CZ389997A3 - Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína - Google Patents

Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ389997A3
CZ389997A3 CZ973899A CZ389997A CZ389997A3 CZ 389997 A3 CZ389997 A3 CZ 389997A3 CZ 973899 A CZ973899 A CZ 973899A CZ 389997 A CZ389997 A CZ 389997A CZ 389997 A3 CZ389997 A3 CZ 389997A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
intracellularis
cells
bacteria
culture
infected
Prior art date
Application number
CZ973899A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295933B6 (cs
Inventor
Jeffrey P. Knittel
Michael B. Roof
Original Assignee
Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27041284&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ389997(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/465,337 external-priority patent/US5714375A/en
Application filed by Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc. filed Critical Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc.
Publication of CZ389997A3 publication Critical patent/CZ389997A3/cs
Publication of CZ295933B6 publication Critical patent/CZ295933B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

\ Předkládaný vynález se týká vakcín proti.... -.--Lawsonia intracellularis a způsobu ochrany proti této bakterii a diagnostiky 5 infekce způsobené touto bakterií. Výsledky a způsoby podle vynálezu jsou částečně dosažitelné v důsledku zlepšeného způsobu pro kultivaci L. intracellularis ve velkém měřítku, který byl objeven.
Dosavadní stav techniky io L. intracellularis, příčina prasečí proliferativní enteropatie („PPE“) postihuje ve skutečnosti všechny živočichy včetně člověka, králíků, fretek, křečků, lišek, koní a jiných zvířat i tak rozdílných, jako pštros a emu.
; L. intracellularis je významnou příčinou ztrát při chovu vepřů. Odhady výskytu a nóvýchToněmochěhí- PPE v USA šé .pohybují áž ’ kolem 20 % z chovů vepřů s ročními odhadovanými ztrátami 20 miliónů dolarů.
Shodným rysem PPE je výskyt intracytoplazmatických zakřivených tyčinek nenavázaných na membránu uvnitř enterocytú v postižených částech střeva. Bakterie spojené s PPE byly označovány jako „Campylobacter - podobné organismy“. S. McOrisť a další, Vet. Pathol, díl 26, 260 - 64 (1989). Potom byly bakterie způsobující uvedené onemocnění identifikovány jako nový taxonomický rod a druh, v odborném jazyce označovaný jako lleal symbiont (IS)
2s intracellularis. C. Gebhart a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 43, č. 3, 533 - 38 (1993). V poslední době dostala tato nová bakterie taxonomický název Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 45, č. 4, 820 - 25 (1995). Tyto tři
• · 9 99 9 ·· 9 « 99 99 • · 9 9*9* 99 9 9 * 9 9 · 9 . 9 9 99
999 * * * *999 9
999999 9 9 9
9999 99 99 9999 99 99 názvy byly používány zaměnitelně pro označení stejného organismu, který je zde dále identifikován a popisován. Autoři vynálezu se snažili při diskusi předkládaného vynálezu používat taxonomický název, L. intracellularis.
s L. intracellularis je obligátní intracelulární bakterie, kterou není možno kultivovat normálními bakteriologickými metodami na běžném bezbuněčném médiu a předpokládalo se, že vyžaduje pro růst přichycené epiteliální buňky. S. McOrist a další, Infection and Immuníty, díl 61, č. 10, 4286 - 92 (1993) a G. Lawson a další, J. of io Clinical Micrůbiology, díl 31, č. 5, 1136 - 42 (1993) diskutují kultivaci L. intracellularis s použitím monovrstév krysích střevních epitelíálních buněk IĚC-18 v běžných lahvích pro‘ tkáňové kultury. Dále H. Stills, Infection and Immuníty, díl 59, č.’9, 3227 - 36 (1991) diskutuje použití monovrstév lidských embryonálních střevních buněk Intestine 407 a monovrstév buněk střevního adenokarcinomu morčete GPC-16 v běžných kultivačních tkáňových lahvích. Tyto dosavadní způsoby kultivace jsou náročné na práci a nehodí se pro zvětšování měřítka.
Získání nových informací o infekci Intracellularis-aAéčeni .r ** -.. , . rtf ··· i'< -- M ’ · · fcp. ·.
a účinném omezování onemocnění bylo silně znesnadňováno
2o náročnými růstovými požadavky L. intracellularis v kulturách in vitro. Proto je třeba v současnosti získat zlepšený způsob kultivace L. intracellularis. Je rovněž potřeba získat vakcíny proti L intracellularis a účinné nástroje pro diagnózu infekce L. intracellularis.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnout vakcíny proti L. intracellularis.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsoby detekce přítomnosti protilátek proti L. intracellularis v biologických vzorcích.
«4 4444 i
-3 · 44 44 44 «4 4 44*4 «4*4 * · , 4 4 · 44*4
4*4' 4 4 4 444* *
444**4 4*4 *4*4 44 «4 4**4 44 44
Dalším předmětem je poskytnutí zlepšeného způsobu kultivace, který dovoluje kultivaci L. intracelluiaris ve velkém měřítku pro produkci vakcín a diagnostických prostředků.
Pro dosažení tohoto a dalších cílů a v souladu s účelem s vynálezu jak se zde popisuje, poskytuje předkládaný vynález způsob kultivace L. intracelluiaris a získání velkého množství bakterií tímto způsobem.
Podle tohoto způsobu jsou bakterie L. intracelluiaris inkubovány !v koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně 18 % za míchání io bakterií, přičemž bakterie L. intracelluiaris jsou udržovány mícháním v suspenzi. \ _ .....
. Podle, dalšího, provedení se poskytuje způsob kultivace bakterií L. intracelluiaris inokulací monovrstvy buněk HEp-2, McCoys, nebo ÍEC'18, která je konfluentní z přibližně 30 % inokulem obsahujícím is bakterie L intracelluiaris tak, aby došlo k infekci buněk bakterií.
Infikované buňky se potom inkubují pří teplotě přibližně 36 až přibližně 38 °C při koncentraci kyslíku přibližně 0 % do přibližné 8,0 % až do dosažení- konfluentního nárůstu* buněk,” Infikované*1 buňkya^růstoyé
---···- . « -l il- ‘ “ 't* médium se potom vloží do fermentoru, bioreaktoru, rotační láhve 20 (spinner flask) nebo jiné nádoby vhodné pro udržování buněk v suspenzi. Infikované buňky se pro kultivaci buněk L. intracelluiaris inkubují za míchání buněk při udržování infikovaných buněk v suspenzi. Část kultivovaných bakterií L. intracelluiaris se potom pasážuje do čerstvé kultury pro dosažení zvýšení produkce bakterií L.
r jj '25 intracelluiaris. .
Vynález poskytuje vakcíny proti L intracelluiaris a způsob výroby vakcín proti L. intracelluiaris. Avirulentní bakterie L. intracelluiaris se získá pasážováním kultivované bakterie L. intracelluiaris dostatečným počtem pasáží a selekcí na oslabený kmen nebo vystavení kultivované bakterie působení chemických prostředků pro oslabení. Vakcíny s usmrcenou L. intracelluiaris se
-4·♦ ·#*· »· «· * · · · « φ · • · 9 φ » • . ·ί * b · · • · » b · · *· · · ·» «·φφ«φ • · φ ·
-99 ί» ·< ·♦.[ rovněž připravují s použitím kultivace podle vynálezu. Podle zvláště výhodného provedení se bakterie kontinuálně kultivují alespoň 6 až 8 měsíců při pasážování alespoň 7 až 12 násobném, přičemž se získá oslabený kmen vhodný pro použití jako vakcína. Oslabená bakterie se potom smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem a podává se v účinném množství člověku nebo zvířeti pro vyvolání imunologické odezvy. V současnosti výhodný osiabený kmen (N343NP40wk) byl uložen v American Type Culture Collection.
Vynález také poskytuje způsob stanovení přítomnosti protilátek, io které. specificky reagují s bakterií „L. intracellularis v biologickém vzorku sklizením alespoň části kultivovaných bakterií ' L.Iriířacélluíárišfuvěáeníín biOÍogickéhó*yzůrku žě’živočicha; do styku i se* sklizeným i baktériemi Lf iriťrácelíuiáris nebo jej ich složkami: za podmínek, při kterých protilátka přítomná v biologickém vzorku is reaguje s L. intracellularis nebo její složkou, a určením, zda došlo k reakci protilátka - antigen nebo ne.
’ Další rysy a výhody vynálezu, budou uvedeny v následujícím popíšu a budou zřejmé ž popíšu nebo z přiložených,příkladů
Jak se u používá v předkládané přihlášce, termín „L intracellularis,, znamená intracelylářní zakřivenou gřamnegativní bakterii popisovanou podrobně v; C. Gebhart a další, Inťl, 'J. of Systemic Bacterioiogy, díl 43, č. 3, 533 - 38 (1993) a S, McOrist a další, Inťl. J. of Systemic Bacterioiogy, díl .45, Č. 4, 820 - 25 (1995) ' < -i ·»· a zahrnuje bez omezení bakterií uloženou jako ATCC 55672 '25 v American Type Culture Collection, Rockville, MD; bakterii uloženou jako NCTC 12656 a 12657 v National Collection of Type Cultures,
Colindale, Londýn; bakterii vyvolávající onemocnění, která může být získána z vepřů infikovaných PPE nebo jiných zvířat na celém světě, s použitím znalostí a zkušenosí z oboru a předkládaného vynálezu; a ao varianty nebo mutace jakýchkoli z výše uvedených bakterií, získaných uměle nebo spontánních.
·· 9999 99 99 9« • 9 · 9 9 9 9 9· 9 · \ ·9»*9·4«* » ’ ' , · · i r · · · · · ·’ « · f 99···9 9·»
—. -» 9999 99 « · ···· 9 · f*
- 5 Jak se zde používá, termín „oslabený kmen“ znamená jakýkoliv kmen L. intracellularís, připravený kultivaci podle vynálezu a pasážováním podle vynálezu pro dosažení avirulence při zachování imunogenních vlastností při podávání hostiteli. Jak je uvedeno níže, s postupy podle vynálezu byly kultivovány a oslabeny rozdílné kmeny L intracellularís za získání oslabených imunogenních kmenů účinných jako vakciny u vepřů a jiných zvířat, vnímavých k infekci
L. intracellularís.
Očekává se, že oslabené kmeny podle vynálezu budou použity io jako imunogeny u antimikrobiálních vakcín pro zvířata, včetně ptáků, ryb, dobytka, vepřů, koní, obecně savců a primátů, a člověka. Tyto , vakciny jé1 možno připravit odborníkům v oboru známými metodami , podle v předkládaném vynálezu použitých postupů. Taková, vakčíná by obsahovala imunologicky účinné množství oslabeného kmene1 ve is farmaceuticky přijatelném nosiči. Vakcína by se podávala v jedné nebo několika dávkách. Imunologicky účinné množství je možno bez dalšího experimentování stanovit v oboru známými prostředky a prostředky podle předkládaného vynálezu. Množství avirulentní \ · bakterie’6y mělo být dostatečné pro stimulaci imunologické odpovědi 20 u organismu vnímavého k nemoci a přitom by mělo stále zůstat avirulentní. To bude záviset na konkrétním živočichu, bakterii a léčeném onemocnění. Doporučená dávka pro podávání vnímavému organismu je s výhodou přibližně 103 až 109 bakterií/kg tělesné hmotnosti a s výhodou přibližně 105 až 107 bakterií/kg tělesné hmotnosti. Odborníkům v oboru jsou známy použitelné nosiče, mezi které patří také stabilizátory a ředící látky. Vakcína může obsahovat také vhodné adjuvans. Vakciny podle vynálezu mohou být použity v kombinaci s jinými vakcínami, například jako diluent jiné lyofilizované vakciny, nebo mohou být kombinovány s jinou vakcínou před lyofilizaci. Vakcínové přípravky mohou být také ve vysušeném stavu, například pomocí lyofilizace, a to zejména ze skladovacích důvodů nebo pro další přídavek do kapalných vakcín, • ···
Ον
-6Vynález také zahrnuje způsob indukce imunologické odpovědi vůči virulentnímu standardnímu typu bakterie L. intracellularis u člověka nebo zvířete s cílem dosáhnout ochrany hostitele před touto bakterií. Způsob zahrnuje podávání imunologicky účinného množství oslabené bakterie nebo usmrcené bakterie podle vynálezu hostiteli a s výhodou podávání vakcíny podle vynálezu hostiteli.
Jak se zde používá, termín „kultivace ve velkém měřítku znamená rozsah kultivace L. intracellularis větší než přibližné 2,0 až 3,0 I a zahrnuje produkci v měřítku objemu 100 i nebo více. „Kultivace“ io jak se v předkládané přihlášce používá znamená způsob navození růstu, reprodukce a/nebo proliferace L. intracellularis.
Při provádění kultivačního způsobu podle vynálezu může být ί , nejprve zaočkována kultura buněk inokulem obsahujícím bakteriet L intracellularis tak, aby došlo k infekci buněk bakteriemi. Při provádění > , is vynálezu je možno použit řady buněčných linií včetně bez omezení IEC-18 (ATCC 1589) - buňky krysího střevního epitelu, HEp-2 (ATCC 23) * buňky lidského karcinomu epidemnis, McCoys (ATCC 1696) rnyš^í(nespecifikpyané),.buňky,JtMDCK.,(ATCC.34) ,-.buňky psí-ledviny-,— - . ... . . .. ... - ...... · -sí
Madin-Darby/ BGMK (Biowhittaker # 71-176) - buňky ledviny opice
2o buffalo green monkey a buňky střevního epiteiu prasete. Výhodné buňky tkáňových kultur jsou HEp-2, McCoys nebo IEC-18, Alternativně může být bakterie kultivována v bezbuněčném systému, pokud se bakterie udržují při vhodné koncentraci rozpuštěného kyslíku podle vynálezu.
Jestliže se použije buněčné kultury, buňky kultury jsou před inokulaci s výhodou ve formě monovrstvy, ale nemusí tomu tak být.
Pro vytvoření monovrstvy mohou být buňky vysety do běžných lahví.
Každá láhev je obvykle zaočkována na 25 cm2 láhev počtem buněk v rozmezí mezi přibližně 1 x 10s až přibližně 10 x 10s, smíšeným
3o s růstovým médiem. Růstovým médiem může být jakékoliv médium pro kultivaci buněk, které obsahuje zdroj dusíku, nezbytné růstové faktory
-7• · 9 · · * ·9 · 9 · · ·· • 9 9 9 9 9' 9 9···
9 99 9 9 9 99 • · 9 9 9 99999··
9999·· 9 99 • 999 99 «9 9999-ϊ, 99 99 pro zvolené kultivované buňky a zdroj uhlíku, jako je glukóza nebo laktóza. Výhodné médium je DMEM s 2 - 5 % fetálního bovinního séra, ačkoliv s dobrými výsledky je možno použít i jiných komerčně dostupných médií.
