PL189287B1 - Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis - Google Patents

Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis

Info

Publication number
PL189287B1
PL189287B1 PL96358166A PL35816696A PL189287B1 PL 189287 B1 PL189287 B1 PL 189287B1 PL 96358166 A PL96358166 A PL 96358166A PL 35816696 A PL35816696 A PL 35816696A PL 189287 B1 PL189287 B1 PL 189287B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
intracellularis
cultures
culture
bacteria
Prior art date
Application number
PL96358166A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey P. Knittel
Michael B. Roof
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Nobl Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27041284&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL189287(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/465,337 external-priority patent/US5714375A/en
Application filed by Boehringer Ingelheim Nobl Lab filed Critical Boehringer Ingelheim Nobl Lab
Publication of PL189287B1 publication Critical patent/PL189287B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

1. Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis, zwlaszcza ATCC 55783, znamien- ny tym, ze wytwarzany jest sposobem obejmujacym otrzymywanie hodowli komórko- wych, korzystnie wybranych z grupy obejmujacej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, zakazonych bakteria Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych za- kazonych komórek w stezeniu tlenu od okolo 0% do okolo 18%, wytrzasanie wymienio- nych zakazonych komórek tak, by hodowac Lawsonia intracellularis podczas utrzymywa- nia wymienionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasazowanie przynajmniej czesci wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej czesci hodowli wymienio- nych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych. 2. Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis, zwlaszcza ATCC 55783, znamien- ny tym, ze wytarzany jest sposobem obejmujacym otrzymywanie hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmujacej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18 zakazonych bakteria Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakazonych komórek w stezeniu tlenu od okolo 2% do okolo 18%, wytrzasanie wymienionych zaka- zonych komórek tak, by hodowac Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymie- nionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasazowanie przynajmniej czesci wymienio- nych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej czesci hodowli wymienionych hodo- wanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783. Produkty według wynalazku są dostępne częściowo jako wynik wynalezienia ulepszonych sposobów hodowania na wielką skalę zasobów L. intracellularis.
L. intracellularis, czynnik wywołujący enteropatię proliferacyjną u świń (PPE), skutecznie atakuje wszystkie zwierzęta, w tym ludzi, króliki, fretki, chomiki, lisy, konie i inne zwierzęta tak odmienne jak strusie i emu.
Zakażenie L. intracellularis powoduje znaczne straty szczególnie w stadach świń. Oceniając rozpowszechnienie i występowanie PPE w USA szacuje się, że około 20 procent trzody chlewnej jest zakazone z szacunkową stratą 20 milionów dolarów rocznie.
Stałą cechą PPE jest występowanie wewnątrzcytoplazmatycznych, nie związanych z błoną zakrzywionych bakterii w enterocytach zakazonych fragmentów jelita. Bakteria związana z wywołaniem PPE opisywano jako „organizmy podobne do Campylobacter”. S. McOrist i in., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989). Następnie, bakteria wywołująca to schorzenie została zidentyfikowan jako nowy taksonomiczny rodzaj i gatunek, endemicznie opisywany jako wewnątrzkomórkowy symbiont jelitowy (IS). C. Gebhart i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 43, No 3, 533-38 (1993). Obecnie, tym nowym bakteriom nadano taksonomiczną nazwę Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 45, No 4, 820-25 (1995). Te trzy nazwy używano zamiennie do opisania tego samego organizmu dalej tu zidentyfikowanego i opisanego. W dyskusji niniejszego wynalazku usiłowano używać nazwę taksonomiczną L. intracellularis.
L. intracellularis jest obligatoryjną, wewnątrzkomórkową bakterią, która nie może być hodowana zwykłymi metodami bakteriologicznymi w konwencjonalnych pozbawionych komórek pożywkach i wydaje się, że wymaga do wzrostu dołączenia komórek nabłonkowych. S. McOrist i in., w Infection and Immunity, Vol. 61, nr 10, 4286-92 (1993) i G Lawson i in., w J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, nr 5, 1136-42 (1993) omawiają hodowanie L. intracellularis przy użyciu hodowli jednowarstwowych komórek nabłonkowych szczurów IEC-18 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowej. Dodatkowo, H. Stills, w Infection and Izmu189 287 nity, Vol. 59, nr 9, 3227-36 (1991) omawia zastosowanie hodowli jednowarstwowych ludzkich, płodowych komórek nabłonkowych Intestine 407 i hodowli jednowarstwowych raka nabłonkowego okrężnicy świnki morskiej GPC-16 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowych. Te wcześniejsze sposoby hodowli wymagają dużego nakładu pracy i są bezwartościowe w hodowli na dużą skalę.
Obecne zrozumienie zakażenia L. intracellularis, leczenie i skuteczna kontrola choroby są poważnie hamowane przez wymyślne potrzeby L. intracellularis w hodowli in vitro. Istnieje obecnie potrzeba polepszenia sposobu hodowania L. intracellularis. Istnieje również obecnie zapotrzebowanie na szczepionki przeciwko L. intracellularis i skuteczne narzędzia do diagnostyki zakazenia L. intracellularis.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783, charakteryzującego się tym, że wytwarzany jest sposobem obejmującym otrzymywanie hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakazonych komórek w stężeniu tlenu od około 0% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakazonych komórek tak, by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasazowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych.
Kolejnym wariantem atenuowanego szczepu według wynalazku jest atenuowany szczep Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783 charakteryzujący się tym, że wytwarzany jest sposobem obejmującym otrzymywanie hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od około 2% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak, by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych.
Do osiągnięcia tych i innych przedmiotów zgodnie z celem niniejszego wynalazku jak to zawarto i szeroko tutaj opisano, dostarczono metodę hodowania L. intracellularis i wytworzonych w ten sposób na wielką skałę zasobów bakterii. Zgodnie ze sposobem, bakterie L. intracellularis są inkubowane w stężeniu tlenu od około 0 do 18%, podczas pobudzania bakterii L. intracellularis do wzrostu, w czasie utrzymywania bakterii w zawiesinie.
Zgodnie z innym wykonaniem, dostarczona jest metoda hodowania bakterii L. intracellularis przez posianie na hodowle jednowarstwowe Hep-2, McCoys lub IEC-18, o około 30% zlewności, z materiałem inokulacyjnym zawierającym bakterie L. intracellularis do zakażania komórek. Zakażone komórki następnie inkubowano w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 0 do 8,0% do osiągnięcia przez komórki zlewności. Zakażone komórki i pożywkę hodowlaną umieszczono następnie w fermentatorach, bioreaktorach, butelkach typu spinner lub innych pojemnikach, w których można utrzymywać komórki w zawiesinie. Zakazone komórki wytrząsa się podczas inkubacji komórek, tak że bakterie L. intracellularis są hodowane podczas utrzymywania zakażonych komórek w zawiesinie. Część wyhodowanych L. intracellularis jest następnie pasażowana do świeżych komórek hodowlanych w celu zwiększenia wytwarzania bakterii L. intracellularis.
Dostarczono nowe szczepionki przeciwko L. intracellularis i sposoby wytwarzania szczepionki przeciwko L. intracellularis. Niezjadliwe bakterie L. intracellularis uzyskuje się przez pasażowanie wyhodowanych bakterii L. intracellularis w wystarczającej ilości w jednostce czasu i selekcję w celu uzyskania szczepów atenuowanych lub przez poddanie wyhodowanych bakterii działaniu środków chemicznych w celu uzyskania atenuacji. Szczepionki zawierające zabite L. intracellularis są również wytwarzane z zastosowaniem metod hodowania według wynalazku. Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem bakterie są ciągle hodowane przez przynajmniej około 6 do 8 miesięcy, i w tym czasie są pasażowane przynajmniej od około 7 do 12 razy w celu wytworzenia atenuowanych szczepów w celu uzyskania szczepionki. Atenuowane bakterie miesza się następnie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i podaje zwierzętom w skutecznej ilości do uzyskania odpowiedzi immunologicznej.
189 287
Aktualnie korzystny atenuowany szczep (N343P40wk) zdeponowano w American Type Culture Collection.
Dostarczono również metodę oceny obecności w próbce biologicznej przeciwciał swoiście reagujących z bakteriami L. inttaaellueatis przez zbieranie przynajmniej części wyhodowanych L. intraaeleuearis, doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z zebranymi hodowlami L. intracellularis lub ich składnikiem w warunkach, w których przeciwciało obecne w próbce biologicznej reaguje z L. intracellularis lub ich składnikiem i ocena występującej reakcji przeciwciało-antygen.
Dodatkowe cechy i korzyści wynalazku zostaną następnie przedstawione w dalej następującym opisie i staną się jasne z opisu i mogą być poznane przez praktyczne zastosowanie wynalazku.
Opis korzystnych wykonań
Zastosowany tutaj termin „L. intracellularis” oznacza wewnątrzkomórkową, zakrzywioną, gram-ujemną bakterię opisaną szczegółowo przez C. Gebbarta i in., Int'l J. of Systemie Bacteriology. vol. 43, nr 3, 533-38 (1993) i S. McOrisPa i in.. Int'l J. of Systemie Baatetiology, vol. 45, nr 4, 820-25 (1995) (każde z nich włączone tutaj w całości przez piśmiennictwo) i obejmują, choć nie są ograniczone do bakterii zdeponowanej jako ATCC 55672 w American Type Culture Cofiection, Roc^nle, MD; bakterię zdeponowaną jako NTCT 12656 i 12657 w National Coelectisn of Type Cul^es, Colindale, London; bakteria wywołującą, która została uzyskana od świń zakażonych PPE i innych zwierząt wykorzystując światowy stan wiedzy i techniki; warianty i mutanty każdej z powyższych bakterii, uzyskane w sposób spontaniczny lub sztuczny.
W sposób tutaj zastosowany termin „szczep atenuowąny” oznacza każdy szczep L. intracellularis uzyskany zgodnie z technikami hodowli i pasażowania tutaj podanymi w celu uzyskania szczepów niezjadeiwych przy zachowaniu własności immunogennych w czasie podawania gospodarzom zwierzęcym. Jak podano poniżej liczne, różne szczepy L. intraaellulαris hodowano i atenuowano zgodnie z współczesnymi technikami w celu uzyskania w celu uzyskania atenuowanych, immunogennych szczepów wykazujących skuteczność jako szczepionki dla świń i innych zwierząt wrażliwych na zakażenie L. intracellularis.
Oczekuje się, ze atenuowane szczepy według wynalazku posiadają własności jako immunogeny w szczepionkach prceciwbaktefyjnych dla zwierząt, włączając w to ptaki, ryby, bydło, świnie, konie, ssaki i ogólnie naczelne, w tym ludzi. Takie szczepionki mogą być przygotowane stosując techniki znane specjalistom wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Taka szczepionka powinna obejmować skuteczną ilość atenuswanegs szczepu w farmaceutycznie dostępnym nośniku. Szczepionka może być podawana w jednej lub więcej dawkach. Immunologicznie skuteczną ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez zbytnich eksperymentów, wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Ilość πίο'^κΐ^χ·) bakterii powinna być wystarczająca do pobudzenia odpowiedzi immunologicznej u zwierząt wrażliwych na to schorzenie, podczas gdy ta ilość stale pozostaje niezjadliwa. Zależy ona od poszczególnych zwierząt, bakterii i schorzeń towarzyszących. Zalecana podawana dawka wynosi korzystnie od około IO3 do IO9 bakterii/kg wagi ciała i najkorzystniej od około IO5 do IO7 bakterii/kg wagi ciała. Nośniki są znane specjalistom i obejmują stabilizatory i rozpuszczalniki. Taka szczepionka może również zawierać odpowiedni adjuwant. Szczepionki mogą być stosowane w kombinacji z innymi szczepionkami, na przykład jako rozpuszczalnik innej liofilizowanej szczepionki, Iub połączone przed liofilizacją z inną szczepionką. Preparaty szczepionek mogą być również wysuszane, na przykład przez suche zamrażanie w celu przechowywania Iub przez następową formulację w płynne szczepionki.
