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Procédé de préparation de peptides Dans son brevet No 338197, la société titulaire a décrit un procédé d'obtention de peptides, par l'intermédiaire des N-trityl-peptides correspondants, ledit procédé consistant en une transformation d'un N-tri- tyl-amino-acide en son anhydride mixte que l'on fait réagir avec l'ester d'un' aminoacide ou peptide, le produit de condensation étant ensuite saponifié pour libérer le carboxyle, puis détritylé par chauffage avec l'acide acétique aqueux.
Ce procédé ne s'applique toutefois pas à certains N-trityl-amino-acides comme la N-trityl-méthionine, la N,N'-ditrityl-histidine et le N-trityl-tryptophane que l'on n'arrive pas à condenser avec des esters d'amino-acides ou peptides par la méthode mettant en oeuvre les anhydrides mixtes.
On a maintenant trouvé que l'on parvient facilement aux peptides correspondant à ces trois amino- acides N-tritylés ainsi que d'ailleurs à ceux des autres aminoacides N-tritylés, en faisant réagir un N-trityl- amino-acide en présence de dicyclohexylcarbodiimide sur un ester d'amino-acide ou de peptide.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de peptides, caractérisé en ce qu'on fait réagir un N-trityl-amino-acide en présence de di- cyclohexylcarbodiimide sur un ester d'amino-acide ou de peptide à fonction amine non salifiée, on élimine la dicyclohexylurée formée, on saponifie l'ester du trityl-peptide obtenu, on isole le N-trityl-peptide libre par acidification et on le détrityle par chauffage avec l'acide acétique aqueux.
Le dicyclohexylcarbodiimide a déjà été appliqué à la condensation des dérivés N-phtaloylés ou N-benzyloxycarbonylés des aminoacides avec des aminoesters en vue de l'obtention des peptides correspondants, mais on ne pouvait pas prévoir qu'il fournirait d'excellents résultats avec des N-trityl- amino-acides ne donnant pas de peptides correspondants par la méthode mettant en oeuvre des anhydrides mixtes.
Le procédé selon l'invention présente un intérêt particulier pour la préparation des peptides de l'histidine et de la méthionine dont on ne connaît que très peu de représentants. Pour l'accès aux peptides du tryptophane, il constitue une méthode de choix au point de vue économique, le chlorure de trityle ayant servi à préparer le N-trityl-tryptophane pouvant être récupéré avec un rendement pratiquement quantitatif, sous forme de triphénylcarbinol grâce à la détritylation.
Pour la mise en pratique du procédé selon l'invention, on opère avantageusement comme suit: on dissout un ester d'amino-acide ou de peptide à fonction amine non salifiée dans un solvant tel que le chlorure dé méthylène ou le chloroforme, ajoute ensuite une solution de dicyclohexylcarbodiimide dans le même solvant et introduit finalement l'amino- acide N-tritylé. Après avoir abandonné une nuit ou même plus longtemps,
on constate une précipitation presque quantitative de dicyclohexylurée que l'on complète par addition d'un peu d'acide acétique destiné à transformer l'excès de dicyclohexylcarbo- diimide en urée correspondante. Après filtration de la dicyclohexylurée, la solution renfermant l'ester du trityl-peptide est évaporée à sec et le résidu fournit après saponification et détritylation par l'acide acétique aqueux chaud le peptide cherché.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Les points de fusion sont des points de fusion instantanée déterminés sur bloc de Maquenne.
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Exemple 1 Préparation de la DL-tnéthioi2yl-glycine
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a) Glycinate d'éthyle 3 g de chlorhydrate de glycinate d'éthyle obtenu par estérification à l'alcool chlorhydrique de la glycine sont mis en suspension dans 6 ce de chloroforme et on ajoute 2 ce de diéthyl-amine. Il y a dissolution. On ajoute 10 ce d'éther pour précipiter le chlorhydrate de diéthyl-amine et abandonne un quart d'heure.
On filtre le chlorhydrate de diéthyl- amine et évapore à sec la solution éthérochloro- formique de glycinate d'éthyle. b) Condensation de la N-trityl-DL-méthiotiirie avec le glycinate d'éthyle en présence de dicyclohexyl- carbodiimide On dissout 1,1 g de glycinate d'éthyle obtenu comme indiqué sous a) dans 3 ce de chlorure de méthylène et y ajoute la solution de 2,5 g de dicyclo- hexylcarbodiimide dans 5 cm-3 de chlorure de méthylène.