Autory vynálezu bylo zjištěno, že úspěšnost kultivace L.
intracellularis se zvýší udržováním buněk tkáňové kultury v konstantním stádiu růstu. Proto by měla být monovrstva tkáňové kultury v době inokulace ve stavu přibližně 20 % až přibližně 50 % b
| konfluence. S výhodou by v době inokulace měla být buněčná kultura | w ve stavu přibližně 30 % až přibližně 40 % konfluence, přičemž nejvýhodnější je přibližně 30 % konfluence.
ř ’ Inokulem může být čistá kultura L. intracellularis,, získaná například z kmene s depozitním číslem ATCC 44672, NCTC 12656 nebo 12657, nebo ž infikovaných vepřů nebo jiných zvířat s použitím uvedených postupů izolace a purifikace.
Podle jednoho provedení vynálezu je inokulum pro provedení vynálezu střevní homogenizát připravený seškrabáním sliznice střeva
----- ·—·— — - ; vepře/ nebo jiného zvířete ' infikovaného PPE‘.”Při'7přípravě „ · · H' * Η. T · · fc· ·. , intestinálníhó homogenizátu by měly úseky střeva zvolené pro
2o kultivaci vykazovat výrazné změny> s makroskopickým ztluštěním střevní stěny. Pro křehkost bakterií by měly být vzorky skladovány při - 70 °C čo nejdříve po nekropsii. Pro potlačení kontaminujících bakterií při zachování růstu t. intracellularis se s výhodou do inokula přidávají . antibiotika, ke kterým je L intracellularis rezistentní, jako je například • 25 vankomycin, amfotericin B nebo členové aminoglykosidové skupiny antibiotik včetně gentamycinu a neomycinu. Ať je inokulem čistá kultura nebo střevní homogenizát, inokulace buněčné kultury může být provedena různými v oboru známými způsoby a postupy podle vynálezu.
Bakterie a/nebo zaočkované buněčné kultury jsou potom inkubovány za snížené koncentrace rozpuštěného kyslíku. Při • 0 0 0 0 0 • 0 0 · 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 * 0000 * 0 000 0 0 0 0000', 0 000000 0 00 0000 00 00 0000 00 00
-8koncentraci rozpuštěného kyslíku větší než 18 % již není růst L. intracellularis optimální a při koncentracích kyslíku mimo tento rozsah se může vyskytnout zastavení růstu. S výhodou jsou zaočkované buněčné kultury inkubovány při koncentraci rozpuštěného kyslíku v rozmezí od přibližně 0 % do přibližně 10 %. Nejvýhodněji jsou buňky inkubovány při koncentraci kyslíku v rozmezí od přibližně 0 % do přibližně 8 % s nejvýhodnější koncentrací kyslíku v rozmezí přibližně 0 % až přibližně 3,0 %.
Pro správný růst L. intracellularis je také důležitá správná io koncentrace oxidu uhličitého. Zhoršení růstu až popřípadě zastaveni růstu se vyskytuje mimo koncentrace oxidu uhličitého v rozmezí větší néž 1Ó % a menší než 4 %.S výhodou je koncentrace oxidu uhličitého v rozmezí od přibližně 6 % do přibližně 9 % a nejvýhodnější'.'je, koncentrace přibližně 8,8 %. ' is Navíc se buňky s výhodou inkubují při koncentraci vodíku přibližně 73 % do přibližně 94 %. Namísto části nebo veškerého množství přítomného vodíku je možno použít dusík. Podle zvláště _ ._yýíl9ŘDÁ^9^P.r9y®AenLse^uňky jnkubujLpři,složení plynů přibližněiOaž 8,0 % O2, přibližně 8,8 % C02 a přibližně 83,2 % H2.
2o Zaočkované buňky je možno inkubovat v inkubátoru umožňujícím přívod dvou plynů, nebo jiném prostoru umožňujícím kultivaci v atmosféře plynů, které obsahují vhodné koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého a které umožňují, aby byly buňky během inkubace suspendovány. Kultivační prostor by měl obsahovat prostředek pro udržování zaočkovaných buněk v suspenzi, monitor plynů a zdroj plynů pro udržování příslušné koncentrace plynů. Teplota inkubace by měla být v rozmezí od 30 °C do 45 °C a výhodněji v rozmezí od přibližně 36 °C do přibližně 38 °C. Nejvýhodněji bude teplota přibližně 37 °C. Nezbytné vybavení pro kultivaci a oslabení buněk podle vynálezu bude odborníkům v oboru s použitím způsobů podle vynálezu dostupné. Příkladem vybavení vhodného pro provádění ««·« »φ «I φφ φφ
ΦΦ · Φ, Φ · · Φ ΦΦΦ '· · 9 9 9. Φ 9 .φ·
Φ; φφφ φ φ · φφφ»' φ
ΦΦΦΦΦΦ φφφ
ΦΦΦΦ ΦΦ -1. ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ φφ
-9předkládaného vynálezu je inkubátor s přívodem dvou plynů, například model 480 firmy Lab-Line, Melrose Park, Illinois, ve spojení s rotačními lahvemi pro udržování buněk v suspenzi. Výhodné vybavení zahrnuje fermentor, bioreaktor nebo rotační třepačku s obsahující alespoň přibližně 2 I média a schopných udržovat buněčnou kulturu v suspenzi pomocí probublávání plynů o vhodné koncentraci nebo pomocí mechanického míchání a kontinuálního měření koncentrací rozpuštěného kyslíku v médiu. Vhodné fermentory a bioreaktory pro tento účel vyrábějí firmy New Brunswick, Braun , a io další.
20'
Udržování zaočkovaných buněk během inkubace v suspenzi se » . _ ...... _ .... ........ . i. „ dosáhne zvýšenínťexpozice každé buňky růstovému médiu a správné . . · -τ .
směsi kyslíku a Oxidu uhličitého maximálního růstu buněk a tím· i. L. intraceltularis. Buněčná kultura může být míchána nebo udržována v suspenzi řadou v oboru známých způsobů, včetně například kultivačních Jahví, otáčivých lahví, kultur na membráně a valivých lahví. Buňky mohou být udržovány v suspenzi v průběhu inkubace inkubací buněk v otáčivé láhvi uvnitř inkubátoru umožňujícího přívod dvou .piyňů7nebo podobného zařízení. Pod termínem “rotační láhev“ (spinner flask) se zde míní láhev nebo jiná nádoba, obsahující lopatky, míchadlo nebo jiné prostředky pro míchání kultury a udržování přítomných buněk v suspenzi.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu se zaočkované buňky inkubují až do dosažení konfluence a potom se umístí v míchané láhvi obsahující růstové médium a inkubují v inkubátoru za otáčení láhve. S výhodou se zaočkované. buňky do rotační láhve seškrabují. Toho je možné dosáhnout řadou v oboru, známých způsobů, při kterých se například pro uvolnění buněk používá seškrabávač buněk. Jakmile jsou buňky přivedeny do míchané láhve, její lopatka se typicky otáčí χ rychlostí od přibližně 30 do přibližně 60 ot/min, aby byly infikované buňky udrženy v suspenzi.
-10I» ·♦» r~ . fefe · aa • * · · · ♦ · • · , · fe · ·.
♦ «· «··« · fe« fe·· «* ···* ·· ··
Část kultivované L. intracellularís se potom pasážuje do čerstvé buněčné kultury pro zvýšení produkce bakterií t. intracellularís. Termín „pasážování“ nebo jeho variace znamenají způsob přenesení části kultivovaných buněk L. intracellularís do čerstvé buněčné kultury 5 s cílem infikovat čerstvé buňky bakterií. Termín „čerstvý“ jak se zde používá znamená buňky, které ještě nebyly infikovány buňkami L. intracellularís. S výhodou nejsou takové buňky v průměru starší než přibližně jeden den.
Pasážování L. intracellularís v suspenzních kulturách je možno provádět odstraněním části původní kultury a přidáním této části do nové baňky obsahující čerstvé buňky buněčné kultury. Jestliže má původní kultura vysoký počet bakterií na ml,; například větší než přibližně 104 báktěřií/ml, jé výhodné přidat rríezi přibližně í až 10 % (objem/objem) kultury z infikované baňky do nové baňky obsahující čerstvé buňky. To se s výhodou provádí, když je infikováno 50 až 100 % buněk. Jestliže je infikováno méně než 50 % buněk, pasážování se s výhodou provádí rozdělením kultury v poměru 1 : 2 do nové baňky a zvětšením objemu přídavkem čerstvého média. V každém případě se narozdíl proti pasážování kultur v monóvrstvách podle stavu techniky nevyžaduje lyže buněk a další kroky.
Po dostatečném nárůstu buněčné kultury a následné infekci L. intracellularís s poměrem infekce větším než přibližně 70 % při stanovení metodou IFA, TCID50 nebo jinou porovnatelnou metodou se alespoň části kultivovaných bakterií L intracellularís sklidí. Sklízení může být provedeno oddělením bakterie ze suspenze různými známými způsoby. S výhodou se bakterie L intracellularís sklízejí centrifugaci části nebo celého objemu suspenze za získání biomasy kultivovaných buněk, resuspendováním získané buněčné biomasy a lyží infikovaných buněk. Typicky se alespoň část média centrifuguje
3o přibližně 20 min ,při přibližně 3000 x g pro získání biomasy buněk a bakterií. Biomasa pak může být resuspendována v roztoku
Φ Φ ·»>» '«φ • « φ Φ V φφ'φφ
Φ) φφφ φ φ Φ φφφφ « » · φ · · φ φφφ φφφφ ♦ · φφ φφφφ φφ φφ sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) a lyže buněk může být dosažena přibližně čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 25. Jestliže je třeba dalšího čištění, vzorky mohou být centrifugovány pro odstranění buněčných jader a částí buněk přibližně 5 min při 145 x g. s Supernatant je pak možno centrifugovat přibližně 20 min při přibližně
3000 x g a výslednou biomasu resuspendovat ve vhodném ředicím roztoku, jako je SPG s fetálním bovinním sérem (pro přípravu sklizených-bakterií vhodných po zamražení jako inokulum) nebo růstové médium (pro přípravu sklizených bakterií vhodnějších pro ío pasážování do čerstvých buněk.
Jak bylo již uvedeno dříve, účinný růst L. intracellularis pro produkci ve velkém měřítku jě možno zvýšit'udržováním aktivního; růstu buněk tkáňové kultury. V případě monovrstev se při dosažení konfluence rychlost dělení buněk podstatně sníží; Pokusy pěstovat L. intracellularis na tkáňových kulturách rostoucích v monovrstvě měly omezený úspěch a nebylo možno zvětšovat měřítko. Použití kultur v suspenzi však umožní udržování buněk v aktivním růstu a umožní průběžnou expanzi kultury a . zvětšování měřítka. S použitím fermentoru a při koncentraci, rozpuštěného kyslíku mezi přibližně Oaž20 3 % jak bylo vysvětleno výše, bylo autory vynálezu dosaženo růstu až do 108 bakterií na ml. Bylo také možno udržovat kultivované bakterie v aktivním růstu mnoho měsíců a očekává se, že by bakterie mohly tímto způsobem růst trvale.
V období před předkládaným vynálezem se obvykle věřilo, že 25 aby mohly být buňky infikovány L. intracellularis, musí být přichyceny na povrchu. Buněčné suspenze podle předkládaného vynálezu jsou proto jedinečné a s touto teorií jsou v rozporu. Pokud se používají buňky McCoys nebo IEC-18, je výhodné spolu s růstovým médiem přidávat želatinu, agarózu, kolagen, akrylamid nebo kuličky oxidu
3o křemičitého, jako jsou porézní mikronosiče Cultisphere-G, vyráběné firmou HyCIone Laboratories, Logan, UT. Buňky HEp-2 však při • · · ··*·«*·· • * · » · ·'*··.
* ····'··*·»·· • ·_ · <·« * a » . Ί2 - ...... ** **** **' ” kultivaci podle vynálezu mikronosiče nevyžadují. To představuje zvláště výhodný a ekonomický způsob velkoobjemové kultivace.
Pro účely zachování kultury se v případě kultur s buňkami HEp2 s výhodou 25 až 50 % kultury v týdenních intervalech odstraní a nahradí čerstvým médiem. V případě buněčných kultur s mikronosiči nebo kuličkami se s výhodou 25 až 50 % kultury odstraní jednou až dvakrát za týden a nahradí čerstvými mikronosiči a kuličkami a čerstvým médiem. Pro účely zvětšení měřítka je možno ke kultuře přidat dalších 25 až 50 % média nebo média s mikronosiči.
ίο V závislosti na rychlosti, se kterou se buňky kultury infikují, pasáž čerstvých buněk obvykle probíhá přibližně každé dva až každých pět týdriů. Za předpokladu, že buňky buněčné kultury jsou alespoň ze 70 % infikovány v průběhu dvou až tří týdnů, výhodný termín pasážování se vyskytne přibližně každé tři až čtyři týdny.
is Předkládaný vynález také poskytuje vákcíny a způsoby produkce vakcin proti’ L. intracellularis. Podle zvláště výhodného provedení se po udržování infikovaných buněk v suspenzi po delší „dobu.(například-6 až 8 měsíců) alespoň-část kultivovaných bakterií L intracellularis sklidí a monitoruje na potenciální oslabení. Takové .
2o monitorování se s výhodou provádí testem podání kultury hostitelskému zvířeti nebo zvířecímu modelu s cílem vybrat oslabený kmen; Takové oslabené kmeny se používají podle způsobů podle předkládaného vynálezu jako vakciny. Oslabené: vakciny L. intracellularis podle předkládaného vynálezu se ukázaly jako účinné t proti infekci L. intracellularis u řady zvířat a očekává se, že budou úspěšné také u člověka.
Předkládaný vynález dovoluje rychlý nárůst kultury, tj. vzrůst výtěžku 100 až 1000 krát a snížení nákladů. Výsledkem je, že se nadbytečné množství bakterie L. intracellularis vyprodukované podle
3o způsobu kultivace podle vynálezu snadno zeslabí pro účely výroby vakciny. Oslabení je u kultur v monovrstvách obtížné z důvodů
Μ »0 •ί*·»
0 * *·· · * * ·
0 · 0 0 0 0 0 0. \ · ·«·, 0 0 0 -00000 ϊ
000000 00«
000 0 '«·? 00 - 0000 00 00-13nízkého výtěžku bakterií produkovaných běžným způsobem pěstování v monovrstvě. Naopak způsob pěstování L. intracellularis podle předkládaného vynálezu značně zvyšuje snadnost, rychlost a počet bakterií dostupných pro tento účel. Čím větší je množství buněk a proběhlých buněčných dělení, tím větší je výskyt mutací, které jsou výhodné pro vývoj vakcíny. Růst v suspenzích podle vynálezu zvyšuje i expresi důležitých imunogenů, řízenou geny ovlivňovanými prostředím-a produkty jejich exprese.