Odpowiednio, przedstawiono również sposób pobudzenia odpowiedzi immunologiasnej na zjadliwe, bakterie L. intracellularis typu dzikiego u zwierząt gospodarzy, w celu zabezpieczenia gospodarzy przed takimi bakteriami. Sposób obejmuje podawanie gospodarzowi immunologicznie efektywnej ilości atenuowanych Iub zabitych bakterii, i korzystnie podawanie gospodarzowi szczepionki.
Jak użyto tutaj termin „hodowla na wielką skalę” oznacza poziom hodowli L. intracellularis większy niż około 2,0 do 3,0 litrów i obejmujący produkcję na skalę 100 Iub więcej
189 287 litrów. „Hodowanie” w sposób tu użyty oznacza proces promowania wzrostu, reprodukcji i/lub proliferacji L. intracellularis.
W praktycznym wykorzystaniu przedstawionego sposobu hodowania, komórki hodowlane mogą być najpierw zakażane materiałem zakażającym zawierającym bakterie L. intracellularis, tak by uzyskać komórki zakazone. Ilość linii komórkowych stosowanych w praktycznym wykonaniu wynalazku, obejmuje lecz nie jest ograniczona do: IEC-18 (ATCC 1589)szczurzych komórek nabłonka jelitowego, Hep-2 (ATCC 23) - ludzkich komórek raka nabłonkowego, McCoys (ATCC 1696) - mysich komórek (nie określone). MDCK (ATCC 34) - psich komórek nerki Madin-Darby, BGMK (Biowhittaker #71-176) - komórek nerki małp „buffalo green” i komórek nabłonka jelitowego świni. Korzystnymi komórkami hodowlanymi są komórki Hep-2, McCoys lub IEC-18. Alternatywnie, bakterie mogą być hodowane w układach bezkomórkowych, tak długo jak bakterie są utrzymywane w odpowiednim stężeniu tlenu takim jak tu podano.
Jeśli używa się komórki hodowlane, to przed zakażeniem, komórki korzystnie, lecz nie koniecznie powinny występować w postaci hodowli jednowarstwowej. By uzyskać postać hodowli jednowarstwowej, komórki mogą być hodowane w zwykłych butelkach hodowlanych. W każdej butelce można hodować komórki zmieszane z pożywką hodowlaną w ilości między około 1 x 1O5 komórek do około 10 x 1O5 komórek na butelkę o pojemności 25 cm2. Pożywką hodowlaną może być każda pożywka hodowlana, która obejmuje źródło azotu, potrzebne czynniki wzrostowe dla wybranych komórek hodowlanych i źródło węgla, takie jak glukoza i laktoza. Korzystną pożywką jest DMEM z 2-5% bydlęcą surowicą płodową, jednakże różne inne dostępne na rynku pożywki mogą być stosowane z dobrym wynikiem.
Znaleziono, że udane hodowanie L. intracellularis jest zwiększone przez utrzymywanie komórek hodowlanych na stałym poziomie wzrostu. Tak więc, hodowla jednowarstwowa komórek powinna mieć od około 20% do około 50% zlewności w momencie zakażania. Korzystnie, hodowle komórkowe powinny mieć od około 30% do około 40% zlewności w momencie zakażania, 30% zlewność jest najkorzystniejsza.
Materiałem zakażającym może być uzyskana czysta hodowla L. intracellularis, na przykład z depozytu 55672 ATCC, depozytu 12656 lub 12657 NCTC, lub z zakażonych świń lub innych zwierząt, po zastosowaniu sposobów izolacji i oczyszczania opisywanych tutaj.
Zgodnie z jednym wykonaniem, materiałem zakażającym do praktycznego zastosowania w wynalazku jest homogenat jelitowy przygotowany przez zdrapanie śluzówki z jelit świni lub innych zwierząt zakażonych PPE. Podczas przygotowania homogenatu jelitowego, skrawki jelitowe wybrane do hodowli powinny wykazywać ciężkie uszkodzenie ze znacznym scieńczeniem śluzówki. W związku z chwiejną strukturą, próbki bakterii powinny być korzystnie umieszczone w -70°C tak szybko jak to możliwe po sekcji. Korzystnie jest dodać do materiału zakażającego antybiotyki, na które L. intracellularis jest oporna takie jak wankomycyna, amfoterycyna B i innych członków grupy aminoglikozydów, obejmujący gentamycynę i neomycynę, by nazwać jedynie kilka, w celu stłumienia zanieczyszczających bakterii, podczas wzrostu L. intracellularis. Gdy materiał zakazający jest czystą hodowlą lub homogenatem jelitowym, zakazenie hodowli komórkowej może być przeprowadzone różnymi technikami znanymi w stanie techniki podanymi tutaj.
Bakterie i/lub zakażone hodowle komórkowe są następnie inkubowane w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu. W stężeniu tlenu większym niż 18% wzrost L. intracellularis jest mniejszy niz optymalny, z ograniczeniem wzrostu pojawiającym się gdy stężenie tlenu jest poza optymalnym zakresem. Korzystnie zakażone komórki hodowlane są inkubowane w stężeniu tlenu wahającym się w granicach od 0% do około 10%. Bardziej korzystnie, komórki są inkubowane w stężeniu tlenu w zakresie od około 0% do około 8%, najkorzystniejsze stężenie tlenu waha się od 0% do 3%.
Właściwe stężenie dwutlenku węgla jest również ważne dla właściwego wzrostu L. intracellularis. W stężeniu dwutlenku węgla większym niż 10% i mniejszym niz 4% pojawia się wzrost nieoptymalny z ewentualnym ograniczeniem wzrostu w przy stężeniach poza tym zakresem. Korzystnie, stężenie dwutlenku węgla waha się w zakresie od około 6% do 9%, najkorzystniejszym stężeniem dwutlenku węgla jest stężenie około 8,8%.
189 287
Dodatkowo, komórki są inkubowane korzystnie w stężeniu wodoru wahającym się w granicach od 73% do 94%. Azot może być użyty w miejsce części lub całości obecnego wodoru. Zgodnie z korzystnym wykonaniem, komórki są inkubowane w stężeniu około 0-8,0% tlenu, około 8,8% dwutlenku węgla i około 83,2% wodoru.
Zakażone komórki mogą być inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym lub innej komorze gazowej zawierającej prawidłowe stężenie tlenu i dwutlenku węgla, i który pozwala na zawieszanie komórek w trakcie inkubacji. Komora powinna zawierać środki utrzymujące zakażone komórki w zawiesinie, monitor stężenia gazu i źródło pozwalające na utrzymanie prawidłowego stężenia gazów. Temperatura inkubacji powinna wahać się w granicach od 30°C do 45°C, bardziej korzystnie od 36°C do 38°C. Najkorzystniej temperatura powinna wynosić około 37°C. Konieczne wyposażenie do hodowli i sposoby atenuacji według wynalazku są tu dla specjalistów czytelnie przedstawione. Jednym z przykładów sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia niniejszego wynalazku jest podwójny inkubator gazowy, np. model 480 dostępny z Lab-Line, Melrose Park, Illinois, w połączeniu z butelkami hodowlanymi typu spinner w celu utrzymania komórek w zawiesinie. Obecnie korzystne wyposażenie obejmuje fermentator, bioreaktor, wytrząsacz obrotowy zawierający przynajmniej 2 litry pożywki i jest zdolny do utrzymywania komórek hodowlanych w zawiesinie przy przepływającym gazie o odpowiednim stężeniu, lub inne środki do mechanicznego wytrząsania i monitorujące stężenie rozpuszczonego tlenu w pożywce. Odpowiednie fermentatory i bioreaktory można uzyskać od New Brunswick, Braun lub innych wytwarzających je przedsiębiorstw.
Maksymalny wzrost komórek i przez to L. intracellularis jest uzyskiwany przez utrzymywanie zakażonych komórek w zawiesinie w trakcie inkubacji, przez co jest zwiększona ekspozycja poszczególnych komórek na pożywkę hodowlaną i właściwą mieszaninę tlenu i dwutlenku węgla. Komórki hodowlane mogą być wytrząsane i utrzymywane w zawiesinie różnymi metodami znanymi w stanie techniki obejmującymi na przykład, butelki hodowlane, butelki hodowlane typu roller, hodowle błonowe i butelki hodowlane typu spinner. Komórki mogą być utrzymywane w zawiesinie podczas inkubacji przez inkubowanie komórek w butelkach hodowlanych typu spinner wewnątrz podwójnych inkubatorów gazowych lub innych podobnych urządzeń. Termin „butelki hodowlane typu spinner” w sposób tu zastosowany, oznacza butelki lub inne pojemniki, wykorzystujące łopatki, śmigła lub inne środki do wytrząsania hodowli i utrzymujące zawarte komórki w postaci zawiesiny.
W szczególnie korzystnym wykonaniu według wynalazku, zakazone komórki są inkubowane aż do osiągnięcia przez komórki zlewności i następnie komórki są umieszczane w butelkach typu spinner zawierających pożywkę hodowlaną i inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym podczas wytrząsania butelki. Korzystnie zakażone komórki są zeskrobane do butelki typu spinner. Można to osiągnąć różnymi metodami znanymi w stanie techniki używając specjalnego skrobaka do komórek w celu odizolowania komórek. Gdy komórki zostaną wprowadzone do butelki typu spinner, wiosełko w butelce typu spinner jest obracane w zakresie od około 30 do około 60 obrotów/minutę w celu utrzymania zakażonych komórek w zawiesinie.
Część hodowanych L. intracellularis jest następnie pasażowana na świeże komórki hodowlane w celu zwiększenia produkcji bakterii L. intracellularis. Termin „pasażowanie” lub jego odmiany oznacza proces przeniesienia porcji hodowanych L. intracellularis na świeże komórki hodowlane w celu zakażenia tych świeżych komórek bakteriami. Termin „świeże” w sposób tu zastosowany oznacza komórki, które nie były do tej pory zakażone L. intracellularis. Korzystnie takie komórki są średnio nie starsze niż mniej więcej jednodniowe.
Pasażowi L. intracellularis w zawiesinach hodowlanych może towarzyszyć usunięcie części oryginalnej pożywki i dodanie jej do nowej butelki zawierającej nowe komórki hodowlane. W oryginalnych hodowlach jest wysoka ilości bakterii/ml, na przykład większe niz około IO4 bakterii/ml, jest korzystnym dodanie między około 1 do 10% (objętość do objętości) hodowli z zakazonych butelek do nowych butelek zawierających świeże komórki. Korzystne jest przeprowadzenie tego, gdy 50-100% komórek jest zakazonych. Jeśli mniej niz 50% komórek jest zakażonych, pasażowaniu korzystnie towarzyszy podzielenie hodowli 1:2 do nowych butelek i powiększenie objętości przez dodanie nowej pożywki. W tym przypadku,
189 287 liza komórkowa i inne etapy nie są wymagane, jak to było w przypadku pasażu hodowli jednowarstwowych, tak jak to przeprowadzano według wcześniejszego stanu techniki.
Po wystarczającym wzroście komórek hodowlanych i następnym osiągnięciu przez zakażenie L. intracellularis więcej niż 70% zakażalności komórkowej, w sposób określony przez IFA, TCID 50 lub inne porównywalne metody jest następnie zbierana przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis.
