PL187850B1 - Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis - Google Patents

Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis

Info

Publication number
PL187850B1
PL187850B1 PL35816396A PL35816396A PL187850B1 PL 187850 B1 PL187850 B1 PL 187850B1 PL 35816396 A PL35816396 A PL 35816396A PL 35816396 A PL35816396 A PL 35816396A PL 187850 B1 PL187850 B1 PL 187850B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
intracellularis
cultures
bacteria
culture
Prior art date
Application number
PL35816396A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey P. Knittel
Michael B. Roof
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Nobl Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27041284&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL187850(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/465,337 external-priority patent/US5714375A/en
Application filed by Boehringer Ingelheim Nobl Lab filed Critical Boehringer Ingelheim Nobl Lab
Publication of PL187850B1 publication Critical patent/PL187850B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

1. Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis, zwlaszcza ATCC 55783, znamienna tym, ze obejmuje etapy: (1) zakazania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmujacej ho- dowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materialem zakazajacym obejmujacym bakterie Lawsonia intracellularis, tak by zakazic wymienione komórki wymieniona bakteria; i (2) inkubowania wymienionych zakazonych komórek w temperaturze od okolo 36°C do okolo 38°C w stezeniu tlenu od okolo 0% do okolo 8% podczas wytrzasania wymienio- nych zakazonych komórek i hodowania Lawsonia intracellularis z utrzymywaniem wy- mienionych zakazonych komórek w zawiesinie. 2. Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis wedlug zastrz. 1, znamien- na tym, ze obejmuje etapy: (1) zakazania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmujacej ho- dowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materialem zakazajacym obejmujacym bakterie Lawsonia intracellularis, tak by zakazic wymienione komórki wymieniona bakteria; i (2) inkubowania wymienionych zakazonych komórek w temperaturze od okolo 36°C do okolo 38°C w stezeniu tlenu od okolo 5% do okolo 8% podczas wytrzasania wymienio- nych zakazonych komórek i hodowania Lawsonia intracellularis z utrzymywania wymie- nionych zakazonych komórek w zawiesinie. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Zakażenie L. intracellularis powoduje znaczne straty szczególnie w stadach świń. Oceniając rozpowszechnienie i występowanie PPE w USA szacuje się, że około 20 procent trzody chlewnej jest zakażone z szacunkową stratą 20 milionów dolarów rocznie.
Stałą cechą PPE jest występowanie wewnątrzcytoplazmatycznych, nie związanych z błoną zakrzywionych bakterii w enterocytach zakażonych fragmentów jelita. Bakteria związana z wywołaniem PPE opisywano jako „organizmy podobne do Campylobacter”. S. McOrist i in., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989). Następnie, bakteria wywołująca to schorzenie została zidentyfikowana jako nowy taksonomiczny rodzaj i gatunek, endemicznie opisywany jako wewnątrzkomórkowy symbiont jelitowy (IS). C. Gebhart i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 43, No 3, 533-38 (1993). Obecnie, tym nowym bakteriom nadano taksonomiczną nazwę Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 45, No 4, 820-25 (1995). Te trzy nazwy używano zamiennie do opisania tego samego organizmu dalej tu zidentyfikowanego i opisanego. W dyskusji niniejszego wynalazku usiłowano używać nazwę taksonomiczną L. intracellularis.
L. intracellularis jest obligatoryjną, wewnątrzkomórkową bakterią, która nie może być hodowana zwykłymi metodami bakteriologicznymi w konwencjonalnych pozbawionych komórek pożywkach i wydaje się, że wymaga do wzrostu dołączenia komórek nabłonkowych. S. McOrist i in., w Infection and Immunity, Vol. 61, nr 10, 41286-92 (1993) i G. Lawson i in., w J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, nr 5, 1136-42 (1993) omawiają hodowanie L. intracellularis przy użyciu hodowli jednowarstwowych komórek nabłonkowych szczurów
187 850
IEC-18 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowej. Dodatkowo, H. Stills, w Infection and Immunity, Vol. 59, nr 9, 3227-36 (1991) omawia zastosowanie hodowli jednowarstwowych ludzkich, płodowych komórek nabłonkowych Intestine 407 i hodowli jednowarstwowych raka nabłonkowego okrężnicy świnki morskiej GPC-16 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowych. Te wcześniejsze sposoby hodowli wymagają dużego nakładu pracy i są bezwartościowe w hodowli na dużą skalę.
Obecne zrozumienie zakażenia L intracellularis, leczenie i skuteczna kontrola choroby są poważnie hamowane przez wymyślne potrzeby L. intracellularis w hodowli in vitro. Istnieje obecnie potrzeba polepszenia sposobu hodowania L. intracellularis. Istnieje również obecnie zapotrzebowanie na szczepionki przeciwko L. intracellularis i skuteczne narzędzia do diagnostyki zakażenia L. intracellularis.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej metody hodowli Lawsonia intracellularis.
Nowa metoda hodowli bakterii L. intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783, polega na tym, że obejmuje etapy:
(1) zakażania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materiałem zakażającym obejmującym bakterie L. intracellulańs, tak by zakazić wymienione komórki wymienioną bakterią; i (2) inkubowania wymienionych zakażonych komórek w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 0% do około 8% podczas wytrząsania wymienionych zakażonych komórek tak, by hodować L. intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie.
Odmiana nowej metody obejmuje etapy (1) zakażania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materiałem zakażającym obejmującym bakterie Lawsonia intracellularis, tak by zakazić wymienione komórki wymienioną bakterią; i (2) inkubowimia wymienionych zs&ihonych komórek w tempetaturec atdi okold 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 5% do około 8% podczas wytrząsania wymienionych zakażonych komórek i hodowania Lawsonia intracellularis z utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie.
Niniejszy wynalazek dostarcza metody hodowania L. intracellularis i wytworzenia w ten sposób na wielką skalę zasobów bakterii. Zgodnie ze sposobem, bakterie L. intracellularis są inkubowane w stężeniu tlenu od około 0 do 18 procent, podczas pobudzania bakterii L. intracellularis do wzrostu, w czasie utrzymywania bakterii w zawiesinie.
Opracowano również metodę hodowania bakterii L. intracellularis przez posianie na hodowle jednowarstwowe Hep-2, McCoys lub IEC-18, o około 30 procentowej zlewności, z materiałem inokulacyjnym zawierającym bakterie L. intracellularis do zakażania komórek. Zakażone komórki następnie inkubowano w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 0 do 8,0 procent do osiągnięcia przez komórki zlewności. Zakażone komórki i pożywkę hodowlaną umieszczono następnie w fermen-totorach, bioreaytorach, butelkach typu spinner Iub innych pojemnikach, w których można utrzymywać komórki w zawiesinie. Zakażone komórki wytrząsa się podczas inkubacji komórek, tak że bakterie L. intracellularis są hodowane podczas utrzymywania zakażonych komórek w zawiesinie. Część wyhodowanych L. intracellularis jest następnie pasażowana do świeżych komórek hodowlanych w celu zwiększenia wytwarzania bakterii L. intracellularis.
Dzięki nowej metodzie hodowli dostarczono szczepionki przeciwko L. intracellularis i sposoby wytwatzcnic szczepionki przeciwko L. intracellularis. Niezjadliwe bakterie L. intracellularis uzyskuje się przez pcscżawcnie wyhodowanych bakterii L. intracellularis w wystarczającej ilości w jednostce czasu i selekcję w celu uzyskania szczepów atenuowcnych Iub przez poddanie wyhodowanych bakterii działaniu środków chemicznych w celu uzyskania aten^cj!. Szczepionki zawierające zabite L. intracellularis są również wytwarzane z zastosowaniem. metod hodowania według wynalazku. Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem bakterie są ciągle hodowane przez przynajmniej około 6 do 8 miesięcy, i w tym czasie są pasażowane przynajmniej od około 7 do 12 razy w celu wytworzenia atenuowanych szcze4
187 850 pów w celu uzyskania szczepionki. Atenuowane bakterie miesza się następnie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i podaje zwierzętom w skutecznej ilości do uzyskania odpowiedzi immunologicznej'. Aktualnie korzystny atenuowany szczep (N343P40wk) zdeponowano w American Type Culture Collection.
Dzięki nowej metodzie hodowli bakterii można dokonać oceny obecności w próbce biologicznej przeciwciał swoiście reagujących z bakteriami L. intracellularis przez zbieranie przynajmniej części wyhodowanych L. intracellularis, doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z zebranymi hodowlami L. intracellularis lub ich składnikiem w warunkach, w których przeciwciało obecne w próbce biologicznej reaguje z L. intracellularis lub ich składnikiem i ocena występującej reakcji przeciwciało-antygen.
Dodatkowe cechy i korzyści wynalazku zostaną następnie przedstawione w dalej następującym opisie i staną się jasne z opisu i mogą być poznane przez praktyczne zastosowanie wynalazku.
Zastosowany tutaj termin „L. intracellularis'” oznacza wewnątrzkomórkową, zakrzywioną, gram-ujemną bakterię opisaną szczegółowo przez C. Gebharta i in., Int'l J. of Systemie Bacteriology, vol. 43, nr 3, 533-38 (1993) i S. McOrist'a i in., Int'l J. of Systemie Bacteriology, vol. 45, nr 4, 820-25 (1995) (każde z nich włączone tutaj w całości przez piśmiennictwo) i obejmują, choć nie są ograniczone do bakterii zdeponowanej jako ATCC 55672 w American Type Culture Collection, Rockville, MD; bakterię zdeponowaną jako NTCT 12656 i 12657 w National Collection of Type Cultures, Colindale, London; bakterią wywołującą, która została uzyskana od świń zakażonych PPE i innych zwierząt wykorzystując światowy stan wiedzy i techniki; warianty i mutanty każdej z powyższych bakterii, uzyskane w sposób spontaniczny lub sztuczny.
W sposób tutaj zastosowany termin „szczep atenuowany” oznacza każdy szczep L. intracellularis uzyskany zgodnie z technikami hodowli i pasażowania tutaj podanymi w celu uzyskania szczepów niezjadliwych przy zachowaniu własności immunogennych w czasie podawania gospodarzom zwierzęcym. Jak podano poniżej liczne, różne szczepy L. intracellularis hodowano i atenuowano zgodnie z współczesnymi technikami w celu uzyskania w celu uzyskania atenuowanych, immunogennych szczepów wykazujących skuteczność jako szczepionki dla świń i innych zwierząt wrażliwych na zakażenie L. intracellularis.
Oczekuje się, że obecnie wytwarzane atenuowane szczepy posiadają własności jako immunogeny w szczepionkach przeciwbakteryjnych dla zwierząt, włączając w to ptaki, ryby, bydło, świnie, konie, ssaki i ogólnie naczelne, w tym ludzi. Takie szczepionki mogą być przygotowane stosując techniki znane specjalistom wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Taka szczepionka powinna obejmować skuteczną ilość atenuowanego szczepu w farmaceutycznie dostępnym nośniku. Szczepionka może być podawana w jednej lub więcej dawkach. Immunologicznie skuteczna ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez zbytnich eksperymentów, wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Ilość niezjadliwej bakterii powinna być wystarczająca do pobudzenia odpowiedzi immunologicznej u zwierząt wrażliwych na to schorzenie, podczas gdy ta ilość stale pozostaje niezjadliwa. Zależy ona od poszczególnych zwierząt, bakterii i schorzeń towarzyszących. Zalecana podawana dawka wynosi korzystnie od około lO3 do lO9 bakterii/kg wagi ciała i najkorzystniej od około IO5 do IO7 bakterii/kg wagi ciała. Nośniki są znane specjalistom i obejmują stabilizatory i rozpuszczalniki. Taka szczepionka może również zawierać odpowiedni adiuwant. Szczepionki mogą być stosowane w kombinacji z innymi szczepionkami, na przykład jako rozpuszczalnik innej liofilizowanej szczepionki, lub połączone przed liofilizacją z inną szczepionką. Preparaty szczepionek mogą być również wysuszane, na przykład przez suche zamrażanie w celu przechowywania lub przez następową formulację w płynne szczepionki.
