CZ362599A3 - Indazolamidové sloučeniny jako serotoninergní přípravky - Google Patents

Indazolamidové sloučeniny jako serotoninergní přípravky Download PDF

Info

Publication number
CZ362599A3
CZ362599A3 CZ19993625A CZ362599A CZ362599A3 CZ 362599 A3 CZ362599 A3 CZ 362599A3 CZ 19993625 A CZ19993625 A CZ 19993625A CZ 362599 A CZ362599 A CZ 362599A CZ 362599 A3 CZ362599 A3 CZ 362599A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bacillus thuringiensis
thuringiensis subsp
bacillus
mutant
subsp
Prior art date
Application number
CZ19993625A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295190B6 (cs
Inventor
Alessandra Alisi
Mario Brufani
Nicola Cazzolla
Marilena Giannangeli
Mario Pinza
Original Assignee
Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C. R. A. F. S. P. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C. R. A. F. S. P. A. filed Critical Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C. R. A. F. S. P. A.
Publication of CZ362599A3 publication Critical patent/CZ362599A3/cs
Publication of CZ295190B6 publication Critical patent/CZ295190B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Paints Or Removers (AREA)

Description

Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bači Hus
Tato patentová přihláška je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 08/146,852, podané 3. listopadu 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 08/095,240, podané 20. července 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č, 07/990,202, přihlášené 14. prosince 1992, která je pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 07/971,786, podané 5. listopadu 1992.
Oblast techniky
Vynález se týká mutantního kmene Bacillus, který vytváří faktor potencující pesticidní aktivitu pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi, u nichž se takový faktor získává ve velkých množstvích, anebo má větší potencující aktivitu ve srovnání s mateřským kmenem, a týká se dále způsobů produkce takových mutantních kmenů. Vynález se také týká způsobů získávání tohoto faktoru.
Dosavadní stav techniky
Škůdci, působící každoročně škody v zemědělství, lesnictví a na obecněn zdraví, představují ztráty v milionech dolarů. Pro zvládnutí takových škůdců byly využity různé strategie.
Jedna ze strategií je užívání chemických pesticidů se širokým rozsahem nebo spektrem účinnosti. Použití chemických pesticidů však přináší řadu nevýhod. Tyto pesticidy, zejména pro své široké spektrum účinnosti, mohou ničit orgamismy, na které nebyly zamířeny, jako je blahodárný hmyz a paraziti ničivých škůdců. Navíc jsou chemické pesticidy obvykle toxické pro zvířata a lidi. Dále si škůdci, na které jsou zaměřeny, často vytvářejí resistenci na takové látky, pokud j im j sou opakovaně vystavovány.
Jinou strategii pro ovládání zamoření hmyzem, houbami a plevelem představuje užití biopesticidů. Biopesticidy jsou přirozeně se vyskytující pathogeny a/nebo substance těmito pathogeny vytvářené. Výhoda použití biopesticidů tkví v tom, že jsou v celkovém srovnání s chemickými pesticidy obyčejně méně škodlivé pro organismy, na které nejsou zaměřeny a pro okolní prostředí.
Bacillus thuringiensis
Nejrozšířenějším biopesticidem je Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis je pohyblivá, tyčinkovítá, gram-positivní bakterie, v přírodě široce rozšířená, zejména v půdě a v prostředí bohatém na hmyz. Bacillus thuringiensis vytváří paraspory ve formě krystalických inklusí, které jsou po požití insekticidní pro citlivé hmyzí larvy řádu Lepidoptera, Diptera a Coleoptera. Inkluse se mohou lišit v tvaru, počtu a složení. Jsou tvořeny jedním nebo více proteiny nazývanými delta-endotoxiny, jejichž velikost se může pohybovat mezi 27 až 140 kDa. Insekticidní delta-endotoxiny jsou obvykle ve vnitřnostech larev přeměněny na menší (zkrácené) toxické polypeptidy způsobující destrukci vyživovacího kanálu a konečně uhynutí hmyzu (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiological Reviews 53:242 - 255).
Existuje několik kmenů Bacillus thuringiensis, které se jako biopesticidy široce užívají v lesnictví, agrikultuře a oblastech obecného zdraví. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produkují delta-endotoxiny specifické pro Lepidoptera. Delta-endotoxin specifický pro Coleoptera produkuje Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg a spol., 1988, U.S. patent č. 4,766,203). A dále Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produkuje delta-endotoxin specifický pro Diptera (Goldberg, 1979, U.S. patent č. 4,166,112).
Pro dvoj křídle škůdce byly popsány i jiné specifické kmeny Bacillus thuringiensis. Byl popsán isolát Bacillus thuringiensis, který je toxický pro Diptera a Lepidoptera (Hodgman a spol., 1993, FEMS Microbiology Letters 114.-17 - 22). Elektroforesa přečištěného krystalu delta-endotoxinu z tohoto isolátu na SDS polyakrylamidovém gelu odhalila tři proteiny, které souvisejí s toxiny CrylA(b), CrylB a CrylIA. Byl rovněž popsán isolát Bacillus thuringiensis, který produkuje na Diptera účinnou krystalickou látku složenou z proteinů s molekulovou hmotností 140, 122, 76, 72 a 38 kDa (Payne, 1994, U.S. patent č. 5,275,815). EPO 480,762 uvádí pět kmenů Bacillus thuringensis, z nichž je každý účinný proti dvojkřídlým škůdcům a každý také má jedinečné složení krystalického delta-endotoxinu.
Bylo popsáno také několik kmenů Bacillus thuringiensis, které vykazují pesticidní účinnost proti jiným škůdcům, než jsou Lepidoptera, Coleoptera a Diptera. Bylo objeveno pět kmenů Bacillus thuringiensis produkujících endotoxiny, které jsou toxické vůči hlísticím (Edwards, Payne a Soares, 1988, Evropská patentová přihláška č. 0 303 426 Bl). Byl také objeven kmen Bacillus thuringiensis PS81F, který může být používán při ošetřování lidí a zvířat, hostících parazitická protozoa (Thompson a Gaertner, 1991, Evropská patentová přihláška č. 0 461 799 A2). Bylo popsáno i několik isolátů Bacillus thuringiensis jsou účinné proti akariosám. Tyto isoláty produkují krystaly složené z proteinů s molekulovou hmotností v (širokém) rozmezí od 35 kDa do 155 kDa (Payne,
Cannon a Bagley, 1992, PCT přihláška č. VO 92/19106). Byly rovněž popsány kmeny Bacillus thuringiensis s účinností proti škůdcům patřícím do řádu Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier a Uick, 1992, Evropská patentová přihláška č. 0 516 306 A2), dále s účinností proti škůdcům řádu Hemiptera (Payne a Cannon, 1993, U.S. patent č. 5,262,159), nebo s účinností proti škodlivým motolicím (Hickle, Sick, Schwab, Narva a Payne, 1993, U.S. patent Č. U.S. 5,262,399) a s účinností proti škůdcům řádu Phthiraptera (Payne a Hide, 1993, U.S. patent č. 5,273,746). 0 jiném kmeni Bacillus thuringiensis supsp. kurstaki, VB3S-16, který byl isolován z vlněné stříže australských ovcí, bylo dále zjištěno, že je toxický pro štípavou veš Damalinia ovis, škůdce Phthiraptera (Drummond, Miller a Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60:102 - 103).
Delta-endotoxiny jsou kódovány pomocí cry (krystalický protein) genů, které jsou obvykle umístěny v plasmidech. Cry geny byly rozděleny do šesti tříd a několika podtříd založených na relativní homologii aminokyselin a pesticidní specifičnosti. Hlavní třídy jsou Lepidoptera - specifická (cry I), Lepidoptera- a Diptera-specifická (cry II), Coleoptera-specifická (cry III), Diptera-specifická (cry IV) (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiological Reviews 53:242-255), Coleoptera- a Lepidoptera-specifická (označovaná jako cry V geny Tailorem a spol., 1992, Molecular Microbiology 6:1211-1217) a Nematoda-specifická (označovaná jako cry V a cry VI Feitelsonem a spol., 1992, Bio/Technology 10:271-275).
Delta-endotoxiny byly získávány metodami rekombinantní DNA. Delta-endotoxiny získané metodami rekombinantní DNA mohou anebo nemusí být v krystalické formě.
U některých kmenů Bacíllus thuringiensis se ukázalo, že produkují tepelně stálý pesticidní analog adenin nukleotidu, známý jako β-exotoxin typu I neboli thuríngiensin, který je sám pesticidní (Šebesta a spol., v H.D. Burges [editor], Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, 1980, str. 249-281). β-Exotoxin typu I byl nalezen v matečném louhu některých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 701 a skládá se z adenosinu, glukosy a allarové kyseliny (Farkaš a spol., Coll. Czechoslovak Chern. Comm. 42:909-929; Lůthy a spol., v Kurstak [editor], Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Okruh jeho hostitelů zahrnuje, ale není omezen na.· Musea domestica, Mamestra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus. Má se za to, že toxicitu β-exotoxinu typu I je třeba přičítat inhibici DNA-řízené RNA polymerázy v soutěži s ATP. Bylo prokázáno, že β-exotoxin typu I je kódován cry plasmidem u pěti kmenů Bacillus thuringiensis (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu I produkuje Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotyp 9 a Bacillus thuringiensis supsp. darmstadiensis serotyp 10.
Jiný β-exotoxin byl popsán a klasifikován jako β-exotoxin typu II (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu II produkuje Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab, a že je účinný proti Leptinotarsa decemlineata. Struktura β-exotoxinu typu II není zcela známá, ale výrazně se liší od struktury β-exotoxinu typu I, protože na místě adeninu je pseudouridinová část, ve které je připojení ke kruhu ribosy v pozici, jež by měla jinak být obsazena protonem (Levinson, v Hickle a Finch [editoři], Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington D.C., 1990, str. 114-136). Dále je tu pouze jeden signál v protonovém NMR spektru odpovídající basi nukleosidu (při 7,95 ppm) a chybí signál protonu anomerů ribosy (5,78 ppm).
Mezi další ve vodě rozpustné látky, které byly isolovány z Bacillus thuringiensis patří alpha-exotoxin, který je toxický pro larvy Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7)-, gamma-exotoxiny, což jsou různé enzymy zahrnující lecithinázy, chitinázy a proteázy, jejichž toxické účinky se projevují pouze ve spojení s beta-endotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg a spol., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pwsticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, který má podobnou strukturu jako beta-exotoxin a je také účinný proti Leptinotarsa decemlineata (Argauer a spol., 1991, J. Entomol. Sci. 26:206-213); a anhydrothuringiensin (Prystaš a spol.,
1975, Coll. Czechoslovak Chern. Comm. 40:1775).