Výsledné oslabené kmeny je možno kultivovat v monovrstvě io tkáňové kultury jak se popisuje v příkladu 1 níže, ale s výhodou probíhá kultivace v suspenzních kulturách podle vynálezu. Další prostředky pro oslabení mohou zahrnovat chemické oslabení použitím například N-methylnitrosoguanidinu a jiných v oboru známých prostředků. Oslabený L. intracellularis, získaný buď mnohonásobným pasážováním nebo chemickými prostředky, se produkuje a provádí se jeho selekce pro přípravu vakcíny.
Podle jednoho provedení vakcíny podle vynálezu se antigen i · · , · .
_______sklidí cjm.trifugacLnebo^mjkrofiltrací jakje„popsáno výše._Antigen,s,erf^ potom standardizuje ; na definovanou koncentraci založenou na
2o optimální imunologické odpovědi hostitelského zvířete, která se určí titrací dávky u druhu zvířecího hostitele. Bakterii je možno inaktivovat prodlouženou expozicí, například jeden týden, koncentraci kyslíku okolí nebo použitím 0,3 % formaldehydu nebo jiného inaktivačního prostředku vhodného pro přípravu usmrcené vakcíny. Antigen se potom zavede do vhodného adjuvans, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej pro dosažení zvýšení imunologické odezvy. Antigen se potom použije pro vakcinaci hostitele intramuskulární nebo subkutánní injekcí, v případě prasat vé věku přibližně tří až čtyř týdnů a v případě nutnosti se zesilující dávkou.
so Podle zvláště výhodného způsobu výroby vakcíny podle vynálezu s použitím výše popsaných metod kultivace je také možno
-149* 9 · 9 · 99 0 9 09 « 9 9 9 90 9 9 * 9'. 9 ·: 9 · 9 0 \ 9 0 9
909*9 09 »09 9 9 .9.9 « 00 9 9 0
9999 99 0 9 9099 «9 90 provádět sériové pasážování bakterie pro indukci a selekci oslabené avirulentní živé kultury. Kultura se testuje u zvířecího hostitele (po přibližně alespoň 6 až 8 měsících růstu v suspenzní kultuře) na známky oslabení. Kultura se sklidí jak bylo popsáno výše a naředí, s Prasata se například vakcinují ústy 1 x 105 až 1 x 106 bakterií.
Přibližně 28 dní po vakcinaci se prasata orálně očkují přibližně 1 x 107 mikroorganismů po menším počtu pasáží (staré přibližně 30 až 45 dnů) virulentní kultury L. intracellularís. U infikovaných zvířat se provede pitva 21 dnů po podání a provede se vyšetření tenkého io střeva na poškození velkého rozsahu i mikroskopická poškození. Je možno také provést PCR a test s fluorescenčními protilátkami.
-Přibližně 80 % kontrolních zvířat bude mít větší nebo mikroskopická poškození a pozitivní test na. přítomnost. L intracellularis v buňkách sliznice střeva při použití buď PCR nebo FA. Vakcinovaná zvířata is budou mít povrchy sliznice normální při histologickém pozorování a budou.negativní při testování pomocí PCR.
Obvykle se vyprodukuje oslabený imunogenni kmen . L. intracellularis po kontinuální kultivaci v rozmezí alespoň 150 až 250 ~dnů? přičemž V*tomto rozmezí še kuíturarpasážuje alespoň přibližně sedm až přibližně dvanáctkrát. Pokud se používá Způsobu monitorování a selekce podle vynálezu, je možno produkovat další oslabené kultury a tím tato čísla měnit.
Potom se připraví vakcína, která obsahuje imunologicky účinné množství oslabené L. intracellularis ve farmaceuticky přijatelném
-nosiči. Spojeným imunogenem a nosičem může být vodní roztok, emulze nebo suspenze. Imunologicky účinné množství je možno určit v oboru známými způsoby bez dalšího experimentování na základě v předkládaném vynálezu uvedených údajů. Množství imunogenu bude obecně mezi 50 a 500 pg a s výhodou mezi 107 a 109 TCIDso při
3o použití purifikovaných bakterií.
»444 * v v * · · v.
• 4 4 · 4 4 *'*444 ·
4*4444 · 4 * *444 44 **' *44* *4 *4 . . -15 Vakciny podle vynálezu se obvykle podávají vnímavým zvířatům, zvláště vepřům v jedné nebo více dávkách. Živá nebo usmrcená vakcína může být podávána jednou nebo dvakrát ve dvoutýdenních intervalech. Pro oslabené živé vakciny je výhodná jedna dávka. Výhodné způsoby podávání u živých oslabených kmenů jsou orální nebo intranazální, ale je možno také použít intramuskulární nebo subkutánní injekce. Intramuskulární a subkutánní injekce jsou způsoby nejvýhodnější v případě usmrcené vakciny. ΐ
Účinná diagnóza PPE byla také ztížena dobou, potřebnou pro io kultivaci bakterie způsobující onemocnění. Jako výsledek předkládaného vynálezu je nyní možný vývoj diagnostických prostředků, prd rychlé a přesné testování přítomnosti L. intracellularis v biologických vzorcích odebraných od vepřů a jiných zvířat vnímavých k PPE) .
is Bakterie L intracellularis vypěstované způsobem podle předkládaného vynálezu nebo. složky odvozené z takových bakterií mohou být použity jako antigen při metodě ELISA nebo jiném . imunologickém stanovení jako j^ imůnofluorescenční^est^ protilátek_ („1FA“) pro 'detekci protilátek proti L intracellularis v séru'a jiných ’ tělesných tekutinách zvířat podezřelých nebo infikovaných bakterií. Výhodným imunologickým testem je v současnosti IFA, popisovaný v příkladu níže. Alternativně mohou být také použity bakterie vypěstované způsobem podle vynálezu při testu westernovým blotem.
Výhodný protokol metody ELISA podle tohoto provedení vynálezu je následující:
1. Přidá se 0,1 ml/jamku antigenu zředěného v potahovacím roztoku. Inkubuje se 18 hod při 4 °C.
2. Promyje se třikrát PBS.
3. Přidá se 0,25 ml blokovacího pufru do každé jamky na destičce. Inkubuje se 1 až 2 hod při 37 °C, »· ·»··
Φ a * · · · · · · φ' · • · ♦ » · *··· • · · · a ' β φ »·* φ « ··»»»· » · ·
- 1θ - ............ ·· ··
4. Promyje se třikrát promývacím pufrem.
5. Sérum se zředí v blokovacím pufru a do prvních jamek na destičce se přidá 0,1 ml. Napříč destičkou se provedou sériová ředění 1 : 2. Inkubace se provádí 1 hod při 37 °C.
6. Promyje se tři až pětkrát promývacím pufrem.
7. Konjugát se naředí v blokovacím pufru, do jamek na destičce se přidá 0,1 ml a inkubuje se 1 hod při 37 °C.
3. Promyje se tři až pětkrát promývacím pufrem.
9. Přidá se substrát.
io 12. Měří se absorbance pomocí spektrofotometru.,
-13. Jamky bez přídavku antigenu se použijí jako biank? . ,
14. V každém testu je možno použít jako pozitivní a negativní kontroly také prasečího séra.
Výhodný protokol westernového blotu je následující:
ppovécTe/se^élěktróforěžá' antigenu'Ί 2~%~SDSýPÁGETT převede se na nitrocělulózovůu membránu.
2. Membrána se vloží na 2 hodiny do blokovacího pufru.
3. Blokovací pufr se odstraní a 1 min se oplachuje PBS.
4. Sérum se zředí blokovacím pufrem a přidá se k membráně.
Inkubace se provádí 2 hodiny při pokojové teplotě.
5, Promyje se třikrát promývacím pufrem (5 min na každé mytí).
6. Konjugát se zředí blokovacím pufrem a přidá se k membráně. Inkubace probíhá 1 hod při pokojové teplotě.
7. Třikrát se promyje promývacím pufrem.
8. Na 10 min, nebo dokud nedojde ke vzniku silných pruhů se přidá substrát.
-1799 9999 • 9 · • *
9 • 9 ♦
9·9· 9* • 9 99 99 ·9 • •9* «999 «9 9 9 · 9 9
9.9 * 99999 9 • 9 9 9 9 9
9999 ·· ··
9. Provede se oplach PBS.
10. Membrána se usuší na vzduchu a uchovává v temnu.
Předkládaný vynález se dále popisuje na následujících s příkladech, které mají sloužit pouze pro ilustraci a nejsou zamýšleny jako limitující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 io Izolace L. intracellularis ze střev amerického vepře s proliferativní enteropatií vepřů
Materiály a metody:
Volba vzorků pro inokulaci: .·'
Vzorek N249Í2 byl získán z chovu na farmě v lowě, kde byly u is 15 ze 300 pětiměsíčních prasat pozorovány přetrvávající krvavé stolice bez ohledu naléčeňí penicilinem: Po nekropsii vepřů byia vé střevě (ileum) pozorována ztluštělá sltznice. Histopatologické vyšetření s barvením stříbrem ukázalo přítomnost zakřivených intraceiulárních bakterií a hyperplasii enterocytů v kryptách, potvrzující diagnózu ΡΡΈ. Vzorek N72994 byl získán z 1,5 letých prasnic po druhém vrhu na farmě v Minnesotě. Velikost chovu byla mezi 70 až 80 prasnicemi a nebyio zjištěno podávání antibiotik. Po nekropsii byla naležena ztluštělá sliznice ilea s krvácením. Barvení sliznice podle Gimineze ukázalo velké množství zakřivených bakterií,
Vzorek N101494 byl získán z 12 týdnů starých prasat z farmy v Indianě se 600 chovnými prasnicemi. Prasata byla po nástupu krvavých průjmů léčena Tylanem ve formě injekcí, ale brzy po léčení zvířata uhynula.
-18* Φ· • * o · «· ·♦·· »» ·* • · * · » » · ··· · « • · « ·· ··
Příprava inokula bakterií pocházejícího z prasat:
Vzorky střev byly uchovávány při - 70 °C. Střeva byla otevřena a promyta fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (P8S).
Jednogramové vzorky sliznice byly seškrabány do pufru sodík-draslíkglutamát (SPG) a homogenizovány 30 s s 4,0 ml 1 % trypsinu (JRH Biosciences, Lenexa, KS) v SPG. Suspenze byly inkubovány 35 min při 37 °C. Bylo přidáno 10 ml SPG/10 % fetálního telecího séra (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) a vzorky byly mlety v tkáňovém io homogenizátoru po dobu 1 minuty. Bylo přidáno 10 ml SPG/10 % (FCS) a suspenze byla jednou zfiltrována filtračním papírem (VVhatman 1 i3V; Whátman Labsales, Hillsboro, OR) a ’ potom postupně přes 5,0, 1,0 a 0,65 μιτι membránovými filtry. Filtráty byly rozděleny do alikvotů po 1,0 mí a uchovávány zmražené při - 70pC.
Sliznice byla rozetřena na sklo pro barvení podle Gimineze. Oddělené roztěry filtrátů byly. barveny IFA pomocí specifické monoklonální protilátky proti L. intracellularis (S - McOrist a další, Vet. Rec. 121: 421 -422 (1987).
Buněčná kultura:
Buňky 1EC-18 (krysí střevní epiteliální buňky, ATCC CRL 1589) rostly v DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) s gfutaminem a 10 % FCS s týdenním pasážovánim trypsinem. Monovrstvy buněk rostly při 37 °C ve vzduchu s 5 % CO2.
Infekce buněčné kultury:
Buňky IEC-18 byly vysety s koncentrací 1,25 χ 105 buněk v 25 cm2 lahvích a v porovnatelném množství v lahvích typu chamberslides (Nunc, lne., Naperville, IL). Buňky byly inkubovány 24 hod a potom bylo médium odstraněno. Zamražené izoláty prasečích
- 19 *« MM 9* «9 »| 99 *9 · · · 9 9 · · 9 · • ·. · .,9 · « tt «tttt * «tttt > 9 9 tt tt 9 · * • •99·· 99· ···· ·· 99 9··« ·· »9 bakterií byíy rychle roztátý a zředěny v DMEM/7 % FCS s vankomycinem (100 pg/ml) a amfotericinem B (2,0 pg/ml) v koncentracích 1,0 ml homogenátu na 15 ml média a přidány k monovrstvám. Monovrstvy a bakteriální suspenze byly centrifugovány s 30 min při 2000 g a převedeny do anaerobních inkubátorů. Inkubátory byly evakuovány a plyn byl nahrazen vodíkem a oxidem uhličitým za vytvoření směsi 8,0 % O2, 10 % C02 a 82 % H2. Kultury byly inkubovány 3 hodiny při 37 °C, potom bylo přidáno DMEM/7 % FCS s > L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomycinem (50 pg/l) io a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Kultury byly v anaerobních inkubačních nádobách vyměněny a inkubovány 6 dnů se změnou média každé dva , . 'dny.............. ...... ... : - Pasážování L. intracellularis·.
* ' ·
Bakterie- L. intracellularis prošly buněčnou lyží s použitím chloridu draselného'jak: bylo popsáno dříve v: G. Lawson a další, J. Clin. Microbiol, 31: 1136 - 1142 (1993) a potom byly přidány k čerstvým<monovrstvám.,.buněk-JEC-18.Média— byla— odlitai z monovrstev, byl přidán 0,1 % KCI a buňky byly inkubovány 10 min při
37 °C. KCI bylo odstraněno a byl přidán SPG/10 % FCS a monovrstvy byly škrabkou mechanicky uvolněny. Buňky byly lyžovány trojnásobným průchodem stříkačkou s jehlou kalibr 21. Buněčná jádra byla odstraněna centrifugací při 100 x g po dobu 5 min a bakteriální suspenze v supernatantu přidána k čerstvým 1 d monovrstvám buněk
IEC-18.
Monitorování infekce buněčných kultur:
Infekce byla monitorována fixováním buněk na sklíčkách studeným roztokem aceton/methanol po dobu 5 minut. Barvení bylo so provedeno metodami imunofluorescence a imunoperoxidázovou
-20» ·· Φ» >fr • · · · · ·· • 0 · · · · <«|9 s • •49 4 4 » ·· ·00· »0 0* ···* 00 metodou. Obě metody používaly myší monoklonální protilátku (jak bylo popsáno v: S. McOrist a další, Vet. Rec. 121: 421 - 422 (1987) jako primární protilátku a buď konjugát antimyší imunoglobulin G fluorochrom (fluorescein izothiokyanát; Organon Teknika Corporation,
Durham, NC) nebo peroxidázový konjugát (kozí antimyší imunogtobulin G; Ktrkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Kvantifikace bakterií byla prováděna počítáním specificky obarvených bakterií uvnitř buněk na každém sklíčku.
io Polymerázová řetězová reakce:
>.