Etap zbierania hodowli bakteryjnych może być przeprowadzony przez separację bakterii z zawiesiny różnymi technikami znanymi specjalistom podanymi tutaj. Korzystnie hodowle L. intracellularis są zbierane przez wirowanie całej zawartości Iub części zawiesiny do postaci peletek komórek hodowlanych, ponowne zawieszane peletek i liza zakażonych komórek. Typowo przynajmniej część zawartości jest wirowana w około 3000 x g przez około 20 minut w celu uzyskania peletek komórek i bakterii. Peletki mogą być następnie zawieszane w, na przykład roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) i przepuszczane około cztery razy przez igłę kaliber 25 w celu lizy komórek. Następnie wymagane jest dalsze oczyszczanie, próbki mogą być wirowane w około 145 x g przez około 5 minut w celu usuwania jąder i resztek komórkowych. Supernatant może być następnie wirowany w około 3000 x g przez około 20 minut i uzyskane peletki ponownie zawieszane w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak SPG z płodową surowicą bydlęcą (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do zamrożenia lub zastosowania jako materiał zakażający) lub pożywka hodowlana (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do pasażowania na świeże komórki).
Jak to wcześniej wspomniano, skuteczny wzrost L. intracellularis w produkcji na wielką skalę jest zwiększany przez utrzymywanie komórek w stanie aktywnego wzrostu. W przypadku hodowli jednowarstwowych, gdy hodowle stają się zlewne stopień podziałów komórkowych znacznie maleje. Próby wzrostu L. intracellularis w jednowarstwowych hodowlach tkankowych są ograniczone i nie jest możliwe zwiększenie skali hodowli. Tak więc zastosowanie zawiesin hodowlanych znacznie ułatwia utrzymanie aktywnego wzrostu komórkowego i ułatwia ciągłe zwiększanie hodowli i jej skali. Stosując fermentator i między około 0-3% rozpuszczonego tlenu, jak to wyjaśniono powyżej, można wyhodować do IO8 bakterii/ml. Można również utrzymywać aktywny wzrost bakterii przez wiele miesięcy i można oczekiwać, że można utrzymywać je bez końca.
Przed niniejszym wynalazkiem uważano, że komórki muszą być przymocowane do powierzchni w celu zakażenia L. intracellularis. Zawiesina komórkowa według niniejszego wynalazku jest unikalna i przeciwstawia się tej teorii. Używając komórek McCoy'a i IEC-18, korzystne jest dodanie żelatyny, agarozy, kolagenu, akrylamidu lub krzemionkowych perełek, takich jak porowate nośniki Cultisphere-G wytwarzane przez HyClone Laboratories, Logan, UT razem z pożywką hodowlaną. Komórki Hep-2 i inne nie wymagają mikronośników do hodowli zgodnie ze sposobem według wynalazku. Zapewnia to szczególne korzyści i ekonomiczny sposób hodowli na wielką skalę.
W celach utrzymania hodowli z hodowlami komórkowymi Hep-2, usuwane jest i zamieniane świeżą pożywką korzystnie 25-50% hodowli w odstępach tygodniowych. W celu hodowli komórkowych z mikronośnikami i perełkami, korzystnie 25-50% hodowli jest usuwane i zamieniane świeżą pożywką 1 -2 razy w tygodniu. W hodowli na wielką skalę dodatkowe 25-50% pożywki, lub pożywki w mikronośnikami może być dodane do hodowli.
Zależnie od stopnia zakazenia komórek hodowlanych pasaż na świeże komórki następuje zwykle co dwa do pięciu tygodni. Zakładając, ze komórki hodowlane są zakażone przynajmniej w 70% w ciągu 2-3 tygodni, korzystnie pasaż następuje co 3-4 tygodnie.
Obecnie również dostarczono szczepionki i sposoby wytwarzania szczepionek przeciwko L. intracellularis. Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem, po utrzymywaniu komórek w zawiesinie przez długi czas (na przykład, 6-8 miesięcy), przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis jest zbierana i sprawdzana w kierunku potencjalnej atenuacji. Takiemu monitorowaniu korzystnie towarzyszy prowokacja zwierząt lub modeli zwierzęcych w celu wybrania szczepu atenuowanego. Takie szczepy atenuowane są wykorzystywane do wytwarzania szczepionek. Atenuowane szczepionki L. intracellularis wykazują skuteczność przeciwko zakażeniu L. intracellularis u różnych zwierząt i należy się spodziewać, ze będą również skuteczne u zwierząt.
189 287
Niniejszy wynalazek pozwala na szybki rozwój hodowli, zwiększenie wyników hodowli 100-1000-krotne i zmniejszenie kosztów. Jako wynik, obfitość dostarczonych bakterii L. intracellularis wyhodowanych zgodnie z przedstawionym sposobem hodowli podlega atenuacji w celu wytworzenia szczepionki.
Atenuacja jest trudna w hodowlach jednowarstwowych ze względu na niewielką ilość wyhodowanych bakterii przy stosowaniu konwencjonalnych technik hodowli jednowarstwowych. W przeciwieństwie, obecny sposób hodowli L. intracellularis znacznie ułatwia, przyspiesza i zwiększa liczbę bakterii wykorzystywanych w celach według wynalazku. Więcej komórek i więcej pojawiających się podziałów, większa liczba pojawiających się mutacji jest korzystne w wytwarzaniu szczepionki. Wzrost w zawiesinie według wynalazku zwiększa ekspresję ważnych immunogenów kontrolowanych przez geny regulowane przez środowisko i ich produkty ekspresji.
Powstałe szczepy atenuowane mogą być hodowane w tkankowych hodowlach jednowarstwowych jak opisano w poniższym przykładzie 1, lecz korzystnym jest hodowanie ich w hodowlach w zawiesinie zgodnie ze sposobem według wynalazku. Inne środki atenuujące mogą obejmować zastosowanie na przykład, N-metylonitrozoguanidyny, lub innych środków znanych w stanie techniki. Tak więc przez wielokrotne pasażowanie lub środkami chemicznymi wytwarzane są atenuowane L. intracellularis i wybierane do przygotowania szczepionki.
Zgodnie z wykonaniem szczepionki, hodowle antygenu są zbierane przez wirowanie lub mikrofiltrowanie jak to opisano poniżej. Antygen jest następnie standaryzowany do określonego poziomu opartego na optymalnej odpowiedzi immmunologicznej zwierząt-gospodarzy. określonego przez miareczkowanie dawki w próbkach zwierząt gospodarzy. Bakteria może być inaktywowana przez przedłużoną ekspozycję na otaczające środowisko tlenu, lub przez zastosowanie 0,3% formaliny lub innych czynników inaktywujących w celu przygotowania zabitej szczepionki. Antygen jest następnie włączany do odpowiedniego adiuwantu, takiego jak wodorotlenek glinu lub płynna parafina celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Antygen jest następnie stosowany do szczepienia gospodarza przez wstrzyknięcie domięśniowe lub podskórne, w przypadku świń w wieku około 3-4 tygodni, z dawką przypominającą jeśli jest wymagana.
Alternatywnie, zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem szczepionki wykorzystującym metody hodowli wcześniej opisane, bakterie są kilkakrotnie pasażowane w celu wywołania i wybrania atenuowanych, nie zjadliwych żywych hodowli. Hodowla bakteryjna jest testowana na zwierzętach-gospodarzach (po korzystnie 6-8 miesiącach lub więcej wzrostu w hodowlach w zawiesinach) w celu uzyskania objawu atenuacji. Hodowana kultura bakteryjna jest zbierana jak to opisano wcześniej i rozcieńczana. Świnie, na przykład, są szczepione doustnie bakteriami w ilości 1 x IO5 do 1 x IO6. Około 28 dnia po zaszczepieniu, świnie są zakażane organizmami w ilości około 1 x IO7 mniej pasazowanymi (około 30 do 45 dni) zjadliwymi kulturami L. intracellularis. Zakażone zwierzęta są zabijane i poddawane sekcji po 21 dniach od ekspozycji i w jelicie cienkim poszukuje się znacznych i mikroskopowych uszkodzeń. PCR i metody badawcze z przeciwciałem fluorescencyjnym powinny również być przeprowadzone. Około 80% zwierząt kontrolnych wykazuje znaczne i mikroskopowe uszkodzenia komórek śluzówki jelit przy zastosowaniu zarówno metod PCR jak i FA. Zaszczepione zwierzęta mają prawidłową powierzchnię błony śluzowej jak to będzie potwierdzone obserwacją histologiczną i ujemnym wynikiem reakcji PCR.
Ogólnie, atenuowane immunogenne szczepy L. intracellularis są wytwarzane po ciągłej trwającej 150 i 250 dni hodowli, w trakcie której hodowla jest pasazowana przynajmniej 7 do 12 razy. hme atenuowane hodowle mogą być \o^tt^w^ir^ane przez różne odmiany podanych tu sposobów monitorowania i wybierania.
Przygotowywanie szczepionki następnie obejmuje immunologicznie skuteczną ilość atenuowanych L. intracellularis w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Kombinacja immunogenu i nośnika może być w postaci roztworu wodnego, emulsji lub zawiesiny. Immunologicznie skuteczna ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez przeprowadzania niepotrzebnych doświadczeń, stosując wskazówki tu podane. Ogólnie, ilość immunogenu będzie się wahać między 50 a 500 mikrogramów, korzystnie między 1O7 a IO9 TCID50, gdy stosuje się oczyszczone bakterie.
189 287
Szczepionki są ogólnie podawane wrażliwym zwierzętom, korzystnie świniom, w jednej lub więcej dawkach. Żywa lub zabita szczepionka może być podawana 1 lub 2 razy w odstępach dwutygodniowych. Korzystne jest podawanie atenuowanej, żywej szczepionki w jednej dawce. Korzystną drogą podawania żywych atenuowanych szczepów jest droga doustna, donosowa, również można stosować podawanie domięśniowe i podskórne. Droga podania domięśniowa i podskórna jest najkorzystniejsza dla zabitej szczepionki.
Skuteczna diagnoza PPE jest również ograniczana przez czas potrzebny do hodowli bakterii wywołujących to schorzenie. Obecnie możliwy stał się rozwój sposobów diagnostycznych umożliwiających powstanie szybkich i skutecznych testów do badania obecności L. intraaellulαris w próbkach biologicznych pobieranych od świń i innych zwierząt wrażliwych.
Bakterie L. inttacellueatis wyhodowane zgodnie z przedstawionym sposobem, lub składniki tych bakterii mogą być zastosowane jako antygen w testach ELISA lub w innych testach immunologicznych, takich jak test immunologiczny z zastosowaniem przeciwciał znakowanych fluoresceiną („IFA”), w celu wykrycia przeciwciał przeciwko L. intracehularis w surowicy i innych płynach zwierząt podejrzanych o zakazenie tymi bakteriami. Obecnie korzystnym jest stosowanie testu immunologicznego IFA jak to opisano w przykładzie poniżej. Alternatywnie bakterie obecnie wyhodowane mogą być stosowane w analizie metodą Western błot.
Korzystny protokół testu ELISA zgodnie z wykonaniem według wynalazku obejmuje co następuje:
1. Dodanie 0,1 ml/studzienkę antygenu rozcieńczonego w buforze opłascccająaym. Inkubacja ptzec 18 godz. w 4°C.
2. Trzykrotne przemycie PBS.
3. Dodanie 0,25 ml buforu blokującego do każdej studzienki na płytce. Inkubowanie 1 do 2 godz. w 37°C.
4. Trzykrotne przemycie w buforze przemywającym.
5. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml do pierwszych stu dzienek płytki. Przeprowadzenie seryjnych roccieńczeń 1:2 ptzec całą płytkę. Inkubowanie przez 1 godz. w 37°C.
6. Przemycie 3-5-krotne w buforze przemywającym.
7. Rozcieńczenie koniugatu w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml na studzienkę płytki inkubowanie przez 1 godz. W 37°C.
8. Przemycie 3-5-krotne w buforze przemywającym.
9. Dodanie substratu.
12. Zmierzenie absotbancji światła spektrofotometrem.
13. Studzienki, do których nie dodano antygenu zastosowano jako kontrolę.
14. Dodatnia i ujemna kontrola surowicy świńskiej powinna być również zastosowana w każdym teście.
Korzystny protokół analizy metodą Western błot:
1. Przeprowadzenie antygenu na 12% SDS-PAGE i przeniesienie na błonę nitrocelulozową.
2. Umieszczenie błony w buforze blokującym na 2 godz.
3. Usunięcie buforu blokującego i przemycie PBS w ciągu 1 min.
4. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie na błonę. Inkubacja przez godz. w temp. pokojowej.
5. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym (5 min każde przemycie).
6. Rozcieńczenie koniugatu w buforze blokującym i dodanie do błony. Inkubacja przez 1 godz. w te-trw. pokoj pweó·
7. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym.
8. Dodanie substratu na 10 min. lub do ukazania się silnego wiązania.
9. Spłukanie PBS.
10. Wysuszenie powietrzem i przechowywanie w ciemności.
Niniejszy wynalazek jest dalej opisany w następujących przykładach, które podano jedynie w celu zilustrowania, a nie ograniczenia.
Przykład 1. Izolacja L. intraaellulαris z jelit świń amerykańskich chorujących na enteropatię proliferacyjną świń.
189 287
Materiały i metody:
Selekcja próbek zakażających.
Próbkę N24912 uzyskano ze stada z farmy z Iowa, w której 15 z 300 świń, które ukończyły 5 miesięcy cierpiało na uporczywe krwiste stolce mimo leczenia penicyliną. Podczas sekcji świń obserwowano scieńczenie śluzówki jelita (cienkiego).
Badania histopatologiczne z użyciem barwienia srebrem wykazało obecność zakrzywionych, wewnątrzkomórkowych bakterii i hiperplazję enterocytów krypt potwierdzające rozpoznanie PPE. Próbkę N72994 uzyskano z drugiego 1,5 rocznego miotu loch SPF hodowanego na farmie w Minnesocie. Wielkość stada wynosiła około 70-80 loch, nieznane było leczenie antybiotykami. Podczas sekcji śluzówka jelit była scieńczała z wybroczynami. Barwienie Giminez'a błony śluzowej wykazało wiele zakrzywionych bakterii. Próbkę N101494 uzyskano od 12-to tygodniowych świń z farmy w Indiana, przeznaczonej dla 600 loch. Świnie były leczone dożylnym Tylan'em od początku wystąpienia krwawej biegunki, lecz wszystkie zwierzęta zdechły wkrótce po leczeniu.
Przygotowanie bakteryjnego materiału zakażającego pochodzącego ze świń.
Próbki jelitowe utrzymywano w temp. -70°C. Jelita przecięto i przemyto solą fizjologiczną buforowana fosoforanem (PBS). Jeden gram próbki błony śluzowej zeskrobano i umieszczono w glutaminianie sodowo-potasowym (SPG) i homogenizowano przez 30 sekund z 4,0 ml trypsyny (JRH Biosciences, Lenexa, KS) w SPG. Zawiesiny inkubowano przez 35 min w 37°C. Dziesięć ml SPG/10% bydlęcą surowicę płodową (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) dodano do próbek i próbki umieszczono w homogenizatorze tkankowym na 1 min. Dziesięć ml SPG/10% (FCS) dodano i filtrowano jednokrotnie przez filtr papierowy (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR), a następnie przez 5,0-, 1,0- i 0,65-mikronowe błony filtrujące. Filtraty rozdzielano do 1,0 ml probówek i zamrażano w -70°C. Błonę śluzową roztarto na szkiełku w celu przeprowadzenia barwienia metoda Gimineza. Oddzielne rozmazy filtratów znakowano metodą IFA stosując swoiste przeciwciała monoklonalne przeciwko L. intracellularis S. McOrist i in., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (włączone w całości przez referencje).
Hodowla komórkowa:
Komórki IEC-18 (szczurze komórki nabłonka jelitowego, ATCC CRL 1589) hodowano w DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) z L-glutaminianem i 10% FCS i normalnie pasażowano przez tydzień trypsyną. Jednowarstwowe hodowle komórkowe hodowano w 37°C w powietrzu z 5% CO 2.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Komórki IEC-18 posiewano w ilości 1,25 x IO5 komórek w 25 cm2 butelki hodowlane w porównywalnym stosunku w szkiełka histologiczne (Nunc, Inc., naperville, IL), inkubowane przez 24 godz., a następnie usunięto pożywkę. Zamrożone bakteryjne izolaty pochodzące od świń szybko rozmrażano i rozcieńczano w DMEM/7% FCS z wankomycyną (100 (fig/ml) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml) w stosunku 1,0 ml homogenatu do 15 ml pożywki i dodano do hodowli jednowarstwowej. Hodowle jednowarstwowe i zawiesiny bakteryjne wirowano przez 30 min w 2000g i przenoszono do pojemników beztlenowych. Pojemniki następnie przenoszono i gaz był zastępowany mieszaniną wodoru i dwutlenku węgla, w celu otrzymania mieszaniny 8,0% O2, 10% CO2 i 82% H2. Hodowle komórkowe inkubowano przez 3 godz. w 31°C, a następnie odżywiane DMEM/7% FCS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/ml i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Hodowle przenoszono do pojemników beztlenowych i inkubowano przez 6 dni, wymieniając pożywkę co 2 dni.
Pasażowanie L. intracellularis'
Bakterie L. intracellularis pasazowano przez lizę komórek stosując chlorek potasu tak jak to opisano poprzednio G. Lawson i in., J. Clin. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (włączono tutaj w całości przez referencje), a następnie dodano do świeżych hodowli jednowarstwowych IEC-18. Pożywkę wymywano z hodowli jednowarstwowych i dodawano 0,1% KCl i inkubowano przez 10 min w 37°C. Usuwano KCl i dodawano SPG/10% i hodowle jednowarstwowe rozdzielano mechaniczne skrobakiem komórkowym. Komórki poddawano lizie przez
189 287 trzykrotne przepuszczenie przez strzykawkę z igła kaliber 25. Jądra komórkowe usuwano przez wirowanie w 100 x g przez 5 min i zawiesinę bakteryjną w płynnym supematancie dodano do świeżej hodowli jednowarstwowej 1 d komórek IEC-18.
Monitorowanie zakażenia hodowli komórkowych:
Zakażenie monitorowano przez utrwalenie komórek na szkiełkach laboratoryjnych zimnym acetonem/etanolem przez 5 min. Znakowanie przeprowadzono metodami immunofluorescencji i immunoperoksydazy. Obie metody stosują mysie przeciwciało monoklonalne (jak opisano przez S. McOrist i in., Vet. Rec. 121:421-422 (1987)) jako przeciwciało pierwszorzędowe i zarówno koniugaty przeciwko mysiej immunoglobulinie G-flourochrom (izotiocjanian fluoresceiny; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) jak i koniugat peroksydazy (kozia anty-mysia immunoglobulina G; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg. MD). Liczeniu bakterii towarzyszy liczenie swoiście barwionych bakterii wewnątrz komórek na każdym szkiełku.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażona próbka i bakterie poddane pasażowi zostały włączone jako DNA matrycowy do PCR stosując sposoby przygotowania próbki, startery i parametry cyklu jak opisano to przez Jones'a i in., J. Clin. Microbiol., 31:2611-2615 (1993) i McOrist i in., Vet. Microbiol. 1-8 (1994) (każde z nich włączone tu w całości przez referencje). Parametrami cyklu były 93°C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45 s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej wymienionych przez 45 s dla danej temperatury, jak również 93 C przez 45 s, 55°C przez 45 s i 72 °C przez 2 min. Jedynie dodatni materiał zakażający użyto do zakazenia komórek IEC-18. PCR przeprowadzono również do monitorowania pasazowanego materiału w celu potwierdzenia zakazenia. DNA wytworzone w technice PCR poddano sekwencjonowaniu w Iowa State University Nucleic Acid Facility. Wyniki sekwencjonowania porównywano z sekwencjami wytworzonymi przez Gary'ego F. Jones'a i podanymi w tezach doktorskich, University of Minnesota, Minneapolis, MN (czerwiec, 1993).
Wyniki:
Wybór próbek zakażających:
Świnie o numerze N24912 i N72994 chorowały na ciężkie PPE z krwistą zawartością jelitową i scieńczeniem błony śluzowej . NI01494 chorowała na ciężką PPE i miała ciężkie krwawienie jelitowe, które spowodowało powstanie wielkiej skrzepliny w świetle jelit. Barwienie metodą Giemza rozmazów jelitowych wykazało znaczną liczbę bakterii zakrzywionych lub w kształcie litery S. Znakowanie IFA wykazało w pochodzącym od świń materiale zakażającym znaczną liczbę jasno, fluorescencyjnych bakterii.
Monitorowanie zakazenia w hodowlach komórkowych:
Zakażone hodowle jednowarstwowe monitorowano w mikroskopie świetlnym w trakcie wzrostu i obserwowano niewielkie zmiany morfologiczne komórek. Niezakażone hodowle jednowarstwowe hodowano w warunkach zmniejszonego ciśnienia tlenu (8% O2) wykazywały podobną morfologię.
Znakowanie immunofluorescencyjne i metodą immunoperoksydazy zakażonych hodowli wykazało wewnątrz komórek znaczną liczbę zakrzywionych i w kształcie litery S specyficznie wybarwionych bakterii. Hodowle jednowarstwowe nie wykazywały zlewnego zakażenia. Zakażone komórki były często powiązane z zakażonymi ogniskami 1-10 komórek. Poważnie zakażone komórki (tj. komórki z 30 Iub więcej bakteriami) były również widoczne z komórkami z mniej niż 30 bakteriami. Szczyt liczby bakterii występował około Iub 6 dnia. Zakażenie było zależne od swoistych warunków hodowli. Bakterie skutecznie pasażowano stosując tu opisane sposoby lizy komórkowej. Wirowanie świeżo zakażonych komórek nie było konieczne lecz znacznie zwiększało liczbę zakażonych komórek. Wirowanie również zmniejszało zanieczyszczenie przez dopuszczenie komórek eksponowanych na zakażenie w pozbawionej antybiotyku pożywce na odżywienie po 3 godz. pożywką zawierającą antybiotyk. Zmniejszenie FCS z 10%o do 7% w pożywce było konieczne do spowolnienia wzrostu komórek IEC-18 co pozwoliło na zwiększenie proliferacji bakterii przez wystąpieniem zlewności hodowli komórkowej.
189 287
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
PCR chromosomalnego DNA pozwoliło na wytworzenie fragmentu 319 bp (włączając startery) z wszystkich izolatów. Fragment o odpowiedniej wielkości był wizualnie porównywany ze znanymi dodatnimi próbkami wytworzonymi przez McOrista i in., (1994) przy użyciu techniki PCR. Analiza sekwencji produktów PCR próbek N24912, N72994 i N101494 potwierdziła bliską homologię (97-99%) do sekwencji p78 określonej przez Jones'a (1993) .
Przykład 2. Wzrost L. intracellularis w hodowlach w zawiesinie komórek Hep-2 Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych:
Homogenaty jelitowe przygotowano przez zdrapywanie błony śluzowej z 6 do 8 cm odcinków jelita cienkiego z próbek jelitowych opisanych w przykładzie 1. Dodano trypsynę (1%) do zdrapanej błony śluzowej i próbki dokładnie homogenizowano, a następnie inkubowano przez 35 min w 37°C. 10 ml SPG/10% FBS dodano do próbki i umieszczono w homogenizatorze tkankowym. Kolejne 10 ml SPG/10% FBS dodano. Homogenizaty przepuszczono przez filtr Whatman V113, a kolejno przez filtry 5,0, 1,0 i 0,65 pm. Próbki następnie rozdzielono do 1 ml probówek i zamrożono w -70°C.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Sposób A
Komórki pochodzące z tkanek posiano na 1 x 107 komórek w 50 ml DMEM/10% FBS w 100 ml butelki typu spinner. Hodowle inkubowano 24 godz., a następnie dodano vankomycynę i fungizon. Jedna probówka zamrożonego homogenatu jelitowego została szybko rozmrożona i rozpuszczona w 3 ml DMEM/5% FBS z waknomycyną (100 pg/ml) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Próbka została przepuszczona przez filtr 0,65 pm i dodana do butelki. Hodowlę umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml, neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml).