Odpowiednio można obecnie przeprowadzić sposób pobudzenia odpowiedzi immunologicznej na zjadliwe bakterie L intracellularis typu dzikiego u zwierząt gospodarzy, w celu zabezpieczenia gospodarzy przed takimi bakteriami. Sposób obejmuje podawanie gospodarzowi immunologicznie efektywnej ilości atenuowanych lub zabitych bakterii według wynalazku, i korzystnie podawanie gospodarzowi szczepionki.
187 850
Jak użyto tutaj termin „hodowla na wielką skalę” oznacza poziom hodowli L. intracellularis większy niż około 2,0 do 3,0 litrów i obejmujący produkcję na skalę 100 lub więcej litrów. „Hodowanie” w sposób tu użyty oznacza proces promowania wzrostu, reprodukcji i/lub proliferacji L. intracellularis.
W praktycznym wykorzystaniu sposobu hodowania według wynalazku, komórki hodowlane mogą być najpierw zakażane materiałem zakażającym zawierającym bakterie L. intracellularis, tak by uzyskać komórki zakażone. Ilość linii komórkowych stosowanych w praktycznym wykonaniu wynalazku, obejmuje lecz nie jest ograniczona do: IEC-18 (ATCC 1589)- szczurzych komórek nabłonka jelitowego, Hep-2 (ATCC 23) - ludzkich komórek raka nabłonkowego, McCoys (ATCC 1696) - mysich komórek (nie określone), MDCK (ATCC 34) - psich komórek nerki Madin-Darby, BGMk (Biowhittaker #71-176) - komórek nerki małp „buffalo green” i komórek nabłonka jelitowego świni. Korzystnymi komórkami hodowlanymi są komórki Hep-2, McCoys lub IEC-18. Alternatywnie, bakterie mogą być hodowane w układach bezkomórkowych, tak długo jak bakterie są utrzymywane w odpowiednim stężeniu tlenu takim jak tu podano.
Jeśli używa się komórki hodowlane, to przed zakażeniem, komórki korzystnie, lecz nie koniecznie powinny występować w postaci hodowli jednowarstwowej. By uzyskać postać hodowli jednowarstwowej, komórki mogą być hodowane w zwykłych butelkach hodowlanych. W każdej butelce można hodować komórki zmieszane z pożywką hodowlaną w ilości między około 1 x 1O5 komórek do około 10 x 1O5 komórek na butelkę o pojemności 25 cm2. Pożywką hodowlaną może być każda pożywka hodowlana, która obejmuje źródło azotu, potrzebne czynniki wzrostowe dla wybranych komórek hodowlanych i źródło węgla, takie jak glukoza i laktoza. Korzystną pożywką jest DMEM z 2-5% bydlęcą surowicą płodową, jednakże różne inne dostępne na rynku pożywki mogą być stosowane z dobrym wynikiem.
Wynaleziono, że udane hodowanie L. intracellularis jest zwiększone przez utrzymywanie komórek hodowlanych na stałym poziomie wzrostu. Tak więc, hodowla jednowarstwowa komórek powinna mieć od około 20% do około 50% zlewności w momencie zakażania. Korzystnie, hodowle komórkowe powinny mieć od około 30% do około 40% zlewności w momencie zakażania, 30% zlewność jest najkorzystniejsza.
Materiałem zakażającym może być uzyskana czysta hodowla L. intracellularis, na przykład z depozytu 55672 aTCc, depozytu 12656 lub 12657 NCTC, lub z zakażonych świń lub innych zwierząt, po zastosowaniu sposobów izolacji i oczyszczania opisywanych tutaj.
Materiałem zakażającym do praktycznego zastosowania w wynalazku jest homogenat jelitowy przygotowany przez zdrapanie śluzówki z jelit świni lub innych zwierząt zakażonych PPE. Podczas przygotowania homogenatu jelitowego, skrawki jelitowe wybrane do hodowli powinny wykazywać ciężkie uszkodzenie ze znacznym scieńczeniem śluzówki. W związku z chwiejną strukturą, próbki bakterii powinny być korzystnie umieszczone w -70°C tak szybko jak to możliwe po sekcji. Korzystnie j'est dodać do materiału zakażającego antybiotyki, na które L. intracellularis jest oporna takie jak wankomycyna, amfoterycyna B i innych członków grupy aminoglikozydów, obejmujący gentamycynę i neomycynę, by nazwać jedynie kilka, w celu stłumienia zanieczyszczających bakterii, podczas wzrostu L. intracellularis. Gdy materiał zakażający jest czystą hodowlą lub homogenatem jelitowym, zakażenie hodowli komórkowej może być przeprowadzone różnymi technikami znanymi w stanie techniki podanymi tutaj.
Bakterie i/lub zakażone hodowle komórkowe są następnie inkubowane w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu. W stężeniu tlenu większym niż 18% wzrost L. intracellularis jest mniejszy niż optymalny, z ograniczeniem wzrostu pojawiającym się gdy stężenie tlenu jest poza optymalnym zakresem. Korzystnie zakażone komórki hodowlane są inkubowane w stężeniu tlenu wahającym się w granicach od 0% do około 8%. Najkorzystniejsze stężenie tlenu waha się od 0% do 3%.
Właściwe stężenie dwutlenku węgla jest również ważne dla właściwego wzrostu L. intracellularis. W stężeniu dwutlenku węgla większym niż 10% i mniejszym niż 4% pojawia się wzrost nieoptymalny z ewentualnym ograniczeniem wzrostu w przy stężeniach poza tym
187 850 zakresem. Korzystnie, stężenie dwutlenku węgla waha się w zakresie od około 6% do 9%, najkorzystniejszym stężeniem dwutlenku węgla jest stężenie około 8,8%.
Dodatkowo, komórki są inkubowane korzystnie w stężeniu wodoru wahającym się w granicach od 73% do 94%. Azot może być użyty w miejsce części lub całości obecnego wodoru. Zgodnie z korzystnym wykonaniem, komórki są inkubowane w stężeniu około 0-8,0% tlenu, około 8,8% dwutlenku węgla i około 83,2% wodoru.
Zakażone komórki mogą być inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym Iub innej komorze gazowej zawierającej prawidłowe stężenie tlenu i dwutlenku węgla, i który pozwala na zawieszanie komórek w trakcie inkubacji. Komora powinna zawierać środki utrzymujące zakażone komórki w zawiesinie, monitor stężenia gazu i źródło pozwalające na utrzymanie prawidłowego stężenia gazów. Temperatura inkubacji może wahać się w granicach od 30°C do 45°C, jednak zwłaszcza od 36°C do 38°C. Najkorzystniej temperatura powinna wynosić około 37°C. Konieczne wyposażenie do hodowli i sposoby atenuacji są tu dla specjalistów czytelnie przedstawione. Jednym z przykładów sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia niniejszego wynalazku jest podwójny inkubator gazowy, np. model 480 dostępny z Lab-Line, Melrose Park, Illnois, w połączeniu z butelkami hodowlanymi typu spinner w celu utrzymania komórek w zawiesinie. Obecnie korzystne wyposażenie obejmuje fermentator, bioreaktor, wytrząsacz obrotowy zawierający przynajmniej 2 litry pożywki i jest zdolny do utrzymywania komórek hodowlanych w zawiesinie przy przepływającym gazie o odpowiednim stężeniu, lub inne środki do mechanicznego wytrząsania i monitorujące stężenie rozpuszczonego tlenu w pożywce. Odpowiednie fermentatory i bioreaktory można uzyskać od New Brunswick, Braun lub innych wytwarzających je przedsiębiorstw.
Maksymalny wzrost komórek i przez to L. intracellularis jest uzyskiwany przez utrzymywanie zakażonych komórek w zawiesinie w trakcie inkubacji, przez co jest zwiększona ekspozycja poszczególnych komórek na pożywkę hodowlaną i właściwą mieszaninę tlenu i dwutlenku węgla. Komórki hodowlane mogą być wytrząsane i utrzymywane w zawiesinie różnymi metodami znanymi w stanie techniki obejmującymi na przykład, butelki hodowlane, butelki hodowlane typu roller, hodowle błonowe i butelki hodowlane typu spinner. Komórki mogą być utrzymywane w zawiesinie podczas inkubacji przez inkubowanie komórek w butelkach hodowlanych typu spinner wewnątrz podwójnych inkubatorów gazowych lub innych podobnych urządzeń. Termin „butelki hodowlane typu spinner” w sposób tu zastosowany, oznacza butelki lub inne pojemniki, wykorzystujące łopatki, śmigła lub inne środki do wytrząsania hodowli i utrzymujące zawarte komórki w postaci zawiesiny.
W szczególnie korzystnym wykonaniu według wynalazku, zakażone komórki są inkubowane aż do osiągnięcia przez komórki zlewności i następnie komórki są umieszczane w butelkach typu spinner zawierających pożywkę hodowlaną i inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym podczas wytrząsania butelki. Korzystnie zakażone komórki są zeskrobane do butelki typu spinner. Można to osiągnąć różnymi metodami znanymi w stanie techniki używając specjalnego skrobaka do komórek w celu odizolowania komórek. Gdy komórki zostaną wprowadzone do butelki typu spinner, wiosełko w butelce typu spinner jest obracane w zakresie od około 30 do około 60 obrotów/minutę w celu utrzymania zakażonych komórek w zawiesinie.
Część hodowanych L. intracellularis jest następnie pasażowana na świeże komórki hodowlane w celu zwiększenia produkcji bakterii L. intracellularis. Termin „pasażowanie” lub jego odmiany oznacza proces przeniesienia porcji hodowanych L. intracellularis na świeże komórki hodowlane w celu zakażenia tych świeżych komórek bakteriami. Termin „świeże” w sposób tu zastosowany oznacza komórki, które nie były do tej pory zakażone L. intracellularis. Korzystnie takie komórki są średnio nie starsze niż mniej więcej jednodniowe1.
Pasażowi L. intracellularis w zawiesinach hodowlanych może towarzyszyć usunięcie części oryginalnej pożywki i dodanie jej do nowej butelki zawierającej nowe komórki hodowlane. W oryginalnych hodowlach jest wysoka ilości bakterii/ml, na przykład większe niż około lO4 bakterii/ml, jest korzystnym dodanie między około 1 do 10%% (objętość do objętości) hodowli z zakażonych butelek do nowych butelek zawierających świeże komórki. Korzystne jest przeprowadzenie tego gdy 50-100% komórek jest zakażonych. Jeśli mniej niż 50% komó187 850 rek jest zakażonych, pasażowaniu korzystnie towarzyszy podzielenie hodowli 1:2 do nowych butelek i powiększenie objętości przez dodanie nowej pożywki. W tym przypadku, liza komórkowa i inne etapy nie są wymagane, jak to było w przypadku pasażu hodowli jednowarstwowych, tak jak to przeprowadzano według wcześniejszego stanu techniki.
Po wystarczającym wzroście komórek hodowlanych i następnym osiągnięciu przez zakażenie L. intracellularis więcej niż 70% zakażalności komórkowej, w sposób określony przez IFA, lub inne porównywalne metody jest następnie zbierana przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis. Etap zbierania hodowli bakteryjnych może być przeprowadzony przez separację bakterii z zawiesiny różnymi technikami znanymi specjalistom podanymi tutaj. Korzystnie hodowle L. intracellularis są zbierane przez wirowanie całej zawartości lub części zawiesiny do postaci peletek komórek hodowlanych, ponowne zawieszane peletek i liza zakażonych komórek. Typowo przynajmniej część zawartości jest wirowana w około 3000 x g przez około 20 minut w celu uzyskania peletek komórek i bakterii. Peletki mogą być następnie zawieszane w, na przykład roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) i przepuszczane około cztery razy przez igłę kaliber 25 w celu lizy komórek. Następnie wymagane jest dalsze oczyszczanie, próbki mogą być wirowane w około 145 x g przez około 5 minut w celu usuwania jąder i resztek komórkowych. Supernatant może być następnie wirowany w około 3000 x g przez około 20 minut i uzyskane peletki ponownie zawieszane w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak SPG z płodową surowicą bydlęcą (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do zamrożenia lub zastosowania jako materiał zakażający) lub pożywka hodowlana (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do pasażowania na świeże komórki).