.Vzorek inokula, a pasážovaných bakterií-byla použity jako templát DNA v PCR s použitím metody pro přípravu vzorků, primerů .. .. a parametrů cyklování jak bylo popsáno u: . Jones a další, J. Clin. . Microbiol., 31: 2611 - 2615 (1993) a McOrist a další, Vet. Microbioí. 1 ’ is - 8 (1994). Parametry cyklování byly pro první cyklus: 93 °C 5 minut, °C 45 s a,72 °C 45 s. Bylo provedeno 33 cyklů při výše uvedených teplotách po dobu 45 s na jednu teplotu a jeden cyklus 93 °C 45 s, ___________55?C 45-s .a .72 -C-2. min. Pro-inokulaci-buněk 1EC-18· bylo- použito - ~ pouze pozitivního inokula.. PCR byla také prováděna pro monitorování
2o pasážovaného materiálu pro potvrzení infekcí. DNA vytvořená pomocí PCR byla zaslána do laboratoře lowa State University Nucletc Acid Facility k sekvenování. Výsledky sekvenování byly porovnány se sekvencemi vytvořenými: Gary F. Jones, dizertační práce, University of Minnesota, Minneapolis, MN (červen 1993).
Výsledky:
Volba vzorků inokula:
Vepři s čísly N24912 a N72994 měli vážnou PPE s krvavým obsahem střev a ztluštěním sliznice. Vepř číslo N101494 měl vážnou
3o PPE a vážné krvácení, které mělo za následek rozsáhlou krevní ·· φφφφ · ·· ΦΦ *1 φ φ · φφφφ φ · · « ν · · · Φ Φ • · · · » * ·♦· φ · • Ο -_· Φφφ ΦΦΦ ···! ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ «Φ
-21sraženinu ve střevě. Barvení roztěrú sliznice podle Gimineze ukázalo velký počet zakřivených bakterií ve tvaru S. Barvení íFA ukázalo velký počet jasně fluoreskujících bakterií v případě inokula prasečích bakterií.
Monitorování infekce buněčných kultur.
Naočkované monovrstvy byly monitorovány v průběhu růstového cyklu pomocí světelné mikroskopie, přičemž byly pozorovány malé morfologické změny buněk. Neinfikované monovrstvy rostly za sníženého tlaku kyslíku (8 % O2) a měly podobnou morfologii, ........ , . ,
Infikované kultury barvené irhunofluorešcenčí a imunopéroxidázovou metodou ukázaly velký počet zakřivených bakterií nebo bakterií ve tvaru S, které byly specificky obarveny a nacházely, se zřejmě uvnitř buněk. Monovrstvy' neměly konfluentní infekci. Infikované buňky byly často; v těsném sousedství s infikovanými . ohnisky po jedné až deseti buňkách. Těžce infikované buňky (tj. buňky ~ š 30 nebo více,bakteriemi), bylý řovněžTvidět spolu s. buňkami.s méně»než třiceti bakteriemi. Počty bakterií dosáhly maxima přibližně po 6 dnech. Infekce byla závislá na konkrétních podmínkách růstu. Bakterie byly úspěšně pasážovány metodou lyže buněk popsanou výše. Centrifugace nově inokulovaných buněk nebyla nutná, ale zvyšovala počty infikovaných buněk. Centrifugace rovněž snižovala kontaminaci tím, že umožnila infikovaným buňkám v médiu bez antibiotik pó třech
2s hodinách výměnu média za médium s antibiotiky. Snížení obsahu FCS z 10 % na 7 % v médiu bylo nutné pro zpomalení růstu buněk IEC-18, což bakteriím dovolilo větší rozšíření před tím, něž buňky v monovrstvě dosáhly konfluence.
φ φ φφφφ • · φφ * « ♦ φ je · φ ' φ « « · · φ · · ι φ Φ \
I
ΦΦ
Polymerázová řetězová reakce:
PCR chromozomální DNA byl ze všech izolátů vytvořen fragment (včetně primerů) o velikosti 319 bp. Fragment vhodné velikosti byl vizuálně porovnáván se známým pozitivním vzorkem s vytvořeným s použitím PCR autory: McOrist a další (1994). Analýza sekvence produktů PCR N24912, N72994 a N101494 potvrdila těsnou homologii (97 - 99 %) se sekvencí p78, určenou Jonesem (1993).
Příklad 2 io Růst L intracellularis v suspenzních kulturách buněk HEp-2
Příprava střevních homoqenátů pro inokulum: ..-/,..
Střevní homogenát byl připraven seškrabáním sliznice z 6,0^až 8,0 cm ilea ze střevních vzorků z příkladu 1. K seškrabané sliznici byl přidán trypsin (1 %) a vzorky.’, byly; krátce homogenizóvány a potom is inkubovány 35 min při 37 °C. Potom.bylo přidáno 10 ml SPG/10 % FBS a vzorky byly rozemlety na tkáňovém homogenizátoru. Potom . bylo. přidáno^dalších—10 ml SPG/10—% - FBSi Homogenáty byly zfiltrovány filtrem Whatman V113 a potom postupně přes filtry 5,0,? 1,0 a 0,65 pm. Vzorky byly rozplněny do alikvotů po 1 ml a zamraženy při
- 70 °C.
infekce buněčné kultury:
Metoda A
Buňky tkání byly vysety v koncentraci 1 χ 107 buněk v 50 ml 25 DMEM/10 % FBS do 100 ml rotační lahve. Kultury byly inkubovány 24 hod, a potom byly přidány vankomycin a fungizon. Jedna ampule zmraženého střevního homogenátu byla rychle rozmražena a zředěna do 3,0 ml DMEM/5 % FBS s vankomycinem (100 pg/ml) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Vzorek byl zfiltrován filtrem 0,65 pm a
-23• fe ···· fefe fefe • · · fe · · fe • · t * fe fe ♦ fe I fe · fefe fefefe ···· ·· ·· ♦ ·»· • fe fefe
V fefe 4 » » fefe • fe · · 4 fe · a • a ·· přidán do láhve. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuována a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za poskytnutí směsi 8,0 % O2, 8,8 % C02 a 83,2 % H2. Kultury byly inkubovány 3 hod při 37 eC a potom byl přidán neomycin a gentamycin. Výměna média proběhla po 24 hodinách s použitím média DMEM/5 % FBS s L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomycinem (50 pg/l), gentamycinem (50 pg/l) a amfotericinem B (2,0 pg/ml).
io Metoda B
Dvě běžné láhve, 25 cm2 byly naočkovány 1,25 x .10® buněk , • HEp-2 v DMEM/1.0 % FBS a ponechány růst 18 - 24 hodin.'V době inokulace byly buňky v 30 % konfluence. Inokuíum bylo naředěno DMEM/5 % FBS. Pokud inokuíum pochází ze střevního homogenátu, is média obsahují rovněž vankomycin, (100^pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Kultury byly, umístěny do. plynového inkubátoru, evakuovány a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za dosažení . ..směsi-8,0~% 02,-8,8 .%.C,02-a 83,2 % H2. U kultur-bylo po 24 hodinách · * vyměněno médium za nové médium DMEM/5 % FBS s L-glutaminem,
2o vankomycinem (100 mg/ml), neomycinem (50 pg/l), gentamycinem (50 pg/l) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Pokud byla inokulem čistá kultura, nebyla nutná žádná antibiotika. Kultury byly inkubovány 6 dnů nebo do dosažení konfluence. Buňky byly z lahví seškrabány a přidány do 100 ml rotační láhve, obsahující 50 ml DMEM/5 % FBS.
Kultura byla zředěna v poměru 1 : 2 každý týden buď sklizením poloviny kultury a přídavkem čerstvého média nebo pasáží do větší rotační láhve a přídavkem.většího množství média.
·· ··· Μ li β· • · · ··<· *··* • · * · ·<··«· • » » * ·!'·’···> « • Ο * * 9 · ·«.>
··*· *· ' ·· ·♦·* . ·· ·♦
Pasážování kultury:
Kultura byla přenesena do čerstvých buněk HEp-2 vysetím nových buněk HEp-2 v koncentraci 1 x 107 do DMEM/5 % FBS. Nová kultura byla ponechána inkubovat přes noc s koncentrací plynů 8,0 %
O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Nová kultura byla potom zaočkována infikovanou kulturou a inkubována při snížených koncentracích O2, jak bylo uvedeno dříve. Množství inokula byla závislé na stupni infekce původní kultury.
io Sklizeň a skladování kultur:
Kultury byly sklizeny odebráním požadovaného ninožství kultury . s centrifugací 20 min při:3000 x g.;Biomasa byla resuspendována;v > - / roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Kultury byly rozděleny do alikvotů a zmraženy při is - 70 °C. Přo další purifikaci byly vzorky centrifugovány při 145 x g po dobu. 5 minut pro ’ odstranění buněčných jader a zbytků buněk. Supernatant byl potom centrifugován 20 minut při 3000 x. g. Centrifugat byl/ešusperídóván v“dii'ueňťů77^;^
Odhad počtu životaschopných buněk L. intracellularis ve tkáňové kultuře:
Kvantifikace životaschopných buněk L. intracellularis byla prováděna určením dávky pro 50 % infekci tkáňové kultury (Tissue Culture Infectious Doše 50 percent (TCIDso). To bylo provedeno odebráním 2,0 ml kultury pro testování a lyží buněk čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 25. Vzorek byl sériově naředěn 1 : 10 v DMEM/5 % FBS $ obsahem vankomycinu (100 pg/ml) a amfotericinu B (2,0 pg/ml). Alikvoty zředěných roztoků byly přidány do 96 jamkové mikrotitrační destičky v množství 0,1 ml/jamku. Mikrotitrační destičky byly zaočkovány buňkami HĚp-2 s koncentrací 1250 buněk/jamku,
-259 · · 9 9 9 9 ·· 99 99 • 9 9 · · 9 « 9 φ * · * » - 9 9 9 9 999 <* 9 9« 9 · > 9999 9 • · · 9. 9 9 φ « «
999« ·· 9* *999 99 99 které byly ponechány růst 18-24 hodin před infekcí. Bylo použito mezí třemi a šesti jamkami na jedno zředění. Destička byla inkubována 6 dnů při koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Buňky byly fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % s methanolu po dobu dvou minut. Do jamek bylo přidáno 0,03 ml/jamku anti-IS L. intracellularis monoklonální protilátky (McOrist, 1994) zředěné v poměru 1 : 2000 v PBS. Destička byla inkubována 30 min při 30 °C a potom třikrát promyta PBS. V množství 0,03 ml/jamku bylo přidáno antimyší FITC .zředěné v poměru 1 : 30 a destička byla io inkubována 30 minut při 37 °C. Destička byla potom třikrát promyta destilovanou vodou a ponechána uschnout. Vzorky byly pozorovány íf
- - ve fluorescenčním mikroskopu a byla určena hodnota TCIDsů/ml.
·*· Ί ... · · - . .v , . M
Výsledky: ' is Výsledky TCID5Q; ukazují, že kultury obsahovaly až do 1 χ 106 bakterií/ml. Toho;bylo dosaženo během 45 dnů. Ve stejné době byl objem kultury zvětšen na 3,0 I.
Příklad 3
Růst L. intracellularis v suspenzních kulturách buněk McCoys
Příprava střevních homogenátů pro inokulum:
Střevní homogenát byl připraven jak bylo popsáno v příkladu 2. Vzorek L. intracellularis kultivovaný způsobem podle následujícího příkladu byl uložen v souladu s Budapešťskou dohodou 19. 5. 1995 v American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852 pod depozitním číslem 55672.
-26 9 4 9 99 99 »9 94 «9 · ·. · 9 9 * 9 9 * 9 ' 9 9' · 9 9 9 9.
• * * 9*99949·· • ι * · «44 *9' ·'
9999 9» 94 9994 94 94
Infekce buněčné kultury:
Do dvou běžných lahvi 25 cm2 bylo zaockováno 1,25 χ 105 buněk McCoys v DMEM/10 % FBS a ponecháno růst 18 až 24 hodin. V čase inokulace jsou buňky ve stavu 30 % konfluence. Inokulum bylo s naředěno DMEM/5 % FBS. Pokud inokulum pocházelo ze střevního homogenátu, médium rovněž obsahovalo vankomycin (100 pg/rnl) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Kultury byly umístěny do plynového inkubátoru; evakuovány a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za vytvoření směsi 8,0 % O2, 10 % CO2 a 82 % H2. Kultury io byly inkubovány 3 hodiny při 37 °C a byl přidán neomycin a gentamycin. Médium v kultuře bylo nahrazeno po 24 hodinách médiem DMEM/5 % FBS š L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomýcinem (50 pg/l), gentamycinem (50 pg/l) a ámfotericiněm B (2,0 pg/ml). Pokud pocházelo inokulum z čisté kultury, něbylo zapotřebí is antibiotik. Kultury byly inkubovány 6 dnů do dosažení konfluence. Buňky potom byly ,z láhví seškrabány a přidány do 100 ml rotační láhve obsahující 50 ml DMEM/2 % FBS a 0,05 g mikronosičů Cultisphere-G Microcarriers. Láhve byly míchány rychlostí 40 - 50 .ot/min. : > --·20 Kultura byla každé dva až tři dny ředěna v poměru 1 : 2 buď sklizením poloviny kultury a přídavkem čerstvého média a kuliček Cultisphere-G nebo přenesením kultury do větší rotační láhve a přídavkem dalšího média s kuličkami Cultisphere-G. Konečná koncentrace kuliček v kultuře byla přibližně 0,001 g kuliček/ml.
Pasážování kultury:
Kultura byla přenesena do čerstvých buněk McCoys zaočkováním 1 χ 107 nových buněk McCoys do DMEM/2 % FBS a 0,05 g kuliček Cultisphere-G. Nová kultura byla ponechána irikubovat přes noc v atmosféře 8,0 ’02, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Nová kultura byla • 9 9* * · · *
-27·» ··«» 9 9 9» » · 9 · ♦ ·9 9 · i • · « . 9 » «
9« 9999 99 9· potom zaockována 25 ml infikované kultury a inkubována při snížené koncentraci O2, jak bylo uvedeno výše.
Sklizeň a skladování kultur:
s Kultury byly sklizeny odebráním požadovaného množství kultury a centrifugací 20 min při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v SPG a čtyřikrát protlačena jehlou kalibr 22. Kultury byly rozplněny do alikvotů a zmrazený při - 70 °C. Pro další purifikaci byly vzorky centrifugovány při 145 x g po dobu 5 min pro odstraněni kuliček, io buněčných jader a částí buněk. Supernatant byl potom centrifugován min při 3000 xg. Biomasa byla potom.resuspendována v diluentu.