Sposób B:
W dwie zwykłe 25 cm2 butelki posiano 1,25 x 105 komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Antybiotyki nie były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS.
Hodowle rozcieńczano 1:2 w odstępach tygodniowych przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki lub przez pasażowanie do większych butelek typu spinner i dalsze dodawanie pożywki.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki Hep-2 przez wysiewanie nowych komórek Hep-2 w ilości 1 x 107 na DMEM/5%FBS. Nowe hodowle inkubowano przez noc w 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano zakażonymi hodowlami i inkubowano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono. Ilość materiału zakażającego zależy od stopnia zakażenia hodowli oryginalnej.
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze Sacharozy-FosforanuGlutaminianu (SPG) i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g
189 287 przez 5 min w celu usunięcia jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku.
Określenie żywotności L. intracellularis w hodowlach tkankowych·.
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być badaniu i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 25. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 1250 komórek/studzienkę i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano rozcieńczenie między 3 a 6 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/studzienkę przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1994) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/studzienkę i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml.
Wyniki:
Wyniki TICD50 wskazują, że hodowle zawierają więcej niż 1 χ 106 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się w 45 dniu. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
Przykład 3. Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych'
Homogenaty jelitowe przygotowano jak to opisano w przykładzie 2. Próbka L. intracellularis hodowana zgodnie ze sposobem według poniższego przykładu była zdeponowana zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim 19 maja 1995 r. w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852 i oznaczona numerem dostępu 55672.
Zakażenie hodowli komórkowych:
W dwie zwykłe 25 cm2 butelki posiano 1,25 χ 105 komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 (pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8,0% O2, 10% CO2 i 82% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°Ć, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Antybiotyki nie były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS i 0,05 g Cultisphere-G Microcarriers. Zawartość butelek mieszano przy 40-50 rpm.
Hodowle rozcieńczano 1:2 co 2-3 dni przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki z perełkami Culti-sphere-G lub przez pasażowanie do większych butelek typu spinner i dalsze dodawanie pożywki i perełek Cultisphere-G. Ostateczne stężenie koralików w hodowli wynosiło około 0,001 g perełek/ml.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki McCoy'a przez wysiewanie nowych komórek McCoy'a w ilości 1 χ 107 na DMEM/2%FBS i 0,05 g koralików Cultisphere-G. Nowe hodowle inkubowano przez noc w 8,0% O2, 8,8 % CO2 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano 25 ml zakażonych hodowli i inkubowano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono.
189 287
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze SPG i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 22. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g przez 5 min w celu usunięcia perełek, jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku.
Określenie żywotności L intracellularis w hodowlach tkankowych:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis określano jak opisano w przykładzie 2 stosując igłę kaliber 22 do lizy komórek i siejąc na płytki do miareczkowania komórki Mc-Coy'a 1250 komórek/wgłębienie.
Wyniki:
Wyniki TICD 50 wskazują, że hodowle zawierają więcej niż 1 x IO6 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się krócej niż w ciągu miesiąca. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
Przykład 4. Określenie dawki zakażającej czystej hodowli L. intracellularis: Podsumowanie·
Badano 31 świnie zakażone, w 6 tygodniu życia czystymi hodowlami L. intracellularis pochodzącymi z próbki N72994. Świnie rozdzielano w sposób przypadkowy na 4 grup, które trzymano w osobnych zagrodach. Grupa 1 składała się z 7 świń stanowiących kontrolę ujemną, której podawano nie zakażone hodowle lub nie podawano nic. Grupa 2 składała się z 8 świń, które otrzymały IO7 bakterii/świnię. Grupa 3 składała się z 8 świń, które otrzymały IO6 bakterii/świnię. Grupa 4 składała się z 8 świń, które otrzymały IO5 bakterii/świnię.
Wymazy kału pobierano 0, 7, 14,21 i 24 dnia do badania metodą PCR. 24 dnia świnie zabijano i jelito kręte, czcze i grube pobierano do badania PCR, histopatologicznego i znakowania FA, tak jak opisano powyżej.
Badanie PCR błony śluzowej jelita krętego wykazało obecność L. intracellularis w 100% przy wysokiej dawce, w 75% przy średniej dawce i w 50% przy niskiej dawce. Wyniki histopatologiczne wskazywały na zwiększoną ilość komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej i podśluzowej w 88 % przypadków przy wysokiej dawce, 75% przy średniej dawce i 88 % przy niskiej dawce. Przerost krypt obserwowano w 50% przypadków przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 50% przy dawce niskiej. Znakowanie FA wykazało obecność L. intracellularis w preparatach tkankowych jelita krętego, czczego i grubego w 88 % przypadkach przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 63% przy dawce niskiej. Zwierzęta kontrolne nie wykazywały obecności L. intracellularis ani w metodzie PCR, ani FA, ani w barwieniu srebrem.
Czystą hodowlą można skutecznie zakazić i spowodować uszkodzenie typowe dla PPE. Postulaty Kocha są spełnione dla identyfikacji i izolacji L. intracellularis z zakazonych zwierząt.
Wśród zwierząt poddanych prowokacji dla 100% zwierząt uzyskano wyzdrowienie przy wysokiej dawce bakterii i identyfikację stosując barwienie srebrem, znakowanie FA i metodę PCR. Materiały i metody:
Hodowla materiału zakażającego:
Do jednej zwykłej butelki hodowlanej posiano 3,75 x A komórek Hep-2 do DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godziny w 37°C i 5% stężeniu CO2. (Komórki wykazywały 30% zlewność w trakcie zakażania). Jedną probówkę N72994 rozcieńczono w 15 ml DMEM/5% FBS. Hodowlę przeniesiono do komory gazowej, usunięto i wymieniono gaz na wodór i dwutlenek węgla, w celu uzyskania mieszaniny 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowla została odżywiona w 24 godz. DMEM/5% PBS.
Hodowle inkubowano przez 6 dni, następnie komórki oddzielano i dodano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS. Objętość zawartości butelek została zwiększona przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle utrzymywano przez 3 tygodnie w butelkach typu spinner.
Zbieranie hodowli komórkowych:
Hodowle zbierano przez wirowanie w około 3000 x g przez około 20 minut. Peletki następnie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i prze189 287 puszczano cztery razy przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/l0% FBS i uzyskano rozcieńczenie 1:10.
Materiał zakażający dla zwierząt kontrolnych składał się z nie zakażonych komórek Hep-2 rozcieńczonych w tym samym stężeniu żywych komórek co zakażone hodowle. Hodowle komórkowe zbierano tak samo jak zakażone hodowle. Świnie kontrolne otrzymywały taką samą dawkę komórek, co grupa otrzymująca wysoką dawkę.
Ilościowe określenie L intracellularis
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być poddane badaniu i lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 (pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczone dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 2500 komórek/wgłębienie i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O 2, 8,8% CO 2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty·'. Do wgłębień dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonąlnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1987) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCID50/ml. Zwierzęta · świń, obu płci w wieku 6 tygodni pochodzących z loch PIC x Lieske i knurów rasy large white dostarczone przez dr Kent Schwartz. Świnie rozdzielono w sposób przypadkowy i umieszczano w 4 zagrodach w zależności od wagi w dniu 0.
Pomieszczenia:
Cztery zagrody w małym pomieszczeniu dla młodych świń, każde oddzielone odległością przynajmniej 1 metra. Zagrody posiadały drucianą podłogę i trwałe ściany zagród. Ciepło dostarczano centralnym ogrzewaniem, ze strefowym rozprowadzeniem ciepła przez lampy grzewcze. Temperaturę utrzymywano między 78 a 85°F przez czas badania.
Pokarm i woda:
Dietę opartą o białko sojowe o zawartości 19% białka, bez antybiotyków dostarczano ad libitum stalowymi karmnikami. Wodę dostarczano ad libitum poidełkami.
Zakażenie świń:
Dnia 0, świnie ważono, pobierano próbki krwi rurkami włosowatymi z zatok zaoczodołowych. Surowicę zbierano i przechowywano w -20°C. Wymazy kału pobierano w celu przeprowadzenia badania PCR. Świniom podawano dawki 10 ml materiału zakażającego dozołądkowo sondą żołądkową.
Leczenie Liczba świń kontrola-komórki niezakażone 5 kontrola-bez leczenia 2 wysoka dawka 8 średnia dawka 8 niska dawka 8
Świnie ważono i pobierano krew w dniu 0, 10, 17 i 24.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażenie świń monitorowano metodą PCR stosując startery i parametry cyklu jak opisał Jones (1993). Próbki kału zbierano w dniu 0, 7, 14, 21 i 24 i tak samo jak błonę śluzową jelit badano metodą PCR.
HistopatologiaSkrawki jelita krętego, czczego i grubego utrwalano w formalinie, poddano zwykłym procedurom, zabarwiono hematoksyliną i eozyną, jak również impregnowano srebrem i oceniano. Skrawki również znakowano stosując przeciwciała monoklonalne przeciwko L. intracellularis.
189 287
Objawy kliniczne:
Objawy kliniczne - luźne stolce po raz pierwszy obserwowano w grupie wysokiej dawki w trzecim dniu. Objawy miały nasilenie 14 dnia i zaczynały się zmniejszać.
Zwiększenie wagi zwierząt:
Średnie dzienne zwiększenie wagi wykazało, że w grupie wysokiej i średniej dawki nastąpiło zmniejszenie wagi w porównaniu z grupą kontrolną. Wykazano efekt zależny od dawki w stosunku do zwiększenia wagi, porównując grupy.
PGR·
Wydalanie bakterii w kale nie obserwowano aż do 14 dnia. W 21 dniu, 37,5% świń z grupy wysokiej dawki wykazywało pozytywny wynik PCR z próbek kału. Po sekcji, wynik badania PCR błony śluzowej jelit był dodatni w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 50% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Wielkość ubytków:
Znaczne ubytki znaleziono u 2 świń z grupy wysokiej dawki (#50 i #202). Świnie wykazywały około 1 m scieńczenia jelita krętego z martwicą w #202.
Histopatologia:
FA:
Znakowanie FA skrawków jelita krętego, czczego i grubego wykazało obecność L. inttαaρllularis w 81,5% w grupie wysokiej dawki, 62,5% w obu zarówno w grupie średniej jak i niskiej dawki i 0 % w grupie kontrolnej.
Ubytki mikroskopowe:
Ubytki obserwowano w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 14% w grupie kontrolnej. Było to ocenione przez obserwację zwiększenia ilości komórek jρdnsjądtzastyah w błonie podstawnej i podśluzowej, często związane z przerostem kępek Peyeria. Obserwowano również przerost krypt.
Barwienie srebrem:
Przeprowadzono również barwienie srebrem w kierunku obecności wewnątrzkomórkowych, zakrzywionych bakterii. Wykazało ono obecność bakterii w 87,5% w grupie wysokiej dawki, w 62,5% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Dyskusja:
Świnie skutecznie zakażono czystymi hodowlami L. intraaeelularis. Przy dawce IO7 bakterii 100% świń wykazywało zakażenie zarówno metodą PCR jak i przez mikroskopowe ubytki. Nasilenie uszkodzeń i liczba bakterii w skrawkach tkankowych było relatywnie niskie. Badanie to jest satysfakcjonującym modelem prowokacji L. intracellularis wskutek obecności L. intraapllulatis i mikrousckodzeń u świń. Uszkodzenia mogą być zwiększone przez podanie drugiej dawki 7 dni po pierwszej dawce.
Przykład 5. Doświadczenie nad skutecznością szczepionki u chomików:
Cel·
Badanie modelu laboratoryjnego w celu określenia bezpieczeństwa i skuteczności niezjadliwej-żywej szczepionki przeciwko L. intraaellulatis u chomików.
