Pour la saponification, le résidu obtenu est dissous dans 3 cm3 d'alcool absolu, on ajoute 6, 9 cm3 de soude N, chauffe dix   minutes à 65"C,    ajoute 30 cm3   d'eau    glacée puis 6, 9 cm3 d'acide chlorhydrique N, extrait au chloroforme, lave la solution   chlo-      roformique    à l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évapore à sec sous vide. On obtient ainsi un résidu qui, après cristallisation dans 5 cm3 d'alcool absolu, fournit la   N-trityl-y-L-glutamyl-L-    méthionine pure, F = vers   1400    C.



   Le produit est nouveau. b)   Dgtritylation   
 de   la N-trityl-y-L-glutamyl-L-methionine    :
 On met en suspension 520 mg de   N-trityl-y-L-      glutamyl-L-méthionine    dans 2, 5 cm3 d'acide acétique aqueux à   50  /o,    chauffe sept minutes au bain-marie bouillant, refroidit, ajoute 2 cm3 d'eau et élimine le   triphénylcarbinol    par filtration. On évapore le filtrat sous vide à une température ne dépassant pas   40O    C, ajoute au résidu 40   cm3    d'acétone, essore, lave à l'acétone puis à l'éther et sèche sous vide.



   On obtient ainsi 175 mg (65  /o)   de y-L-glutamyl-   
L-mÚthionine,   F = 228-231 C, [a] =-9 l (c   
 = 1, 4    /0,    eau). Ce produit, qui n'a pas encore été décrit, se   présentesousformed'aiguillesincolores,    solubles dans l'eau, insolubles dans l'alcool, l'éther, l'acétone, le benzène, le chloroforme.



     Analyse : CloHl8OaN2S=278,    32
Calculé : C 43, 2    /o    H 6, 5   o/o    N 10,   1 ouzo   
Trouvé : C 43, 2    /o      H 6, 5D/o    N 9,   8 ouzo   
 Exemple 4
 Préparation de la   y-L-glutamyl-glycine       (VIII, R = H)    a)   Condensation de l'acide N-trityl-L-glutamique   
 avec le   glycnate d'éthyle et saponification   
 de l'ester :

  
 On met 1, 4 g de chlorhydrate du glycinate d'éthyle en suspension dans 25 cm3 de chlorure de méthylène, refroidit à   0O    C et ajoute, petit à petit, en agitant, 1   cm3    de   diéthylamine.    On introduit ensuite dans la solution, 4, 9 g de sel de triéthylamine de l'acide N-trityl-L-glutamique et 2, 1 g de   dicyclo-    hexylcarbodiimide. On abandonne une nuit à la température ambiante, ajoute 0, 5 cm3 d'acide acétique, essore la   dicyclohexylurée    qu'on lave avec   10 cm3    de chlorure de méthylène. Le filtrat et la solution de lavage sont réunis, lavés à l'acide chlorhydrique
N/2, à 1'eau glacée, sèches sur sulfate de sodium et évaporés à sec sous vide.

   Le résidu est repris dans
 25   cm3    d'acétate d'éthyle, on ajoute 1 cm3 de   diéthyl-    amine et abandonne dix heures en refroidissant. On essore et obtient ainsi 3, 65 g   (67  /o)    de sel de diéthylamine du   N-trityl-y-L-glutamyl-glycinate    d'éthyle. On dissout 2, 45 g de ce sel dans 20 cm3 d'eau, ajoute 6 cm3 d'acide chlorhydrique normal, extrait par 50 cm3 d'éther, lave la solution éthérée à 1'eau glacée, la sèche sur sulfate de magnésium et l'évapore à sec sous vide. Le produit obtenu   (y-N-      trityl-L-glutamyl-glycinate    d'éthyle) est dissous dans
   10 cm3    d'alcool. On ajoute   10 cm3    de soude N et abandonne une heure et demie à la température ambiante.

   On refroidit à   00    C, ajoute 11 cm3 d'acide chlorhydrique N et extrait par 25 cm3 de chloroforme. La solution   chloroformique    est lavée trois fois à 1'eau glacée et concentrée sous vide à 5 cm3.



  On essore, lave au chloroforme et sèche. On obtient ainsi la N-trityl-y-L-glutamyl-glycine, F=vers 145  C.



  Le produit, qui n'a pas encore été décrit, se présente sous forme d'aiguilles incolores insolubles dans l'eau, peu solubles dans le chloroforme et l'éther, solubles dans l'alcool et l'acétone. b)   Dgtritylation   
 de la   N-trityl-y-L-glutamyl-glycine :   
 La   détritylation    peut être effectuée par l'acide acétique aqueux selon le procédé décrit en   lb), 2b)    et 3b), mais on peut aussi opérer en milieu alcoolique comme indiqué ci-après :
 On dissout 1 g de   N-trityl-y-L-glutamyl-glycine    dans 9 cm3 d'alcool à   95"/o, ajoute    0, 9 cm3 d'acide acétique et chauffe à   ó50    C pendant une heure.