Odhad životaschopných buněk L. intracellularis ve tkáňové kultuře:
Určení počtu životaschopných buněk L. intracellularis bylo provedeno podle popisutv; příkladu 2 s použitím jehly kalibr 22 pro lyži buněk a zaočkování mikrotitračních destiček buňkami McCoys
_.l K?Π.Ρθ PtrA9ί.ί250 buněk/jamku... , * . - ' « >| ' ' ·· ' ·ΤΚ· * ta , ·
Výsledky:
Výsledky TCID50 ukázaly, že kultury obsahovaly až do 1 x 106 bakterií/ml. Toho bylo dosaženo v době méně než 1 měsíc. Ve stejném období byl kultivační objem zvýšen na 3,0 I.
-28• · · v · · · · * · · • 9. , · · a 9 a a · · 9 i · · ti , « · a a 9
9*9*9« » » i •99» 99 9» 999« 9» 9» ’ Příklad 4
Stanovení infekční dávky čistých kultur L, intracellularis u hostitelských zvířat
Souhrn:
Studie na 31 praseti byla uzavřena infekcí normálních prasat šest týdnů starých čistou kulturou L. intracellularis ze vzorku N72994. Prasata byla náhodně rozdělena do čtyř skupin, které byly umístěny odděleně. Skupina 1 obsahovala sedm prasat a byla považována za negativní kontrolní skupinu, která dostala neinfikovanou tkáňovou io kulturu nebo nic. Skupina 2 obsahovala osm prasat a dostala 107 bakterií na jedno prase. Skupina 3 obsahovala osm prasat a bylají • podána dávka 106 bákterií/prase. Konečně skupina .4 se skládala z osmi prasat, která obdržela 105 bakterií/prase.
Výtěry fekálií byly shromažďovány ve dnech O, 7, 14 a 21 a v den 24 pro: testování PCR:; V den 24 byla prasata usmrcena a jejich íleum, jejunum ’ a kolon byly odebrány pro testování PCR, histopatologické vyšetření a barvení FA, jak bylo popsáno výše.. .
Testování - PCŘ střevní sliznice - odhalilo přítomnost í. ’ intracellularis ve 1,00 % případů u vysoké dávky, 75 % střední dávky a 50 % nízké dávky. Histopatologické výsledky ukázaly na vzrůst počtu mononukleárních buněk v lamina propria a podslizniční vrstvě u 88 % v případě vysoké dávky, 75 % u střední dávky a 88 % u nízké dávky. Hyperplazie v kryptách byla pozorována v 50 % případů u vysoké dávky, 63 % u střední dávky a 50 % u nízké dávky. Barvení
FA odhalilo L. intracellularis v tkáňových řezech ilea, jejuna a kolonu u 88 % případů u vysoké dávky, 63 % u střední dávky a 63 % u nízké dávky. Kontrolní zvířata byla negativní na přítomnost L. intracellularis při zjišťování PCR, FA a barvení stříbrem.
Čisté kultury tedy byly úspěšně použity pro infekci a pro indukci poškození PPE. Kochovy postuláty byly splněny identifikací a izolací L intracellularis z infikovaných zvířat.
U zvířat, kterým byla podána testovací kultura, se ve 100 % 5 případů s podanou vysokou dávkou potvrdilo zpětné získání bakterií a identifikace barvením stříbrem, FA a PCR.
Materiály a metody:
Růst inokula:
io Jedna normální láhev 75 cm2 byla zaočkována 3,75 x 10s buněk
HEp-2 v DMEM/10 % FBS a ponechána růst 18 - 24 hodin při 37 °C •l ’ 'λ,··.
a koncentraci CO2 5 % (v'době inokulace byly buňky vé stádiu 30 % ‘konfluence). Jedna ampule N72994 byla zředěna v 15 ml DMEM/5 % FBS. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuóvána 15 a plyn byl nahrazen*vodíkem a oxidem uhličitým za poskytnutí směsi
8,0 %’ O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Kultura dostala čerstvé médium
DMEM/5 % FBS ve 24. hodině. ; v
Kultury byly inkubovány 6’dnů, potom byly z láhví seškrabány
M.. 1 i . · J a přidány do 100 ml rotačních láhví obsahujících 50 ml DMEM/5 % 20 FBS. Objem láhve byl zvětšován zdvojováním objemu média v týdenních intervalech. Kultura rostla v rotační láhvi 3 týdny..
Sklízení kultur:
Kultura byla sklizena centrifugací 20 minut při 3000 x g. 25 Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a 4 x protlačena jehlou kalibr 25. Inokulum bylo naředěno na konečný objem SPG/10 % FBS a byla připravena ředění
9«
9» 9« • · · «. « * * · · 9 9 \ ««.*·** · j ·- * ► *' 9 9 * ··# · « 9 · < 9 9 .99» *·=. _ _ 9999 <9 9· 999« 99 99
- 30 Inokulum pro kontroly se skládalo z neinfikovaných buněk HEp2 neředěných na stejnou koncentraci životaschopných buněk jako kultura infikovaná. Buňky byly sklizeny stejným způsobem jako infikovaná kultura. Kontrolní prasata dostala podobnou dávku buněk jako skupina s vysokou dávkou.
Kvantifikace L. intracellularis:
Kvantifikace životaschopných buněk L. intracellularis byla prováděna určením dávky infikující tkáňovou kulturu z 50 % (TCIĎ50).
To bylo provedeno odebráním 2 ml kultury k testování a iyzí buněk čtyřnásobným, průchodem jehlou kalibr 22. Vzorek byl sériově, ředěn 1 ?10 DMEM/5 % FBS obsahujícím vankomycin' (100.. pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Ředění byla přidávána do 96 jamkové mikrótitrační destičky v množství 0,1 ml/jamku. Mikrotítrační destičky byly naočkovány buňkami ΉΕρ-2 na koncentraci 2500 buněk/jamku a před. infekcí ponechány růst 18 až 24 hodin. Bylo použito 12 jamek na jedno ředění. Destička byla iňkubována 6 dnů v atmosféře 8,0 % , . ,·..·; ,02,^.8,8,%_CO2>a„83,2„%-N2.-Bunky.byly-fixoványstudeným roztokem50 % aceton a 50 % methanol po dobu 2 minut. K jamkám bylo přidáno
0,03 ml/jamku monoklonální protilátky anti- L. intracellularis (McOrist,
1987), zředěné v poměru 1 : 2000 PBS. Destička byla 30 min inkubována při 37 °C a potom třikrát promyta PBS, V koncentraci 0,03 ml/jamku bylo přidáno antimyší FITC zředěné 1 ; 30 a inkubováno 30 min při 37 °C. Destička byla promyta třikrát destilovanou vodou a
2s ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a bylo určeno číslo TCI D5o/ml.
4 4 4 4* .· « 4 4. 4 4 « 9 4 4 4 4 .4 .» 4 4 41 4 4
4 4 4
44*44 44' 44
-31 14 4 4 4 4 4 4 '· 9 9 9 9 \ 4 4 • 4 »j 4 4
9 * ·· 4
4 4 4· 4 4
Zvířata:
Třicetjedna prasat obojího pohlaví a věku šest týdnů bylo získáno od dr. Kenta Schwartze. Prasata byla v den 0 náhodně rozdělena do Čtyř kotců podle váhy.
Umístění zvířat:
Pro umístění zvířat byly použity čtyři kotce v malé ošetřovně, každý oddělen alespoň 90 cm. Kotce měly drátěnou podlahu a byly odděleny pevnou přepážkou. Prostor byl vytápěn s dodatečným io zahříváním topnými lampami. Teplota byla během trvání studie udržována mezi 26 a 29 °C.
Krmivo a voda: '
Zvířatům:byla do nerezových žlabů podle libosti podávána dieta is obsahujícíí, 19^%'. proteinů;: složená z drcené kukuřice a sóji . bez antibiotik. Voda byla rovněž podávána podle libosti.
Infekce prasat:
V den 0 byla prasata zvážena a kapilárou v retroorbitáiním sinu z) jim byly odebrány vzorky krve. Sérum bylo odděleno a skladováno zmrazení při -20 °C. Pro PCR byly také odebrány výtěry výkalů.
Prasata dostala 10 ml inokula, podaného žaludeční sondou.
Ošetření Počet prasat
Kontrola - neinfikované buňky 5
Kontrola - bez ošetření 2
Vysoká dávky 8
Střední dávka 8
-32: « 0 0 · 9 9 Μ 9 '· 9
0 0 9 0 0 <99
9099 09 ·* ···* ··: 90'
Nízká dávka 8
Prasata byla ve dnech O, 10, 17 až 24 zvážena a byly jim odebrány vzorky krve.
Polymerázová řetězová reakce:
Infekce prasat byla monitorováno PCR s použitím primerů a parametrů cyklování jak bylo popsáno v: Jones (1993). PCR byly testovány vzorky fekálií odebrané ve dnech 0, 7, 14, 21 a 24 stejně jako sliznice střev.
-io
Histopatoloqické vyšetření:
Řezy ilea, jéjuna a kolonu byly fixovány formalinem, běžným způsobem zpracovány, barveny ilematoxylinem a eosinem, impregnovány stříbrem- a vyhodnoceny. Řezy byly rovněž barveny is s použitím monoklonální protilátky specifické proti L. intracellularis.
Výsledky: .' .
+f
Klinické příznaky:
Klinické příznaky spočívající v řídké stolici byly u vysoké dávky 20 poprvé pozorovány po třech dnech. Příznaky vrcholily ve čtrnáctí dnech a potom se začaly rozlišovat.
Přírůstek hmotnosti:
Byly počítány průměrné denní přírůstky hmotnosti, které 25 ukázaly, že skupina, které byla podána vysoká a střední dávka, měla ve srovnání s kontrolní skupinou snížené hmotnostní přírůstky. Při porovnávání skupin z hlediska přírůstku hmotnosti bylo možno pozorovat účinek titrace dávky.
s a · . · a « » a a . a a; « a · a · · ·· . - .. · atá a ·* ··«· ' a a · a. · · . * a i aa»» aa aa aaáa · aa -33-
5 PCR: Do čtrnácti dnů nebyl pozorován úbytek stolice. Po 21 dnech bylo 37,5 % prasat, kterým byla podána vysoká dávka, ve fekáliích PCR pozitivní. Po nekropsii byly střevní sliznice testovány PCR s výsledkem 100 % pozitivních u vysoké dávky, 75 % u střední dávky, 50 % u nízké dávky a 0 % u kontroly.
a 10 Makroskopická poškození: Makroskopická poškození byla nalezena u dvou prasat s podanou vysokou dávkou (# 50 a # 202). Prasata měla přibližně 90 cm ztluštění střev, v případě # 202 s nekrózou.
15 Histopatoloqické vyšetřením FA:
Barvení FA řezů ilea, jejuna a kolonu odhalilo, přítomnost, J.. r, Γ intracetlularis v 87,5 % u vysoké dávky, 62,5 % jak. u střední/ ták i malé dávky a 0 % u kontrol.
20 Mikroskopická poškození: ’
. φ1 . 25 Poškození byla pozorována ve 100 % případů u vysoké dávky, 75 % u střední dávky, 87,5 % u nízké dávky a 14 % u kontrol. Tato poškození byla stanovena pozorováním zvýšeného množství mononukleárních buněk v lamina propria a podslizniční vrstvě, často spojeným s hyperpiazií Peyer's Patchers. Byla také pozorována hyperplazie krypt.
« 0 · t * 0 0 > * · 0 • ·' 0 · 0 ·' ' * t 0 0 • 0 0 0 ·' «''0/ 00 0 ·'· «000 0 0 0' 0 «
0000 00 «0 0000 «0. 0«
- 34 Barvení stříbrem:
Bylo provedeno barvení řezů na přítomnost intracelulárních zakřivených bakterií. V 87,5 % případů vysoké dávky, 62,5 % střední dávky a 87,5 % nízké dávky byla přítomnost bakterií pozorována, zatímco u kontrol pozorována nebyla.
Diskuse:
Prasata byla úspěšně infikována čistými. kulturami L. intracellularis. V dávkách 107 bakterií vykázalo 100 % prasat infekci io zjištěnou PCR a mikroskopickými poškozeními. Vážnost poškození ř
a množství bakterie v tkáňových řezech byla relativně nízká. Tato studie je uspokojivým modelem testovacího podávání L intracellularis díky přítomnosti L. intracellularis a mikroskopických poškození u prasete. Poškození se mohou zvětšit druhou dávkou, následující sedm dní·po dávce první.?. ' _ Příklad 5 ______' _ J _________ ; . /_________ .. .
Testování účinnosti vakcíny u křečků 1
Cíl: .
2o Cílem experimentu bylo najít laboratorní zvířecí model pro stanovení bezpečnosti a účinnosti avirulentní. živé vakcíny L. intracellularis u křečků.
Souhrn:
Byla uskutečněna studie na 40 křečcích vakcinaci třítýdenních křečků Čistými kulturami vysoce pasážovaného kmene 1 L. intracellularis a testovacím podáním 22 dnů po vakcinaci čistými kulturami virulentního materiálu s nízkým počtem pasáží. Křečci bylo rozdělení do tří skupin. Skupina A byla vakcinována jednou dávku L.
* · » · • 0 a> 0 ·
000 0 0 ·, ·• ·
000*
-350 0 I. 0
0 0 0000 ··
0. 0 0 intracellularis kmene N72994 v den 0. Skupina B byla označena jako kontrolní skupina a vakcinační kultura jí nebyla podána. Oběma skupinám byly podány dvě testovací dávky čisté kultury kmene N343 L. intracellularis ve dnech 22 a 25 po vakcinaci. Skupina C dostala dávku testovacího kmene N101494 pro srovnání relativní virulence vzhledem ke kmenu N343. Skupina A a B obsahovala každá 15 křečků a skupina C obsahovala 10 křečků. Výsledky stanovení dávky infikující 50 % tkáňavých kultur (TCID50) ukázaly, že křečci byli vakcinováni 105 TCID5o/dávku. Testovací dávka N343 obsahovala 105,5 TCID50/dávku. io Testovací dávka pro skupinu C byla 102,75 TCID50/dávku. Fekální výtěry byly shromažďovány ve dnech 0, 7, 14, 21, 29, 36 a 43 pro testování polymerázovou řetězovou reakcí. (PCR). V den 21 bylo ze , skupin A. a B usmrceno vždy 5 zvířat pro testování sliznic pomocí FA, hematoxalinového a eosinového barvení a barvení stříbrem střevních is řezů pro určení přetrvávání osídlení bakteriemi u vakcinovaných křečků? Zbývající; zvířata:byla usmrcena 21 dnů po testovacím podání a vyšetřována· padobnýmzpůsobem.
Výsledky PCR ukázaly přítomnost L. /nřrace//u/ans ve střevních sližničíčh TOO % křečkůskupiny Á 21 dnů pp; vakcinaci. Skupina B ί1'
2o byla ve všech případech 21 dnů po vakcinaci negativní. 21 dnů po testovacím podání bylo 50 % křečků ve skupině A PCR pozitivní a ve skupině B bylo 100 % pozitivních. Histopatologické vyšetření řezů ukázalo mírné áž těžké poškození u 50 % zvířat ve skupině A a mírná poškození u 50 % případů ve skupině B, vždy 21 dnů po podání. 21 dnů po vakcinaci neměla poškození žádná zvířata. Skupina C neměla poškození 21 dnů pó testovacím podání. Barvení FA a stříbrem nebyla schopna dokázat přítomnost L. intracellularis u žádného řezu.