Podsumowanie.
Przeprowadzono badanie 40 chomików. Zaszczepiono trzytygodniowe chomiki czystymi hodowlami, intensywnie pasazowanych szczepów L. intrαaeelularis i poddano prowokacji 22 dnia po szczepieniu czystymi hodowlami mało pasażowanych, zjadliwych szczepów. Chomiki podzielono na trzy grupy. Grupa A została cassazppiona jedną dawką L. intracellularis szczepu N72994 w dniu 0. Grupa B została zaplanowana jako grupa kontrolna i nie została saszasppisna hodowlą. Obie grupy poddane zostały prowokacji dwiema dawkami czystej hodowli szczepu L. intracenularis N343 w dniu 22 i 25 po caszacepipniu. Grupa C była prowokowana szczepem NI01494, by porównać wirulencję ze szczepem N343. Grupy A i B liczyły po 15 chomików w każdej grupie, grupa C liczyła 10 chomików. Wyniki dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50) wskazują, że chomiki szczepiono IO5 TCIDis/dawkę.
189 287
Prowokacja N343 wynosiła IO5' TCIDso/dawkę. Dawka prowokacyjna dla grupy C wynosiła IO2’75 TCID5o/dawkę. Rozmazy kału pobierano w dniu 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 w celu przeprowadzenia badania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W 21 dniu 5 zwierząt z grupy A i B poddawano sekcji i przeprowadzano badanie PCR błony śluzowej, jak również znakowanie FA i barwienie hematoksyliną i eozyną i barwienie srebrem skrawków jelita krętego w celu oceny utrzymywania się kolonizacji bakterii w zaszczepionych chomikach. Pozostałe zwierzęta poddawano sekcji 21 dnia po prowokacji i poddawano podobnym badaniom.
Wyniki PCR wskazywały na obecność L. intracellularis w śluzówce jelitowej 100% chomików grupy A w 21 dniu po zaszczepieniu. Wyniki wszystkich chomików grupy B były ujemne w 21 dni po zaszczepieniu. 21 dnia po prowokacji materiałem zakazającym wyniki PCR 50% chomików były dodatnie w grupie A, a 100% było dodatnich w grupie B. Badanie histopatologiczne skrawków wykazało łagodne do średnich uszkodzeń u 50% zwierząt w grupie A i łagodne uszkodzenia u 50% w grupie B w 21 dniu po prowokacji. Żadne zwierzę nie wykazywało uszkodzeń w 21 dniu po zaszczepieniu. W grupie C zwierzęta nie wykazywały uszkodzenia w 21 dniu po prowokacji. Znakowanie FA i barwienie srebrem nie wykazywało obecności L. intracellularis w żadnym ze skrawków.
We wnioskach, 50% zmniejszenie zakażenia obserwowano u chomików szczepionych intensywnie pasażowanymi szczepami L. intracellularis jak wykazano to badaniem PCR. Jelita były skolonizowane niewielką ilością organizmów wewnątrzkomórkowych co wykazano brakiem obserwowanych organizmów w skrawkach znakowanych FA i barwionych srebrem. Chomiki w grupie C nie wykazywały zakażenia w trakcie badania, najprawdopodobniej wskutek małej dawki bakterii.
Materiały i sposoby/.
Opis chomików.
Wykorzystano 40 trzytygodniowych samic chomików z Harlan Sprague Dawley .
Wzrost materiału zakażającego:
Hodowla szczepionki:
Wykorzystano rosnącą przez 29 hodowlę L. intracellularis w komórkach Hep-2. Hodowla wzrastała w takich samych warunkach jak to opisano o hodowlach skrawków do prowokacji za wyjątkiem tego, że hodowle pasażowano na nowe komórki Hep-2 co 2-3 tygodnie.
Hodowle do prowokacji:
W jedną zwykłą 75 cm2 butelki do hodowli tkankowej posiano 3,75 x A komórek McCoy'a do zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagle'a (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. w 37°C z 5% CO 2. Usunięto pożywkę z komórek i do butelek dodano jedną probówkę N343 MSC X rozcieńczoną w 14 ml DMEM/5% FBS. Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8% O2, 8,8% CO 2 i 83,2% H 2. Hodowle rosły przez 6 dni. Komórki oddzielano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 90 ml DMEM/2% FBS i 0,01 g perełek Cultisphere-G Hodowle rosły w stężeniu gazu opisanym powyżej. Objętość w butelkach zwiększano przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle rosły w butelkach typu spinner do osiągnięcia ostatecznej objętości 250 ml.
Szczep N 101494 hodowano według tych samych zasad co szczep N343.
Zbieranie hodowli'.
Hodowla szczepionki.
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakazający rozcieńczano do ostatecznej objętości (15 ml) w SPG/10% FBS.
Hodowle materiału do prowokacje
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakazający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/10% FBS.
(20 ml dla szczepu N343 i 10 ml dla szczepu N101494).
189 287
Dawkowanie chomikom.
W dniu 0 chomiki z grupy A szczepiono doustnie 1 ml przygotowanej szczepionki. Prowokacja · dni po szczepieniu, 10 chomików w grupie A i 10 chomików w grupie B poddano doustnej prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N343. Grupa C była poddana prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N 101494.
Określenie ilościowe IS L intracellularis ·
Ilościowe określenie żywotności IS L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCIDo). Przeprowadzone to było przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być badaniu i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotne przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/wgłębienie, do których wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 komórek/studzienkę i inkubowano przez 18-24 godz. przy 37°C w 5% CO2 przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0 % O2, 8,8 % CO2 i 83,2% H2. 6 dnia komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml.
Zakażenie chomików monitorowano stosując metodę PCR stosując startery i parametry cyklu jak to opisał Gary Jones. Próbki kału pobierano w 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 dniu po zaszczepieniu. Po zakończeniu badania błonę śluzową jelit chomików badano również stosując technikę PCR.
Histopatologia.
Skrawki jelita krętego i grubego utrwalano w formalinie, poddawano rutynowemu postępowaniu, barwiono hematoksyliną i eozyną, impregnowano srebrem i oceniano. Skrawki znaczono również przeciwciałem monoklonalnym swoistym dla L. intracellularis .
Średni dzienny przyrost wagi
Chomiki ważono 21, 28, 35 i 42 dnia po zaszczepieniu w celu określenia średniego przyrostu wagi.
Wyniki' patrz tablica poniżej.
TCID5P
Wyniki TCID 50 wskazują, ze grupa szczepiona (grupa A) otrzymała 10 ’ TCID 50/-chomika. Chomiki w grupie A i B poddawano prowokacji szczepem N343 i otrzymały 105’5 TCIDsochomika. Chomiki grupy C poddawano prowokacji szczepem N101494 otrzymały 102’75 TCID 50/chomika.
PGRWyniki testu PCR wskazują obecność L. intracellularis u 100% szczepionych chomików, które zabito i poddano sekcji w 21 dni po zaszczepieniu. Badanie 43 dni po zaszczepieniu wykazało, że 100% chomików kontrolnych i 50% zaszczepionych chomików było zakażonych L. intracellularis. Wynik żadnego z królików poddanych prowokacji szczepem N101494 nie był dodatni. Wydalania bakterii w kale nie stwierdzono w trakcie badania u żadnego chomika.
Histopatologia ·
Barwienie HE nie wykazało histologicznych uszkodzeń u wszystkich chomików zabitych i poddanych sekcji 21 dnia po zaszczepieniu. W skrawkach pobranych 43 dnia po zaszczepieniu 50% zwierząt w grupie zaszczepionej wykazywało łagodne do ciężkiego limfocytarnego zapalenia jelit i 50% zwierząt grupy kontrolnej wykazywało łagodne limfocytarne zapalenie jelit. Nie było widocznych uszkodzeń w grupie poddanej prowokacji szczepem N101494.
189 287
Znakowanie FA nie wykazało L. intracellularis u żadnego z chomików w 43 po zaszczepieniu.
Dyskusja
Obserwowano 50% zmniejszenie zakażenia u chomików zaszczepionych intensywnie pasażowanym szczepem L. intracellularis jak to wykazano w badaniu PCR.
Kał Kał Kał Kał Kał Kał Kał śluzówka śluzówka
ID PCR DO PCR d PCR d14 PCR d21 PCR d29 PCR d36 PCR d43 PCR Day 21 PCR Day 43 Ubytki mikroskopowe
barwienie HE sre- brem FA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 U 12 13
A-I - - - - NA + łagodne zapalenie jelit - -
A-2 - - - - - - - NA - - - -
A-3 - - - - - - - NA + łagodne zapalenie jelit - -
A-4 - - - - - - - NA - - - -
A-5 - - - - - - - NA + - - -
A-6 - - - - - - - NA - - - -
A-7 - - - - - - - NA + ciężkie zapalenie jelit - -
A-8 - - - - - - - NA + umiar- kowane zapalenie jelit - -
A-9 - - - - - - - NA - - - -
A-10 - - - - - - - NA - łagodne zapalenie jelit - -
A-11 - - - - NA NA NA + NA - - -
A-12 - - - - NA NA NA + NA - - -
A-13 - - - - NA NA NA + NA - - -
A-14 - - - - NA NA NA + NA - - -
A-15 - - - - NA NA NA + NA - - -
B-1 - - - - - - - NA + minimalne zapalenie jelit - -
B-2 NA + minimalne zapalenie jelit
B-3 - - - - - - - NA + - - -
B-4 NA + minimalne zapalenie jelit
B-5 NA + Minimalne zapalenie jelit
189 287
c.d. tabeli
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
B-6 - NA + Minimalne zapalenie jelit
B-7 - - - - - - - NA + - - -
B-8 - - - - - - - NA + - - -
B-9 - - - - - - - NA + - - -
B-10 - - - - - - - NA + - - -
B-ll - - - - NA NA NA - NA - - -
B-12 - - - - NA NA NA - NA - - -
B-13 - - - - NA NA NA - NA - - -
B-14 - - - - NA NA NA - NA - - -
B-15 - - - - NA NA NA - NA - - -
C-l - - - - - - - NA - - - -
C-2 - - - - - - - NA - - - -
C-3 - - - - - - - NA - - - -
C-4 - - - - - - - NA - - - -
C-5 - - - - - - - NA - - - -
C-6 - - - - - - - NA - - - -
C-7 - - - - - - - NA - - - -
C-8 - - - - - - - NA - - - -
C-9 - - - - - - - NA - - - -
C-10 - - - - - - - NA - - - -
Pr z y k ł a d 6. Doświadczenie nad skutecznością szczepionki dla świń Cel.
Przedmiotem tego doświadczenia jest ocena bezpieczeństwa, utrzymującej się kolonizacji i skuteczności niezjadliwych, żywych izolatów i zabitych izolatów L. intracellularis u 2-3-tygodniowych świń. Badanie na zwierzętach przeprowadzono na trzytygodniowych świniach zaszczepionych, a następnie poddanych ekspozycji na zjadliwy szczep M343 L. intracellularis i porównanie zabezpieczenia pomiędzy szczepionkami.
Sposoby:
grudnig ld95 ogólna gó św iń, w wieku trzech tygohni gadup iono w H&K Fanns. Zostały przewiezione do Yeterinary Resources, Inc., pomieszczenia badawcze mieściły się niedaleko Cambridge, Iowa, gdzie je znakowano celem identyfikacji poszczególnych świń. Świnie sprowadzono do ich pomieszczeń na dwa dni przed rozpoczęciem badania, by mogły się zaaklimatyzować do pomieszczeń i karmiono je karmą pozbawioną antybiotyków w trakcie trwania badania.
grudnia wszast^ śwmi e kwaeonk, poboano krew celew uzyskania próbęk surowicy, przeprowadzono ocenę Pliurczną i pobrano rozmazy kału. Następnie świnie randomizowaua do grup po 5 i umieszczano w wannach. 20 świń umieszozoua w oddzielnym pomieszczeniu i były zaplanowane jako grupy kontrolne i ściśle kontrolne. 15 świń amieseczoua w drugim pamrgszczguia i były poddawane szczepieniu szczepionką Isi-1, w trzecim pomieszczeniu 10 świń otrzymywało Isi-2.