   On refroidit à la température ambiante, essore, lave à l'alcool puis à l'acétone et sèche à   90O    C pour obtenir 0, 3 g (66    /o)    de   y-L-glutamyl-glycine,    identique à un échantillon authentique préparé selon G. Amiard, R.



  Heymes et L. Velluz, Bull. Soc. Chim. 1956, p. 97.



   Préparation de l'acide N-trityl-glutamique a) Préparation du N-trityl-L-glutamate
 de dibenzyle :
 On dissout 18, 2 g de chlorhydrate de L   (q-)    glutamate de   dibenzyle    préparé selon les indications de H. Sachs et E. Brand (J. Am. Chem. Soc., 1953, 75,   4610)    dans 100 cm3 de chloroforme, refroidit à   00    C et ajoute 15 cm3 de   triéthylamine.    On introduit alors, tout en maintenant la température à 0  C,   14 g    de chlorure de trityle et abandonne quarantehuit heures à la température ordinaire.

   On lave la solution dans laquelle le chlorhydrate de   triéthyl-    amine a cristallisé partiellement, à l'eau, puis à 1'eau chlorhydrique et à nouveau à l'eau jusqu'à neutralité des eaux de lavage, sèche la solution   chlorofor-    mique sur sulfate de magnésium et évapore à sec au bain-marie à   400    C. Le résidu est repris dans 75 cm3 d'alcool absolu chaud dont on distille environ 15 cm3 pour éliminer complètement le chloroforme.

   On laisse cristalliser en grattant les parois du ballon avec un agitateur puis on glace, essore, lave au méthanol et obtient 23, 1 g de produit directement utilisable pour   l'hydrogénolyse    (rendement 81    /o).    b)   Hydrogénolyse   
 du N-trityl-L-glutamate de dibenzyle    :   
 On dissout   57    g de N-trityl-L-glutamate de dibenzyle dans 500 cm3 d'acétate d'éthyle, introduit le charbon palladié préparé au départ de 15 g de noir végétal et de 5 cm3 d'une solution aqueuse à   20 ouzo    de chlorure palladeux et ajoute 27 cm3 de   triéthyl-    amine.

   On hydrogène jusqu'à fixation de la quantité théorique d'hydrogène, ce qui demande environ quarate-cinq minutes, essore le catalyseur, le lave à l'acétate d'éthyle, réunit le liquide de lavage au filtrat et concentre à environ 100 cm3. Après refroidissement, on ajoute 100 cm3 d'éther, essore, lave à l'éther et sèche à   80     C pour obtenir   40 g (81  /o)    de sel acide de triéthylamine de l'acide   N-trityl-Lr    glutamique, qui est utilisé dans la mise en oeuvre du procédé de la présente invention et dont la préparation n'a été indiquée ici qu'à titre de rappel.



  L'acide N-trityl-L-glutamique peut   aussi être pré-    paré par   tritylation    directe de l'acide L-glutamique ou par saponification   d'un    ester N-trityl-L-glutamique.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé pour la préparation de y-L-glutamyl- peptides de formule : EMI5.1 dans laquelle R est de l'hydrogène ou un reste alcoyle, aralcoyle, aryle ou hétérocyclique, ce dernier lié directement ou par un reste alcoylène à chaîne droite comportant de 1 à 8 atomes de carbone, tous ces restes pouvant comporter un groupe hydroxyle ou un reste contenant du soufre, caractaris en ce qu'on fait réagir, dans un solvant et en présence d'un carbodiimide disubstitué, l'acide Ntrityl-L-glutamique ou un sel de celui-ci, avec un aminoester de formule :

   EMI5.2 dans laquelle R'représente un alcoyle inférieur, à une température comprise entre 00 C et le reflux du solvant utilisé, en ce qu'on élimine le carbodi- imide par traitement acide, en ce qu'on saponifie par traitement alcalin et en ce qu'on isole le N tri, tyl-peptide que l'on détrityle.

   SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise le sel de triéthylamine de l'acide N-trityl-L-glutamique.

   2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise comme solvant le chlorure de méthylène.

   3. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que la réaction a liou à la température ambiante.

   4. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le carbodiimide disubstitué est le dicyclo- hexylcarbodiimide.

   5. Procédé suivant la revendication et la sous, revendication 4, caractérisé en ce qu'on élimine l'excès de dicyclohexylcarbodiimide par l'acide acétique à température ambiante, on libère le carboxyle par traitement à la soude alcoolique et on détrityle par chauffage dans l'acide acétique aqueux ou alcoolique.

   6. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on condense l'acide N-trityl-L-glutamique avec un ester de glycine, de L-méthionine, de Lleucine ou de L-tyrosine.