Je možno uzavřít, že u křečků vakcinovaných - vysoce pasážovaným kmenem L. intracellularis došlo při testování pomocí
PCR k 50 % snížení infekce. Střeva byla osídlena nízkým počtem intracelulárních organismů, jak bylo ukázáno nepřítomností
-36• « * » * « · fr
V « « · · 9 « »ι ·' 9 9 9·' 9 99 • ·. · « » · v ·· »·»· « 9 99 pozorovaných organismů u řezů s barvením FA a stříbrem. Křečci ve skupině C nebyli schopni dosáhnout propuknutí infekce v průběhu studie nejpravděpodobněji v důsledku nízké dávky bakterií.
s Materiály a metody:
Popis křečků:
Bylo-použito 40 tři týdny starých samic křečků Harlan Sprague Dawley.
io Růst inokula:
. .Kultura.vakciny:. . . .......... . í_. .....
Byla použita kontinuální kultura L. intracellularis rostoucí na buňkách HEp-2 po dobu 29 týdnů. Kultura byla pěstována podobným zpusobermjak bylo; uvedeno v části věnované testovací kultuře kromě toho; že na nové buňky HEp-2 přechází kultura každé dva až tři týdny.
' ' - .... .·' T - ; ·! *
Testovací kultury:
Jedna normální láhev pro tkáňové kultury 75 cm2 byla zaočkována 3,75 χ 105 buněk McCoys v médiu Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium (DMEM) s 10 % fetálního bovinního séra (FBS) a ponechána růst 18 až 24 hod při 37 °C v atmosféře s 5 % CO2. Z buněk bylo odstraněno médium a k láhvi byla přidána 1 lahvička N343 MSC X, zředěných 14 ml DMEM/2 % FBS. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuována a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za poskytnutí směsi 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Kultura rostla 6 dnů, potom byly buňky seškrabány do 100 ml rotační láhve s 90 ml DMEM/2 % FBS a 0,01 g kuliček Cultisphere-G. Kultura rostla v koncentraci plynů uvedené výše. Objem láhve byl •v»· · » » ·
0 0 0 · 0 0 0 \ 0 0 0 0 0 0 0I 000 · · «
0.000 0 0 000 «000 00 00 0000 00 00
-37zvětšován zdvojováním objemu média v týdenních intervalech. Kultura rostla 25 dnů v rotační láhvi na konečný objem 250 ml.
Kmen N101494 byl pěstován stejným způsobem jako kmen
N343.
Sklízení kultur
Vakcinační-kultura:
Kultura byla sklizena centrifugaci 20 min pří 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s io 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Inokulum bylo naředěno na konečný objem (15 ml) SPG/10 % FBS. >
L ····*’..
Testovací kultury:
Kultura'byla; sklizena centrifugaci 20 min při 3000 x g. Biomasa is byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Inokulum bylo > - rf. r '-™~--paj:^ěn0-^'(^necňýTjbjěm^
N101494) SPG/10 % FBS.
Dávkováni:
Vakcína:
V den 0 byly všichni křečci ve skupině A ústy vakcinováni 1 ml připravené vakctny.
Testovací podání:
dnů po vakcinaci dostalo 10 křečků skupiny A a 10 křečků skupiny B orálně dávku 0,5 ml testovací kultury kmene N344. Skupina C dostala 0,5 ml testovací kultury kmene N101494, * 4 v · « > · v ·-> 4 • · · * · ·· « «·«!·. · ttjl ··· ·' · ····<· · · » • tttt· ·· ·· ····' ·· ··
-38Určení počtu IS Intracellularis:
Určení počtu životaschopných IS intracellularis bylo provedeno určením dávky infikující 50 % tkáňové kultury (TCIDso). To bylo provedeno odebráním 2 ml kultury pro testování a lyží buněk čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 22. Vzorek byl sériově zředěn 1 : 10 v médiu DMEM/5 % FBS s obsahem vankomycinu (100 μρ/πηΙ) a amfotericinu B (2,0 pg/ml). Ředění byla rozplněna v množství 0,1 ml/jamku do 96 jamkové mikrotitrační destičky, která byla zaočkována io buňkami McCoys v počtu 1250 buněk na jamku a před infekcí inkubována 18 až 24 hodin při 37 °C a koncentraci C02 5 %, Bylo použito 12 jamek na jedno ředění. Destičky byly inkubovány 6 dnů při koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CÓ2 a 83,2 % N2; V den 6 byly buňky fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % methanolu is po dobu 2 min. K jamkám bylo přidáno 0,03 ml/jamku anti-IS intracellularisimonoklonální protilátky zředěné 1 : 2000 PBS. Destička byla 30 min inkubována při 37 °C a potom třikrát promyta PBS. Bylo přidáno antimyší, FITC zředěné 1 : 30 v množství 0,03 ml/jamku a inkubováno 30' min při 37 °C. Destička byla třikrát promyta • . . -I destilovanou vodou a ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a byla určena hodnota TCID50/ml.
Monitorování infekce u křečků:
Infekce u křečků byla monitorována PCR s použitím primerů a parametrů cyklů, jak bylo popsáno u Gary Jonese. Fekální vzorky byíy odebrány v den 0, 7, 14, 21, 29, 36 a 43 po vakcinaci. Po usmrcení křečků byla pomocí PCR testována také střevní sliznice.
ft * • · 9 · · · ·:·.· 9 9
9 9 9 · 9';- ·9· 9 9 • 99 9, 99 \9 9 9
9999 99 99 9999 99 »·
-39Histopatologické vyšetření:
Řezy ilea a kolonu byly fixovány formalinem, běžným způsobem zpracovány, obarveny hematoxylinem a eosinem, impregnovány stříbrem a vyhodnoceny. Řezy byly také barveny monoklonální protilátkou specifickou proti L. intracellularis.
Průměrné denní přírůstky hmotnosti:
Hmotnosti křečků byly zjišťovány 21, 28, 35 a 42 dnů po vakcinaci pro stanovení průměrného denního přírůstku hmotnosti.
.10 .
Výsledky:
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
TCIDsc:·
Výsledky TCID50 ukázaly, že vakcinovaná skupina (skupina A) _____-.dostala. 10-..?l.TCID5o/křečka. Křečkům-ve,skupinách-A-a-B^bylyTpodány— testovací dávky kmene N343 v množství 103 5 TCID50. Skupina :C dostala testovací látku kmene N101494 v množství 102,75 TCID50/křečka.
PCR:
Testování PCR ukázalo přítomnost L. intracellularis u 100 % vakcinovaných křečků, kteří byli usmrceni 21 dnů po vakcinaci. Testování 43 dnů po vakcinaci ukázalo, že 100 % kontrolních křečků 25 a 50 % vakcinovaných křečků bylo infikováno L intracellularis. Pozitivní nebyl žádný z křečků, který dostal testovací dávku N101494. Vylučování bakterie stolicí nebylo v průběhu studie u žádného z křečků prokázáno.
• 9 9 9
9 l · a ♦ a 9 · ·
9 9 • ·
- 40 '9 · a a • a · aaaa ·· «
• · • 9 « 9
999
Histopatologické vyšetření:
Barvení Η & E neukázalo žádná hístologická poškození u všech řezů z křečků usmrcených 21 dnů po vakcinaci. V řezech odebraných
43 dnů po vakcinaci mělo 50 % vakcinované skupiny mírnou až těžkou lymfocytickou enteritidu a 50 % kontrolní skupiny mělo mírnou lymfocytickou enteritidu. U skupiny, které byla podána testovací dávka N101494 nebylo zpozorováno žádné poškození. Barvením FA· se u žádného z křečků 43 dnů po vakcinaci nepodařilo prokázat bakterii io L. intracellularis.
I . ' '· Diskuse: ' -.....
LÍ křečků vakcinovaných vysoce pasážovaným kmenem L. intracellularis bylo pozorováno .50 % snížení infekce při testování is pomocí PCR.: .
OJ
4 4 4 4 • 4 4 4
4 4 · 4 * • 4 4 4 * • 4 44 4444
4 4 4
4.44 ·4·4 4
4 4
4 4 4
1 1 1 1 1 1 1 ' 1 1 1
1 1 1 1 1 1 t 1 1 1
I l 1 1 1 E1 LU 1 r- LLI T- LU T“ LU 1
NA NA ' NA NA NA + + + + + + +
+ - + : ' + + + NA < Z ♦ j NA NA NA ·<. ; z < z
NA NA NA i 1 NA NA 1 i 1 1 1 : 1 .
NA NÁ <·· Z, NA NA 1 1 1 t 1
*?< Z < Z Z Z ’ < ' Z 1, 1 — ’ i Γ r | f'
1 1 I J 1 1 1 1 1 i 1 1
1 1 1 1 J • 1 ) 1 - ' 1 1
í 1 ř 1 1 1 1 1 1 1
1 1 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1
A-11 A-12 CO τ- ι . < τι < A-1 5 B-1 B-2 B-3 TT 1 m B-5 B-6 B-7
0 0 0
0 00
0«·· 0
0 0
00
Τ 0 · • 9 • · «ί · 0 • 0 * «000 0«
0 · 0 0.4
0 · «000
1 ί 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 t 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 ( ί 1 1 t
+ .+ + ΝΑ ΝΑ ΝΑ ΝΑ ΝΑ 1
ΝΑ ΝΑ .· i ΝΑ 1 1 1 1 ΝΑ ΝΑ ΝΑ VN
1 · 1 1 ΝΑ ΝΑ ΝΑ < ζ ΝΑ 1 1
κ I 1 ΝΑ ΝΑ ΝΑ ΝΑ ΝΑ 1 1 1
-<7 Ζ -’<* Ζ · I
1 ' J 1 '< ζ ’< - Ζ <- Ζ 1 1 7 d 1
1 1 1 1 1 1 J 1
I 1 ί r • r 1 1 1 1 ( -
I 1 1 ι 1 ι . 1 1 1 1
J 1 ι ι 1 ι 1 1 1 1 1
Β-8 Β-9 ο τ— ώ T“ V“ ώ Β-12 Β-13 Β-14 m T“ ί CQ C-1 ÍM 1 ο C-3 C-4
* 4 4 4 4 4 • 4 4
4 ' • 4 «
4 4
444 4 44
4 ·· 444« f
• 4 ·« • * 4 * 4 4
4·· 4
4 4
4 44
( . t 1 4 1
1 1 1 1 1
- 1 1 1
I 1 1 1 1 1 ·
NA NA NA NA NA NA
1 1 1 4
1 • 1 1 1 1 ,
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1
1 1 1 t 1 t
1 1 1 1 1
C-5 C-6 R- 1 o C-8 C-9 C-10
<n
Ό (fl
T3
0) c
(1) c
Ό <D
CO
II
CQ
LU
0) c
Φ '(0 c
>N >
II
TT
LU w
φ φ » · ·
-45 φ φ . φ · · φφφφ • . · · · «- φ · · β · φ φ • φ φ Φ φφ φφφ • ΦΦΦ φφ φφ φφφφ φφ Φβ
Příklad 6
Zjišťování účinnosti vakcíny u prasat
Cíl:
Předmětem této studie bylo vyhodnotit bezpečnost, přetrvávající 5 osídlení bakteriemi a účinnost avirulentního živého izolátu a usmrceného izolátu L. intracellularis u prasat ve věku dvou až tří týdnů. Byla prováděna studie na hostitelských zvířatech, ve které byla vakcinována prasata ve věku tří týdnů a potom vystavena virulentní testovací dávce L. intracellularis kmene N343 pro srovnání rozdílů v ochraně mezi vakcinami.
Metody:
11. prosince 1995 bylo zakoupeno od firmy Η & K Farms celkem 45 prasat ve^ věku tří. týdnů. Prasata byla převezena do výzkumné stanice;. Veterinary·-- Resources, lne., která se nachází v blízkosti Cambridge, lowa, kde byla označena pro identifikaci každého __-—. jednotlivce.... Prasata -byla· v-této-výzkumné - stanici-1* dva “dny před™ začátkem pokusů pro umožnění aklimatizace na stanici a v průběhu studie byla krmena stravou bez antibiotik. , χ 13. prosince byla všechna prasata zvážena, byly jim odebrány vzorky krve pro získání séra, byla klinicky vyšetřena a byly odebrány rektální výtěry. Prasata potom byla náhodně rozdělena do skupin po pěti a umístěna v kotcích. Dvacet prasat bylo umístěno do> oddělené místnosti a byla označena jako kontrolní skupina a přísně kontrolní skupina. Patnáct prasat bylo umístěno ve druhé místnosti pro vakcinaci ISi-1. Ve třetí místnosti bylo deset prasat pro vakcinaci ISi2.
Živá vakcína byla připravena v laboratoři NÓBL Laboratories Research and Development a identifikována jako experimentální řada • · · · · · • · ·' * · · ··»· · ·*·· ♦ » · · ···· ·· ·· ···» ·· *·
- 46 ISi-1. ISi-1 (kmen N343) byla izolována z prasete a ponechána kontinuálně růst v čisté kultuře 29 týdnů. Vakcina rostla na buňkách McCoys v rotačních lahvích při sníženém množství kyslíku, dokud nebylo zjištěno přibližně 100 % infekce. Vzorek vysoce pasážovaného kmene N343 použitý pro ISi-1 byl pěstován dalších 11 týdnů („N343NP40wk“) a uložen v souladu s Budapešťskou dohodou 22. 5. 1996 v ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852 a označen depozitním číslem 55783. Kultury byly sklizeny centrifugací při 3000 x g 20 min. Biomasa byla resuspendována io v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Lyzáty byly centrifugovány při 500 x g 5 min pro odstranění úlomků buněk a mikronosičových
- kuliček. Supernatant- byl uschován a skladován při - 70--0C až. do přibližně jedné hodiny před vakcinací; kdy byl do podání skladován na ledu.
Usmrcená vakcina (ISi-2) byla pěstována, pasážována po dobu 12,5 týdne a sklizena'podobným způsobem jak bylo uvedeno výše a čištěna gradientem percolu. Čištěné bakterie byly skladovány při ^‘70 , °Č až do doby přibližně i týden před vakcinací, kdy byly: skladovány 20 při 4 ’C a normální atmosférické koncentraci kyslíku, která je pro L.' intracetlularis toxická. K bakteriím byl přidán. AIOH až do dosažení . složení konečné směsi 10 % AIOH. Koncentrace proteinu byla stanovena biuretovou metodou.
