DK146631B - Varmestabil glucoamylase og fremgangsmaade til fremstilling af en sirup med hoejt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse - Google Patents

Description

i 146631

Opfindelsen angår en hidtil ukendt varmestabil gluco:amy~ lase og en fremgangsmåde til fremstilling af en sirup med højt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse.

5 Por tiden anvendes chargeprocesser til fremstilling af D- glucose ved saccharificering af stivelsehydrolysater med en glucoamylase. Mange af de kommercielle glucoamylaser, der fremstilles idag, fås fra mikroorganismer af slægterne Rhizopus og Aspergillus. Når disse enzymer anvendes til 10 fremstilling af glucose, får de almindeligvis lov at reagere ved 55 - 60° C i 2- 4 dage. Hvis glucoamylase kan immobiliseres, og saccharificeringen kan gennemføres kontinuert igennem en søjle, reduceres reaktionstiden, og der er ikke brug for nogen stor reaktionstank, hvorved 15 der spares arbejde og energi. Glucoamylaser produceret af

Rhizopus og Aspergillus kan immobiliseres ved ionbytterpro-cesser, fysisk adsorption, kovalent binding, gelindeslutning osv. Alle glucoamylaser, der immobiliseres ved nogen af disse fremgangsmåder, inaktiveres imidlertid, når de 20 anvendes ved over 50° C.

En artikel af D.R. Marsh, Y.Y. Lee og G.T. Tsao, Biotech.

Bioeng. 15. 483 (1973) rapporterede, at immobiliserede glucoamylaseenzymer var stabile i ret lang tid, når de blev anvendt ved under 50° C, men denne fremgangsmåde er 25 ikke kommercielt brugbar på grund af faren for mikrobiel forurening.

Derfor er udviklingen af en immobiliseret glucoamylase, som er stabil ved temperaturer over 50° C, nødvendig for kontinuert saccharificering i kommerciel målestok.

30 For at opnå dette må der udvikles en glucoamylase med be tydeligt højere varmestabiltet end de konventionelle enzymer.

2 146631

Der er nu fundet en mikroorganismestamme tilhørende slægten Talaromyces, som producerer en glucoamylase, der har optimal reaktionstemperatur på 75°C og er i stand til at bevare mindst ca. 90% af dens oprindelige glucoamylase-aktivitet, 5 når den holdes ved 70°C og pH 4,5 i 10 minutter.

I overensstemmelse hermed er den varmestabile glucoamylase ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Denne glucoamylase kan således fremstilles ved dyrkning 10 af mikroorganismestammen Talaromyces duponti FRI 4566 i et næringsmedium og udvinding af enzymet fra dyrkningsvæsken .

Egenskaberne af den hidtil ukendte varmestabile glucoamylase ifølge opfindelsen skal i det følgende beskrives 15 nærmere og sammenlignes med egenskaberne af de kendte glu-coamylaser under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser sammenhængen mellem pH-værdien og enzymaktiviteten for enzymet ifølge opfindelsen og de konventionelle glucoamylaser produceret af Rhizopus niveus og Asper-20 gillus niger; fig. 2 viser sammenhængen mellem temperaturen og enzymaktiviteten for enzymet ifølge opfindelsen og glucoamy-laserne fra Aspergillus luchuensis og Humicola lanuginosa; 25 fig. 3 giver en sammenligning af enzymet ifølge opfindelsen og de glucoamylaser, der produceres af H. lanuginosa, A. niger og R. niveus med hensyn til deres relative varmestabiliteter.

146631 3 I det følgende er betegnelsen "D.E." en forkortelse for "dextrose ækvivalent", og disse betegnelser anvendes valgfrit til at angive et materiales indhold af reducerende sukker udregnet som D-glucose og udtrykt som procent af 5 det totale faststofindhold.

Betegnelsen "stivelsehydrolysat" anvendes alment til at angive en sirup eller et tørt produkt, som er fremstillet ved delvis hydrolyse af stivelse. Et sådant produkt kan fremstilles ved sur eller enzymatisk hydrolyse.

10 Betegnelsen "smeltet stivelse" anvendes til at angive et stivelsehydrolysat med lavt D.E. (fra ca. 2 til ca. 20).

1. Aktivitet oq substratspecificitet

Enzymet ifølge opfindelsen hydrolyserer stivelse, opløselig stivelse, amylose, amylopectin, glycogen osv. til D-glucose.

15 Når substratkoncentrationen er 1% er udbyttet af glucose 100%, og den optiske drejning af den dannede glucose er positiv. Derfor er dette enzym en glucoamylase.

2. Optimal pH-værdi og stabilt pH-område

Fig. 1 viser sammenhængen mellem den relative enzymaktivitet 20 og pH-værdien i sammenligning med de glucoamylaser, som produceres af Rhizopus og Aspergillus. Som vist i figuren er den optimale pH-værdi for enzymet ifølge opfindelsen ved 60°C 4,0, og de optimale pH-værdier af glucoamylaserne produceret af Rhizopus og Aspergillus er henholdsvis 5»0 og 4,0.

25 Enzymet ifølge opfindelsen er mest stabilt ved pH-værdier mellem 3 og 5, men der fandt ingen inaktivering sted, når det holdtes ved stuetemperatur og pH-værdier mellem 2 og 9 i 24 timer.

146631 4 3. Bestemmelse af enzymatisk aktivitet

En 0,5 ml aliquot af en fortyndet enzymopløsning sættes til 0,5 ml af en 2% opløsning af maltodextrin (D.E. ca.