Zwittermicin
Z Bacillus cereus byla isolována substance, která inhibuje růst rostlinného pathogenu Phythophthora medicaginis a omezuje infekci vojtěšky (viz například U.S. patenty č. 4,877,738 a 4,878,936). Jiná účinnost popsána nebyla. Pro zwittermicin A byla stanovena následuj ící struktura (He a spol., Tet. Lett. 35:2499-2502):
OH NH~ NH~
I I I 2 h2nco-nh-ch2-ch-nhco-ch-ch-ch-ch-ch2-ch-ch-ch2-oh
CONH2 OH OH OH
Bylo vyvíjeno úsilí dosáhnout u formulací přípravků s Bacillus thuringiensis vyšší mortality. Zahrnovalo hledání nových kmenů se zvýšenou mortalitou, pokusy o zdokonalení existujících kmenů a pokusy navrhnout efektivnější formulaci kombinací spor Bacillus thuringiensis s novými pesticidními nosiči, chemickými pesticidy anebo zesilovači (viz na příklad U.S. patent č. 5,250,515, inhibitor trypsinu). Z těchto důvodů je účelem předkládaného vynálezu potencovat pesticidní účinnost pesticidů. Předmětem vynálezu je také isolace kmenů, které produkují větší množství potenciátoru.
Podstata vynálezu
Vynález se vztahuje na mutantní kmen Bacillus produkující faktor, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, při čemž množství faktoru produkovaného mutantem je větší, než množství faktoru produkované odpovídajícím mateřským kmenem. V konkrétním provedení je kmen Bacillus volen ze skupiny sestávající z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis a Bacillus thuringiensis.
Faktor vytvářený řečeným mutantem je potenciátorem. Jak se zde definuje, potenciátor je substance, která nemá signifikantní pesticidní účinnost tak, že by měla na příklad LC^q (LC$q je koncentrace látky nutná k usmrcení 50 % škůdců) více než kolem 3000 pg/g při stanovení bioassayem (viz dále), která však působí zvýšení pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus zhruba alespoň o 50 % a nezpůsobuje zabránění larvárního růstu. Jak bylo zmíněno výše, jiné substance, o nichž je známo, že jsou schopny zvyšovat pesticidní účinnost, jako jsou delta-endotoxiny, inhibitory trypsinu a exotoxiny, pesticidní účinnost mají.
Ve specifickém provedení je faktor ve vodě rozpustný. Jak se zde definuje, substance nebo sloučenina je ve vodě rozpustná, pokud se alespoň kolem 1 mg látky může rozpustit v 1 ml vody. Faktor může také potencovat pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.
Jak se zde definuje, pesticid související s druhem Bacillus je kmen Bacillus (na příklad Bacillus thuringiensis nebo Bacillus subtilis), spora nebo substance, například protein nebo jeho fragment, které jsou účinné proti škůdcům nebo je hubí, anebo mikroorganismus schopný exprimovat gen Bacillus, který kóduje protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti škůdcům nebo je hubí (například Bacillus thuringiensis delta-endotoxin), a přijatelný nosič (pro příklady takových nosičů viz níže oddíl 5.2). Škůdcem může být na přiklad hmyz, hlíštice, roztoč nebo slimák. Mikroorganismus schopný exprimovat gen, který kóduje protein druhu Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo hubí škůdce sídlící na povrchu listů rostlin (phylloplane), a/nebo v rhizosféře (půda obklopující kořeny rostlin), a/nebo ve vodném prostředí a je schopný v daném prostředí (úroda a jiné hmyzí lokality) úspěšně soutěžit s divoce se vyskytujícími mikroorganismy a poskytovat stálé udržování a expresi genu Bacillus, v němž je zakódován protein druhu Bacillus nebo jeho fragment, který má účinnost proti, anebo zabíjí škůdce. Příklady takových mikroorganismů představují, avšak nejsou omezeny na bakterie, například rodu Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes a Clostridium; na řasy, například čeledi Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae a Chlorophyceae; a na houby, zejména kvasinky, například rodu Saccharomyces, Cryptococcus,
Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium.
Jak se zde definuje, pesticidní účinnost se měří velikostí účinku proti škůdcům při jejich zahubení, nebo při zabránění jejich růstu, anebo při ochraně rostliny před zamořením škůdcem.
Vynález se také týká způsobu získání mutantu podle tohoto vynálezu, který zahrnuje:
(a) ošetření kmene Bacillus mutagenem;
(b) pěstování mutovaného kmene Bacillus podle stupně (a) za podmínek vhodných pro selekci mutantu;
(c) selekci mutantu získaného ve stupnmi (b).
Podstatně čistý faktor může být z mutantu získán takto:
(a) kultivací mutantu kmene Bacillus za vhodných podmínek;
(b) odebráním supernatantu kultury mutantu ze stupně (a) a (c) isolací faktoru ze supernatantu kultury mutantu podle stupně (b) a získání podstatně čistého faktoru.
Faktor získaný z řečeného mutantu může být formulován do kompozice obsahující faktor a pesticidní nosič, právě tak jako faktor a pesticid související s druhem Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Tyto kompozice se mohou užívat k potírání škůdců snižováním resistence škůdce na pesticidy související s druhem Bacillus, což spočívá na vystavení škůdce vůči kompozici, která obsahuje faktor a pesticidně přijatelný nosič anebo na potenciaci pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem 'Bacillus.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje schematicky obecný postup použitý pro čistění la.
Obrázek 2 ukazuje C NMR spektrum la.
Obrázek 3 ukazuje NMR spektrum la.
Obrázek 4 ukazuje výsledky NOE experimentů acetylderivátu la.
Mateřským kmenem Bacillus může být například Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis nebo Bacillus thuringiensis. Mateřský Bacillus thuringiensis může být kmenem divokého typu, což zahrnuje, ale neomezuje se na Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. Indiana, Bacillus thuringiensis subsp.tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistáni, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri , Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp.
shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.
V typickém provedení je mateřským kmenem Bacillu thuringiensis Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Nejčastěji je v typickém provedení mateřským kmenem Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki kmen EMCC0086 (uložený v NRRL jako NRRL B-21147). Mutant ještě v jiném typickém provedení má identifikační charakteristiky EMCC0129, je deponován v NRRL a má přírůstkové číslo NRRL B-21445, nebo má identifikační charaktrištiky EMCC0130 a přírůstkové číslo NRRL B-2144.
Metody získání mutantu
Mateřský kmen může být ošetřen mutagenem, aby došlo k indukci mutačního pochodu. Konkrétně při jedné z metod mutace kmene Bacillus thuringiensis a selekce takových mutantů, které jsou schopné produkovat podstatně větší množství faktoru než jejich mateřský kmen, je mateřský kmen:
i) ošetřen mutagenem ii) ošetřené buňky se kultivují ve vhodném kultivačním mediu (na příklad NSMP medium) a iii) vyberou se buňky, které produkují větší množství faktoru.
Ve stupni (i) může být mutagenem na příklad chemický mutagen, N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidin,
N,N -dinitro-N -nitrosoguanidin, nebo methansulfonan ethylnatý, gamma záření, rentgenové záření a/nebo UV-záření
Buňky se vyberou na základě zkoušky na produkci faktoru, na příklad pomocí kapilární elektroforesy anebo pomocí imunoanalýzy za použití protilátky faktoru.
Jiný způsob získání vysoce produktivních mutantů podle vynálezu může představovat pěstování matečného kmene v kapalném prostředí a vybrání spontánních mutantů po rozestření živné směsi kultury na agarové medium vhodné pro selekci mutantů.
Za další metody výběru vysoce produktivních mutantů podle vynálezu lze považovat separaci mutantů od jiného materiálu na základě hmotnosti centrifugováním, nebo jinými prostředky, které se používají k separaci na základě hmotnosti.
Získávání faktoru
Mutanty Bacillus podle předkládaného vynálezu mohou být pěstovány za použití medií a fermentačních technik, které jsou v oboru běžné (viz na příklad Rogoff a spol., 1969, J. Intervertebrate Path. 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, J. Intervertebrate Path. 18:353-358; Dulmage a spol., v Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, editor, Academic Press, N.Y., 1980). Při typickém provedení může fermentační prostředí obsahovat hydrolysovaný protein, hydrolysovaný uhlohydrát, soli a stopové kovy. Fermentační prostředí může také případně obsahovat jednu nebo více aminokyselin. Po dokončení fermentačního cyklu může být kapalina nad kulturou získána po oddělení spor Bacillu thuringiensis a krystalů z fermentační živné směsi v oboru dobře známými prostředky, jako je centrifugování a/nebo ultrafiltrace. Faktor se nalézá v kapalině nad kulturou a může být získán v oboru dobře známými způsoby, na příklad ultrafiltrací, odpařením nebo sušením rozprašováním. Tento postup je podrobněji popsán v následujícím oddílu.
Čistění faktoru může být provedeno různými v oboru známými procedurami, včetně, nikoliv však pouze, chromatografických (na příklad iontoměniče, afinitní a rozdělovači kolonová chromatografie), elektroforetických procedur, diferenční rozpustnosti, extrakce, anebo jakékoliv standardní techniky známé v oboru.
Potencující účinnost faktoru pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, viru majícího pesticidní účinnost nebo chemického pesticidu proti různým škůdcům může být stanovena v oboru známými postupy jako je přidávání do umělé hmyzí potravy, překrývání umělé potravy, natíráni listu, namáčení listu a postřik listu. Modelové příklady takových zkoušek jsou popsány níže. Množství produkovaného faktoru může být kvantifikováno například kapilární elektroforesou.
Faktor může mít molekulovou hmotnost od kolem 350 do kolem 1200 nebo ve specifickém případě od kolem 350 do kolem 700.
Faktor znásobuje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s kmenem Bacillus nejméně zhruba 1,5-krát, popřípadě až zhruba 1000-krát, výhodně pak zhruba 100-krát až zhruba 400-krát. V typickém případě znásobuje faktor circa 1,5-krát až circa 1000-krát pesticidní účinnost delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis, včetně, avšak nikoliv pouze Cryl (včetně, avšak nikoliv pouze CrylA, CrylB a CrylC), CrylI, CrylII, CryIV, CryV, nebo CryVI proteinu v jeho původní délce nebo proteolyticky zpracované zkrácené formě. V nejčastějších případech znásobuje faktor delta-endotoxin Bacillu thuringiensis circa 100-krát až circa 400-krát. Faktor může také násobit pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.