Stanovení množství živých IS intracellularis:
Stanovení počtu životaschopných bakterií L. intracellularis bylo provedeno určením dávky pro infekci 50 % tkáňové kultury(TCiDso). 96 jamkové mikrotitrační destičky byly zaočkovány buňkami McCoys s koncentrací 1250 buněk/jamka a ponechány růst 18-24 hodin před χ infekcí. Vzorky byly sériově naředěny 1 : 10 DMEM/5 % FBS obsahujícího vankomycin (100pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml).
.· · · · · · *« .
• · · *··« «··« . Τ- \ «« **}*· ·*
I · ·«··'· *·«··« • ·'· ·.·· ··.
- 47 - *'**’ *’ ...... ” “
Zředěné vzorky byly přidávány do 96 jamkových mikrotitračních destiček v množství 0,1 ml/jamku. Bylo použito 12 jamek na jedno ředění. Destička byla inkubována 6 dnů při 37 °C a koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. Buňky byly fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % methanolu po dobu dvou minut. Do jamek bylo přidáno 0,03 ml/jamku monoklonální protilátky anti- L. intracellularis (vyvinul dr. Steven McOrist), zředěné 1 . 2000 v PBS.
Destička byla inkubována 30 minut při 37 °C a potom třikrát promyta PBS. Byl přidán konjugát antimyší imunoglobulin G - fluorochrom io (FITC) zředěný v poměru 1 : 30 v množství 0,03 ml/jamku a destičky byly inkubovány 30 min při 37 °C. Destička byla promyta třikrát
I '* destilovanou vodou a ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány
... fluorescenčním.....mikroskopem a .* hodnoty TGIDso/ml byly určeny ’ s použitím Reed-Meunschovy metody výpočtu.
is Hodnoty TCIDso ukázaly, že ISi-1 měla 1,8 x 10s bakterií/ml. '
Čtvrté inokulumbyloplacebo a bylo odvozeno z buněk tkáňové kultury zpracovaných .stejným způsobem jako vakcíny.
Usmrcená vakcína byla testována biuretovgu;,metodouřna / celkový obsah proteinu, který byl zjištěn 0,311 mg/ml. i
Prasata byla vakcinována 13. 12, 1995. Živá vakcína byla všem podána v dávce 2 ml intranazálně po 1 nríí do každé nozdry. Vakcína ISi-2 (usmrcená) byla podána IM v dávce. 1,5 ml na prase a znovu o 14 dnů později. Všechna kontrolní zvířata dostala stejným způsobem jako živé vakcíny neinfikované buňky.
Pozorování a vzorky:
V průběhu studie byiy v sedmidenních intervalech odebírány fekální výtěry a vzorky séra. Fekální výtery byly zpracovány pro PCR testování s použitím sady primerů 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3’ a 5’-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3’ pro amplifikaci DNA. Parametry ·· 0··· ·· *· ' 0 * ♦ *·»·0··β \ Λ· w · · 4 · 0 0 0: · 1 . · ««»·0000·0 . _ ·*·· ·«
- 48 - ···* *..........
cyklů byly 93 °C 5 minut, 55 °C 45 sekund a 72 °C po dobu 45 sekund pro první cyklus. Bylo provedeno 33 cyklů při výše uvedených teplotách se 45 sekundami na každou teplotu. Poslední cyklus byl 93 ’C 45 sekund, 55 °C 45 sekund a 72 eC 2 minuty, přičemž příměry byly definovány Jonesem a dalšími.
Podávání testovacího mikroorganismu:
Všechna zvířata kromě přísných kontrol dostala testovací dávku kultury 26 a 27 dnů po vakcinaci, skládající se z nízkopasážovaných io kultur L. intracellularis kmenů N343 a N72994, které byly pěstovány kontinuálně mezi 8 a 12 týdny. Kultury byly sklizeny centrifugováním při 3000 x g 20 min. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % fetálního bovinního séra a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Některé sklizené kultury byly is skladovány, při - 70 °C až do doby podání; zatímco jiné byly pěstovány až do.’ dne podánha potom sklizeny. Inokulum testovacích dávek bylo spojeno a bylo stanoveno TCID5okultur. Vzorky byly skladovány až do.
^_Éání_na ledu. _____., v ·,·- 1
V- V ?*
Testovací kultura byla podána 8, 1. 1996 a obsahovala 4 x 104 20 bakterií/ml a testovací kultura podaná 9. 1. 1996 obsahovala 3 x 104 bakterií/ml. Prasatům bylo podáno oba dny žaludeční sodnou 15 ml testovací dávky. Zvířata tedy dostala 6 x 10s bakterií/prase a 4,7 x 10s bakterií na prase 8. 1. 1996, popřípadě 9. 1. 1996.
Výsledky:
Test bezpečnosti:
Výsledky fekálního PCR:
Detekce L. intracellularis pomocí PCR ukázala, že na počátku studie nevylučovala bakterie žádná prasata. Sedm dnů po vakcinaci
-49 fefe fefefe· fe fefefefe ·« fefe • fefe fe „ · fe · fe ·. ·' • . · · · ·· · fefefe* • fe 1 fe* • fefe · • fe ·· fefe· · fe fefe · fefe , « byla všechna zvířata negativní. Čtrnáct dnů po vakcinaci byla tři prasata ve skupině ISi-1 pozitivní. Ve skupině ISi-1 byla 21 dnů po vakcinaci dvě zvířata pozitivní a všechna ostatní prasata negativní. Dvacátý šestý den po vakcinaci nevylučovala podle detekce PCR s bakterie žádná zvířata. 26 dnů po vakcinaci bylo usmrceno pět prasat ze skupin ISi-1 a kontrol a Čtyři prasata ISi-2. Byly odebrány vzorky ilea, kolonu, mezenterické lymfatické uzliny a tonsil stejně jako vzorky plic u prasat s nálezy s podezřením na pneumonii.
U jednotlivých vzorků ilea a plic bylo provedeno testování PCR. io Tonsily, kolon a lymfatické uzliny byly u jednotlivých skupin spojeny a bylo provedeno PCR. Výsledky testování PCR jsou uvedeny níže.
Skupina PCR ilea 26 dnů po vakcinacř Spoienv koion Spojené tonsílv s Spojené mezenter. lymf.uzlinv Spojené plíce
ISi-1 1.z5 + - - 1 z 1
ISi-2 0 z 4 — A Ozt
------------- Λ -------——1 ·*- ‘ · '**·—7^·, ---—I^!· '>! ·
Kontroly 0z5 ť1 - 7 * ’* ·'··· it- netest.
Přísné kontroly netest. netest. netest. netest. . netest.
Histologické řezy ilea byly barvený použitím monoklonální is protilátky specifické proti L. intracellularís jako primární protilátky a konjugátu antimyší imunoglobulin G - fluorochrom jako sekundární, protilátky, L. intracellularís byla pozorována u tří z pěti prasat ze skupiny ISi-1. Metodou barvení fluorescenční protilátkou byla všechna ostatní zvířata negativní.
- 50- ...... ’* *·** ·· *
Zbývající zvířata byla usmrcena 21 dnů po podání testovací dávky a těmto zvířatům byly odebrány vzorky pro vyhodnocení. Výsledky PCR jsou uvedeny níže.
Skupina PCR ilea 21 dnů po vakcinaci Sooienv kolon Spojené tonsilv Spojené mezenter. Ivmf. uzliny Spojené plíce
ISi-1 0 z 10 + - - -
ISi-2 0z6 - -
Kontroly 4 z 10 - . - ·' -
Přísné kontroly 0z5 -k 1 : ·· .
FA-barveníeílea bylcnprovedeno jak bylo uvedeno výše, přičemž v kontrolní skupině bylo'pozitivních sedm zvířat z deseti. Všechna ostatní zvířata byla na přítomnost L. intracellularís.negativní.
Sérum bylo testováno na produkci’protilátky IgG u prasat po 10 expozici L. intracellularís. Test 3 byl proveden zaočkováním Terasakiho destiček upravených pro tkáňové kultury buňkami McCoys v počtu 125 buněk/jamku, které byly ponechány před infekcí růst‘18 24 hodin. Potom byla do jamek přidána Čistá kultura L. intracellularís, zředěná na 1000 - 3000 bakterií/ml DMEM s 5 % fetálního bovinního is séra v množství 0,01 ml/jamku. Destička byla inkubována. 6 dnů při koncentracích plynu 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. Buňky byly fixovány studeným 50 % acetonem a 50 % methanolem po dobu dvou minut. Séra pro prasata byla zředěna 1 : 75 sterilním PBS. Zředěné sérum bylo přidáno do jamek v množství 0,01 ml/jamku. Destičky
2o potom byly inkubovány 30 až 60 min při 37 ’C. Destičky byly promyty pětkrát sterilním PBS. K jamkám bylo přidáno 0,01 ml/jamku konjugátu φφ »♦·· • * · · Φ· ·φ • · · · · · φ • · · φ φ • φ ··· φ φ • φ φ · φ ··' «φφφ φφ φφ antiprasečího IgG imunoglobulinu G - fluorochrom. Destičky byly inkubovány 30 min pří 37 °C. Potom byly pětkrát promyty destilovanou vodou a ponechány usušit. Vzorky byly promyty pětkrát destilovanou vodou a ponechány usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a jamky, ve kterých byly pozorovány bakterie, byly označeny jako pozitivní a jamky, ve kterých žádné bakterie pozorovány nebyly, byly označeny jako negativní.
Výsledky:
Skupina Den 0 26 dnů po vakcinaci 47 dnů po vakcinaci, 21 dnů po testovacím podání
ISi-1 Oz 15 6 2 15 “........; 8 z to
ISi-2 0 z 10 3 z 10 5z6
Kontroly.. ’ 1 z 15.. 0 z 15 9z10
Přísné, kontrolyr i- 0 z 5 · 0 z 5 0 z 5
10 · * ·· · 1 /' '
Zvířata, která byla pozitivní v den 0 byla opět testována v týdenních intervalech. Výsledky ukázaly, že se všechna stala sérologicky negativními do 14 dnů po vakcinaci. To není nečekané, protože věk prasat v den 0 byl tři týdny a pozitivní výsledky v tomto is věku by mohly být způsoben protilátkami matky.
Séra byla testována spolu s pozitivními kontrolními séry získanými hyperimunizací prasete L intracellularis pěstovanou v čisté kultuře. Použité negativní kontrolní sérum bylo odebráno z gnotobiotického prasete v South Dakota State University.
2o Výsledky uvedené výše a příklady jsou pouze ilustrativní pro výhodná provedení, která dosahují předmětů, rysů a výhod předkládaného vynálezu a předkládaný vynález jimi nemá být
V 9 9 » V 9 • í - · ·
9 · 99 * 9 9 I ,9.. ,9 4 ·· 9» •i 9 · 9 ' *' 9 9« • j 999 9 9 .· 9
9« «9 *» *
9 9 9 9 9
9·»« omezován. Za část předkládaného vynálezu jsou pokládány jakékoliv, modifikace vynálezu, které spadají do rámce následujících nároků.
Zastupuje:
φφ φφ·· ·* ·· · ·· ♦ · · · · · * • · ·· · ·· :·· • · * · · · · · · « ♦ — _ ··♦··· «φφ
- 53 - ·*·· ·· ·* ···· ·· ··

Claims (5)

1. Způsob kultivace bakterie L. intracellularis,
5 vyznačující se tím, že zahrnuje pro kultivaci uvedené bakterie kroky inkubace bakterie při koncentraci kyslíku méně než přibližně 18 % a udržování uvedené bakterie v suspenzi.
io 2. Způsob podle nároku 1, vyznaču jí cíše tím, ž e uvedená bakterie se nachází v buňkách buněčné kultury, které se udržují v suspenzi.“ ' ’ 3. Způsob.podle nároku 2, vyznačující se tím,
15 ž ,e zahrnuje; pro; zvýšeni produkce bakterie L. intracellularis další krok pasážování části uvedených buněk do čerstvých •i .
4- · ' - í f
4. Způsob podle nároku 3, vyzná č u jící se tím,
2o že dále obsahuje krok sklizení alespoň části uvedených buněk.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedená bakterie L. intracellularis se získá z živočicha,
25 infikovaného L. intracellularis.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e uvedeným živočichem je prase.
9 9 9
-549 9« 9 9 9
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e inkubace probíhá při koncentraci kyslíku v rozmezí od přibližně 0 % do přibližně 8 %.
s
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, ž e uvedená inkubace probíhá pří koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně
3 %.
io 9. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e uvedenými buňkami buněčné kultury jsou buňky zvolené · ...... ze skupinýHEp-2,.MčCoys á IEC-18.
10. Způsob podle nároku· 9,.; v yznačující se tím, 15 ž e buňky McCoy.s a IEC-18 se inkubují na mikronosičích.
11. Bakterie L. intracellularis,. pěstovaná způsobem* podle nároku 1.
fl
20 12. Způsob kultivace bakterie L. intracellularis, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
(1) inokulace buněk buněčné kultury inokulem obsahujícím bakterie L. intracellularis, aby došlo k infekci buněk Uvedenou bakterií; a
25 (2) inkubace uvedených infikovaných buněk při teplotě od přibližně 36 °C do přibližně 38 eC při koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně 8 % za míchání uvedených
0·
00 ·♦*· 0* 00 0«
0 0 · 0 00 0 '··«'· • · 0 · 0 ·. 0 · ·
1. 0 000 000000·· . 0 0 0 ··0 0··
1 ’ - 55 - ................
infikovaných buněk tak, že kultivace bakterií t. intracellularis probíhá při udržování infikovaných buněk v suspenzi.
13. Způsob výroby oslabeného kmene L. intracellularis, s vyznačující se tím, že zahrnuje získání buněk buněčné kultury infikovaných bakterií L. intracellularis, inkubaci uvedených infikovaných buněk v koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně 18 %, míchání uvedených infikovaných buněk tak, aby kultivace bakterií probíhala při y io udržování infikovaných buněk,v suspenzi, pasážování alespoň části kultivované bakterie, sklizení alespoň části kultivované bakterie a selekci oslabeného kmene pro získání oslabené bakterie L. intraceíiuiaris.
14. Diagnostický: tesť prosdetekci přítomnosti protilátek specificky reagujících·· .s·· L. intracellularis v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že využívá, bakterie L.
----mfrace//t//ar/sJvyprodukované^podle'~způ's'óbO'‘pó_dlě/liá7ókurH” nebo složky této bakterie.
15. Způsob určení přítomnosti protilátek specificky reagujících s bakterií L. intracellularis v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky získání buněk buněčné kultury infikovaných bakterií L intracellularis, inkubace uvedených infikovaných buněk při koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně 18 %, míchání uvedených infikovaných buněk tak, aby kultivace L. intracellularis probíhala při udržování infikovaných buněk v suspenzi, sklizení alespoň části kultivované bakterie L. intracellularis, získání biologického vzorku ze zvířete, uvedení získaného vzorku do «« ·»·* »» »« ·· ·· * · » · · · · · A β V · fr * · 9 · » • ♦ · » · · · ···· 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 9999 ,99 99 styku se sklizenou bakterií L. intracellularis nebo z ní odvozenou složkou za podmínek, při kterých protilátka přítomná v uvedeném biologickém vzorku reaguje s L intracellularis nebo její složkou a určení zda proběhla reakce s protilátka - antigen a tím i určení přítomnosti protilátky proti L intracellularis v uvedeném vzorku.