Après avoir refroidi à 0 C, on introduit 3,9 de N-trityl-DL-méthionine dont la préparation a été décrite par G. Amiard, R. Heymes et L. Velluz (Bull. Soc. Chim. No 2 (1955) 191) et abandonne une nuit à la température ambiante. Le lendemain, on ajoute 0,5 cms d'acide acétique, abandonne quelques minutes et filtre la dicyclohexylurée qui a précipité. La solution filtrée est lavée à l'acide chlorhydrique normal, à l'eau, à l'ammoniaque, à l'eau jusqu'à neutralité, puis on la sèche sur sulfate de magnésium et évapore à sec.
Le résidu est constitué par du N-trityl-DL-méthionyl-glycinate d'éthyle brut renfermant un peu de chlorure de méthylène. Le rendement est quantitatif. c) Saponification du N-trityl-DL-méthionyl-glycinate d'éthyle Le produit brut obtenu selon b) est débarrassé du chlorure de méthylène qu'il renferme par reprise à l'alcool et distillation d'une partie de celui-ci. On ajoute à la solution alcoolique 8 ce de potasse méthanolique à 20% et 2 ce d'eau et fait bouillir 5 minutes. On dilue par l'eau, refroidit et acidifie par l'acide acétique.
Le trityl-peptide brut cherché se présente sous forme d'un précipité huileux qu'on purifie par reprise en chloroforme et lavage de la solution chloroformique à l'eau. Après séchage de la solution sur sulfate de sodium et évaporation du solvant, on obtient la N-trityl-DL-méthionyl-glycine sous forme d'huile épaisse.
d) Détritylation de la N-trityl-DL-méthiottyl-glycine Le N-trityl-peptide brut obtenu selon c) est repris par 10 ce d'acide acétique. On ajoute 10 ce d'eau et chauffe au bain-marie bouillant. Après quelques minutes de chauffage, le triphénylcarbinol cristallise, le peptide restant dissous. On arrête le chauffage, ajoute de l'eau, essore et lave le triphénylcarbinol à l'eau et concentre le filtrat à petit volume, passe au noir végétal et concentre jusqu'à cristallisation com- mençante. On introduit alors 20 ce d'alcool absolu, essore, lave à l'alcool et sèche.
On obtient 1,5 g de DL-méthionyl-glycine, F. (déc.) = 240-245o C, identique à la DL-méthionyl-glycine décrite dans la littérature. Le produit est soluble dans l'eau, les acides dilués aqueux, insoluble dans l'alcool, l'éther et l'acétone.
Exemple 2 Préparation de la DL-tryptophyl-glycine
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a) Glycinate d'éthyle Ce produit est préparé comme dans l'exemple la). b) Condensation du N-trityl-DL-tryptophatie avec le glycinate d'éthyle en présence de dicyclohexyl- c arbodiimide On opère exactement dans les conditions de l'exemple lb) sur 1,l g de glycinate d'éthyle en utilisant 4,46 de N-trityl-DL-tryptophane, obtenu selon le procédé indiqué pour la N-trityl-méthionine. Après évaporation du chlorure de méthylène, on obtient 4,
25 g de N-trityl-DL-tryptophyl-glycinate d'éthyle brut (soit un rendement de 80 %). Le produit cris- tallise par reprise à l'alcool. Pour l'analyse, on le recristallise dans le toluène. F. 203o C, soluble en chloroforme et acétone, peu soluble en alcool et éther, insoluble dans l'eau.
Analyse : C.;1H.;,SO.;N.; = 531,63 Calculé C 76,81 % H 6,26 % 0 9,03 % N 7,90 0/0 Trouvé C 77,1 % H 6,3 % O 8,9 '1/o N 7,9 Vo Ce produit est nouveau.
c) Saponification du N-trityl-DL-tryptophyl- glycinate d'éthyle On opère dans les conditions de l'exemple I c) en utilisant, pour 2 g d'ester, 5 cm-" de potasse métha- nolique à 20 % et 1 ce d'eau. On acidifie par l'acide acétique après dilution par l'eau.
La N-trityl- DL-tryptophyl-glycine précipite à l'état pulvérulent. d) Détritylation de la N-trityl-DL-tryptophyl-glycine On opère comme dans.l'exemple 1d) en utilisant 10 cm\; d'acide acétique à 50 %. Après concentra- tion du filtrat du triphénylcarbinol et addition d'al-
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cool, on obtient 880 mg de DL-tryptophyl-glycine hydratée, F. = 170e C, identique au produit décrit dans la littérature.