Faktor může být také ve vodě rozpustný, stálý ve vodě až circa do 100 C nejméně po dobu asi 5 minut, stálý při vystavení přímému slunečnímu světlu nejméně po dobu asi 10 hodin, a/nebo stálý při přibližně pH 2 asi 10 dní. Faktor může mít 13 uhlíků. K tomu dále může mít faktor v ^H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny 13C kolem 31,6; 37,2; 51,1; 53,3; 54,0; 54,4; 61,5; 61,6;
64,1; 65,6; 158,3; 170,7 a 171,3.
V nejčastějších typických případech má řečený faktor strukturu la
OH NHO NH~
I I I h2nco-nh-ch2-ch-nhco-ch-ch-ch-ch-ch2-ch-ch-ch2-oh
CONH2 OH OH OH (la) nebo je jeho solí. Sůl by byla schopna zesilovat pesticid související s druhem Bacillus.
Kompozice obsahující faktor
Faktor získaný z mutantu podle tohoto vynálezu, se může formulovat samostatně, nebo s pesticidem souvisejícím s druhem Bacillus, který, jak je svrchu definováno, je kmenem Bacillus, sporou, proteinem nebo fragmentem, nebo jinou jeho substancí, s účinností proti škůdcům nebo která hubí škůdce nebo chrání rostliny proti škůdci, nebo dále s chemickým pesticidem a/nebo s entomopathogenním virem a přijatelným nosičem, do pesticidní kompozice/í, což je na příklad suspense, roztok, emulse, prachový pudr, dispersibilní granule, prach ulpívající po zvlhčení, koncentrát pro emulsi, aerosol nebo obalované granule. Příklady takových kmenů Bacillus zahrnují, avšak nejsou omezeny na Bacillus TM thuringiensis subsp. kurstaki (na trhu jako DIPEL od Abbott Laboratories, Inc., JAVELUN™ od Sandoz, BIOBIT^ od Novo Nordisk A/S, FORAY^ od Novo Nordisk A/S, BIOCOT^ od Novo Nordisk A/S, MVP^ od Mycogen, BACTOSPEINE^ od Novo Nordisk A/S a THURICIDE™ od Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp.
aizawai (na trhu jako FLORBAC™ od Novo Nordísk A/S a XENTARI™ od Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (na trhu jako NOVODOR™ od Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ od Sandoz, M-TRAK™ a M-ONE™ od Mycogen a DTERRA™ od Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (na trhu buď jako BACTIMOS™ nebo SKEETAL™ od Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ od Sandoz, a VECTOBAC™ od Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (na trhu jako FOIL™ od Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (na trhu jako CONDOR ™ od Ecogen a AGREE™ od Ciba Geigy); Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (na trhu jako CUTLASS™ od Ecogen). Protein související s druhem Bacillus může být vybrán ze skupiny, neomezené však jenom, na Cryl, CrylI, CrylII, CryIV, CryV a Cry VI. Chemickým pesticidem může být například regulátor hmyzího růstu jako diflubenzuron, karbamát jako thiodicarb a methomyl, organofosfát jako chlorpyrifos , pyrethroid jako cypermethrin a esfenvalerate, anorganický fluorid jako kryolit a pyrrol. Entomopathogenní virus může představovat baculovirus, například virus nukleární polyhedrosis (PNV) Autographa californica, NPV Syngrapha falcifera, GV (virus granulosis) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Limantria dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NPV Neodiprion lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brillians a NPV Endopiza viteana Clemens.
Ve směsích, které obsahují substanci a pesticid související s druhem Bacillus, může být substance přítomna v množství nejméně asi 0,1 g/BIU nebo 0,05 g faktoru na g delta-endotoxinu nebo spory bacilu, volívá se asi 300 g/BIU nebo 150 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu, nejlépe pak 2 g/BIU nebo 1 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu. Jak se zde definuje, BIU je miliarda mezinárodních jednotek, jak se určuje bioassayem. Při bioassayi je vzorek srovnáván se standardním referenčním materiálem druhu Bacillus, za použití Trichoplusia ni nebo jiného škůdce jako standardního testovacího hmyzu. Potence se určí vydělením referenčního standardu LC$q a pak násobením potencí referenčního standardu.
V dalším provedení může komposice obsahovat faktor v podstatně čisté formě, nebo faktor z kapaliny nad kulturou bacilu ve vysušené, koncentrované nebo kapalné formě a pesticidně přijatelný nosič, jak je níže na příkladech vyloženo. Tato kompozice může být na rostlinu aplikována odděleně, na příklad na transgenní rostliny. Ve specifickém případě lze kompozici aplikovat na rostlinu již před tím obsahující a exprimující gen Bacillus thuringiensis. V jiném případě je možné kompozici aplikovat na rostlinu, která byla kompozici Bacillus thuringiensis vystavena dříve. Při dalším případě lze kompozici aplikovat v jiných prostředích dvojkřídlého škůdce/ů jako na příklad ve vodě nebo v půdě. Koncentrace substance v kompozici je asi od 0,001 % do asi 60 % hmotnostních.
Kompozici obsahující substanci a navíc ještě pesticidně přijatelný nosič ke kontrole škůdce lze používat také ke snížení resistence škůdce na pesticid. Alternativně je možné používat kompozici k potencování pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus. V jednom z provedení se kompozice aplikuje ve stejném čase jako pesticid v množství alespoň kolem 2 g substance/BIU až do případných cca 300 g substance/BIU. V jiném provedení lze kompozici aplikovat do zhruba 24 hodin po pesticidu jako adjuvans pro rozvinutí působivosti residuálního pesticidu.
Takové, svrchu uváděné kompozice, lze získat po přidání povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, ochranného prostředku, zvlhčovadla, chuťového stimulantu, atraktantu, kapsulačního činidla, pojidla, emulsifikátoru, barviva, ochrany proti UV záření, pufru, zkapalňujícího činidla nebo jiných komponent, které usnadňují manipulaci a aplikaci zaměřenou na určité škůdce.
Vhodná povrchově aktivní činidla jsou anionaktivní sloučeniny jako karboxyláty, například kovové soli mastných kyselin o dlouhém řetězci; N-acylsarkosinát; mono- nebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů či soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsíran sodný, oktadecylsíran sodný nebo cetylsíran sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarylsulfonáty jako alkylbenzensulfonáty, nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, na příklad butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondensačních produktů naftalenu a formaldehydu; soli sulfonovaných kondensačních produktů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty, například sulfonovaný kondensační produkt olejové kyseliny a N-methyltaurinu nebo dialkyl sulfosukcináty, na příklad dioktyl sulfosukcinát sodný. Mezi neionogenními činidly se pak používaj í kondensační produkty ethylenoxidu a esterů mastných kyselin, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin, nebo alkyl- či alkenylfenolů s mastnými alkyly či alkenyly, dále estery polyhydroxyalkoholetherů, například estery sorbitolu a mastných kyselin, kondensační produkty takových esterů a ethylenoxidu, například estery mastných kyselin a polyoxyethylensorbitolu, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenické glykoly jako 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, nebo ethoxylované acetylenické glykoly. Příklady kationaktivních povrchově aktivních činidel představují na příklad alifatické mono-, di- nebo polyaminy ve formě acetátů, naftenátů nebo oleátů, dále kyslík obsahující amin jako aminoxid polyoxyethylenalkylaminu, potom amidovými skupinami seřetězený amin, získaný kondensací karboxylové kyseliny s di- či polyaminem, anebo kvarterní amoniová sůl.
Příklady inertních materiálů zahrnuj i anorganické materiály jako kaolin, slídu, sádru, umělé hnojivo, fylosilikáty, uhličitany, sírany nebo fosforečnany, dále i organické materiály jako cukr, škroby nebo cyklodextriny, anebo botanické materiály jako lesní produkty, korek, rozemleté kukuřičné palice, rýžové slupky, slupky burských oříšků a skořápky vlašských ořechů.
Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě vhodné pro přímou aplikaci, nebo jako koncentrát či základní směs, která před aplikací vyžaduje zředění příslušným množstvím vody nebo jiného ředidla. Koncentrace pesticidu se bude měnit v závislosti podle povahy jednotlivé formulace, konkrétně podle toho, zda je to koncentrát, nebo zda je pro přímé použití. Kompozice obsahuje 1 až 98 % pevného nebo kapalného inertního nosiče a 0 až 50 %, nejlépe 0,1 až 50 % povrchově aktivního činidla. Kompozice se aplikují v dávkách určených pro komerční produkt, nejlépe kolem 0,01 kg/ha (lb/akr) až 5,6 kg/ha (lb/akr), pokud jsou v suchém stavu a kolem 0,007 1/ha (0,01 pint/akr) do 17,5 1/ha (25 pint/akr), pokud jsou kapalné.
Podle dalšího způsobu provedení může být krystalický delta-endotoxin Bacillu thuringiensis a/nebo faktor před formulací ošetřen tak, aby byla prodloužena pesticidní účinnost při jeho aplikaci v prostředí ničeného škůdce, pokud toto předběžné ošetření neničí krystalický delta-endotoxin nebo substanci. Takové ošetření nůže být uskutečněno chemickými a/nebo fysikálními prostředky, pokud toto ošetření neovlivní zhoubně vlastnosti směsi/í. Mezi příklady chemických činidel patří, ale nejsou omezeny na halogenační činidla, aldehydy jako formaldehyd a glutaraldehyd, činidla proti infekci jako zephiran chlorid, alkoholy jako isopropanol a ethanol a histologické fixativy jako Bouin-ův fixativ a Helly-ho fixativ (viz na příklad Humason, Animal Tissue Techniqes, V.H. Freeman and Co., 1967).