. 16. Vakcína pro vyvolání imunologické odpovědi proti bakterii L.
intracellularis u živočicha, vyznačující se tím, io že obsahuje oslabený kmen L. intracellularis ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž uvedený oslabený kmen je v účinném množství pro vyvolání imunologické \ odpovědi.
15 17. Vakcína -podle nároku ;16, vyznačující se tím, ž e uvedenýoslabenýkmen se produkuje podle nároku 13.
18. Vakcína pro vyvolání imunologické odpovědi proti bakterii L intracellularis u živočicha, vyznačující se tím,
20 že obsahuje usmrcenou bakterii L. intracellularis ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž uvedená bakterie se produkuje způsobem podle nároku 1, a je v množství účinném pro vyvolání imunologické odpovědi.
' 1
25 19. Vakcína podle nároku 16 nebo 18, vyznačující se . t i m , ž e L intracellularis infikující uvedenou buněčnou kulturu se připraví ze střevního homogenátu zvířete infikovaného L. intracellularis.
»9 9«
4 9 4 9
9 4 94
9 4 · 9 ·
4 ♦ «
9 4 44
20. Vakcína podle nároku 16, vyznačující se tím, ž e uvedeným oslabeným kmenem je kmen N343NP40wk.
-57«9 49*9
9 4 · • · · · • 4 · · ·
4 · ♦ · · 4 • 444 4« 44 9494
21. Způsob vyvolání imunologické odpovědi proti bakterii L.
5 intracellularis u živočicha, vyznačující se tím, ž e zahrnuje podávání imunologicky účinného množství vakcíny podle nároku 16 nebo 18 uvedenému zvířeti.
22. Oslabený kmen, vyznačující se io vyprodukován způsobem podle nároku 13.
Zastupuje:
CZ19973899A 1995-06-05 1996-06-05 Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína CZ295933B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/465,337 US5714375A (en) 1995-06-05 1995-06-05 Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US08/658,194 US5885823A (en) 1995-06-05 1996-06-04 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ389997A3 true CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
CZ295933B6 CZ295933B6 (cs) 2005-12-14

Family

ID=27041284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973899A CZ295933B6 (cs) 1995-06-05 1996-06-05 Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5885823A (cs)
EP (5) EP1655607B1 (cs)
JP (4) JP3765834B2 (cs)
KR (4) KR100544857B1 (cs)
AT (3) ATE441863T1 (cs)
AU (1) AU717045B2 (cs)
BG (1) BG64292B1 (cs)
BR (2) BR9608338B1 (cs)
CA (1) CA2222643C (cs)
CZ (1) CZ295933B6 (cs)
DE (5) DE122007000102I1 (cs)
DK (3) DK1645567T4 (cs)
ES (3) ES2294620T5 (cs)
FR (1) FR07C0071I2 (cs)
HU (1) HU230199B1 (cs)
LU (1) LU91405I2 (cs)
NL (1) NL300331I2 (cs)
NZ (1) NZ319994A (cs)
PL (6) PL189250B1 (cs)
PT (3) PT843818E (cs)
RO (1) RO118885B1 (cs)
RU (2) RU2265849C2 (cs)
WO (1) WO1996039629A1 (cs)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7022328B1 (en) 1995-11-30 2006-04-04 Australian Pork Limited Therapeutic and diagnostic compositions
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US7052697B1 (en) * 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
WO2000069904A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED FlgE POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
CA2372105A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7029683B1 (en) 1999-05-13 2006-04-18 Pfizer Products, Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
JP2003521881A (ja) * 1999-05-13 2003-07-22 オーストラリアン ポーク リミティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＯｍｐＨポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
NZ515332A (en) * 1999-05-13 2004-01-30 Pfizer Prod Inc Lawsonia derived gene and related SodC polypeptides, peptides and proteins and their uses
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
JP2004529854A (ja) * 2000-09-29 2004-09-30 アリゾナ・ボード・オブ・リージエンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・アリゾナ 増殖性回腸炎のための改善されたワクチン及びその作製と使用の方法
JP2004512851A (ja) * 2000-11-10 2004-04-30 アグリカルチュア　ビクトリア　サービシーズプロプライエトリー　リミティッド ラウソニア種による感染を処置する新規な治療用組成物
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
ES2266090T3 (es) * 2000-12-20 2007-03-01 Intervet International Bv Vacuna contra lawsonia intracellularis.
US20030087421A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-08 Gebhart Connie J Lawsonia intracellularis
AU2003295341A1 (en) * 2002-10-04 2004-05-04 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid and polypeptide sequences from lawsonia intracellularis and methods of using
DE602004023094D1 (de) * 2003-07-25 2009-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmed Lawsonia intracellularis europäischen ursprungs unür
CA2536989A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Akzo Nobel N.V. Lawsonia intracellularis subunit vaccine
BRPI0417440A (pt) * 2003-12-09 2007-03-06 Intervet Int Bv ácido nucleico, fragmento e molécula de dna, veìculo recombinante vivo, célula hospedeira, proteìna de lawsonia intracellularis, vacina para combater as infecções com lawsonia intracelularis, método para a preparação de uma vacina, e, testes de diagnóstico para aldetecção de anticorpos contra lawsonia intracellularis e material antigênico de lawsonia intracellularis
WO2005070958A2 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Intervet International B.V Lawsonia intracellularis subunit vaccines
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
MY146476A (en) 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
US20060021536A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Limin Song Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme
KR100621882B1 (ko) * 2004-09-30 2006-09-19 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법
US20090232848A1 (en) * 2004-11-24 2009-09-17 Pfizer Inc. Methods for cultivating lawsonia intracellularis
US20070212373A1 (en) * 2004-12-08 2007-09-13 Akzo Nobel N.V. Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
EP3868400A1 (en) 2005-12-29 2021-08-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
DK3766518T3 (da) * 2005-12-29 2026-04-13 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Immunogen pcv2-sammensætning til mindskelse af kliniske symptomer hos grise
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
EP2859900A1 (en) 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PT2094872T (pt) * 2006-12-15 2017-04-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Tratamento de porcos seropositivos para o anticorpo anti-pcv2 com antigénio de pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2200643B1 (en) 2007-09-17 2013-09-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. A live lawsonia intracellularis vaccine administered in combination with an antibiotic for use in the treatment of lawsonia intracellularis infections in pigs
CN101874106A (zh) * 2007-10-12 2010-10-27 辉瑞大药厂 培养胞内劳森氏菌的方法
CN101932336B (zh) * 2007-12-31 2014-07-09 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒
KR20100113582A (ko) 2008-01-23 2010-10-21 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법
EP2254595A4 (en) * 2008-02-15 2012-12-05 Boehringer Ingelheim Vetmed METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING THE IMPACT OF ENTERIC DISEASES
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
US8557254B2 (en) 2008-07-22 2013-10-15 Intervet Inc. Lawsonia intracellularis bacterium of a novel serotype, vaccine based on that bacterium, antibodies suitable for diagnosing the novel Lawsonia intracellularis serotype and hybridomas for producing the said antibodies
US8142760B2 (en) * 2008-09-05 2012-03-27 Nathan Len Winkelman Vaccination for Lawsonia intracellularis
WO2011006880A1 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis propagation
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US8530223B2 (en) * 2009-11-09 2013-09-10 Intervet International B.V. Method to grow Lawsonia intracellularis bacteria in persistently infected McCoy cells
MX361273B (es) 2012-12-28 2018-12-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Metodo para obtener una vacuna de mycoplasma.
CN105579060B (zh) 2013-09-25 2021-03-16 硕腾服务有限责任公司 Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法
MX373884B (es) 2013-10-02 2020-03-26 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína pcv2 orf2 y partículas similares al virus compuestas por ésta.
CN107206062B (zh) 2015-02-04 2021-07-02 英特维特国际股份有限公司 用于针对猪中亚临床劳森氏菌感染的疫苗
RU2709197C2 (ru) * 2015-02-04 2019-12-17 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина для применения против субклинической инфекции lawsonia у свиней
KR20180062468A (ko) * 2016-11-18 2018-06-11 녹십자수의약품(주) 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도
EP3758740A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Method for reducing skatole and/or indole in animals
EP4185321A2 (en) 2020-07-24 2023-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Combination porcine vaccine
US12409212B2 (en) 2021-11-01 2025-09-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic gel compositions
US20260103674A1 (en) 2022-09-27 2026-04-16 Intervet Inc. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
WO2024260953A1 (en) * 2023-06-23 2024-12-26 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
CN119185351B (zh) * 2024-09-25 2025-09-16 武汉轻工大学 Li0004蛋白靶点在制备抑制劳森菌感染细胞增殖的药物中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132597A (en) * 1976-06-09 1979-01-02 Ab Medipharm Method for cultivation of bacteria
US4237218A (en) * 1979-02-09 1980-12-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Micro-carrier cell culture
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
JPH0644865B2 (ja) * 1985-10-29 1994-06-15 三菱瓦斯化学株式会社 カンピロバクタ−属細菌の培養方法
US5338670A (en) * 1986-07-28 1994-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
IT1227657B (it) * 1988-12-01 1991-04-23 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione
JPH0822221B2 (ja) * 1988-12-28 1996-03-06 日東化学工業株式会社 シュードモナス属細菌の培養法
JPH02308754A (ja) * 1989-05-24 1990-12-21 Yakult Honsha Co Ltd 乳発酵食品の製造法
US5296221A (en) * 1990-01-31 1994-03-22 Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations
DK0555366T3 (da) * 1990-11-01 2000-08-28 Univ Iowa State Res Found Inc Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine
SU1768637A1 (en) * 1990-12-04 1992-10-15 Inst Virusologii Im D I Ivanov Strain of human immunodeficient virus 1-type for preparation of diagnostic preparation
DK0669971T3 (da) * 1991-11-15 2003-04-22 Pfizer Fremgangsmåde til fremstilling af Gram-negative bakterielle vacciner
DE4208785A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5610059A (en) * 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI9612938B8 (pt) 2017-09-12
PL325872A1 (en) 1998-08-17
RU2265849C2 (ru) 2005-12-10
JP5078740B2 (ja) 2012-11-21
EP1645567B2 (en) 2016-01-06
DE69637251T3 (de) 2016-06-02
EP0843818A1 (en) 1998-05-27
KR100513481B1 (ko) 2006-01-27
DE69634334D1 (de) 2005-03-17
EP1645567A1 (en) 2006-04-12
ES2332587T3 (es) 2010-02-09
EP1403643B1 (en) 2009-09-02
JP3920300B2 (ja) 2007-05-30
AU6262796A (en) 1996-12-24
HUP9900884A2 (hu) 1999-07-28
ES2173055T3 (es) 2005-07-01
FR07C0071I1 (cs) 2008-01-02
DK1645567T4 (en) 2016-04-11
RU2005114739A (ru) 2006-11-20
BRPI9612938B1 (pt) 2010-07-27
ES2294620T5 (es) 2016-03-23
JP4263212B2 (ja) 2009-05-13
DE69634334T2 (de) 2006-04-13
DE69637251D1 (de) 2007-10-25
NL300331I1 (nl) 2008-03-03
PL189250B1 (pl) 2005-07-29
JP2007151554A (ja) 2007-06-21
LU91405I2 (fr) 2008-02-21
CZ295933B6 (cs) 2005-12-14
DE69637251T2 (de) 2008-06-12
DK1645567T3 (da) 2007-11-26
BR9608338B1 (pt) 2009-05-05
PL189187B1 (pl) 2005-07-29
DK0843818T3 (da) 2005-05-09
PL187849B1 (pl) 2004-10-29
ATE441863T1 (de) 2009-09-15
ATE373015T1 (de) 2007-09-15
ES2173055T1 (es) 2002-10-16
CA2222643A1 (en) 1996-12-12
NZ319994A (en) 2000-01-28
PL187850B1 (pl) 2004-10-29
CA2222643C (en) 2013-08-13
JP2006061165A (ja) 2006-03-09
FR07C0071I2 (fr) 2010-12-31
DK1403643T3 (da) 2010-01-04
EP1655607A1 (en) 2006-05-10
KR20050048651A (ko) 2005-05-24
RO118885B1 (ro) 2003-12-30
PL189287B1 (pl) 2005-07-29
BG64292B1 (bg) 2004-08-31
EP1655607B1 (en) 2015-05-13
ES2294620T3 (es) 2008-04-01
EP2199795A2 (en) 2010-06-23
BG102130A (bg) 1998-09-30
KR100758614B1 (ko) 2007-09-13
DE843818T1 (de) 2002-11-28
EP0843818B2 (en) 2018-12-19
WO1996039629A1 (en) 1996-12-12
JP2008266340A (ja) 2008-11-06
BR9608338A (pt) 1999-01-05
AU717045B2 (en) 2000-03-16
EP2199795B1 (en) 2016-03-30
HUP9900884A3 (en) 2001-01-29
EP1403643B2 (en) 2018-10-03
DE122007000102I1 (de) 2008-04-17
KR20060129549A (ko) 2006-12-15
DE69638016D1 (de) 2009-10-15
NL300331I2 (nl) 2008-07-01
EP1645567B1 (en) 2007-09-12
EP2199795A3 (en) 2010-11-03
HU230199B1 (hu) 2015-10-28
EP0843818B1 (en) 2005-02-09
HK1010911A1 (en) 1999-07-02
MX9709464A (es) 1998-06-30
KR20050046741A (ko) 2005-05-18
US5885823A (en) 1999-03-23
ATE289069T1 (de) 2005-02-15
EP1403643A1 (en) 2004-03-31
KR19990022509A (ko) 1999-03-25
PT843818E (pt) 2005-04-29
JPH11507225A (ja) 1999-06-29
PT1403643E (pt) 2009-10-08
RU2305707C2 (ru) 2007-09-10
PT1645567E (pt) 2007-11-19
JP3765834B2 (ja) 2006-04-12
PL189286B1 (pl) 2005-07-29
KR100544857B1 (ko) 2006-01-24
EP0843818A4 (en) 2002-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ389997A3 (cs) Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína
RU2420570C2 (ru) Lawsonia intracellularis ЕВРОПЕЙСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ВАКЦИНЫ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ НА ЕЕ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CN1519311B (zh) 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂
HK1081594B (en) Lawsonia intracellularis cultivation in mccoy cell
MXPA97009464A (en) Culture of lawsonia intracellularis, vaccines against lawsonia intracellulares and agents of diagnost
HK1067662B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
HK1010911B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20160605