Jak 10 wcześniej wspomniano, skuteczny wzrost L. intracellularis w produkcji na wielką skalę jest zwiększany przez utrzymywanie komórek w stanie aktywnego wzrostu. W przypadku hodowli jednowarstwowych, gdy hodowle stają się zlewne stopień podziałów komórkowych znacznie maleje. Próby wzrostu L. intracellularis w jednowarstwowych hodowlach tkankowych są ograniczone i nie jest możliwe zwiększenie skali hodowli. Tak więc zastosowanie zawiesin hodowlanych znacznie ułatwia utrzymanie aktywnego wzrostu komórkowego i ułatwia ciągłe zwiększanie hodowli i jej skali. Stosując fermentator i między około 0-3% rozpuszczonego tlenu, jak to wyjaśniono powyżej, można wyhodować do IO8 bakterii/ml. Można również utrzymywać aktywny wzrost bakterii przez wiele miesięcy i można oczekiwać, że można utrzymywać je bez końca.
Przed niniejszym wynalazkiem uważano, że komórki muszą być przymocowane do powierzchni w celu zakażenia L. intracellularis. Zawiesina komórkowa według niniejszego wynalazku jest unikalna i przeciwstawia się tej teorii. Używając komórek McCoy'a i IEC-18, korzystne jest dodanie żelatyny, agarozy, kolagenu, akrylamidu lub krzemionkowych perełek, takich jak porowate nośniki Cultisphere-G wytwarzane przez HyClone Laboratories, Logan, UT razem z pożywką hodowlaną. Komórki Hep-2 i inne nie wymagają mikronośników do hodowli zgodnie ze sposobem według wynalazku. Zapewnia to szczególne korzyści i ekonomiczny sposób hodowli na wielką skalę,
W celach utrzymania hodowli z hodowlami komórkowymi Hep-2, usuwane jest i zamieniane świeżą pożywką korzystnie 25-50% hodowli w odstępach tygodniowych. W celu hodowli komórkowych z mikronośnikami i perełkami, korzystnie 25-50% hodowli jest usuwane i zamieniane świeżą pożywką 1-2 razy w tygodniu. W hodowli na wielką skalę dodatkowe 25-50% pożywki, lub pożywki w mikronośnikami może być dodane do hodowli.
Zależnie od stopnia zakażenia komórek hodowlanych pasaż na świeże komórki następuje zwykle co dwa do pięciu tygodni. Zakładając, że komórki hodowlane są najmniej w 70% w ciągu 2-3 tygodni, korzystnie pasaż następuje co 3-4 tygodnie.
Dzięki niniejszemu wynalazkowi dostarczono obecnie szczepionki i sposoby wytwarzania szczepionek przeciwko L. intracellularis. Po utrzymywaniu komórek w zawiesinie przsz długi czas (na przykład, 6-8 miesięcy), przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis jest zbierana i sprawdzana w kierunku potencjalnej atenuacji. Takiemu monitorowaniu korzystnie towarzyszy prowokacja zwierząt lub modeli zwierzęcych w celu wybrania szczepu atenuowanego. Takie szczepy atenuowane są wykorzystywane do wytwarzania szczepionek.
187 850
Atenuowane szczepionki L. intracellularis wykazują skuteczność przeciwko zakażeniu L intracellularis u różnych zwierząt i należy się spodziewać, że będą również skuteczne u zwierząt.
Niniejszy wynalazek pozwala na szybki rozwój hodowli, zwiększenie wyników hodowli 100-1000-krotne i zmniejszenie kosztów. Jako wynik, obfitość dostarczonych bakterii L. intracellularis wyhodowanych zgodnie z metodą hodowli według wynalazku podlega atenuacji w celu wytworzenia szczepionki. Atenuacja jest trudna w hodowlach jednowarstwowych ze względu na niewielką ilość wyhodowanych bakterii przy stosowaniu konwencjonalnych technik hodowli jednowarstwowych. W przeciwieństwie, obecna metoda hodowli L. intracellularis według niniejszego wynalazku znacznie ułatwia, przyspiesza i zwiększa liczbę wykorzystywanych bakterii. Więcej komórek i więcej pojawiających się podziałów, większa liczba pojawiających się mutacji jest korzystne w wytwarzaniu szczepionki. Wzrost w zawiesinie według wynalazku zwiększa ekspresję ważnych immunogenów kontrolowanych przez geny regulowane przez środowisko i ich produkty ekspresji.
Powstałe szczepy atenuowane mogą być hodowane w tkankowych hodowlach jednowarstwowych jak opisano w poniższym przykładzie 1, lecz korzystnym jest hodowanie ich w hodowlach w zawiesinie zgodnie ze sposobem według wynalazku. Inne środki atenuujące mogą obejmować zastosowanie na przykład, N-metylonitrozoguanidyny, lub innych środków znanych w stanie techniki. Tak więc przez wielokrotne pasażowanie lub środkami chemicznymi wytwarzane są atenuowane L. intracellularis i wybierane do przygotowania szczepionki.
Zgodnie z wykonaniem szczepionki, hodowle antygenu są zbierane przez wirowanie lub mikrofiltrowanie jak to opisano poniżej. Antygen jest następnie standaryzowany do określonego poziomu opartego na optymalnej odpowiedzi immmunologicznej zwicrząt-gospodarzy, określonego przez miareczkowanie dawki w próbkach zwierząt gospodarzy. Bakteria może być inaktywowana przez przedłużoną ekspozycję na otaczające środowisko tlenu, lub przez zastosowanie 0,3% formaliny lub innych czynników inaktywujących w celu przygotowania zabitej szczepionki. Antygen jest następnie włączany do odpowiedniego adiuwantu, takiego jak wodorotlenek glinu lub płynna parafina celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Antygen jest następnie stosowany do szczepienia gospodarza przez wstrzyknięcie domięśniowe lub podskórne, w przypadku świń w wieku około 3-4 tygodni, z dawką przypominającą jeśli jest wymagana.
Alternatywnie, zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem szczepionki wykorzystującym metody hodowli wcześniej opisane, bakterie są kilkakrotnie pasażowane w celu wywołania i wybrania atenuowanych, nie zjadliwych żywych hodowli. Hodowla bakteryjna jest testowana na zwierzętach-gospodarzach (po korzystnie 6-8 miesiącach lub więcej wzrostu w hodowlach w zawiesinach) w celu uzyskania objawu atenuacji. Hodowana kultura bakteryjna jest zbierana jak to opisano wcześniej i rozcieńczana. Świnie, na przykład, są szczepione doustnie bakteriami w ilości 1 x IO5 do 1 x IO6. Około 28 dnia po zaszczepieniu, świnie są zakażane organizmami w ilości około 1 x IO7 mniej pasażowanymi (około 30 do 45 dni) zjadliwymi kulturami L. intracellularis. Zakażone zwierzęta są zabijane i poddawane sekcji po 21 dniach od ekspozycji i w jelicie cienkim poszukuje się znacznych i mikroskopowych uszkodzeń. PCR i metody badawcze z przeciwciałem fluorescencyjnym powinny również być przeprowadzone. Około 80% zwierząt kontrolnych wykazuje znaczne i mikroskopowe uszkodzenia komórek śluzówki jelit przy zastosowaniu zarówno metod PCR jak i FA. Zaszczepione zwierzęta mają prawidłową powierzchnię błony śluzowej jak to będzie potwierdzone obserwacją histologi<^szn^ą i ujemnym wynikiem reakcji PCR.
Ogólnie, atenuowane immunogenne szczepy L. intracellularis są wytwarzane po ciągłej trwającej 150 i 250 dni hodowli, w trakcie której hodowla jest pasażowana przynajmniej 7 do 12 razy, inne aaenuowane hi^o^kowłle bakteryjne mogą, być wytwarzane pi^rz^^z różne odmiany podanych tu sposobów monitorowania i wybierania.
Przygotowywanie szczepionki następnie obejmuje immunologicznie skuteczną ilość atenuowanych L. intracellularis w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Kombinacja immunogenu i nośnika może być w postaci roztworu wodnego, emulsji lub zawiesiny. Immunologicznie skuteczna ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez przepro187 850 wcdzcnia niepotrzebnych doświadczeń, stosując wskazówki tu podane. Ogólnie, ilość immunogenu będzie się wahać między 50 a 500 miyragramów, korzystnie między IO7 a IO9 TCID50, gdy stosuje się oczyszczone bakterie.
Szczepionki są ogólnie podawane wrażliwym zwierzętom, korzystnie świniom, w jednej lub więcej dawkach. Żywa lub zabita szczepionka może być podawana 1 lub 2 razy w odstępach dwutygodniowych. Korzystne jest podawanie atenuowanej, żywej szczepionki w jednej dawce. Korzystną drogą podawania żywych atenuowcnycó szczepów jest droga doustna, donosowa, również można stosować podawanie domięśniowe i podskórne. Droga podcnic domięśniowa i podskórna jest najkorzystniejsza dla zabitej szczepionki.
Skuteczna diagnoza PPE jest również ograniczana przez czas potrzebny do hodowli bakterii wywołujących to schorzenie. Skutkiem mniejszego wynalazku możliwy stał się rozwój sposobów diagnostycznych umożliwiających powstanie szybkich i skutecznych testów do badania obecności L. intracellularis w próbkach biologicznych pobieranych od świń i innych zwierząt wrażliwych.
Bakterie L intracellularis wyhodowane zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku, lub składniki tych bakterii mogą być zastosowane jako antygen w testach ELISA lub w innych testach immunologicznych, takich jak test immunologiczny z zastosowaniem przeciwciał znakowanych fluoresceiną („IFA”), w celu wykrycia przeciwciał przeciwko L. intracellularis w surowicy i innych płynach zwierząt podejrzanych o zakażenie tymi bakteriami. Obecnie korzystnym jest stosowanie testu immunologicznego IFA jak to opisano w przykładzie poniżej. Alternatywnie bakterie wyhodowane według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w analizie metodą Western biot.
Korzystny protokół testu ELISA zgodnie z wykonaniem według wynalazku obejmuje co następuje:
1. Dodanie 0,1 ml/studzienkę antygenu rozcieńczonego w buforze opuszczającym. Inkubacja przez 18 godz. w 4°C.
2. Trzykrotne przemycie PBS.
3. Dodanie 0,25 ml buforu blokującego do każdej studzienki na płytce. Inkubowanie 1 do 2 godz. w 37°C.
4. Trzykrotne przemycie w buforze przemywającym.
5. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml do pierwszych studzienek płytki. Przeprowadzenie seryjnych rozcieńczeń 1:2 przez całą płytkę. Inyubowcnie przez 1 godz. w 37°C.
6. Przemycie 3-5-krotne w buforze przemywającym.
7. Rozcieńczenie koniugatu w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml na studzienkę płytki i inkubowanie przez 1 godz. w 37°C.
8. Przemycie 3-5-6rotne w buforze przemywającym.
9. Dodanie substratu.
12. Zmierzenie absorbuj światła spektrofotometrem.
13. Studzienki, do których nie dodano antygenu zastosowano jako kontrolę.
14. Dodatnia i ujemna kontrola surowicy świńskiej powinna być również zastosowana w każdym teście.
Korzystny protokół analizy metodą Western biot:
1. Przeprowadzenie antygenu na 12% SDS-PAGE i przeniesienie na błonę nitrocelulozową.
2. Umieszczenie błony w buforze blokującym na 2 godz.
3. Usunięcie bufon! blokującego i przemycie PBS w ciągu 1 min.
4. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie na błonę. Inkubacja przez 2 godz. w temp. pokojowej.
5. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym (5 min. każde przemycie).
6. Rozcieńczenie koninga^ w buforze blokującym i dodanie do błony. Inkubacja przez 1 godz. w temp. pokojowej.
7. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym.
8. Dodanie substratu na 10 min. lub do ukczcnic się silnego wiązania.
187 850
9. Spłukanie PBS.
10. Wysuszenie powietrzem i przechowywanie w ciemności.
Niniejszy wynalazek jest dalej opisany w następujących przykładach, które podano jedynie w celu zilustrowania, a nie ograniczenia.
PRZYKŁAD 1
Izolacja L. intracellularis z jelit świń amerykańskich chorujących na enteropatię proliferacyjną świń.