Kompozice podle vynálezu lze aplikovat přímo na rostlinu, například postřikem nebo poprášením v době, kdy se na rostlině začal objevovat škůdce nebo jako ochranné opatření před jeho příchodem. Mezi rostliny, které lze chránit v rozsahu tohoto vynálezu patří, ale nej sou omezeny jen na ně: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (vojtěška, fazole, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovíté rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, zelí a jiné košfáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, trávníkové rostliny, tabák, ořechy, káva, třtina cukrová, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně tak jako rostliny okrasné. Kompozici lze aplikovat na list, zapravením do země, rozhozem granulí, na poslední chvíli při sklizni nebo nasáknutím do půdy. Zpravidla je důležité získat kontrolu nad škůdcem v raných stadiích vývoje rostliny, protože to je doba, kdy může být poškozena nejvážněji. Pokud se má za to, že je to nutné, může postřik nebo poprašek obsahovat výhodně i jiný pesticid. V preferovaném provedení se kompozice podle vynálezu aplikuje přímo na rostlinu.
Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány přímo do rybníků, jezer, potoků, řek, stojatých vod a dalších míst vystavených zamoření dvojkřídlými škůdci, zvláště škůdci ohrožuj ícími obecné zdraví. Kompozice může být aplikována sprej ováním, práškováním, postřikem a tak podobně.
Kompozice podle předkládaného vynálezu může být účinná proti škůdcům řádu Lepidoptera, například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp. , Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operoptera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota oceli ana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; dále řádu Diptera na příklad Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Avšak kompozice podle vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera, například Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formocarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp., Cyclocephala borealis,
Cyclocephala immaculata, Makrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; dále řádu Acari, například Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi , Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera, například Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; či řádu Isoptera, například Reticulitermes hesperils, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formas anus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; nebo řádu Siphonaptera, například Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; anebo řádu Tylenchida, například Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans .
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci, nikoliv však aby omezovaly.
Charakterisace la
Podrobně se popisuje získávání a čištění la. Podrobnosti o charakterisaci la jsou uvedney dále.
1. Získání a čistění la
Kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (uložený v NRRL jako B-21147) byl fermentován 72 hodin při 30 C v mediu složeném ze zdroje uhlíku jako je škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosa a ze zdroje dusíku jako je protein, proteinový hydrolysát nebo výluh z obilí. Tvorba la
byla stanovována po 13 hodinách během fermentace. Vrchol účinnosti byl nalezen zhruba po 30 hodinách.
Kapalina nad živnou půdou z fermentace Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki byla odcentrifugována a poté vyčeřena ultrafiltaci membránou 30 kDa MV-CO s použitím Rhone Poulenc UF systému. Ultrafiltrací se odstranily jakékoliv zbytky buněk, krystaly delta-endotoxinu, spory a rozpustný protein s větší hmotností než 30 kDa. Filtrát byl odpařením zahuštěn desetinásobně. Filtrát byl poté centrifugován a filtrován membránou 0,2 pm, k dalšímu odstranění nerozpustných částic z živného roztoku a získání čistého roztoku obsahujícího la.
Vyčistění la do homogenity se dosáhlo použitím mnohastupňového čistícího pochodu, který je schematicky uveden na obrázku 1. V návaznosti na postup přípravy popsaný shora, pokračoval čistící proces stupněm ultrafiltrace na 5 kDa. Filtrát po 5 kDa ultrafiltraci byl absorbován na kationtoměnič Sulfopropyl (SP) a eluován roztokem octanu amoného. Látka byla pak přibližně 30x zkoncentrována lyofilisací a sůl a ostatní kontaminanty byly odstraněny pomocí dělící kolony BioRad P2. Podíl z P2 kolony poskytl homogenní sloučeninu po projití kolonou s vysokým rozlišením, obsahující SP HPLC kationtoměnič. Kontaminující sůl byla odstraněna opakovanou lyofilisací.
Účinnost byla monitorována pomoci mikrobioassaye se Spodoptera exigua a čistota se určovala kapilární elektroforesou. Vzorek, sestávající z 50 μΐ la a 50 μΐ proteinu CrylA(c) (15 pg/ml) , přečištěný z BIOBITu™ FC (100 μΐ) byl přidáván do individuálních nádobek v želatinovém tácku obsahujících 500 μΐ ztužené umělé hmyzí potravy. Tácky obsahující různé vzorky byly vysušeny na vzduchu. Do nádobek obsahujících vysušený vzorek byly přidány dvě až čtyři Spodoptera exigua v druhém nebo časném třetím vývojovém stadiu. Nádobky byly zataveny do plastikového sáčku s dí ram-i a inkubovány při 30 C 2 až 3 dny. Potom byl zaznamenán stupeň zakrnění a úmrtnosti. Pro každý vzorek bylo běžně provedeno 5 replik.
2. Stanovení struktury
Účinná sloučenina je ve vodě rozpustná a nerozpustná je v organických rozpouštědlech. Má positvní náboj a reaguje s ninhydrinem, jak to bylo prokázáno chromatografií na tenké vrstvě, na silikagelu. a NMR spektra sloučeniny jsou na obrázku 2 respektive 3. NMR experimenty vyjevily přítomnost 13 uhlíků (vztaženo k 3-[trimethylsilyl]propionové kyselině jako standardu). DEPT experiment určil přítomnost tří kvarterních uhlíků (C), sedmi methinových skupin (CH), tří methylenových (CH2) a nepřítomnost methylové skupiny (CH3). Pomocí couplingu protonů jako je 1-D decoupling a COSY byl identifikován rozsáhlý spinový systém osmi uhlíků. Vedle toho je přítomen menší spinový systém dvou uhlíků. Korelační experiment uhlík - proton (HMBC) umožnil přiřazení resonance každého protonu v molekule k uhlíku, na který je vázán.
Reakce účinné sloučeniny (13 mg) s acetanhydridem v pyridinu poskytla acetylderivát, který je mnohem méně polární. Tento derivát byl čištěn pomocí HLPC a poskytl 3 mg čistého acetylderivátu. Hmotnostní spektroskopie ukázala, že derivát má 7 acetylových skupin a molekulární hmotnost 690, což pro účinnou sloučeninu dává molekulovou hmotnost 396 a indikuje, že je přítomen sudý počet dusíkových atomů. Byly také detegovány fragmenty se 6 a 5 acetyly. Data z vysokého rozlišení pro dceřinné ionty s 5 a 6 acetyly jsou 645,2594 (6 acetylů) a 607,2519 (5 acetylů), což značí, že molekulový vzorec pro la je C-^2H2gNgOg.
Působení 6 N HC1 na aktivní sloučeninu (13 mg) poskytlo derivát, který je positivní na ninhydrin. Tyto výsledky udávají přítomnost amidových vazeb. Tento derivát má stejnou hodnotu Rf jaká byla chromatografií na tenké vrstvě stanovena pro 2,3-diaminopropionovou kyselinu. To spolu s NMR daty udává přítomnost 2,3-diaminopropionové kyseliny.
Další technika, která byla využita pro analýzu la, je NOE (Nucleár-ní Overhauser-ův Efekt), který umožňuje určit jak blízko v prostoru má jeden proton ke druhému. NOE byl proveden na acetylovaném la. Ve dvojrozměrném NOE experimentu (NOESY), byl NOE pozorován mezi N-H protonem s δ 8,06 ppm a protonem s δ 5,17 (Obrázek 4).
Pro la byla stanovena následující struktura:
OH NH~ NH~
I I I
H9NCO-NH-CH9-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH9-CH-CH-CH9-OH
I III 2
CONH2 OH OH OH
Lze ji označit jako ureidoamid. Jejími konstituenty jsou dvě amidové skupiny, močovina, dvě aminoskupiny a pět hydroxyskupin. Má sedm chirálních center.
3. Vlastnosti la
Zjistilo se, že isolovaný la znásobuje účinnost krystalického delta-endotoxinu pesticidních proteinů Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki a Bacillu thuringiensis subsp. aizawai vůči Spodoptera exigua bez ohledu na formu pesticidních proteinů. Pesticidní účinnost se potencuje jak u formulací Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, tak u isolovaných krystalů i u CrylA proteinů nezkrácených (molekulární hmotnost 130 kDa) či zkrácených (- 65 kDa molekulární hmotnosti). Účinnosti inklusí CrylI a CrylC se rovněž znásobují. Zjistilo se také, že je potencována účinnost individuálních zkrácených proteinů Cryla (a), (b) a (c). Nezjistilo se, že by pro bioaktivitu byla kritická inkubační doba la s Cry proteinem. Avšak samotný la je inaktivní. Bylo nalezeno, že úroveň potencování je 100 až 200 násobná pro zkrácené CrylA proteiny, CryII a CrylC inkluse a přibližně 320-ti násobná pro CrylA (c) plné délky (viz Tabulka I respektive II). Konkrétně, jestliže se použije la, způsobí 0,75 pg/ml CrylA (c) stejný poměr mortalita/zakrnění hmyzu jako 240 gg/ml samotného CrylA (c). V případě zkráceného CrylA (c) 0,0006 θϋ280 poskytly v kombinaci s la stejné skoré v zakrnění jako stejný vzorek Cryla (c) testovaný sám s 0,075 OD280. Inkluse CrylI při koncentraci 0,6 pg/ml daly v kombinaci s la stejné skoré v zakrnění a podobnou mortalitu jako 75 pg/ml samotného CryII proteinu, což je 125ti násobná potenciace. Inkluse CrylC, při 0,3 gg/ml s přidáním la vykázaly podobnou mortalitu a skoré zakrněni jako 75 pg/ml CrylC protein samotný, což odpovídá 250ti násobné úrovni potenciace. Koncentrace proteinu CrylA, která způsobovala zakrnění, po přidání la vykázala mortalitu.
Zjistilo se, že la je stálý po pětiminutovém varu, ale při autoklávování (>190 C) veškerou aktivitu ztrácí. Dále je stálý, je-li vystaven po dobu nejméně 10 hodin přímému slunečnímu světlu. la je stálý 3 dny při pH 2, ale nestálý při pH 12. Bylo zjištěno, že veškerou aktivitu ztrácí, je-li vystaven působení kyseliny jodisté nebo koncentrované kyseliny solné.
Tabulka I
POTENCIAČNÍ EFEKTY la U ČIŠTĚNÉHO ZKRÁCENÉHO PROTEINU B.t.
Protein B. thuringiensis Spodoptera exigua
Typ OD 280 la Mortalita1 Skoré zakrnění^
Cryla (a) 0,055 - 0/52,2
0,040 - 0/52,2
0,020 - 0/52,0
0,020 + 2/50,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 0/5 0,0
0,0025 + 0/5 0,4
0,0012 + 0/5 1,8
0,0006 + 0/5 1,6
CrylA (c) 0,075 - 0/5 3,4
0,040 - 0/5 2,6
0,020 - 0/5 2,8
0,020 + 1/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 1/5 0,0
0,0025 + 2/5 2,0
0,0012 + 0/5 1,0
0,0006 + 1/5 1,0
Žádný NA + 0/5 4,0
Žádný NA - 0/5 4,0
^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech ^Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioessaye: 4,0 = neošetřená kontrola, 3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.