Żywe szczepionki przygotowano w NOBL Laboratories Rgseerch and Dgvglopmeut i oznaczono numerem doświadczalnym Isi-1. Isi-1 (szczep N343) izolowano ze świń i hodowano w sposób ciągły przez 29 tygodni. Szczepionkę hodowano na komórkach McCoy'a
189 287 w butelkach typu spinner i w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu aż do zauważenia zakażenia około 100% komórek. Próbka intensywnie pasażowanego szczepu N343 wykorzystanego w wytworzeniu ISi-1 pasażowano dodatkowo przez 11 tygodni („N343NP40wk”) i zdeponowano zgodnie z warunkami Porozumienia Budapeszteńskiego 22 maja 1996 w ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville. Maryland, USA 200852 i oznaczono numerem dostępu 55783. Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 min. Peletki zostały ponownie zawieszone w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) w 10% FBS i pasażowano 4 razy przez igłę kaliber 25. Lizaty wirowano przy 500 x g przez 5 min w celu oddzielenia reszt komórkowych i koralików mikronośnika. Supernatant zachowano i przechowywano w -70°C w lodzie przez podaniem do około 1 godz. przed szczepieniem.
Zabite szczepionki (Isi-2) hodowano, pasażowano przez 12,5 tygodnia i zbierano w według podobnych zasad jak opisano powyżej i oczyszczano na gradiencie percollu. Oczyszczone bakterie przechowywano w -70°C do około tygodnia przez szczepieniem, następnie przechowywano je w 4°C w przy normalnym poziomie tlenu atmosferycznego, który jest toksyczny dla L. intracellularis. Al OH dodano do bakterii do uzyskania ostatecznego stężenia 10% A10H. Stężenie białka oznaczano stosują metodę Biuretta.
Określenie ilościowe żywych IS L. intracellularis:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Do 96-studzienkowych płytek do mikromiarecz-kowania wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 komórek/wgłębienie i hodowano przez 18-24 godz. przed zakazeniem. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/wgłębienie. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O 2, 8,8 % CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko L. intracellularis (uzyskane od dr Stevena McOrist'a) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie koniugaty immunogloguliny klasy G-fluorochrom (FITC) w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml stosując metodę obliczeń Reed-Meunscha
Wyniki TICD 50 wskazują, że ISi-1 zawierają więcej niz 1 x IO5 bakterii/ml. Czwartym materiałem zakażającym było placebo pochodzące z komórkowych hodowli tkankowych przygotowanych w ten sam sposób co szczepionki.
Zabita szczepionka badana w kierunku zawartości białka metodą Biurett'a zawierała 0,311 mg/ml.
Świnie zaszczepiono 13 grudnia 1995. Wszystkie żywe szczepionki podano w dawce 2 ml IN w ilości 1 ml/ nozdrze. Isi-2 (zabite) szczepionki podano domięśniowo w ilości 1,5 ml/świnię i powtórzono po 14 dniach. Wszystkim zwierzętom kontrolnym podano niezakażone komórki w ten sam sposób co żywe szczepionki.
Obserwacje i próbki:
Rozmazy kału i próbki surowicy pobierano co 7 dni w trakcie trwania badania. Rozmazy kału badano metodą PCR stosując zestaw starterów, 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' i 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' do amplifikacji DNA. Parametry cyklu to 93°C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej podanych temperaturach przez 45 s dla danej temperatury. Ostatni cykl przeprowadzono w 72°C przez 2 min, startery określono przez Jones'a i in.
Prowokacja.
Wszystkim zwierzętom, za wyjątkiem ścisłej kontroli poddano prowokacji hodowlami 26 i 27 dnia po szczepieniu, hodowle zawierały nieintensywnie pasażowanymi hodowlami L. intracellularis szczepów N343 i N72994, które były hodowane w sposób ciągły przez 8 do 12 tygodni. Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (ŚPG) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (PBS) i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Niektóre hodowle przecho22
189 287 wywano w -70°C do czasu prowokacji i zbierania hodowli. Prowokacja materiałami zakażającymi została połączona i określono TCID 50 hodowli. Próbki trzymano na lodzie aż do momentu podawania.
stycznia 1996 podano do hodowle prowokacji składające się z 4 x 104 bakterii/ml, a 9 stycznia 1996 podano do hodowle prowokacji składające się z 3 x 104 bakterii/ml. Świniom podano w obu tych dniach po 15 ml materiału do prowokacji drogą płukania żołądkowego. Tak więc zwierzęta otrzymały odpowiednio 819 stycznia 1996 6 x 105 bakterii/świnię i 4,7 x 105 bakterii/świnię.
Wyniki:
Bezpieczeństwo :
Wyniki PCR rozmazów kałowych: Wykrywanie L. intracellularis przy zastosowaniu metody PCR wykazało, że żadna ze świń nie wydalała bakterii z kałem na początku badania. Siódmego DNA po zaszczepieniu wyniki wszystkich świń były ujemne. Czternastego DNA po zaszczepieniu wyniki 3 świń w grupie ISi-1 były dodatnie. Wyniki dwóch zwierząt w grupie ISi-1 w 21 dniu po zaszczepieniu były dodatnie, a wszystkich innych zwierząt ujemne. W 26 dniu po zaszczepieniu żadne ze zwierząt nie wydzielało bakterii z kałem jak to wykazano w badaniu PCR. 26 dnia po zaszczepieniu po 5 świń z grupy ISi-1 i z grupy kontrolnej i 4 świnie z grupy ISi-2 zostało zabitych i poddano sekcji. Pobrano próbki jelita krętego, okrężnicy, krezkowych węzłów limfatycznych i migdałki jak również próbki płuc od świń podejrzanych o zapalenie płuc.
Badnie PCR na zwierzętach przeprowadzono wykorzystując próbki jelita krętego i płuc. Jedynie w grupie leczonej pobrano próbki migdałków, jelita grubego i węzłach chłonnych i przeprowadzono PCR. Wyniki badania PCR pokazano poniżej.
Grupa PCR jelita krętego w 26 dniu po szczepieniu Próbki jelita grubego Próbki migdałków Próbki krezkowych węzłów chłonnych Próbki płuc
ISi-1 1 z 5 + - - 1 z 1
ISi-2 0 z 4 - - - 0 z 1
Kontrole 0 z 5 - - - nie badano
Ścisłe kontrole nie badano nie badano nie badano nie badano nie badano
Histologiczne skrawki jelita krętego znakowano stosując swoiste przeciwciało monoklonalne przeciwko L. intracellularis jako przeciwciało pierwszorzędowe i anty-mysie koniugaty immunoglobuliny klasy G-fluorochrom jako przeciwciało drugorzędowe. L. intracellularis obserwowano u 3 z 5 świń z grupy ISi-1. Wyniki wszystkich inne świń były ujemne w znakowaniu przeciwciałem fluorescencyjnym.
Wymienione świnie zostały zabite i poddane sekcji 21 dnia po prowokacji i te same próbki zostały pobrane dla określenia wyników.
Wyniki PCR podano poniżej.
grupa PCR jelita krętego w 21 dniu po szczepieniu Próbki jelita grubego Próbki migdałków Próbki krezkowych węzłów chłonnych Próbki płuc
ISi-1 0 z 10 + - - -
ISi-2 0 z 6 - - - -
Kontrole 4 z 10 - - - -
Ścisłe kontrole 0 z 5 - - - -
189 287
Znakowanie FA jelita krętego przeprowadzono jak to pokazano powyżej, 7 z 10 zwierząt miało dodatnie wyniki w grupie kontrolnej. U wszystkich pozostałych zwierząt nie wykazano obecności L. intraapeluearis.
Surowicę badano w kierunku wytwarzania przeciwciał IgG przez świnie po ekspozycji na L. inttacpeeuearis. Test przeprowadzono przez wysiewanie hodowli tkankowych na płytki Terasaki z komórkami McCT/a w ilości 125 komórek/wgłębienie i hodowanie przez 18-24 godziny przez zakażeniem. Czyste hodowle L. intraapeeuearis rozcieńczone do 1000-3000 bakterii/ml w DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą dodano do studzienek w ilości 0,01 ml/wgłębienie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO 2 i 83,2% H 2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty'. Surowicę świń rozcieńczono 1:75 w sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie rozcieńczonej surowicy. Płytki inkubowano przez 30-60 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie anty-świński koniugat immunoglobuliny klasy IgG z fluorsahtompm. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki przemywano 5 razy ddH2O i pozwalano im wyschnąć Próbki obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i studzienki, w których obserwowano bakterie były znakowane jako dodatnie, a te w których nie obserwowano bakterii znakowano jako ujemne.
Wyniki:
Grupa Dzień 0 26 dzień po zaszczepieniu 47 dzień po zaszczepieniu 21 dzień po prowokacji
ISi-1 0 z 15 6 z 15 8 z 10
lS-2 0 z 10 3 z 10 5 z 6
Kontrole 1 z 15 Oz 15 9 z 10
Ścisłe kontrole 0 z 5 0 z 5 0 z 5
Zwierzęta, które miały wyniki dodatnie w dniu 0 ponownie badano w odstępach tygodniowych. Wyniki wskazują, że wszystkie zwierzęta miały ujemne wyniki serologiczne przez 14 dni po zaszczepieniu. Nie oczekiwano takiego wyniku, lecz wiek świń w dniu 0 wynosił 3 ΐΛ^χΙπίο i dodatnie wyrnki mogły za^zeć od przeeiiΛ'ciai przekazanye-h przez γοη^.
Surowice badano cały czas z dodatnią surowicą kontrolną uzyskana przez hiperimmunizację świń czystymi hodowlami L. intracehularis. Wykorzystywana ujemna surowica kontrolna była uzyskana z gnotobiotycznych świń z South Dakota State University.
Podany powyżej opis i przykłady są jedynie ilustracja korzystnego wykonania osiągniętego przy wykorzystaniu przedmiotów, cech i korzyści według niniejszego wynalazku, lecz nie było zamiarem ograniczenie przez to niniejszego wynalazku. Wszystkie modyfikacje niniejszego wynalazku objęte myślą i zakresem następujących zastrzeżeń są częścią niniejszego wynalazku.

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783, znamienny tym, że wytwarzany jest sposobem obejmującym otrzymywanie hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18, zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od około 0% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakazonych komórek tak, by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych.
  2. 2. Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis, zwłaszcza ATCC 55783, znamienny tym, ze wytarzany jest sposobem obejmującym otrzymywanie hodowli komórkowych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej hodowle komórek Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakazonych komórek w stężeniu tlenu od około 2% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak, by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych.