Materiały i metody:
Selekcja próbek zakażających:
Próbkę N24912 uzyskano ze stada z farmy z Iowa, w której 15 z 300 świń, które ukończyły 5 miesięcy cierpiało na uporczywe krwiste stolce mimo leczenia penicyliną. Podczas sekcji świń obserwowano scieńczenie śluzówki jelita (cienkiego). Badania histopatologiczne z użyciem barwienia srebrem wykazało obecność zakrzywionych, wewnątrzkomórkowych bakterii i hiperplazję enterocytów krypt potwierdzające rozpoznanie PPE. Próbkę N72994 uzyskano z drugiego 1,5 rocznego miotu loch SPF hodowanego na farmie w Minnesocie. Wielkość stada wynosiła około 70-80 loch, nieznane było leczenie antybiotykami. Podczas sekcji śluzówka jelit była scieńczała z wybroczynami. Barwienie Giminez'a błony śluzowej wykazało wiele zakrzywionych bakterii. Próbkę N101494 uzyskano od 12-to tygodniowych świń z farmy w Indiana, przeznaczonej dla 600 loch. Świnie były leczone dożylnym Tylan'em od początku wystąpienia krwawej biegunki, lecz wszystkie zwierzęta zdechły wkrótce po leczeniu.
Przygotowanie bakteryjnego materiału zakażającego pochodzącego ze świń.
Próbki jelitowe utrzymywano w temp. -70°C. Jelita przecięto i przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosoforanem (PBS). Jeden gram próbki błony śluzowej zeskrobano i umieszczono w glutaminianie sodowo-potasowym (SPG) i homogenizowano przez 30 sekund z 4.0 ml trypsyny (JRH Biosciences, Lenexa, KS) w ŚPG. Zawiesiny inkubowano przez 35 min w 37°C. Dziesięć ml SPG/10% bydlęcą surowicę płodową (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) dodano do próbek i próbki umieszczono w homogenizatorze tkankowym na 1 min. Dziesięć ml SPG/10% (FCS) dodano i filtrowano jednokrotnie przez filtr papierowy (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR), a następnie przez 5,0-, 1,0- i 0,65mikronowe błony filtrujące. Filtraty rozdzielano do 1,0 ml probówek i zamrażano w -70°C. Błonę śluzową roztarto na szkiełku w celu przeprowadzenia barwienia metodą Gimineza. Oddzielne rozmazy filtratów znakowano metodą IFA stosując swoiste przeciwciała monoklonalne przeciwko L. intracellularis S. McOrist i In., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (włączone w całości przez referencje).
Hodowla komórkowa:
Komórki IEC-18 (szczurze komórki nabłonka jelitowego, ATCC CRL 1589) hodowano w DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) z L-glutaminianem i 10% FCS i normalnie pasażowano przez tydzień trypsyną. Jednowarstwowe hodowle komórkowe hodowano w 37°C w powietrzu z 5% CO2.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Komórki IEC-18 posiewano w ilości 1,25 x 105 komórek w 25 cm2 butelki hodowlane w porównywalnym stosunku w szkiełka histologiczne (Nunc, Inc., naperville, IL), inkubowane przez 24 godz., a następnie usunięto pożywkę. Zamrożone bakteryjne izolaty pochodzące od świń szybko rozmrażano i rozcieńczano w DMEM/7% FCS z wankomycyną (100 .ug/ml) i amfoterycyną B (2,0 um/ml) w stosunku 1,0 ml homogenatu do 15 ml pożywki i dodano do hodowli jednowarstwowej. Hodowle jednowarstwowe i zawiesiny bakteryjne wirowano przez 30 min w 2000 g i przenoszono do pojemników beztlenowych. Pojemniki następnie przenoszono i gaz był zastępowany mieszaniną wodoru i dwutlenku węgla, w celu otrzymania mieszaniny 8.0% O2, 10% CO2 i 82% H?. Hodowle komórkowe inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie odżywiane DMEM/7% FCS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 ug/ml), neomycyną (50 ug/ml) i amfoterycyną B (2,0 ug/ml). Hodowle przenoszono do pojemników beztlenowych i inkubowano przez 6 dni, wymieniając pożywkę co 2 dni.
187 850
Pasażowanie L. intracellularis:
Bakterie L. intracellularis pasażowano przez lizę komórek stosując chlorek potasu tak jak to opisano poprzednio G. Lawson i in., J. Clin. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (włączono tutaj w całości przez referencje), a następnie dodano do świeżych hodowli jednowarstwowych IEC-18. Pożywkę wymywano z hodowli jednowarstwowych i dodawano 0,1% KCl i inkubowano przez 10 min w 37°C. Usuwano KCl i dodawano SPG/10% i hodowle jednowarstwowe rozdzielano mechaniczne skrobakiem komórkowym. Komórki poddawano lizie przez trzykrotne przepuszczenie przez strzykawkę z igłą kaliber 25. Jądra komórkowe usuwano przez wirowanie w 100 x g przez 5 min i zawiesinę bakteryjną w płynnym supernatancie dodano do świeżej hodowli jednowarstwowej 1 d komórek IEC-18.
Monitorowanie zakażenia hodowli komórkowych:
Zakażenie monitorowano przez utrwalenie komórek na szkiełkach laboratoryjnych zimnym acetonem/etanolem przez 5 min. Znakowanie przeprowadzono metodami immunofluorescencji i immunoperoksydazy. Obie metody stosują mysie przeciwciało monoklonalne (jak opisano przez S. McOrist i in., Vet. Rec. 121:421-422 (1987)) jako przeciwciało pierwszorzędowe i zarówno koniugaty przeciwko mysiej immunoglobulinie G-flourochrom (izotiocjanian fluoresceiny; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) jak i koniugat peroksydazy (kozia anty-mysia immunoglobulina G; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Liczeniu bakterii towarzyszy liczenie swoiście barwionych bakterii wewnątrz komórek na każdym szkiełku.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażona próbka i bakterie poddane pasażowi zostały włączone jako DNA matrycowy do PCR stosując sposoby przygotowania próbki, siartery i parametry cyklu jak opisano to przez Jones'a i in., J. Clin. Microbiol., 31:2611-2615 (1993) i McOrist i in., Vet. Microbiol. 1-8 (1994) (każde z nich włączone tu w całości przez referencje). Parametrami cyklu były 93°C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45 s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej wymienionych przez 45 s dla danej temperatury, jak również 93°C przez 45 s, 55°C przez 45 s i 72°C przez 2 min. Jedynie dodatni materiał zakażający użyto do zakażenia komórek IEC-18. PCR przeprowadzono również do monitorowania pasażowanego materiału w celu potwierdzenia zakażenia. DNA wytworzone w technice PCR poddano sekwencjonowaniu w Iowa State University Nucleic Acid Facility. Wyniki sekwencjonowania porównywano z sekwencjami wytworzonymi przez Gary'ego F. Jones'a i podanymi w tezach doktorskich, University of Minnesota, Minneapolis, MN (czerwiec, 1993).
Wyniki:
Wybór próbek zakażających:
Świnie o numerze N24912 i N72994 chorowały na ciężkie PPE z krwistą zawartością jelitową i scieńczeniem błony śluzowej. N101494 chorowała na ciężką PPE i miała ciężkie krwawienie jelitowe, które spowodowało powstanie wielkiej skrzepimy w świetle jelit. Barwienie metodą Giemza rozmazów jelitowych wykazało znaczną liczbę bakterii zakrzywionych lub w kształcie litery S. Znakowanie IFA wykazało w pochodzącym od świń materiale zakażającym znaczną liczbę jasno, fluorescencyjnych bakterii.
Monitorowanie zakażenia w hodowlach komórkowych:
Zakażone hodowle jednowarstwowe monitorowano w mikroskopie świetlnym w trakcie wzrostu i obserwowano niewielkie zmiany morfologiczne komórek. Niezakażone hodowle jednowarstwowe hodowano w warunkach zmniejszonego ciśnienia tlenu (8% O2) wykazywały podobną morfologię.
Znakowanie immunofluorescencyine i metodą immunoperoksydazy zakażonych hodowli wykazało wewnątrz komórek znaczną liczbę zakrzywionych i w kształcie litery S specyficznie wybarwionych bakterii. Hodowle jednowarstwowe nie wykazywały zlewnego zakażenia. Zakażone komórki były często powiązane z zakażonymi ogniskami 1-10 komórek. Poważnie zakażone komórki (tj. komórki z 30 lub więcej bakteriami) były również widoczne z komórkami z mniej niż 30 bakteriami. Szczyt liczby bakterii występował około lub 6 dnia. Zakażenie było zależne od swoistych warunków hodowli. Bakterie skutecznie pasażowano stosując tu opisane sposoby lizy komórkowej. Wirowanie świeżo zakażonych komórek nie
187 850 było konieczne lecz znacznie zwiększało liczbę zakażonych komórek. Wirowanie również zmniejszało zanieczyszczenie przez dopuszczenie komórek eksponowanych na zakażenie w pozbawionej antybiotyku pożywce na odżywienie po 3 godz. pożywką zawierającą antybiotyk. Zmniejszenie FCS z 10% do 7% w pożywce było konieczne do spowolnienia wzrostu komórek IEC-18 co pozwoliło na zwiększenie proliferacji bakterii przez wystąpieniem zlewności hodowli komórkowej.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
PCR chromosomalnego DNA pozwoliło na wytworzenie fragmentu 319 bp (włączając startery) z wszystkich izolatów. Fragment o odpowiedniej wielkości był wizualnie porównywany ze znanymi dodatnimi próbkami wytworzonymi przez McOrista i in., (1994) przy użyciu techniki PCR. Analiza sekwencji produktów PCR próbek N24912, N72994 i N101494 potwierdziła bliską homologię (97-99%) do sekwencji p78 określonej przez Jones'a (1993).
PRZYKŁAD 2
Wzrost L. intracellularis w hodowlach w zawiesinie komórek Hep-2.
Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych:
Homogenaty jelitowe przygotowano przez zdrapywanie błony śluzowej z 6 do 8 cm odcinków jelita cienkiego z próbek jelitowych opisanych w przykładzie 1. Dodano trypsynę (1%) do zdrapanej błony śluzowej i próbki dokładnie homogenizowano, a następnie inkubowano przez 35 min w 37°C. 10 ml SPG/10% FBS dodano do próbki i umieszczono w homogenizatorze tkankowym. Kolejne 10 ml SPG/10% FBS dodano. Homogenizaty przepuszczono przez filtr Whatman V113, a kolejno przez filtry 5,0, 1,0 i 0,65 pm. Próbki następnie rozdzielono do 1 ml probówek i zamrożono w -70°C.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Sposób A:
Komórki pochodzące z tkanek posiano na 1 x 107 komórek w 50 ml DMEM/10% FBS w 100 ml butelki typu spinner. Hodowle inkubowano 24 godz., a następnie dodano vankomycynę i fungizon. Jedna probówka zamrożonego homogenatu jelitowego została szybko rozmrożona i rozpuszczona w 3 ml DMEM/5% FBS z waknomycyną (100 pg/ml) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Próbka została przepuszczona przez filtr 0,65 pm i dodana do butelki. Hodowlę umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną(50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml).
Sposób B:
W dwie zwykłe 25 cm2 butelki posiano 1,25 x 105 komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Antybiotyki nie były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS.
Hodowle rozcieńczano 1:2 w odstępach tygodniowych przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki Iub przez pasażowanie do większych butelek typu spinner i dalsze dodawanie pożywki.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki Hep-2 przez wysiewanie nowych komórek Hep-2 w ilości 1 x 107 na DMEM/5%FBS. Nowe hodowle inkubowano przez noc w 8,0% O2,
8,8 % CO2 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano zakażonymi hodowlami i inkubo187 850 wano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono. Ilość materiału zakażającego zależy od stopnia zakażenia hodowli oryginalnej.
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze Sacharozy-FosforanuGlutaminianu (SPG) i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g przez 5 min w celu usunięcia jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku.