Exemple 3: Préparation de la L-histidyl-glycine
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a) Glycinate d'éthyle Ce produit est préparé comme dans l'exemple la). b) Condensation de la N,N'-ditrityl-L-histidine avec le glycinate d'éthyle en présence de dicyclohexyl- carbodiimide On opère exactement dans les conditions de l'exemple lb) sur 1,1g de glycinate d'éthyle en utilisant 6,4 g de N,N'-ditrityl-L-histidine, préparée selon le procédé mentionné pour la N-trityl-méthio- nine. Après évaporation du solvant, on obtient l'ester éthylique de la N,
N'-ditrityl-L-histidyl-glycine brut sous forme huileuse avec un rendement quantitatif, c) Saponification du N,N'-ditrityl-L-histidyl-glycinate d'éthyle On opère dans les conditions de l'exemple le) en utilisant pour la totalité de l'ester brut obtenu selon b) 10 ce de potasse méthanolique à 20 % et 3 ce d'eau. On acidifie par l'acide acétique après dilution par l'eau. Le produit pulvérulent qui précipite est essoré, lavé à l'eau et essoré à nouveau. On purifie par recristallisation dans 20 cm-3 de toluène.
La N,N'- ditrityl-L-histidyl-glycine cristallise sous forme de gros prismes hydratés. Après lavage au toluène et séchage à 1100C, on obtient 5,6 g (soit un rendement de 80%) de N,N'-ditrityl-L-histidyl-glycine pure pour l'analyse, F. = 155-160C (avec effer- vescence), [a] ri = -I- 171, 1 (c = 2 %, chloro- forme). Le produit est soluble dans l'acétone et le chloroforme, peu soluble dans l'alcool, l'éther et les alcalis dilués aqueux et insoluble dans l'eau.
Analyse : Cl,;H_1"O.;N1 = 696,81 Calculé C 79,28 % H 5,79 0/0 06,89% N 8,04 0/0 Trouvé C 79,5 % H 6,0 % 06,7 % N 7,9 0/0 Ce composé n'a pas encore été décrit jusqu'ici.
d) Détritylation de la N,N'-ditrityl-L-histidyl-glycine On opère comme dans l'exemple 1d) en utilisant 10 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 0/0. Après concentration du filtrat du triphényl-carbinol et addition d'alcool, on provoque la cristallisation du peptide. Après filtration, lavage à l'alcool et séchage, on obtient 1,2 g d'hémihydrate de L-histidyl-glycine, F. = 190,) C environ (peu net),
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(c = 2 0/0, eau). (Le pouvoir rotatoire est rapporté au produit anhydre).
Le dosage de l'eau selon Fischer montre que le produit renferme 0,62 mol. d'eau. Il est soluble dans l'eau, les acides et les alcalis dilués aqueux, insoluble dans l'alcool et l'éther.
Analyse : C$H1,O.;N4, / 0,62 H.,O = 223,4 Calculé C 43,0 % H 5,97 % 025,91/o N 25,08 % Trouvé C 43,3 % H 6,1 % 0 25,6 % N 24,9 0/0 Ce produit est nouveau.
Exemple 4: Préparation de la L-histidyl-L-leticine
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a) Préparation du leucinate de méthyle On prépare 1,5 g de leucinate de méthyle à partir de son chlorhydrate selon la technique décrite dans l'exemple la) pour le glycinate d'éthyle.
b) Condensation de la N,N'-ditrityl-L-histidine avec le L-leucinate de méthyle en présence de dicyclo- hexylcarbodiimide On opère selon les conditions de l'exemple lb) en employant pour 1,6 g de L-leucinate de méthyle, 6,4 g de N,N'-ditrityl-L-histidine et 2,5 g de dicyclo- hexylcarbodiimide et en prolongeant la durée de réaction pendant deux jours. Après évaporation du solvant, on obtient, avec un rendement quantitatif, l'ester méthylique de la N,N'-ditrityl-L-histidyl-L- leucine brut à l'état semi-solide et sans tendance à la cristallisation.
c) Saponification du N,N'-ditrityl-L-hi,stidyl- L-leucinate de méthyle On opère dans les conditions de l'exemple le) en utilisant pour la totalité de l'ester brut obtenu 10 ce de potasse méthanolique à 20 % et 2 ce d'eau ut obtient finalement, après acidification, 6,5 g (soit un rendement de 86 0/0) de N,N'-ditrityl-L- histidyl-L-leucine pulvérulente, laquelle, après reprise au chloroforme et lavage à l'eau, devient huileuse sans tendance à la cristallisation.
d) Détritylation de la N,N'-ditrityl-L-histidyl- L-leucine On opère comme dans l'exemple I d) en utilisant pour 6 g de peptide brut N,N'- ditritylé, 20 cm,' d'acide acétique aqueux à 50 % et obtient finalement
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2 g (soit un rendement de 93 %) de L-histidyl-L- leucine identique au produit décrit par Holley et Sondheimer (J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 1326).