PL96358166A 1995-06-05 1996-06-05 Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis PL189287B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/465,337 US5714375A (en) 1995-06-05 1995-06-05 Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US08/658,194 US5885823A (en) 1995-06-05 1996-06-04 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
PCT/US1996/009576 WO1996039629A1 (en) 1995-06-05 1996-06-05 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL189287B1 true PL189287B1 (pl) 2005-07-29

Family

ID=27041284

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35816396A PL187850B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis
PL96358166A PL189287B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis
PL35816296A PL187849B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny
PL96358164A PL189187B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis
PL96325872A PL189250B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis
PL96358165A PL189286B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35816396A PL187850B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35816296A PL187849B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny
PL96358164A PL189187B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis
PL96325872A PL189250B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis
PL96358165A PL189286B1 (pl) 1995-06-05 1996-06-05 Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5885823A (pl)
EP (5) EP1403643B2 (pl)
JP (4) JP3765834B2 (pl)
KR (4) KR100544857B1 (pl)
AT (3) ATE289069T1 (pl)
AU (1) AU717045B2 (pl)
BG (1) BG64292B1 (pl)
BR (2) BR9608338B1 (pl)
CA (1) CA2222643C (pl)
CZ (1) CZ295933B6 (pl)
DE (5) DE843818T1 (pl)
DK (3) DK1403643T3 (pl)
ES (3) ES2294620T5 (pl)
FR (1) FR07C0071I2 (pl)
HU (1) HU230199B1 (pl)
LU (1) LU91405I2 (pl)
NL (1) NL300331I2 (pl)
NZ (1) NZ319994A (pl)
PL (6) PL187850B1 (pl)
PT (3) PT1645567E (pl)
RO (1) RO118885B1 (pl)
RU (2) RU2265849C2 (pl)
WO (1) WO1996039629A1 (pl)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7022328B1 (en) 1995-11-30 2006-04-04 Australian Pork Limited Therapeutic and diagnostic compositions
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US7029683B1 (en) 1999-05-13 2006-04-18 Pfizer Products, Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
EP1177213A4 (en) * 1999-05-13 2002-08-28 Pfizer Prod Inc LAWSONIA DERIVATIVE GENE, POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND HEMOLYSIN PROTEINS AND USES THEREOF
WO2000069905A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Australian Pork Limited LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED OmpH POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
WO2000069903A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Pfizer Products Inc LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED SodC POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
AU771376B2 (en) * 1999-05-13 2004-03-18 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related FlgE polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7052697B1 (en) * 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
JP2004529854A (ja) * 2000-09-29 2004-09-30 アリゾナ・ボード・オブ・リージエンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・アリゾナ 増殖性回腸炎のための改善されたワクチン及びその作製と使用の方法
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
BR0114835A (pt) * 2000-11-10 2003-07-01 Agriculture Victoria Serv Pty Composições terapêuticas para tratamento de infecção por lawsonia spp
ES2360225T3 (es) * 2000-12-20 2011-06-02 Intervet International Bv Vacuna contra lawsonia intracellularis.
US20030087421A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-08 Gebhart Connie J Lawsonia intracellularis
WO2004033631A2 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid and polypeptide sequences from lawsonia intracellularis and methods of using
UA87665C2 (ru) * 2003-07-25 2009-08-10 Берингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Авирулентный изолят lawsonia intracellularis европейского происхождения, вакцина для иммунизации животных, применение заявленного авирулентного изолята как вакцины, способ получения вакцины, способ культивирования lawsonia intracellularis, способ диагностики пролиферативной энтеропатии свиней и способ получения антисыворотки к lawsonia intracellularis
ATE450545T1 (de) * 2003-09-12 2009-12-15 Intervet Int Bv Impfstoff mit lawsonia intracellularis- untereinheit
AU2004297018A1 (en) * 2003-12-09 2005-06-23 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis 26 KD subunit vaccine
KR20060134054A (ko) * 2004-01-22 2006-12-27 인터벳 인터내셔널 비.브이. 로소니아 인트라셀룰라리스 서브유닛 백신
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
MY146476A (en) * 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
US20060021536A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Limin Song Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme
KR100621882B1 (ko) * 2004-09-30 2006-09-19 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법
CA2586093A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Pharmacia & Upjohn Company Llc Methods for cultivating lawsonia intracellularis
US20070212373A1 (en) * 2004-12-08 2007-09-13 Akzo Nobel N.V. Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
PL2371383T3 (pl) 2005-12-29 2016-01-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Zastosowanie kompozycji immunogennej do zmniejszania objawów klinicznych u świń
US20080226669A1 (en) 2005-12-29 2008-09-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
WO2008073464A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
ES2625460T5 (es) * 2006-12-15 2020-11-04 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Tratamiento de cerdos seropositivos en anticuerpo anti-PCV2 con antígeno de PCV2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
US8398970B2 (en) 2007-09-17 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of preventing early Lawsonia intracellularis infections
WO2009049306A1 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Pfizer Inc. Methods of culturing lawsonia intracellularis
BRPI0821456A2 (pt) * 2007-12-31 2015-06-16 Boehring Ingelheim Vetmedica Inc Partícula similar à pcv2 orf2 com inserção de aminoácido estranho
EP2242511A4 (en) 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
ES2534556T3 (es) * 2008-07-22 2015-04-24 Intervet International Bv Bacteria Lawsonia intracellularis de un nuevo serotipo, vacuna basada en esa bacteria, anticuerpos adecuados para diagnosticar el nuevo serotipo de Lawsonia intracellularis e hibridomas para producir dichos anticuerpos
US8142760B2 (en) * 2008-09-05 2012-03-27 Nathan Len Winkelman Vaccination for Lawsonia intracellularis
WO2011006880A1 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis propagation
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
HUE032982T2 (hu) * 2009-11-09 2017-11-28 Intervet Int Bv Eljárás Lawsonia intracellularis baktériumok tenyésztésére tartósan fertõzött McCoy sejtekben
PL2938747T3 (pl) * 2012-12-28 2019-11-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko mykoplazmie
EP3049106A1 (en) 2013-09-25 2016-08-03 Zoetis Services LLC Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
DK3052516T3 (da) 2013-10-02 2020-03-23 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc PCV2-ORF2-proteinvariant og viruslignende partikler sammensat deraf
WO2016124620A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Intervet International B.V. A vaccine for use against subclinical lawsonia infection in a pig
JP2018504423A (ja) 2015-02-04 2018-02-15 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 豚における無症候性ローソニア感染症に対する使用のためのワクチン
KR20180062468A (ko) * 2016-11-18 2018-06-11 녹십자수의약품(주) 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도
WO2019166362A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for reducing skatole and/or indole in animals
MX2023001024A (es) 2020-07-24 2023-02-15 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacuna porcina combinada.
AU2022375120A1 (en) 2021-11-01 2024-04-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic gel compositions
WO2024068637A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
WO2024260953A1 (en) * 2023-06-23 2024-12-26 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
CN119185351B (zh) * 2024-09-25 2025-09-16 武汉轻工大学 Li0004蛋白靶点在制备抑制劳森菌感染细胞增殖的药物中的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132597A (en) * 1976-06-09 1979-01-02 Ab Medipharm Method for cultivation of bacteria
US4237218A (en) * 1979-02-09 1980-12-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Micro-carrier cell culture
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
JPH0644865B2 (ja) * 1985-10-29 1994-06-15 三菱瓦斯化学株式会社 カンピロバクタ−属細菌の培養方法
US5338670A (en) * 1986-07-28 1994-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
IT1227657B (it) * 1988-12-01 1991-04-23 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione
JPH0822221B2 (ja) * 1988-12-28 1996-03-06 日東化学工業株式会社 シュードモナス属細菌の培養法
JPH02308754A (ja) * 1989-05-24 1990-12-21 Yakult Honsha Co Ltd 乳発酵食品の製造法
US5296221A (en) * 1990-01-31 1994-03-22 Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations
DK0555366T3 (da) * 1990-11-01 2000-08-28 Univ Iowa State Res Found Inc Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine
SU1768637A1 (en) * 1990-12-04 1992-10-15 Inst Virusologii Im D I Ivanov Strain of human immunodeficient virus 1-type for preparation of diagnostic preparation
JP3043809B2 (ja) * 1991-11-15 2000-05-22 ファイザー・インコーポレイテッド グラム陰性菌ワクチン
DE4208785A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5610059A (en) * 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990022509A (ko) 1999-03-25
JP2008266340A (ja) 2008-11-06
KR100513481B1 (ko) 2006-01-27
ES2294620T3 (es) 2008-04-01
EP0843818A1 (en) 1998-05-27
BG64292B1 (bg) 2004-08-31
ES2332587T3 (es) 2010-02-09
RU2005114739A (ru) 2006-11-20
RU2265849C2 (ru) 2005-12-10
DE69638016D1 (de) 2009-10-15
HK1010911A1 (en) 1999-07-02
EP1645567B1 (en) 2007-09-12
WO1996039629A1 (en) 1996-12-12
EP0843818A4 (en) 2002-02-06
PT1645567E (pt) 2007-11-19
KR100758614B1 (ko) 2007-09-13
EP1645567B2 (en) 2016-01-06
ES2173055T1 (es) 2002-10-16
EP0843818B1 (en) 2005-02-09
RO118885B1 (ro) 2003-12-30
EP1403643B2 (en) 2018-10-03
EP2199795B1 (en) 2016-03-30
ATE373015T1 (de) 2007-09-15
EP1645567A1 (en) 2006-04-12
DE69634334T2 (de) 2006-04-13
BG102130A (bg) 1998-09-30
PL189187B1 (pl) 2005-07-29
CZ295933B6 (cs) 2005-12-14
PL189250B1 (pl) 2005-07-29
KR20050048651A (ko) 2005-05-24
BR9608338B1 (pt) 2009-05-05
KR20050046741A (ko) 2005-05-18
BRPI9612938B1 (pt) 2010-07-27
PT1403643E (pt) 2009-10-08
RU2305707C2 (ru) 2007-09-10
PL187849B1 (pl) 2004-10-29
EP1655607A1 (en) 2006-05-10
DE122007000102I1 (de) 2008-04-17
JP2007151554A (ja) 2007-06-21
PL187850B1 (pl) 2004-10-29
JP4263212B2 (ja) 2009-05-13
PL325872A1 (en) 1998-08-17
EP2199795A3 (en) 2010-11-03
CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
CA2222643A1 (en) 1996-12-12
PT843818E (pt) 2005-04-29
BRPI9612938B8 (pt) 2017-09-12
AU717045B2 (en) 2000-03-16
ES2173055T3 (es) 2005-07-01
FR07C0071I1 (pl) 2008-01-02
JP2006061165A (ja) 2006-03-09
EP0843818B2 (en) 2018-12-19
PL189286B1 (pl) 2005-07-29
NL300331I1 (nl) 2008-03-03
DE69637251T3 (de) 2016-06-02
DK1645567T4 (en) 2016-04-11
MX9709464A (es) 1998-06-30
HUP9900884A3 (en) 2001-01-29
FR07C0071I2 (fr) 2010-12-31
KR100544857B1 (ko) 2006-01-24
HU230199B1 (hu) 2015-10-28
DE69637251T2 (de) 2008-06-12
JP3920300B2 (ja) 2007-05-30
ES2294620T5 (es) 2016-03-23
DE69634334D1 (de) 2005-03-17
JP5078740B2 (ja) 2012-11-21
DE69637251D1 (de) 2007-10-25
KR20060129549A (ko) 2006-12-15
HUP9900884A2 (hu) 1999-07-28
EP2199795A2 (en) 2010-06-23
NL300331I2 (nl) 2008-07-01
AU6262796A (en) 1996-12-24
EP1655607B1 (en) 2015-05-13
ATE441863T1 (de) 2009-09-15
JPH11507225A (ja) 1999-06-29
DE843818T1 (de) 2002-11-28
US5885823A (en) 1999-03-23
CA2222643C (en) 2013-08-13
LU91405I2 (fr) 2008-02-21
JP3765834B2 (ja) 2006-04-12
EP1403643A1 (en) 2004-03-31
ATE289069T1 (de) 2005-02-15
DK0843818T3 (da) 2005-05-09
EP1403643B1 (en) 2009-09-02
BR9608338A (pt) 1999-01-05
NZ319994A (en) 2000-01-28
DK1403643T3 (da) 2010-01-04
DK1645567T3 (da) 2007-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL189287B1 (pl) Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis
EP1651260B1 (en) Lawsonia intracellularis of european origin and vaccines, diagnostic agents and methods of use thereof
CN1519311B (zh) 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂
HK1010911B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
MXPA97009464A (en) Culture of lawsonia intracellularis, vaccines against lawsonia intracellulares and agents of diagnost
HK1067662B (en) Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
HK1081594B (en) Lawsonia intracellularis cultivation in mccoy cell