Określenie żywotności L. intracellularis w hodowlach tkankowych:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być badana i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 25. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycyne (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikro-miareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 1250 komórek/studzienkę i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano rozcieńczenie między 3 a 6 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/studzienkę przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1994) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS, Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/studzienkę i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCID50/ml.
Wyniki:
Wyniki TICD50 wskazują, że hodowle zawierają więcej niż 1 x 106 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się w 45 dniu. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
PRZYKŁAD 3
Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych:
Homogenaty jelitowe przygotowano jak to opisano w przykładzie 2. Próbka L. intracellularis hodowana zgodnie ze sposobem według poniższego przykładu była zdeponowana zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim 19 maja 1995 r w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852 i oznaczona numerem dostępu 55672.
Zakażenie hodowli komórkowych:
W dwie zwykłe 25 cm 2 butelki posiano 1,25 x 105 komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8,0% O2, 10% CO2 i 82% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Antybiotyki nie były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS i 0,05 g Cultisphere-G Microcarriers. Zawartość butelek mieszano przy 40-50 rpm.
Hodowle rozcieńczano 1:2 co 2-3 dni przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki z perełkami Cultisphere-G lub przez pasażowanie do większych butelek typu
187 850 spinner i dalsze dodawanie pożywki i perełek Cultisphere-G. Ostateczne stężenie koralików w hodowli wynosiło około 0,001 g perełek/ml.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki McCoy’a przez wysiewanie nowych komórek McCoy'a w ilości 1 x IO7 na DMEM/2%FBS i 0,05 g koralików Cultisphere-G. Nowe hodowle inkubowano przez noc w 8,0% 02, 8,8% C02 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano 25 ml zakażonych hodowli i inkubowano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono.
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze SPG i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 22. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g przez 5 min w celu usunięcia perełek, jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku.
Określenie żywotności L. intracellularis w hodowlach tkankowych:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis określano jak opisano w przykładzie 2 stosując igłę kaliber 22 do lizy komórek i siejąc na płytki do miareczkowania komórki McCoy'a 1250 komórek/wgłębienie.
Wyniki:
Wyniki TICD50 wskazują, że hodowle zawierają więcej niż 1 x IO6 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się krócej niż w ciągu miesiąca. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
PRZYKŁAD 4
Określenie dawki zakażającej czystej hodowli L. intracellnlaris'.
Podsumowanie:
Badano 31 świnie zakażone 6 tygodniu życia czystymi hodowlami L. intracellularis pochodzącymi z próbki N72994. Świnie rozdzielano w sposób przypadkowy na 4 grup, które trzymano w osobnych zagrodach. Grupa 1 składała się z 7 świń stanowiących kontrolę ujemną, której podawano nie zakażone hodowle lub nie podawano nic. Grupa 2 składała się z 8 świń, które otrzymały 107 bakterii/świnię. Grupa 3 składała się z 8 świń, które otrzymały 106 bakterii/świnię· Grupa 4 składała się z 8 świń, które otrzymały IO5 bakterii/świnię.
Wymazy kału pobierano 0, 7, 14, 21 i 24 dnia do badania metodą PCR. 24 dnia świnie zabijano ijelito kręte, czcze i grube pobierano do badania PCR, histopatologicznego i znakowania FA, tak jak opisano powyżej.
Badanie PCR błony śluzowej jelita krętego wykazało obecność L. intracellularis w 100% przy wysokiej dawce, w 75% przy średniej dawce i w 50% przy niskiej dawce. Wyniki histopatologiczne wskazywały na zwiększoną ilość komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej i podśłuzowej w 88 % przypadków przy wysokiej dawce, 75% przy średniej dawce i 88 % przy niskiej dawce. Przerost krypt obserwowano w 50% przypadków przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 50% przy dawce niskiej. Znakowanie FA wykazało obecność L intracellularis w preparatach tkankowych jelita krętego, czczego i grubego w 88% przypadkach przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 63% przy dawce niskiej. Zwierzęta kontrolne nie wykazywały obecności L. intracellularis ani w metodzie PCR, ani FA, ani w barwieniu srebrem.
Czystą hodowlą można skutecznie zakazić i spowodować uszkodzenie typowe dla PPE. Postulaty Kocha są spełnione dla identyfikacji i izolacji L. intracellularis z zakażonych zwierząt.
Wśród zwierząt poddanych prowokacji dla 100% zwierząt uzyskano wyzdrowienie przy wysokiej dawce bakterii i identyfikację stosując barwienie srebrem, znakowanie FA i metodę PCR.
Materiały i metody:
Hodowla materiału zakażającego:
187 850
Do jednej zwykłej butelki hodowlanej posiano 3,75 χ 105 komórek Hep-2 do DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost prze 18-24 godziny w 37°C i 5% stężeniu CO2. (Komórki wykazywały 30% zlewność w trakcie zakażania). Jedną probówkę N72994 rozcieńczono w 15 ml DMEM/5% FBS. Hodowlę przeniesiono do komory gazowej, usunięto i wymieniono gaz na wodór i dwutlenek węgla, w celu uzyskania mieszaniny 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowla została odżywiona w 24 godz. DMEM/5% PBS.
Hodowle inkubowano przez 6 dni, następnie komórki oddzielano i dodano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS. Objętość zawartości butelek została zwiększona przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle utrzymywano przez 3 tygodnie w butelkach typu spinner.
Zbieranie hodowli komórkowych:
Hodowle zbierano przez wirowanie w około 3000 x g przez około 20 minut. Peletki następnie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i przepuszczano cztery razy przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/10% FBS i uzyskano rozcieńczenie 1:10.
Materiał zakażający dla zwierząt kontrolnych składał się z nie zakażonych komórek Hep-2 rozcieńczonych w tym samym stężeniu żywych komórek co zakażone hodowle. Hodowle komórkowe zbierano tak samo jak zakażone hodowle. Świnie kontrolne otrzymywały taką samą dawkę komórek, co grupa otrzymująca wysoką dawkę.
Ilościowe określenie L. intracellularis
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być poddana badaniu i lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczone dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 2500 komórek/wgłębienie i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do wgłębień dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1987) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FlTC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCEWml.
Zwierzęta:
świń, obu płci w wieku 6 tygodni pochodzących z loch PIC x Lieske i knurów rasy large white dostarczone przez dr Kent Schwartz. Świnie rozdzielono w sposób przypadkowy i umieszczano w 4 zagrodach w zależności od wagi w dniu 0.
Pomieszczenia:
Cztery zagrody w małym pomieszczeniu dla młodych świń, każde oddzielone odległością przynajmniej 1 metra. Zagrody posiadały drucianą podłogę i trwałe ściany zagród. Ciepło dostarczano centralnym ogrzewaniem, ze strefowym rozprowadzeniem ciepła przez lampy grzewcze. Temperaturę utrzymywano między 78 a 85°F przez czas badania.
Pokarm i woda:
Dietę opartą o białko sojowe o zawartości 19% białka, bez antybiotyków dostarczano ad libitum stalowymi karmnikami. Wodę dostarczano ad libitum poidełkami.
Zakażenie świń:
Dnia 0, świnie ważono, pobierano próbki krwi rurkami włosowatymi z zatok zaoczodołowych. Surowicę zbierano i przechowywano w -20°C. Wymazy kału pobierano w celu przeprowadzenia badania PCR. Świniom podawano dawki 10 ml materiału zakażającego dożołądkowo sondą żołądkową.
187 850
Leczenie Liczba świń kontrola-komórki niezakazone 5 kontrola-bez leczenia 2 wysoka dawka 8 średnia dawka 8 niska dawka 8
Świnie ważono i pobierano krew w dniu 0, 10, 17 i 24.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażenie świń monitorowano metodą PCR stosując startery i parametry cyklu jak opisał Jones (1993). Próbki kału zbierano w dniu 0, 7, 14, 21 i 24 i tak samo jak błonę śluzową jelit badano metodą PCR.
Histopatologia:
Skrawki jelita krętego, czczego i grubego utrwalano w formalinie, poddano zwykłym procedurom, zabarwiono hematoksyliną i eozyną, jak również impregnowano srebrem i oceniano. Skrawki również znakowano stosując przeciwciała monoklonalne przeciwko L. intracellularis.
Wyniki:
Objawy kliniczne:
Objawy kliniczne - luźne stolce po raz pierwszy obserwowano w grupie wysokiej dawki w trzecim dniu. Objawy miały nasilenie 14 dnia i zaczynały się zmniejszać.
Zwiększenie wagi zwierząt:
Średnie dzienne zwiększenie wagi wykazało, że w grapie wysokiej i średniej dawki nastąpiło zmniejszenie wagi w porównaniu z grupą kontrolną. Wykazano efekt zależny od dawki w stosunku do zwiększenia wagi, porównując grupy.
PCR:
Wydalanie bakterii w kale nie obserwowano aż do 14 dnia. W 21 dniu, 37,5% świń z grupy wysokiej dawki wykazywało pozytywny wynik PCR z próbek kału. Po sekcji, wynik badania PCR błony śluzowej jelit był dodatni w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 50% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Wielkość ubytków: r
Znaczne ubytki znaleziono if 2 świń z grupy wysokiej dawki (#50 i #202). Świnie wykazywały około 1 m scieńczenia jelita krętego z martwicą w #202.
Histopatologia:
FA:
Znakowanie FA skrawków jelita krętego, czczego i grubego wykazało obecność L. intracellularis w 87,5% w grupie wysokiej dawki, 62,5% w obu zarówno w grupie średniej jak i niskiej dawki i 0% w grupie kontrolnej.
Ubytki mikroskopowe:
Ubytki obserwowano w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 14% w grupie kontrolnej. Było to ocenione przez obserwację zwiększenia ilości komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej i podśluzowej, często związane z przerostem kępek Peyer'a. Obserwowano również przerost krypt.
Barwienie srebrem:
Przeprowadzono również barwienie srebrem w kierunku obecności wewnątrzkomórkowych, zakrzywionych bakterii. Wykazało ono obecność bakterii w 87,5% w grupie wysokiej dawki, w 62,5% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Dyskusja:
Świnie skutecznie zakażono czystymi hodowlami L. intracellularis. Przy dawce 10 7 bakterii 100% świń wykazywało zakażenie zarówno metodą PCR jak i przez mikroskopowe ubytki. Nasilenie uszkodzeń i liczba bakterii w skrawkach tkankowych było relatywnie niskie. Badanie to jest satysfakcjonującym modelem prowokacji L intracellularis wskutek obecności L. intracellularis i mikrouszkodzeń u świń. Uszkodzenia mogą być zwiększone przez podanie drugiej dawki 7 dni po pierwszej dawce.
187 850 . PRZYKŁAD 5
Doświadczenie nad skutecznością szczepionki u chomików·.
Ceł:
Badanie modelu laboratoryjnego w celu określenia bezpieczeństwa i skuteczności niezjadliwej-żywej szczepionki przeciwko Z. intracellularis u chomików.
Podsumowanie:
Przeprowadzono badanie 40 chomików. Zaszczepiono trzytygodniowe chomiki czystymi hodowlami, intensywnie pasazowonych szczepów L. intracellularis i poddano prowokacji 22 dnia po szczepieniu czystymi hodowlami mało pasażow^ych, zjadliwych szczepów. Chomiki podzielono na trzy grupy. Grupa A została zaszczepiona jedną dawką Z. intracellularis szczepu N72994 w dniu 0. Grupa B została zaplanowana jako grupa kontrolna i nie została zaszczepiona hodowlą. Obie grupy poddane zostały prowokacji dwiema dawkami czystej hodowli szczepu Z. intracellularis N343 w dniu 22 i 25 po zaszczepieniu. Grupa C była prowokowana szczepem NI01494, by porównać wirulencję ze szczepem N343. Grupy A i B liczyły po 15 chomików w każdej grupie, grupa C liczyła 10 chomików. Wyniki dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50) wskazują, że chomiki szczepiono IO5 TCH^o/dawkę. Prowokacja N343 wynosiła iO5' TClE^/dawkę. Dawka prowokacyjna dla grupy C wynosiła IO2^ TC^o/dawkę. Rozmazy kału pobierano w dniu 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 w celu przeprowadzenia badania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W 21 dniu 5 zwierząt z grupy A i B poddawano sekcji i przeprowadzano badanie PCR błony śluzowej, jak również znakowanie FA i barwienie hematoksyliną i eozyną i barwienie srebrem skrawków jelita krętego w celu oceny utrzymywania się kolonizacji bakterii w zaszczepionych chomikach. Pozostałe zwierzęta poddawano sekcji 21 dnia po prowokacji i poddawano podobnym badaniom.