Tabulka II POTENCIAČNÍ EFEKTY la U PROTEINU B. THURINGIENSIS
Protein B. thuringiensis Spodoptera exigua
Typ pg/ml la Mortalita^- 9 Skoré zakrněni
Cryla (c) 240 - 1/5 0,5
120 - 0/5 2,2
60 0/5 2,2
30 - 0/5 4,0
60 + 5/5 —
30 + 5/5 —
15 + 4/5 0,0
3 + 4/5 1,0
0,8 + 2/5 1,6
Cry II 300 - 1/5 0,8
150 - 2/5 0,7
75 - 1/5 0,2
38 - 0/5 0,8
19 - 0/5 1,6
9 5 38 19 9 5 2,4 1,2 0,6 + + + + + + + 0/5 1/5 3/5 2/5 3/5 1/5 1/5 3/5 2/5 1,8 4,0 1,0 0,5 0,0 0,5 0,0 0,5 0,3
Cry II 300 - 2/5 0,3
150 - 2/5 0,0
75 - 1/5 0,8
38 - 0/5 3,2
38 + 5/5 —
19 + 5/5 —
9 + 5/5 —
5 + 4/5 0,0
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 5/5 —
0,6 + 3/5 1,5
0,3 + 2/5 1,3
Žádný NA - 0/5 4,0
Žádný NA + 0/5 4,0
^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech
^Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých
hmyzích larev na konci bioessaye : 4,0 = neošetřená kontrola,
3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 %
velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti
neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost
od začátku experimentu.
4. Zhodnocení dalších subspecies Bacillu thuringiensis a dalších species druhu Bacillus
Některé Bacillus species byly hodnoceny z hlediska tvorby la. Kmeny byly fermentovány 72 hodin při 30 C v prostředí, které obsahovalo zdroj uhlíku jako škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosu a zdroj dusíku jako protein, hydrolysát proteinu nebo výluh z obilí. Kapaliny nad živnou půdou byly na tvorbu la testovány pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua, jak je shora popsáno. Bylo zjištěno, že Bacillus thuringiensis subsp. aizawai druh EMCC0087 (uložený v NRRL jako NRRL B-21148) a Bacillus thuringiensis subsp. galleriae (uložený v NRRL), produkují la přibližně ve stejné koncentraci jako Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
la produkuje také B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis subsp. alesti, B. t. subsp. canadiensis, B. t. subsp. darmstadiensis, B. t. subsp. dendrolimus, B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. f i nitimus, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis a B. thuringiensis subsp. kurstaki cry- spo- mutant jak bylo stanoveno kapilární elektroforesou.
Pro kvantifikaci hodnot la byl použit Beckman P/ACE systém kapilární elektroforesy, opatřený neplněnou kapilárou 50 gm x 57 cm, 0,2 M fosfátový pufr o pH 6,8, při napětí 15 kV a detekci při 200 nm. Objemy vzorků jsou 20 nl a doba stanovení 25 minut.
Standardní křivka byla vytvořena za použití čištěného la jako standardu při hodnotách 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml a 0,078 mg/ml. Vznikla lineární kalibrační křivka. Výsledkem rovnice y = mx + b se určovala koncentrace la v každém vzorku.
Před každým stanovením se kapilára po dobu 3 minut proplachovala proudem pufru (0,2 M fosfát, pH 6,8). Po každém 25 minutovém stanovení se kapilára proplachovala 1 minutu 1 N NaOH, 1 minutu filtrovanou vodou pro HPLC, 3 minuty 0,5 M kyselinou fosforečnou a 1 minutu filtrovanou vodou pro HLPC. Integrací plochy pod každým peakem byla určena její velikost akonečná koncentrace byla vypočtena na základě standardní křivky.
5. Hodnocení komerčních produktů B. thuringiensis
Množství la přítomného v různých komerčně dostupných produktech B. thuringiensis se určovalo kapilární elektroforesou, která je popsána svrchu v odstavci 4. BACTOSPEINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ a BIOBIT™ byly získány od Novo Nordisk A/S. XENTARI™ a DIPEL™ byly získány od Abbott Laboratories. AGREE™ pocházel od Ciba-Geigy, MVP™ dodával Mycogen a CUTLASS™ byl získán od firmy Ecogen.
Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce III a ukazují, že la je přítomen v různém množství v rozmezí od méně než 0,001 g la/BIU až do 0,071 g la/BIU.
Tabulka III la V KOMERČNÍCH PRODUKTECH BACILLUS THURINGIENSIS
Produkt Typ Šarže č. Potence la g/BIU
JAVELIN™ VG Btk 99942281 32000 lU/mg 0,071
XENTARI™ Bta 58715PG 15000 lU/mg 0,06
AGREE™ Bta/Btk RA208004 25000 lU/mg 0,033
BIOBIT™ HPVP Btk 5012 48950 U/mgPIA 0,018
BIOBIT™ FC Btk AG46669071 8 BIU/1 0,013
FORAY™ 48B Btk BBN7018 12,6 BIU/1 0,012
DIPEL™ Btk 58739PG 32 000 lU/mg 0,011
FORAY™ 76B Btk 20,0 BIU/1 0,007
BACTOSPEINE™ Btk B0B001 123653 lU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk KX02A 100 000 lU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk VP 16 000 lU/mg < 0,001
NOVODOR™ Btt 9024 16,3 milionů LTU/qt 9,5 x 10-9 g/LTU
FLORBAC™ Bta 082-31-1 30 000 U/mg E < 0,001
SPHERIMOS™ B. sphr BSN006 žádný
MVP™ Btk 21193542 žádný
CUTLASS™ Btk/Btk žádný
BACTIMOS™ Bti BIB0024 11 700 lU/mg žádný
6. Bíoassaye s přidávanou výživou
Účinnost B. t. k. se stanovovala bioassayem s přidáváním umělé výživy pro larvy třetího stadia vývoje Spodoptera exigua, druhého stadia larev Helikoverpa zea, třetího stadia larev Spodoptera frugiperda, druhého stadia larev Heliothis virescens, třetího stadia larev Trichoplusia ni, třetího stadia larev Pseudoplusia includens, třetího stadia larev Plutella xylostella, třetího stadia larev Spodoptera littoralis a třetího stadia larev Mamestra brassicae.
Bíoassaye s přidávánou výživou se prováděly ke zjištění úrovně potenciace po přidání la ke komerčním produktům B. thuringiensis a stanovení rozsahu působení na hmyz. V experimentech s vysokými koncentracemi la vůči Spodoptera exigua (7,4 - 23,7 g la/BIU), byl k potenciaci BIOBITu™ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) použit čištěný la (70 % aktivní složky, 30 % neutralisačního acetátového iontu). Získaná, v tabulce IV uvedená, data ukazují potenciaci BIOBITu™ HPVP (HPVP = smáčitelný prach s vysokou účinností) pomocí la (0,658 % aktivní složky). S. littoralis a M. brassicae byly testovány FLORBACem™ HPVP a la.
Byly navažovány různé komerční produkty B. thuringiensis a byl k nim přidán la, aby vzniklo 0,1 až 237 g la/BIU. Objem TM byl adjustován s 0,1 % Tween . Vzorky byly na 1 minutu vystaveny ultrazvuku a pak zředěny na konečný obj em. Byly připraveny také čisté vzorky (bez la) a referenční látky. Referenční látky představují B. t. k. HD-1S-1980 (získaný od NRRRL), u něhož se udává síla 16 000 mezinárodních jednotek ’T'lVf (IU) na miligram a JAVELIN1 , jemuž se přisuzuje sila 53 000 Spodoptera jednotek/mg (SU).
Standardní umělá výživa složená z vody, agaru, cukru, kaseinu, pšeničných klíčků, methyl parabenu (= methyl 4-hydroxybenzoát), sorbové kyseliny, lněného oleje, celulosy, solí a vitaminů se připravovala ve 20 1, vyhřívaném kotli. To poskytlo dostatek výživy pro testování 10 až 12 vzorků se sedmi různými koncentracemi pro každou testovanou látku. Roztoky B.t. byly sériově zředěny na alikvotní podíly o 16 ml. Každý alikvot byl přidán ke 184 g roztavené výživy. Následně se směs homogenisovala a nalila na plastikový tác obsahující 40 jednotlivých buněk. Pro každou násadu výživy byly připraveny tři kontrolní tácy. Na to byla potrava ochlazena a ztužena, do každé buňky byl přidán hmyz určitého stáří (druhé až třetí vývojové stadium) a tácy byly pokryty perforovanou folii průhledného plastu. Tácy byly umístěny do polic a čtyři dny podrobeny inkubaci při 28 C a 65 %-ní relativní vlhkosti.
Po čtyřech dnech byla spočítána mortalita hmyzu. Na vrch každého tácu bylo zamířeno prudké fouknutí a larvy, které se nehýbaly, byly počítány jako mrtvé. Byla vypočtena procenta mortality a data byla analyzována pomocí paralelních kontrolních analýz. Byly stanoveny LC$q, LC$q, směrnice regresních přímek, koeficient odchylek a potence. Stanovení vzorků se provádělo nejméně třikrát, nebo dokud tři potence nebyly mezi 20 % kolem vypočteného průměru pro každý vzorek. Pro výpočet vzrůstu aktivity spojené s každou koncentrací la, byla provedena korekce LC50 poměru jB.t./Ia ve vzorku tak, aby odpovídal množství B.t. ve vzorku. LC50 párových čistých vzorků se vydělily korigovanými LC$q hodnotami a tak se získal násobek snížení LC$q spojený s la.
Pro essay na Lobesia bothrana byl použit následující postup. Vinné hrozny napadené od Lobesia bothrana byly shromážděny na nepostříkaném poli a odstranily se larvy. Byla připravena serie ředění la ve vodě (250 gg/ml, 500 gg/ml a 1000 pg/ml). Doprostřed petri misky se umístila jedna larva. Jakmile se zpozorovalo, že larva pije, byla přemístěna do petri misky s čersvě utrženými bobulemi hroznů. Larvy byly uchovávány při 22C, 3 - 4 dny.