Wyniki PCR wskazywały na obecność Z. intracellularis w śluzówce jeditowej 100% chomików grupy A w 21 dniu po zaszczepieniu. Wyniki wszystkich chomików grupy B były ujemne w 21 dni po zaszczepieniu. 21 dnia po prowokacji materiałem zakażającym wyniki PCR 50% chomików były dodatnie w grupie A, a 100% było dodatnich w grupie B. Badanie histopatologiczne skrawków wykazało łagodne do średnich uszkodzeń u 50% zwierząt w grupie A i łagodne uszkodzenia u 50% w grupie B w 21 dniu po prowokacji. Żadne zwierzę nie wykazywało uszkodzeń w 21 dniu po zaszczepieniu. W grupie C zwierzęta nie wykazywały uszkodzenia w 21 dniu po prowokacji. Znakowanie FA i barwienie srebrem nie wykazywało obecności Z intracellularis w żadnym ze skrawków.
We wnioskach, 50% zmniejszenie zakażenia obserwowano u chomików szczepionych intensywnie pasażowanymi szczepami Z. intracellularis jak wykazano to badaniem PCR. Jelita były skolonizowane niewielką ilością organizmów wewnątrzkomórkowych co wykazano brakiem obserwowanych organizmów w skrawkach znakowanych FA i barwionych srebrem. Chomiki w grupie C nie wykazywały zakażenia w trakcie badania, najprawdopodobniej wskutek małej dawki bakterii.
Materiały i sposoby:
Opis chomików:
Wykorzystano 40 trzytygodniowych samic chomików z Harlan Sprague Dawley.
Wzrost materiału zakażającego:
Hodowla szczepionki:
Wykorzystano rosnącą przez 29 hodowlę Z. intracellularis w komórkach Hep-2. Hodowla wzrastała w takich samych warunyccó jak to opisano o hodowlach skrawków do prowokacji za wyjątkiem tego, że hodowle pasażow^o na nowe komórki Hep-2 co 2-3 tygodnie.
Hodowle do prowokacji:
W jedną zwykłą 75 cm butelki do hodowli tkankowej posiano 3,75 x IO5 komórek McCoy^ do zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagle'a (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. w 37°C z 5% CO2. Usunięto pożywkę z komórek i do butelek dodano jedną probówkę N343 MSC X rozcieńczoną w 14 ml DMEM/5% FBS. Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle rosły przez
187 850 dni. Komórki oddzielano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 90 ml DMEM/2% FBS i 0,01 g perełek Cultisphere-G. Hodowle rosły w stężeniu gazu opisanym powyżej. Objętość w butelkach zwiększano przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle rosły w butelkach typu spinner do osiągnięcia ostatecznej objętości 250 ml.
Szczep N 101494 hodowano według tych samych zasad co szczep N343.
Zbieranie hodowli:
Hodowla szczepionki:
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości (15ml) w SPG/10% FBS.
Hodowle materiału do prowokacji:
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/10% FBS.
(20 ml dla szczepu N343 i 10 ml dla szczepu N101494).
Dawkowanie chomikom:
W dniu 0 chomiki z grupy A szczepiono doustnie 1 ml przygotowanej szczepionki.
Prowokacja:
dni po szczepieniu, 10 chomików w grupie A i 10 chomików w grupie B poddano doustnej prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N343. Grupa C była poddana prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N 101494.
Określenie ilościowe IS L. intracellularis:
Ilościowe określenie żywotności IS L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadzone to było przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być badana i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 ug/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiaraczkowania w ilości 0,1 ml/wgłębienie, do których wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 komórek/studzienkę i inkubowano przez 1824 godz. przy 37°C w 5% CO2 przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. 6 dnia komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCID50/ml.
Zakażenie chomików monitorowano stosując metodę PCR stosując startery i parametry cyklu jak to opisał Gary Jones. Próbki kału pobierano w 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 dniu po zaszczepieniu. Po zakończeniu badania błonę śluzową jelit chomików badano również stosując technikę PCR.
Histopatologia:
Skrawki jelita krętego i grubego utrwalano w formalinie, poddawano rutynowemu postępowaniu, barwiono hematoksyliną i eozyną. impregnowano srebrem i oceniano Skrawki znaczono również przeciwciałem monoklonalnym swoistym dla L. intracellularis.
Średni dzienny przyrost wagi:
Chomiki ważono 21, 28, 35 i 42 dnia po zaszczepieniu w celu określenia średniego przyrostu wagi.
187 850
Wyniki: patrz tabela poniżej.
TCID50:
Wyniki TCID50 wskazują, że grupa szczepiona (grupa A) otrzymała 104'86 TCIDsp/chomika. Chomiki w grupie A i B poddawano prowokacji szczepem N343 i otrzymały 105,5 TClD50/chomika. Chomiki grupy C poddawano prowokacji szczepem N101494 otrzymały 102,?3 TClD50/chomika.
PCR:
Wyniki testu PCR wskazują obecność L. intracellularis u 100% szczepionych chomików, które zabito i poddano sekcji w 21 dni po zaszczepieniu. Badanie 43 dni po zaszczepieniu wykazało, że 100% chomików kontrolnych i 50% zaszczepionych chomików było zakażonych L intracellularis. Wynik żadnego z królików poddanych prowokacji szczepem N101494 nie był dodatni. Wydalania bakterii w kale nie stwierdzono w trakcie badania u żadnego chomika.
Histopatologia:
Barwienie HE nie wykazało histologicznych uszkodzeń u wszystkich chomików zabitych i poddanych sekcji 21 dnia po zaszczepieniu. W skrawkach pobranych 43 dnia po zaszczepieniu 50% zwierząt w grupie zaszczepionej wykazywało łagodne do ciężkiego limfocytarnego zapalenia jelit i 50% zwierząt grupy kontrolnej wykazywało łagodne limfocytarne zapalenie jelit. Nie było widocznych uszkodzeń w grupie poddanej prowokacji szczepem N101494.
Znakowanie FA nie wykazało L. intracellularis u żadnego z chomików w 43 po zaszczepieniu.
Dyskusja:
Obserwowano 50% zmniejszenie zakażenia u chomików zaszczepionych intensywnie pasazowanym szczepem L. intracellularis jak to wykazano w badaniu PCR.
187 850 (U
S
O
CU
O
Λί ta o
u
X rl e
Ή
X
JJ >.
£ §
Λ
4)
U <D
G <ti λ;
s ο
Ν
Π
Γ-1
Ό3 <0
Λ!
Ό
Ν r—I '(0 rM (ti ϋ
cd a
CU
2°!·§Λ d
ifl xt
Cl i 'Τ 1 >1
n) a
CM
Ci >ł U «1 CU Q ci m o ’Τ CU TJ rM (0 id cd
U <n
CL. TJ
Al (0 w
ci <n υ
CU TJ I
Al (ti id cd T-t O CM O. Tł
a) id
Al (0 id u £ tu Ό
A, (ti ϋ
4-1
O -H θ' ti «-t tti <ΰ Φ rM N -n
OJ •K <u G G Φ tj <-i -u O (ti -ri Cn CU rl nl Λ Φ rM n -m
I I
1 1
<D
G
Φ (ti Φ
-rl •rl
a> C O G
-rl Φ Si <ł> |
f-d rl 4-1 ł-ł i—1 4->
-tJ (ti -rl (ti (ti -rl
a> CU -Ί Ή CUrl
-r-( rtj <D £ (ti Φ
υ N -O tM -m
+ + 1
Φ
-rl
G ω rM 4-1 _ (0 -rl cn CU <-{ rtj (0 Φ rM Ν -n
Φ
G
TJ
O iii'
III' id τ u ri
CU T>
cd o £ Oj O
Q ł—(
1 1 i 1 1 1 1 1 1
I i i t 1
' 1 i 1
i | I
1 1 Ϊ 1 1
O »“<
«—ł CM n <T tn \£> r— j co cr> r—1 | e-1 ł
i 1 < 1 1 Ci i ć,
187 850 ιιιιι lilii <u φ Φ Φ β -Η β -H
Η β Η β (0 0) Φ Φ
Φ Φ 2 ? C -γ4 β ·Η β -Η Έ 2
Η £ Η £ 5
- - φ φ ® ® η} Φ ίθ φ <υ ψ ~ ,. & . ι, β rH -ρ
I I ι I β I—i 4-> ł 4-1 1 β +3 .§ rt -Η ·Η Φ -Η
-Η Φ -Η -Η Φ ·Η Η g-H £ β -i Α 9- d .5 8* « -5 Φ Φ ·η 2 <ϋ
-Η φ Φ -Η « Φ '2 S 6 Ν ·π βφ-η 6 Ν ·η β Μ -rt e Ν η β r-ι -Ρ I I I I ι I Η Φ -Η β ϋ Η Η Φ φ β Μ ·π 'Ζ, ζ g g g g g.1 · 1 • 1 1 1 Z 55 l 1’ 1 55 53 lilii liii· ιιιιι lilii η O· tf>
*—i «—i T—1 F-1
I I I I < < < < co
C\i
I
CQ
ΙΌ «Γ
I I
CQ ® ιη ό ι i
Cfl CQ p-» OD <7l r-<
j | | I ® CO cQ CQ CQ ®
187 850 % z z « 1 ’ ’ · ' d rij rtj rtj rtj gj^J^tlltllllll ^^11 i i I I I I I I
5S55;2< <·’’>’><»
STo r-tCNrO-TtOljDr-COCTl^
I I I I I I I I I I ωωεοοουουυοουο
187 850
PRZYKŁAD 6
Doświadczenie nad skutecznością szczepionki dla świń
Cel:
Przedmiotem tego doświadczenia jest ocena bezpieczeństwa, utrzymującej się kolonizacji i skuteczności niezjadliwych, żywych izolatów i zabitych izolatów L. intracellularis u 2-3tygodniowych świń. Badanie na zwierzętach przeprowadzono na trzytygodniowych świniach zaszczepionych, a następnie poddanych ekspozycji na zjadliwy szczep M343 L intracellularis i porównanie zabezpieczenia pomiędzy szczepionkami.
Sposoby:
grudnia 1995 ogólna 45 śaiń, w wieku trzech tygodm zaknp iono w H&w H&ns. Zostały przewiezione do Veterinary Resources, Inc., pomieszczenia badawcze mieściły się niedaleko Cambridge, Iowa, gdzie je znakowano celem identyfikacji poszczególnych świń. Świnie sprowadzono do ich pomieszczeń na dwa dni przed rozpoczęciem badania, by mogły się zaaklimatyzować do pomieszczeń i karmiono je karmą pozbawioną antybiotyków w trakcie trwania badania.
grudnig w99ysWSe świiń e k.wazonk, pon^^nio braw edew i^ilymM^i^a kaliak róirowścy, przeprowadzono ocenę kliniczną i pobrano rozmazy kału. Następnie świnie randomizowano do grup po 5 i umieszczano w wannach. 20 świń umieszczono w oddzielnym pomieszczeniu i były zaplanowane jako grupy kontrolne i ściśle kontrolne. 15 świń umieszczono w drugim pomieszczeniu i były poddawane szczepieniu szczepionką Isi-1, w trzecim pomieszczeniu 10 świń otrzymywało Isi-2.