Jak ukazuje tabulka IV u všech případů bylo zaznamenáno signifikantní snížení LC^q
Tabulka IV
BIOASSAYE S PŘIDÁVANOU VÝŽIVOU
Hmyz g la na BIU Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC$q
Spodoptera exigua 0,1 1,5
(BIOBIT™ HPVP) 0,2 1,7
2,0 4,3
4,0 7,5
Spodoptera exigua 7,4 13
(BIOBIT™ FC) 15 26
30 34
118 59
237 79
Spodoptera frugiperda 0,2 2,2
(BIOBIT™ HPVP) 0,8 3,9
2,0 7,2
4,0 11,6
Trichoplusia ni (BIOBIT™ HPVP) 0,1 0,2 1,1 1,2
2,0 2,0
4,0 3,1
Pseudoplusia includens (BIOBIT™ HPVP) Η M O O H O N>
0,8 2,1
2,0 2,4
4,0 3,4
Plutellaxylostella 0,2 1,6
(BIOBIT™ HPVP) 0,8 1,3
2,0 1,4
4,0 1,9
Helicoverpa zea (BIOBIT™ HPVP) 3,2 12,6
Heliothis virescens (BIOBIT™ HPVP) 3,2 4,2
Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPVP) 2,0 3,0
Spodoptera littoralis (FLORBAC™ HPVP) 2,0 8,6
Mamestra brassicae (FLORBAC™ HPVP) 2,0 4,9
Potenciace různých komerčních produktů na Spodoptera exigua pomocí la byla určována, jak popsáno svrchu, bioassayem s přidávánou výživou. Množství přidaného la na BIU komerčního produktu j sou uvedena níže, v tabulce V. Směs la/vzorek produktu B.t. byl přidán do výživy obsahující kasein pšeničných klíčků na agaru. Hmyz byl k výživě umístěn na čtyři dny a udržován při 28 C. Mortalita byla zaznamenávána a analyzována průběžně. LC^q, LC^q a potence byly vypočítávány z paralelních vzorků, které la neobsahovaly. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce V, ukazují, že la potencuje rozdílné produkty B.t.k. a B.t.a. pocházející z různých zdrojů. Druhy B. thuringiensis obsažené v těchto vzorcích, jsou popsány svrchu v oddíle 5.2.
I----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------( | Tabulka V | | POTENCIACE PRODUKTŮ B. thuringiensis NA Spodoptera exigua |
Produkt g la na BIU Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC$q
BACTOSPEINE™ VP 0,4 1,04
1,7 2,3
CONDOR™ 0,4 1,7 2,4 5,1
AGREE™ 0,4 1,1
1,7 1,6
CUTLASS™ 0,4 1,1
1,7 2,5
MVP™ 0,4 6,0
1,7 7,7
2,0 12,1
FLORBAC™ HPVP 0,2 1,1
0,8 2,0
DI PEL™ 2X 0,2 1,2
0,8 2,3
2,0 OS m
JAVELIN™ VG 0,2 0
0,8 1,08
2,0 2,9
XENTARI™ 0,2 1,2
0,8 1,6
2,0 2,4
7. Bioassaye na list
Bioassaye na list se prováděly s larvami Spodoptera
TM exigua ve druhém stadiu na brokolicích a použit byl BIOBIT FC a la. Poměr la k BIOBITu™ FC byl 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Brokolice byly ošetřeny pomocí pojízdného ostřikovače a objem s nosičem byl 225 1/ha (20 gal/akr). Když postřik na listech uschl, byly listy z rostlin otrhány a zamořeny larvami Spodoptera exigua druhého stadia. Níže, v tabulce VI, jsou uvedeny výsledky. 100 %ni mortalita byla zaznamenána při dávce BIOBITu™ FC + la 8,7 BIU/ha, zatímco samotný BIOBIT™ FC usmrtil 92 % larev při 58,8 BIU/ha a 8 % při 17,6 BIU/ha. Ošetřené rostliny byly také na osm hodin vystaveny přímému slunečnímu záření a pak byly listy otrhány a zamořeny. Po osmi hodinách na slunečním světle vykázal samotný BIOLIT FC
TM při 58,8 BIU/ha mortalitu 27 %, zatímco BIOBIT FC + la vykázal 100 % mortality pri 8,7 BIU/ha.
Při pokusech na list prováděných s larvami časného čtvrtého stadia vykázal samotný BIOBIT™ FC 75 % mortality při 52 BIU/ha a BIOBIT™ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) spolu s la vykázal 100 % mortality při 13 BIU/ha.
Tabulka VI BIOASSAYE NA LIST
Ošetření BIU/ha mortalita % larvární stadium
BIOBIT™ FC 58,8 92 2
BIOBIT™ FC 17,6 8 2
BIOBIT™ FC + la 8,7 100 2
BIOBIT™ FC + sluneční
záření 8 hodin 58,8 27 2
BIOBIT™ FC + la +
sluneční záření 8 hodin 8,7 100 2
BIOBIT™ FC 52 75 4
BIOBIT™ FC + la 13 100 4
8. Polní pokusy
Polní pokusy na cizrně (Spodoptera exigua) ukázaly, že výsledek u samotného BIOBITu^^ FC při 70 BIU/ha byl 51 %, zatímco 2 g la/BIU BIOBIT™ FC při 40 BIU/ha vykázaly 89 % (vztaženo na neošetřený případ). JAVELIN™ VG při 45 BIU/ha vykázal 51 %.
Polní pokusy na kukuřici cukrové (Spodoptera frugiperda) ukázaly, že s 2 g la/BIU BIOBIT™ FC při 39,5 BIU/ha je výsledek 84 %.
9. Stupně resistence
Bioassaye byly uskutečněny s koloniemi citlivé a resistentní Plutella xylostella. Resistentní můry byly z pole sesbírané vzorky z Floridy, u nichž se vyvinula resistence vůči B. t. po intensivní exposici na JAVELIN™ VG. Analýzy byly prováděny s BIOBITem™ HPVP a la při bioassay s namáčením listu. Resistence vůči JAVELIN™ a XENTARI™ byly zjišťovány bez la. Disk ze zelného listu o průměru sesti cm byl na 10 sekund ponořen do jedné z osmi různých koncentrací vzorků B. t. nebo formulací B. t./la. Rozsah koncentrací byl od 1 ppm do 1000 ppm. Disky listů byly dvě hodiny sušeny na vzduchu a umístěny do plastikových petri misek s larvami (0,2 až 0,4 mg) druhého stadia. Dávka dvacetipěti kusu hmyzu/den byla opakována dvakrát, aby bylo dosaženo dávky 50 kusů. Mortalita se zaznamenávala po 72 hodinách při 27 C. Regrese mortality u dávky se analyzovala průběžně. Stupně resistence byly vypočítány dělením hodnot LC50 a LC9Q citlivých můr. Výsledky jsou v tabulce VII a ukazují, ze BIOBIT™ HPVP potencuje při 2 g la/BIU a 4 g la/BIU. Konkrétně při 4 g la/BIU je dvojnásobné snížení stupně resistence LC50 a desetinásobné snížení stupně resistence LC90·
Tabulka VII
STUPNĚ RESISTENCE Plutella xylostella (B.t.k. resistentní)
Testovaný vzorek lc50 rr lc90 rr
JAVELIN™ VG 302,6 3829,7
BIOBIT™ HPVP 20,5 98,5
2 g la/BIU BIOBIT™ HPVP 23,2 88,0
4 g la/BIU BIOBIT™ HPVP 10,4 11,5
XENTARI™ 9,7 8,2
10. Mutanty
10.1. Kmen
Byl použit kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (NRRL B-21147), Septoria nodorum (A04119) a Alternaria alternata (druh 6, IM-SMP).
10.2. Assay inhibice fungálniho růstu
Mutanty druhu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, které produkuji faktor, byly identifikovány za použití plísňových agarových ploten se Septoria nodorum a Alternaria alternata. Faktor inhibuje růst obou plísní.
Tyto dvě plísně rostly na PDA (agar bramborové dextrosy) plotnách při 26 C 10 - 14 dní dokud nebylo získáno dostatečné množství spor. Inkubace Alternaria alternata se prováděla při alternujícím UV zářením a tmou (každé 12 hodin). Spory byly z ploten odstraněny a suspendovány ve sterilní vodě. Spory Septoria nodorum byly filtrovány sterilním G1 filtrem. Koncentrace spor Alternaria alternata byla adjustována na přibližně 2 x 105 v ml a koncentrace spor Septoria nodorum byla adjustována přibližně na 2 x 106 v ml pomocí Burkeřová-Turkova nebo Fuchsova-Rosenthalova počitadla. Vzorky 1,5 ml suspense spor byly pak smíseny s 1,5 ml sterilního 40 % glycerolu ve vodě, zmrazený 1 den na -20 C a potom, až do použití, uchovávány při -80 C.
Plotny pro testování faktoru se připravovaly smísením 1,5 ml vzorku spor (jak je nahoře popsáno) při 46 C se 115 ml antibiotického agarového media č.2 (25,5 g na litr), obsahujícího streptomycin v konečné koncentraci 100 pg na ml a přenesením směsi na sterilní plastikové desky (Nunc č. 101875). Když agar ztuhl, byly do něj udělány mm vpichy (120 děr na desku).
Vzorky kultury byly sériově zředěny 100 pg streptomycinu na ml sterilní vody a 10 μΐ zředěných vzorků bylo rozděleno na plotny připravené, jak je shora popsáno. Plotny byly při 26 C inkubovány 2 dny. Jako positivní kontrola se provádělo také ředění faktoru.
Citlivost assaye inhibice fungálního růstu leží v rozmezí 0,05 g faktoru na litr (stěží viditelné) a 0,1 g faktoru na litr (čistá zona) pro obě plísně.
10.3. Stanovení faktoru kapilární zonovou elektroforesou
Před analýzou byly ze vzorku živné směsi celé kultury odstraněny centrifugováním, a/nebo filtrací nylonovým membránovým filtrem 0,2 gm, buňky a jiné nerozpustné částice. Množství faktoru se stanovovalo pomocí Beckman P/AC systému kapilární elektroforesy, opatřeného nepotahovanou kapilárou 50 gm x 47 cm, s použitím pufru sestávajícího z 0,1 M fosfátu o pH 6,6, napětí bylo 15 kV a detekce při 200 nm. Před každým stanovením byla kapilára promyta 2 minuty proudem pufru. Objem násady vzorku byl 20 nl.
Časový průběh analýzy byl 12 minut a eluace faktoru trvala přibližně 8,5 minuty. Koncentrace faktoru byla určena relativně vůči standardní křivce čisté sloučeniny.
Mezi každým 12 minutovým cyklem byla kapilára postupně propláchnuta 0,5 minuty 1 N hydroxidem sodným, 0,5 minuty 0,1 N hydroxidem sodným, 0,5 minuty vodou pro HPLC a 0,5 minuty 1,5 M kyselinou fosforečnou.
10.4. Mutagenese kmene B. thuringiensis subsp. kurstaki
Spory Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki byly nejdříve ozářeny gamma-paprsky dávkou 700 krad. Ozářené spory byly sériově naředěny, rozprostřeny na TY agarové plotny a podrobeny 2 dny inkubaci pri 30 C. Osmdesát z takto ošetřených mutantů bylo čištěno naproužkováním jednotlivých kolonií na TY agarové plotny a potom přeneseno do 500 ml třepacích nádobek obsahujících 100 ml media o následujícím složení:
obilní výluh maltodextrin protein z brambor kh2po4 k2hpo4 15 g/1 40 g/1 30 g/1 1,77 g/1 4,53 g/1
Třepací nádobky se inkubovaly při 30 C, 250 ot./min 3 dny.
Z každé kultury v třepací nádobce byly denně odebírány 5 ml vzorky a buňky byly peletisovány centrifugováním. Kapaliny nad kulturami byly 2 - 10 krát zředěny deionisovanou vodou se streptomycinem o koncentraci 0,1 mg na ml a potom testovány na antifungální účinnost jak se popisuje v odstavci 8.2. Vzorky kultur těch mutantů, které vykázaly největší inhibici fungálního růstu, byly pak kapilární zonovou elektroforesou, jak popsáno v odstavci 8.3., analyzovaný na množství faktoru. Nej produktivnější mutant z první mutace je
NBB-76.
NBB-76, mutant první generace, byl potom podroben druhé mutaci za použití N,N -dinitro-N -nitrosoguanidinu (NTG). V daném případě byl druh mutantu kultivován přes noc při 30 C, 240 οΐ./min, v 500 ml třepací nádobce obsahující 100 ml TY živné půdy o následujícím složení a adjustované před autoklávováním na pH 7,3:
trypton 20 g/1
extrakt z droždí 5 g/1
FeCl2.4 H20 6 mg/1
MnCl2.4 H20 1 mg/1
MgSO4.7 H20 15 mg/1
• « *
Po noční kultivaci byla kultura 100 krát zředěna do nové třepací nádoby s TY živnou půdou a kultivována při 30 C, 240 ot./min, dokud kultura nedosáhla logaritmický růst (přibližně 4 hodiny). Z třepací nádobky byl odebrán 10 ml vzorek kultury a filtrován pomocí filtrační jednotky Nalgene 0,45 μιη. Buňky z filtru byly znovu suspendovány v 10 ml TM pufru obsahujícího 100 ^g NTG na ml. TM pufr se skládá z 6,05 g Tris a 5,08 g maleinové kyseliny na litr deionisované vody a je hydroxidem sodným adjustován na pH 6. Suspense buněk byla podrobena 30 minut inkubaci při 37 C a potom připojena na zdroj vakua, aby se z buněk odstranil NTG. Dříve než byly buňky znovu suspendovány v 10 ml M9 pufru, byly dvakrát promyty 20 ml M9 pufru, potom byly sériově zředěny, rozprostřeny na TY agarové plotny a 2 dny při 30 C byly inkubovány. Pufr M9 se skládá z 8,78 g Na2HPO4.2 H20, 3 g KH2PO4, 4 g NaCl a 0,2 g MgSO4.7 H20 na litr deionisované vody. Mutanty byly isolovány a testovány jak popsaáno svrchu. Nej produktivnější mutant získaný z druhého kola mutace je EMCC0130.
EMCC0130, mutant druhé generace, byl potom podroben třetí mutaci za použití NTG, jak je nahoře popsáno. Nej produktivnější mutant získaný z třetího kola mutace je NBC-217.
Jak popsáno nahoře, byl i mutant třetí generace, NBC-217 za použití NTG podroben čtvrté mutaci. Nejproduktivnější mutant ze čtvrtého kola mutace je EMCC0129.
10.5. Produkce faktoru mutanty a mateřskými kmeny
Mutanty EMCC0130, NBC-217 a EMCC0129 a mateřské kmeny Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 byly pěstovány ve 250 ml třepacích nádobkách, které obsahovaly 50 ml media složeného z následuj ícich komponent, doplněných stopovými kovy o 0,2 ml na litr a potom, před sterilizací, adjustovaného H3PO4 na pH 7:
hydrolyzovaný rostlinný protein 30g/1 hydrolyzovaný škrob 40g/1 k2hpo4 5g/
MgSO4 °’3 g/1
Kultury v třepacich nádobkách byly inkubovány při 30 C a 250 ot./min, po 3 dny.
Kvantitativní analýza faktoru produkovaného mutanty a mateřskými druhy byla provedena kapilární zonovou analýzou, jak je popsáno v odstavci 8.3. Kvantitativní analýza ukazuje, že mutant EMCC0129 produkuje přibližně 0,9 g faktoru na litr živné kultury po třech dnech v třepacich nádobkách, zatímco mateřský druh produkuje přibližně 0,15 g na litr. Mutant EMCC0129 dává zhruba šestkrát více faktoru než mateřský kmen.
PRODUKCE FAKTORU Tabulka VIII MUTANTY Bacillu thuringiensis kurstaki subsp.
Mutant Faktor (g/1)
Mateřský kmen 0,15
EMCC0130 0,65
NBC-217 0,65
EMCC0129 0,75 —
Vynález zde popsaný a nárokovaný není ve svém rozsahu omezen na provedení zde uvadena, protože tato provedeni jsou zamýšlena jako ilustrace některých aspektu vynalezu. Jakákoliv ekvivalentní provedení je třeba považovat za jsoucí v rozsahu tohoto vynálezu. Ve skutečnosti různé modifikace vynálezu, spolu se zde ukázanými a popsanými, se stanou z předcházejícího popisu zřejmými pro ty, kteří mají zkušenosti v oboru. Takové modifikace jsou také považovány za spadající do rozsahu připojených nároků.
Jsou zde citovány různé reference, jejichž obsahy jsou vtěleny odkazem v jejich celistvostech.
Uložení mikroorganismů
Následující kmeny Bacillu thuringiensis byly podle Budapešťské dohody uloženy v Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.
Přírůstkové číslo _ Datum uložení
EMCC0086 NRRL B-21147 6. října 1993
EMCC0129 NRRL B-21445 23. května 1995
EMCC0130 NRRL B-21444 23. května 1995
Kmeny byly deponovány za podmínek, které zaručuj í, že
přístup ke kultuře bude dosažitelný během řízení o teto patentové přihlášce tomu, koho určí Commissioner of Patents and Trademarks (předseda úřadu pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn pod 37 C.F.R. 1.14 a U.S.C. 122. Uložený vzorek představuje podstatně čistou kulturu každého deponovaného druhu. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Avšak je třeba rozumět, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mutant kmene Bacillus produkující faktor, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, kde množství faktoru produkovaného mutantem je větší, než množství faktoru produkované odpovidajícím mateřským kmenem, přičemž řečený druh Bacillus je volen ze skupiny sestávající z Bacillus licheniformis, Bacillus subtilus a Bacillus thuringiensis.
  2. 2. Mutant podle nároku 1, kde mutant produkuje nejméně kolem dvojnásobného množství faktoru než odpovídající mateřský kmen.
  3. 3. Mutant podle nároku 1, kde faktor má v NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43, 3,58, 3 73· 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny C kolem 31,6; 37,2; 51,1; 53,3; 54,0; 54,4; 61,5; 61,6; 64,1; 65,6; 158,3; 170,7 a 171,3.
  4. 4. Mutant podle nároku 1, kde faktor ma stukturu I
    OH NH9 NH2
    II I
    HoNC0-NH-CH9-CH-NHC0-CH-CH-CH-CH-CH2-CH-CH-CH2-0H 2 I III
    CONH2 OH OH OH (I) nebo je její solí.
  5. 5. Mutant podle nároku 1, kde kmen Bacillus je kmen Bacillus thuringiensis.
  6. 6. Mutant podle nároku 5, kde kmen Bacillus thuringiensis je volen ze skupiny tvořené kmeny Bacillus thuringiensis subsp. atzawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. Indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. Pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.
  7. 7. Mutant podle nároku 5, kde thuringiensis je kmen Bacillus thuringiensis kmen Bacillus subsp. kurstaki.
  8. 8. Mutant podle nároku 1, kde mutant má identifikační charakteristiku EMCC0129, je uložen v NRRL a má přírůstkové číslo NRRL B-wwww anebo má identifikační charakteristiku EMCC0130, je uložen v NRRL a má přírůstkové číslo NRRL B-xxxx.
  9. 9. Mutant podle nároku 1, kde s druhem Bacillus související pesticid zahrnuje delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  10. 10. Mutant podle nároku 9, kde delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment se volí ze skupiny tvořené Cryl, CrylI, CrylII, CryIV, CryV a CryVI.
  11. 11. Mutant podle nároku 10, kde delta-endotoxin Badllus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylA delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  12. 12. Mutant podle nároku 10, kde delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylC delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  13. 13. Mutant podle nároku 1, kde s druhem Bacillus související pesticid zahrnuje sporu druhu Bacillus thuringiensis.
  14. 14. Mutant podle nároku 1, kde se faktor získává (a) pěstováním mutantu kmene Bacillus za vhodných podmínek;
    (b) odebráním supernatantu kultury mutantu ze stupně (a) a (c) isolací faktoru ze supernatantu ze stupně (b).
  15. 15. Mutant podle nároku 14, kde se faktor získává ze supernatantu kultury kmene Bacillus thuringiensis.
  16. 16. Způsob získání mutantu podle nároku 1, vyznačující se t i m , ze zahrnuj e (a) ošetření kmene Bacillus mutagenem;
    (b) pěstování mutovaného kmene Bacillus ze stupně (a) za podmínek vhodných pro selekci mutantu a (c) selekci mutantu ze stupně (b).
  17. 17. Mutant kmene Bacillus, získaný způsobem podle nároku
    16.