Żywe szczepionki przygotowano w NOBL Laboratories Research and Develapme9t i oznaczono numerem doświadczalnym iIsś-1. I^i-1 (szczep N343) izolow<ano ze świń i hodowano w sposób ciągły przez 29 tygodni. Szczepionkę hodowano na komórkach McCo/a w butelkach typu spinner i w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu aż do zauważenia zakażenia około 100% komórek. Próbka intensywnie pasaZawa9ego szczepu N343 wykorzystanego w wytworzeniu ISi-1 pasażowano dodatkowo przez 11 tygodni („N343NP40wk”) i zdepanawa9a zgodnie z warunkami Porozumienia Budapeszteńskiego 22 maja 1996 w ATCC, 12301 Parklawn Drive, Roc^nle, Maryland, USA 200852 i oznaczono numerem dostępu 55783. Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 min. Poletki zostały ponownie zawieszone w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) w 10% FBS i pasażawana 4 razy przez igłę kaliber 25. Lizaty wirowano przy 500 x g przez 5 min w celu oddzielenia reszt komórkowych i koralików mikronośnika. Supernatant zachowano i przechowywano w -70°C w lodzie przez podaniem do około 1 godz. przed szczepieniem.
Zabite szczepionki (Isi-2) hodowano, pasażowano przez 12,5 tygodnia i zbierano w według podobnych zasad jak opisano powyżej i oczyszczano na gradiencie percollu. Oczyszczone bakterie przechowywano w -70°C do około tygodnia przez szczepieniem, następnie przechowywano je w 4°C w przy normalnym poziomie tlenu atmosferycznego, który jest toksyczny dla L. intracellularis. AlOH dodano do bakterii do uzyskania ostatecznego stężenia 10%o AlOH. Stężenie białka oznaczano stosując metodę Biuretta.
Określenie ilościowe żywych IS L intracellularis:'
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez okroślonio dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Do 96-stukpionkawaoh płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 kam5rok/w4łębionio i hodowano przez 18-24 godz. przed zakażeniem. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wa9komaoynę (100 ug/ml) i amfotoryca9ę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studpio9kawych płytek do mikromiarocpkowania w ilości 0,1 mi/wgłębienie. Stosowano 12 stul9penś0krozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 drn w ss^^^rni^u gazów 8,0% (O, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała mo9oklanal9ogo przeciwko L. intracellularis (uzyskane od dr Stovona McOrisfa) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano antymysie koniugaty immunagloguliny klasy G - fluaroohrom (FITC) w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębionio i i9kubowa9a 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzy24
187 850 krotnie dclILO i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCID5o/ml stosując metodę obliczeń Reed-Meunsch'a.
Wyniki TICD50 wskazują, że ISi-1 zawierają więcej niż 1 x 103 bakterii/ml. Czwartym materiałem zakażającym było placebo pochodzące z komórkowych hodowli tkankowych przygotowanych w ten sam sposób co szczepionki.
Zabita szczepionka badana w kierunku zawartości białka metodą Biuret'a zawierała 0,311 mg/ml.
Świnie zaszczepiono 13 grudnia 1995. Wszystkie żywe szczepionki podano w dawce 2 ml IN w ilości 1 ml/nozdrze. Isi-2 (zabite) szczepionki podano domięśniowo w ilości 1,5 ml/świnię i powtórzono po 14 dniach. Wszystkim zwierzętom kontrolnym podano niezakażone komórki w ten sam sposób co żywe szczepionki.
Obserwacje i próbki:
Rozmazy kału i próbki surowicy pobierano co 7 dni w trakcie trwania badania. Rozmazy kału badano metodą PCR stosując zestaw starterów, 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG3' i 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' do amplifikacji DNA. Parametry cyklu to 93°C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45 s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej podanych temperaturach przez 45 s dla danej temperatury. Ostatni cykl przeprowadzono w 72°C przez 2 min, startery określono przez Jones'a i in.
Prowokacja:
Wszystkim zwierzętom, za wyjątkiem ścisłej kontroli poddano prowokacji hodowlami 26 i 27 dnia po szczepieniu, hodowle zawierały nieintensywnie pasażowanymi hodowlami L intracellularis szczepów N343 i N72994, które były hodowane w sposób ciągły przez 8 do 12 tygodni. Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (PBS) i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Niektóre hodowle przechowywano w -70°C do czasu prowokacji i zbierania hodowli. Prowokacja materiałami zakażającymi została połączona i określono TCID50 hodowli. Próbki trzymano na lodzie aż do momentu podawania.
stycznia 1996 podano do hodowle prowokacji składające się z 4 x 104 bakterii/ml, a 9 stycznia 1996 podano do hodowle prowokacji składające się z 3 x 104 bakterii/ml. Świniom podano w obu tych dniach po 15 ml materiału do prowokacji drogą płukania żołądkowego. Tak więc zwierzęta otrzymały odpowiednio 8 i 9 stycznia 1996 6 x 10s bakterii/świnię i 4,7 x 1 05 bakterii/świnię.
Wyniki:
Bezpieczeństwo:
Wyniki PCR rozmazów kałowych: Wykrywanie L. intracellularis przy zastosowaniu metody PCR wykazało, że żadna ze świń nie wydalała bakterii z kałem na początku badania. Siódmego DNA po zaszczepieniu wyniki wszystkich świń były ujemne. Czternastego DNA po zaszczepieniu wyniki 3 świń w grupie ISi-1 były dodatnie. Wyniki dwóch zwierząt w grupie ISi-1 w 21 dniu po zaszczepieniu były dodatnie, a wszystkich innych zwierząt ujemne. W 26 dniu po zaszczepieniu żadne ze zwierząt nie wydzielało bakterii z kałem jak to wykazano w badaniu PCR. 26 dnia po zaszczepieniu po 5 świń z grupy Isi-1 i z grupy kontrolnej i 4 świnie z grupy Isi-2 zostało zabitych i poddano sekcji. Pobrano próbki jelita krętego, okrężnicy, krezkowych węzłów limfatycznych i migdałki jak również próbki płuc od świń podejrzanych o zapalenie płuc.
Badanie PCR na zwierzętach przeprowadzono wykorzystując próbki jelita krętego i płuc. Jedynie w grupie leczonej pobrano próbki migdalków, jelita grubego i węzłach chłonnych i przeprowadzono PCR. Wyniki badania PCR pokazano poniżej.
187 850
Grupa
PCR jelita krętego w 26 dniu po szczepieniu
Próbki jelita grubego
Próbki migdalków
Próbki krezkowych węzłów Próbki płuc chłonnych
ISi-1 1z5 +
ISi-2 0 z 4 - - - 0 z I
Kontrole
Ścisłe kontrole z 5 nie badano nie badano nie badano nie badano nie badano nie badano
Histologiczne skrawki jelita krętego znakowano stosując swoiste przeciwciało raanoklonalne przeciwko L. intracellularis jako przeciwciało pierwszorzędowe i anty-mysie koniugaty immunoglobuliny klasy G-fluorocórom jako przeciwciało drugorzędowe. L. intracellularis obserwowano u 3 z 5 świń z grupy Isi-1. Wyniki wszystkich innych świń były ujemne w znakowaniu przeciwciałem fluorescencyjnym.
Wymienione świnie zostały zabite i poddane sekcji 21 dnia po prowokacji i te same próbki zostały pobrane dla określenia wyników. Wyniki PCR podano poniżej.
Grupa
PCR jelita krętego w 21 dniu po szczepieniu
Próbki jelita Próbki grubego migdałków
Próbki krezkowych węzłów Próbki płuc chłonnych
ISi-1 z 10 +
ISi-2 0 z 6
Kontrole 4 z 10
Ścisłe 0 _ 5 kontrole 0 z 5
Znakowanie FA jelita krętego przeprowadzono jak to pokazano powyżej, 7 z 10 zwierząt miało dodatnie wyniki w grupie kontrolnej. U wszystkich pozostałych zwierząt nie wykazano obecności L. intracellularis.
Surowicę badano w kierunku wytwarzania przeciwciał IgG przez świnie po ekspozycji na L. intracellularis. Test przeprowadzono przez wysiewanie hodowli tkankowych na płytki Terasaki z komórkami MeCoy'a w ilości 125 komórek/wgłębienie i hodowanie przez 18-24 godziny przez zakażeniem. Czyste hodowle L. intracellularis rozcieńczone do 1000-3000 bakterii/ml w DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą dodano do studzienek w ilości 0,01 ml/wgłębienie. Płytki in6ubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Surowicę świń rozcieńczono 1:75 w sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie rozcieńczonej surowicy. Płytki inyubowcno przez 30-60 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie anty-świński koniugat immunoglobuliny klasy IgG z fluorochromem. Płytki ^ubow^o przez 30 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy ddHzO i pozwalano im wyschnąć. Próbki przemywano 5 razy ddlŁO i pozwalano im wyschnąć. Próbki obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i studzienki, w których obserwowano bakterie byty znakowane jako dodatnie, a te w których nie obserwowano bakterii znakowano jako ujemne.
187 850
Wyniki:
Grupa Dzień 0 26 dzień po zaszczepieniu 47 dzień po zaszczepieniu 21 dzień po zaszczepieniu
ISi-1 Oz 15 6z 15 8 z 10
ISi-2 0 z 10 3 z 10 5 z 6
Kontrole 1 z 15 Oz 15 9z 10
Ścisłe kontrole 0 z 5 0 z 5 0 z 5
Zwierzęta, które miały wyniki dodatnie w dniu 0 ponownie badano w odstępach tygodniowych. Wyniki wskazują, że wszystkie zwierzęta miały ujemne wyniki serologiczne przez 14 dni po zaszczepieniu. Nie oczekiwano takiego wyniku, lecz wiek świń w dniu 0 wynosił 3 tygodnie i dodatnie wyniki mogły zależeć od przeciwciał przekazanych przez matkę.
Surowice badano cały czas z dodatnią surowicą kontrolną uzyskaną przez hiperimmunizację świń czystymi hodowlami L. intracellularis. Wykorzystywana ujemna surowica kontrolna była uzyskana z gnotobiotycznych świń z South Dakota State University.
Podany powyżej opis i przykłady są jedynie ilustruj korzystnego wykonania osiągniętego przy wykorzystaniu przedmiotów, cech i korzyści według niniejszego wynalazku, lecz nie było zamiarem ograniczenie przez to niniejszego wynalazku. Wszystkie modyfikacje niniejszego wynalazku objęte myślą i zakresem następujących zastrzeżeń są częścią mniejszego wynalazku.

Claims (2)

1. Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783, znamienna tym, że obejmuje etapy:
(1) zakażania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materiałem zakażającym obejmującym bakterie Lawsonia intracellularis, tak by zakazić wymienione komórki wymienioną bakterią; i (2) inkubowania wymienionych zakażonych komórek w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 0% do około 8% podczas wytrząsania wymienionych zakażonych komórek i hodowania Lawsonia intracellularis z utrzymywaniem wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie.
2. Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje etapy:
(1) zakażania hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, materiałem zakażającym obejmującym bakterie Lawsonia intracellularis, tak by zakazić wymienione komórki wymienioną bakterią; i (2) inkubowania wymienionych zakażonych komórek w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 5% do około 8% podczas wytrząsania wymienionych zakażonych komórek i hodowania Lawsonia intracellularis z utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie.
Niniejszy wynalazek dotyczy nowej metody hodowli bakterii Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783. Wynaleziono ulepszoną metodę hodowania na wielką skalę zasobów L. intracellularis.
L. intracellularis, czynnik wywołujący enteropatię proliferacyjną u świń (PPE), skutecznie atakuje wszystkie zwierzęta, w tym ludzi, króliki, fretki, chomiki, lisy, konie i inne zwierzęta tak odmienne jak strusie i emu.
PL35816396A 1995-06-05 1996-06-05 Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis PL187850B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/465,337 US5714375A (en) 1995-06-05 1995-06-05 Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US08/658,194 US5885823A (en) 1995-06-05 1996-06-04 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
PCT/US1996/009576 WO1996039629A1 (en) 1995-06-05 1996-06-05 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL187850B1 true PL187850B1 (pl) 2004-10-29

Family

ID=27041284

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325872A PL189250B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis
PL35816296A PL187849B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny
PL96358164A PL189187B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis
PL35816396A PL187850B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis
PL96358166A PL189287B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis
PL96358165A PL189286B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325872A PL189250B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis
PL35816296A PL187849B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny
PL96358164A PL189187B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96358166A PL189287B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis
PL96358165A PL189286B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5885823A (pl)
EP (5) EP1655607B1 (pl)
JP (4) JP3765834B2 (pl)
KR (4) KR100544857B1 (pl)
AT (3) ATE441863T1 (pl)
AU (1) AU717045B2 (pl)
BG (1) BG64292B1 (pl)
BR (2) BR9608338B1 (pl)
CA (1) CA2222643C (pl)
CZ (1) CZ295933B6 (pl)
DE (5) DE122007000102I1 (pl)
DK (3) DK1645567T4 (pl)
ES (3) ES2294620T5 (pl)
FR (1) FR07C0071I2 (pl)
HU (1) HU230199B1 (pl)
LU (1) LU91405I2 (pl)
NL (1) NL300331I2 (pl)
NZ (1) NZ319994A (pl)
PL (6) PL189250B1 (pl)
PT (3) PT843818E (pl)
RO (1) RO118885B1 (pl)
RU (2) RU2265849C2 (pl)
WO (1) WO1996039629A1 (pl)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7022328B1 (en) 1995-11-30 2006-04-04 Australian Pork Limited Therapeutic and diagnostic compositions
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US7052697B1 (en) * 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
WO2000069904A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED FlgE POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
CA2372105A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7029683B1 (en) 1999-05-13 2006-04-18 Pfizer Products, Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
JP2003521881A (ja) * 1999-05-13 2003-07-22 オーストラリアン ポーク リミティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＯｍｐＨポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
NZ515332A (en) * 1999-05-13 2004-01-30 Pfizer Prod Inc Lawsonia derived gene and related SodC polypeptides, peptides and proteins and their uses
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
JP2004529854A (ja) * 2000-09-29 2004-09-30 アリゾナ・ボード・オブ・リージエンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・アリゾナ 増殖性回腸炎のための改善されたワクチン及びその作製と使用の方法
JP2004512851A (ja) * 2000-11-10 2004-04-30 アグリカルチュア　ビクトリア　サービシーズプロプライエトリー　リミティッド ラウソニア種による感染を処置する新規な治療用組成物
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
ES2266090T3 (es) * 2000-12-20 2007-03-01 Intervet International Bv Vacuna contra lawsonia intracellularis.
US20030087421A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-08 Gebhart Connie J Lawsonia intracellularis
AU2003295341A1 (en) * 2002-10-04 2004-05-04 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid and polypeptide sequences from lawsonia intracellularis and methods of using
DE602004023094D1 (de) * 2003-07-25 2009-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmed Lawsonia intracellularis europäischen ursprungs unür
CA2536989A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Akzo Nobel N.V. Lawsonia intracellularis subunit vaccine
BRPI0417440A (pt) * 2003-12-09 2007-03-06 Intervet Int Bv ácido nucleico, fragmento e molécula de dna, veìculo recombinante vivo, célula hospedeira, proteìna de lawsonia intracellularis, vacina para combater as infecções com lawsonia intracelularis, método para a preparação de uma vacina, e, testes de diagnóstico para aldetecção de anticorpos contra lawsonia intracellularis e material antigênico de lawsonia intracellularis
WO2005070958A2 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Intervet International B.V Lawsonia intracellularis subunit vaccines
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
MY146476A (en) 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
US20060021536A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Limin Song Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme
KR100621882B1 (ko) * 2004-09-30 2006-09-19 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법
US20090232848A1 (en) * 2004-11-24 2009-09-17 Pfizer Inc. Methods for cultivating lawsonia intracellularis
US20070212373A1 (en) * 2004-12-08 2007-09-13 Akzo Nobel N.V. Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
EP3868400A1 (en) 2005-12-29 2021-08-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
DK3766518T3 (da) * 2005-12-29 2026-04-13 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Immunogen pcv2-sammensætning til mindskelse af kliniske symptomer hos grise
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
EP2859900A1 (en) 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
PT2094872T (pt) * 2006-12-15 2017-04-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Tratamento de porcos seropositivos para o anticorpo anti-pcv2 com antigénio de pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
EP2200643B1 (en) 2007-09-17 2013-09-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. A live lawsonia intracellularis vaccine administered in combination with an antibiotic for use in the treatment of lawsonia intracellularis infections in pigs
CN101874106A (zh) * 2007-10-12 2010-10-27 辉瑞大药厂 培养胞内劳森氏菌的方法
CN101932336B (zh) * 2007-12-31 2014-07-09 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒
KR20100113582A (ko) 2008-01-23 2010-10-21 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법
EP2254595A4 (en) * 2008-02-15 2012-12-05 Boehringer Ingelheim Vetmed METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING THE IMPACT OF ENTERIC DISEASES
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
US8557254B2 (en) 2008-07-22 2013-10-15 Intervet Inc. Lawsonia intracellularis bacterium of a novel serotype, vaccine based on that bacterium, antibodies suitable for diagnosing the novel Lawsonia intracellularis serotype and hybridomas for producing the said antibodies
US8142760B2 (en) * 2008-09-05 2012-03-27 Nathan Len Winkelman Vaccination for Lawsonia intracellularis
WO2011006880A1 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis propagation
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US8530223B2 (en) * 2009-11-09 2013-09-10 Intervet International B.V. Method to grow Lawsonia intracellularis bacteria in persistently infected McCoy cells
MX361273B (es) 2012-12-28 2018-12-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Metodo para obtener una vacuna de mycoplasma.
CN105579060B (zh) 2013-09-25 2021-03-16 硕腾服务有限责任公司 Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法
MX373884B (es) 2013-10-02 2020-03-26 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Variante de la proteína pcv2 orf2 y partículas similares al virus compuestas por ésta.
CN107206062B (zh) 2015-02-04 2021-07-02 英特维特国际股份有限公司 用于针对猪中亚临床劳森氏菌感染的疫苗
RU2709197C2 (ru) * 2015-02-04 2019-12-17 Интервет Интернэшнл Б.В. Вакцина для применения против субклинической инфекции lawsonia у свиней
KR20180062468A (ko) * 2016-11-18 2018-06-11 녹십자수의약품(주) 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도
EP3758740A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Method for reducing skatole and/or indole in animals
EP4185321A2 (en) 2020-07-24 2023-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Combination porcine vaccine
US12409212B2 (en) 2021-11-01 2025-09-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic gel compositions
US20260103674A1 (en) 2022-09-27 2026-04-16 Intervet Inc. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
WO2024260953A1 (en) * 2023-06-23 2024-12-26 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
CN119185351B (zh) * 2024-09-25 2025-09-16 武汉轻工大学 Li0004蛋白靶点在制备抑制劳森菌感染细胞增殖的药物中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132597A (en) * 1976-06-09 1979-01-02 Ab Medipharm Method for cultivation of bacteria
US4237218A (en) * 1979-02-09 1980-12-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Micro-carrier cell culture
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
JPH0644865B2 (ja) * 1985-10-29 1994-06-15 三菱瓦斯化学株式会社 カンピロバクタ−属細菌の培養方法
US5338670A (en) * 1986-07-28 1994-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
IT1227657B (it) * 1988-12-01 1991-04-23 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione
JPH0822221B2 (ja) * 1988-12-28 1996-03-06 日東化学工業株式会社 シュードモナス属細菌の培養法
JPH02308754A (ja) * 1989-05-24 1990-12-21 Yakult Honsha Co Ltd 乳発酵食品の製造法
US5296221A (en) * 1990-01-31 1994-03-22 Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations
DK0555366T3 (da) * 1990-11-01 2000-08-28 Univ Iowa State Res Found Inc Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine
SU1768637A1 (en) * 1990-12-04 1992-10-15 Inst Virusologii Im D I Ivanov Strain of human immunodeficient virus 1-type for preparation of diagnostic preparation
DK0669971T3 (da) * 1991-11-15 2003-04-22 Pfizer Fremgangsmåde til fremstilling af Gram-negative bakterielle vacciner
DE4208785A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5610059A (en) * 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI9612938B8 (pt) 2017-09-12
PL325872A1 (en) 1998-08-17
RU2265849C2 (ru) 2005-12-10
JP5078740B2 (ja) 2012-11-21
EP1645567B2 (en) 2016-01-06
DE69637251T3 (de) 2016-06-02
EP0843818A1 (en) 1998-05-27
KR100513481B1 (ko) 2006-01-27
DE69634334D1 (de) 2005-03-17
EP1645567A1 (en) 2006-04-12
ES2332587T3 (es) 2010-02-09
EP1403643B1 (en) 2009-09-02
JP3920300B2 (ja) 2007-05-30
AU6262796A (en) 1996-12-24
HUP9900884A2 (hu) 1999-07-28
ES2173055T3 (es) 2005-07-01
FR07C0071I1 (pl) 2008-01-02
DK1645567T4 (en) 2016-04-11
RU2005114739A (ru) 2006-11-20
BRPI9612938B1 (pt) 2010-07-27
ES2294620T5 (es) 2016-03-23
JP4263212B2 (ja) 2009-05-13
DE69634334T2 (de) 2006-04-13
DE69637251D1 (de) 2007-10-25
NL300331I1 (nl) 2008-03-03
PL189250B1 (pl) 2005-07-29
JP2007151554A (ja) 2007-06-21
LU91405I2 (fr) 2008-02-21
CZ295933B6 (cs) 2005-12-14
DE69637251T2 (de) 2008-06-12
DK1645567T3 (da) 2007-11-26
BR9608338B1 (pt) 2009-05-05
PL189187B1 (pl) 2005-07-29
DK0843818T3 (da) 2005-05-09
PL187849B1 (pl) 2004-10-29
ATE441863T1 (de) 2009-09-15
ATE373015T1 (de) 2007-09-15
ES2173055T1 (es) 2002-10-16
CA2222643A1 (en) 1996-12-12
NZ319994A (en) 2000-01-28
CA2222643C (en) 2013-08-13
JP2006061165A (ja) 2006-03-09
FR07C0071I2 (fr) 2010-12-31
DK1403643T3 (da) 2010-01-04
EP1655607A1 (en) 2006-05-10
KR20050048651A (ko) 2005-05-24
RO118885B1 (ro) 2003-12-30
PL189287B1 (pl) 2005-07-29
BG64292B1 (bg) 2004-08-31
EP1655607B1 (en) 2015-05-13
ES2294620T3 (es) 2008-04-01
EP2199795A2 (en) 2010-06-23
BG102130A (bg) 1998-09-30
KR100758614B1 (ko) 2007-09-13
DE843818T1 (de) 2002-11-28
EP0843818B2 (en) 2018-12-19
WO1996039629A1 (en) 1996-12-12
JP2008266340A (ja) 2008-11-06
BR9608338A (pt) 1999-01-05
AU717045B2 (en) 2000-03-16
CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
EP2199795B1 (en) 2016-03-30
HUP9900884A3 (en) 2001-01-29
EP1403643B2 (en) 2018-10-03
DE122007000102I1 (de) 2008-04-17
KR20060129549A (ko) 2006-12-15
DE69638016D1 (de) 2009-10-15
NL300331I2 (nl) 2008-07-01
EP1645567B1 (en) 2007-09-12
EP2199795A3 (en) 2010-11-03
HU230199B1 (hu) 2015-10-28
EP0843818B1 (en) 2005-02-09
HK1010911A1 (en) 1999-07-02
MX9709464A (es) 1998-06-30
KR20050046741A (ko) 2005-05-18
US5885823A (en) 1999-03-23
ATE289069T1 (de) 2005-02-15
EP1403643A1 (en) 2004-03-31
KR19990022509A (ko) 1999-03-25
PT843818E (pt) 2005-04-29
JPH11507225A (ja) 1999-06-29
PT1403643E (pt) 2009-10-08
RU2305707C2 (ru) 2007-09-10
PT1645567E (pt) 2007-11-19
JP3765834B2 (ja) 2006-04-12
PL189286B1 (pl) 2005-07-29
KR100544857B1 (ko) 2006-01-24
EP0843818A4 (en) 2002-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL187850B1 (pl) Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis
DK1651260T4 (en) Lawsonia intracellularis of European origin and vaccines, diagnostic agents and methods for their use
US5714375A (en) Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
CN1519311B (zh) 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂
HK1010911B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
HK1067662B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
HK1081594B (en) Lawsonia intracellularis cultivation in mccoy cell
MXPA97009464A (en) Culture of lawsonia intracellularis, vaccines against lawsonia intracellulares and agents of diagnost