    Supernatant ζ fermentace x NB75) centrifugování filtrace 0,2 pm membránou
    Surový supernatant 0,2 um ultrafiltrace na 5 kDa
    Filtrát 5 kPa
    SP kationtoměnič v SP podíl zahuštění lyofilisací gelová filtrace P2
    P2 podíl
    SP HPLC kolona v Podíl z SP HPLC opakovaná lyofilisace
    Čistá sloučenina
    Obrázek 1.
CZ19993625A 1997-04-15 1998-04-02 Indazolamidová sloučenina, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek s jejím obsahem CZ295190B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT97MI000867A IT1291569B1 (it) 1997-04-15 1997-04-15 Indazolammidi come agenti serotoninergici

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ362599A3 true CZ362599A3 (cs) 2000-04-12
CZ295190B6 CZ295190B6 (cs) 2005-06-15

Family

ID=11376888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19993625A CZ295190B6 (cs) 1997-04-15 1998-04-02 Indazolamidová sloučenina, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek s jejím obsahem

Country Status (26)

Country Link
US (1) US6197769B1 (cs)
EP (1) EP0975623B1 (cs)
JP (2) JP4578581B2 (cs)
KR (1) KR100563867B1 (cs)
CN (1) CN1318416C (cs)
AR (1) AR012426A1 (cs)
AT (1) ATE219490T1 (cs)
AU (1) AU740360B2 (cs)
BG (1) BG64006B1 (cs)
CA (1) CA2286870C (cs)
CZ (1) CZ295190B6 (cs)
DE (1) DE69806141T2 (cs)
DK (1) DK0975623T3 (cs)
EA (1) EA002352B1 (cs)
ES (1) ES2178205T3 (cs)
GE (1) GEP20022654B (cs)
HU (1) HU227973B1 (cs)
IL (1) IL132127A (cs)
IT (1) IT1291569B1 (cs)
PL (1) PL193308B1 (cs)
PT (1) PT975623E (cs)
SK (1) SK284731B6 (cs)
TR (1) TR199902546T2 (cs)
UA (1) UA58550C2 (cs)
WO (1) WO1998046589A2 (cs)
ZA (1) ZA982926B (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1291569B1 (it) * 1997-04-15 1999-01-11 Angelini Ricerche Spa Indazolammidi come agenti serotoninergici
MXPA03007621A (es) 2001-02-23 2003-12-04 Merck & Co Inc Antagonistas nr2b de n-metil-d-aspartato no arilheterociclicos n-sustituidos.
EP1390034A4 (en) * 2001-04-03 2005-07-13 Merck & Co Inc N-SUBSTITUTED NONARYL HETEROCYCLO AMIDYL-NMDA / NR2B ANTAGONISTS
ITMI20030287A1 (it) 2003-02-18 2004-08-19 Acraf Indazolammidi dotate di attivita' analgesica metodo, per
ITMI20030972A1 (it) 2003-05-15 2004-11-16 Acraf Indazolo dotato di attivita' analgesica, metodo per prepararlo e composizione farmaceutica che lo comprende.
ITMI20031468A1 (it) * 2003-07-18 2005-01-19 Acraf Farmaco ativo nel dolore neuropatico
TW200533348A (en) * 2004-02-18 2005-10-16 Theravance Inc Indazole-carboxamide compounds as 5-ht4 receptor agonists
US7728006B2 (en) * 2004-04-07 2010-06-01 Theravance, Inc. Quinolinone-carboxamide compounds as 5-HT4 receptor agonists
TWI351282B (en) 2004-04-07 2011-11-01 Theravance Inc Quinolinone-carboxamide compounds as 5-ht4 recepto
US8309575B2 (en) 2004-04-07 2012-11-13 Theravance, Inc. Quinolinone-carboxamide compounds as 5-HT4 receptor agonists
DE602005016446D1 (de) * 2004-11-05 2009-10-15 Theravance Inc 5-HT4-Rezeptoragonistenverbindungen
DE602005014566D1 (de) * 2004-11-05 2009-07-02 Theravance Inc Chinolinon-carboxamid-verbindungen
ATE469897T1 (de) * 2004-12-22 2010-06-15 Theravance Inc Indazolcarbonsäureamidverbindungen
US20060183901A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-17 Theravance, Inc. Crystalline form of an indazole-carboxamide compound
BRPI0608392A2 (pt) * 2005-03-02 2009-12-29 Theravance Inc compostos de quinolinona como agonistas do receptor 5-ht4
ITMI20062230A1 (it) * 2006-11-22 2008-05-23 Acraf Composto 2-alchil-indazolico procedimento per preparalo e composizione farmaceutica che lo comprende
UA99927C2 (uk) * 2007-11-12 2012-10-25 Ацьенде Кимике Риуните Анджелини Франческо А.Чи.Р.А.Ф. С.П.А. Медикамент, який є активним при невропатичному болі
US8377968B2 (en) * 2008-06-02 2013-02-19 Zalicus Pharmaceuticals, Ltd. N-piperidinyl acetamide derivatives as calcium channel blockers
CA2833507A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Indazole- and pyrrolopyridine-derivative and pharmaceutical use thereof
WO2013124169A1 (en) * 2012-02-21 2013-08-29 Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A.C.R.A.F. S.P.A. Use of 1h-indazole-3-carboxamide compounds as glycogen synthase kinase 3 beta inhibitors
EA024939B1 (ru) * 2012-02-21 2016-11-30 Ацьенде Кимике Рьюните Анджелини Франческо А.К.Р.А.Ф. С.П.А. 1h-индазол-3-карбоксамидные соединения в качестве ингибиторов гликогенсинтазы киназы 3-бета
WO2014134306A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 Zalicus Pharmaceuticals, Ltd. Heterocyclic inhibitors of the sodium channel
WO2021007487A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Praxis Precision Medicines, Inc. Formulations of t-type calcium channel modulators and methods of use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9103862D0 (en) * 1991-02-25 1991-04-10 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
NZ243993A (en) * 1991-08-20 1994-10-26 Smithkline Beecham Plc Pharmaceutical compositions having 5-ht4 receptor antagonist activity and selected compounds having such activity
IL117438A (en) * 1995-03-16 2001-12-23 Lilly Co Eli Indazolecarboxamides, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1996038420A1 (en) * 1995-05-31 1996-12-05 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Indazole derivatives having monocyclic amino group
IT1291569B1 (it) * 1997-04-15 1999-01-11 Angelini Ricerche Spa Indazolammidi come agenti serotoninergici

Also Published As

Publication number Publication date
JP5237324B2 (ja) 2013-07-17
EA199900935A1 (ru) 2000-04-24
HK1027811A1 (en) 2001-01-23
SK284731B6 (sk) 2005-10-06
HUP0002057A2 (hu) 2001-04-28
EP0975623B1 (en) 2002-06-19
WO1998046589A2 (en) 1998-10-22
BG64006B1 (bg) 2003-09-30
KR20010006120A (ko) 2001-01-26
HU227973B1 (hu) 2012-07-30
ITMI970867A1 (it) 1998-10-15
DE69806141T2 (de) 2003-01-30
AU740360B2 (en) 2001-11-01
US6197769B1 (en) 2001-03-06
IL132127A (en) 2005-06-19
CA2286870C (en) 2007-05-22
DK0975623T3 (da) 2002-10-14
JP2010195813A (ja) 2010-09-09
EA002352B1 (ru) 2002-04-25
KR100563867B1 (ko) 2006-03-24
IT1291569B1 (it) 1999-01-11
PT975623E (pt) 2002-10-31
AU7215998A (en) 1998-11-11
UA58550C2 (uk) 2003-08-15
SK142399A3 (en) 2000-08-14
EP0975623A2 (en) 2000-02-02
ATE219490T1 (de) 2002-07-15
DE69806141D1 (de) 2002-07-25
PL193308B1 (pl) 2007-01-31
CZ295190B6 (cs) 2005-06-15
WO1998046589A3 (en) 1999-01-28
CN1252798A (zh) 2000-05-10
JP4578581B2 (ja) 2010-11-10
IL132127A0 (en) 2001-03-19
JP2001518906A (ja) 2001-10-16
GEP20022654B (en) 2002-03-25
ES2178205T3 (es) 2002-12-16
CN1318416C (zh) 2007-05-30
AR012426A1 (es) 2000-10-18
PL336348A1 (en) 2000-06-19
CA2286870A1 (en) 1998-10-22
ZA982926B (en) 1998-10-09
TR199902546T2 (xx) 2000-05-22
HUP0002057A3 (en) 2002-01-28
BG103863A (en) 2000-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5237324B2 (ja) セロトニン様作用薬としてのインダゾールアミド化合物
DK3116859T3 (en) HIS UNKNOWN RELATIONSHIPS OF HISTONDEACETYLASE-6 INHIBITORS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS INCLUDING THESE
CN101896459B (zh) 驱肠虫药及其用途
PT1499589E (pt) Derivados de n- fenil ( piperidin-2-il ) metilbenzamida, sua preparação e sua aplicação em terapêutica
SK15852000A3 (sk) Derivát 1-[(1-substituovaného-4-piperidinyl)metyl]-4-piperidínu, spôsob jeho prípravy, farmaceutický prípravok obsahujúci tento derivát a medziprodukt tohto derivátu
CZ350796A3 (en) Piperazine derivatives as 5ht1a antagonists
KR20010053254A (ko) 무스카린성 길항제
US6355642B1 (en) Tetrahydrobenzindole compounds
JP2918508B2 (ja) アゼチジン類
SK286977B6 (sk) Morfolínové deriváty, spôsob ich prípravy a farmaceutické prostriedky obsahujúce tieto zlúčeniny a ich použitie
SK2192002A3 (en) Piperidine alcohol derivative, process for the preparation and use thereof and pharmaceutical composition comprising same
HK1027811B (en) Indazole amide compounds as serotoninergic agents
MXPA99009422A (en) Indazole amide compounds as serotoninergic agents
JPH10182602A (ja) 新規ピロリジノン誘導体
JPH09291090A (ja) ピペリジノンおよびホモピペリジノン誘導体
JPH06166676A (ja) 縮合複素環ケトン誘導体、その製造法、中間体および剤
CZ20003948A3 (cs) Derivát l-[(l-substituovaného-4- piperidinyl)methyl]-4-piperidinu, způsob jeho přípravy, farmaceutický přípravek obsahující tento derivát, a meziprodukt pro tento derivát

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20150402