10) i 0,1 M acetat puffer (pH 4,5), og blandingen får lov at 5 reagere ved 60°C.i nøjagtig 10 minutter. Efter 10 minutters forløb afsluttes enzymreaktionen ved opvarmning i et kogende vandbad i 5 minutter. Den dannede glucose bestemmes ved glucoseoxidasemetoden. Den enzymmængde, som er i stand til at producere 1 mikromol glucose pr. minut, defineres 10 som en enzymenhed.

4. Reaktionstemperaturområde

Fig. 2 viser sammenhængen mellem den relative enzymaktivitet og reaktionstemperaturen i sammenligning med den glucoamylase, som produceres af Aspergillus luchuensis 15 U2 (japansk offentliggørelsesskrift 55-7513) og også med den glucoamylase, som produceres af Humicola lanuginosa (Carbohydrate Research, 61 301, 1978), som er de mest var-mestabile glucoamylaser, der kendes til dato. Som vist i figuren er den optimale reaktionstemperatur for enzymet ifølge 20 opfindelsen 75°C, hvilket er 10°C højere end den optimale reaktionstemperatur for glucoamylaserne fra Aspergillus luchuensis og Humicola lanuginosa.

5. Inaktivering på grund af pH- og temperaturbetingelser

Enzymet ifølge opfindelsen inaktiveres fuldstændigt ved op-25 varmning til 70°C ved pH-værdier på under 2 eller over 8 i en time. Fig. 3 viser inaktiveringskurven for dette enzym i sammenligning med de glucoamylaser., som produceres af Humicola lanuginosa, Aspergillus niger Og Rhizopus niveus. Figuren viser inaktiveringskurverne for disse 4 glucoamylaser, når 30 de blev behandlet ved 7Q°C og deres optimale pH-værdier for stabilitet.

Som vist i figuren har enzymet ifølge opfindelsen en bety- 146631 5 deligt højere varmestabilitet end de kendte glucoamylaser, idet det viser 92,5% restaktivitet efter opvarmning til 70° C i 10 minutter og 48% restaktivitet selv efter opvarmning i 1 time. Dette indicerer, at denne glucoamylase 5 er væsentligt mere varmestabil end de kendte glucoamy laser.

6. Inhibering, aktivering og stabilisering

Enzymet ifølge opfindelsen kræver hverken aktiverende eller stabiliserende midler. Det inhiberes af sådanne 10 metalsalte som kviksølv(ll)-chlorid.

7. Rensningsproces

Enzymet ifølge opfindelsen kan renses ved udsaltning med et uorganisk salt, fraktionering med et organisk opløsningsmiddel, behandling med aktivt ler, forskellige chro-15 matografiske metoder og kombinationer deraf. En udførel sesform af rensningsprocessen er beskrevet i eksemplet.

Når det rensede enzym blev analyseret ved skive-elektrofo-rese ifølge Davis-metoden (Ann.New York Acad. Sci. 121, 321 (1964)), vandrede det imod katoden ved pH 8,8 og viste 20 et enkelt bånd.

8. Molekylvægt

Molekylvægten af enzymet ifølge opfindelsen blev tindersøgt ved anvendelse af en søjle af tværbundet dextrangel "Sephadej^ G-150", i overensstemmelse med den procedure, som er beskrevet 25 af Andrews, P., Biol. Chem. J. 96, 595 (1965)· Resultaterne indicerede, at enzymets molekylvægt er omkring 31 000.

Herefter skal forskellene mellem enzymet ifølge opfindelsen og de konventionelle glucoamylaser anføres, og der gives en forklaring på grundene til, at dette enzym må betragtes 6 146631 som et hidtil ukendt enzym med høj varmestabilitet.

Tabel I viser det optimale reaktions-pH, den optimale reaktionstemperatur og molekylvægten af enzymet ifølge opfindelsen i sammenligning med værdierne for flere kendte glu-5 coamylaser. Den optimale reaktionstemperatur for enzymet ifølge opfindelsen er 75°C, hvilket er 5 - 15°C højere end for de kendte glucoamylaser. Molekylvægten af enzymet ifølge opfindelsen er væsentligt mindre end af de kendte glucoamylaser.

TABEL X

10 Sammenligning af forskellige glucoamylaser med hensyn til optimums- pH, optimumstemperatur og molekylvægt

Glucoamylase Optimums- Optimums- Molekyl- _ pH3,^_ temp, °Ca^ vægt

Enzymet ifølge opf. 4,0* 75* 31 000* (Talaromyces)

Humicola lanuginosa^ 6,5 65

Aspergillus luchuensis0^ 4,0 65

Aspergillus niger 4,5* 70* 97 000^|

Rhizopus sp. 5,0* 60* 70 000e'

Endomyces sp.*^ 5,0 60 64 000

Trichoderma viride®^ 5,0 60 75 000

Cephalosporium cherticola*1^ 5,4 60 69 000 a) Alle værdier undtagen dem, der er mærket med stjerne (x), er taget fra referencerne.

b) P.M. Taylor et al.: Carbohydrate Research, 61, 301 (1978).

c) T. Kanno et al.: Japansk offentliggørelsesskrift 53-7513 (1978).

d) J.H. Pazur et al.: J. Biol. Chem. 257, 1002 (1962).

e) Hiromi et al.: Biochem. Biophys. Acta 302, 362 (1973).

f) Hattori et al.: Agr. Biol. Chem. 2£, 895 (1961).

g) Okada: J. Jap. Soc. Starch Sci. 21, 283 (1974).

h) H. Urbanek: Appl. Microbiol. 30, 163 (1975).

146631 7

Fig. 3 viser som nævnt inaktiveringskurven for enzymet ifølge opfindelsen i sammenligning med glucoamylaserne fra Humicola lanuginosa, Aspergillus niger og Rhizopus niveus. Disse blev opvarmet til 70°C ved den mest stabile pH-værdi for 5 hvert enzym. Som vist i figuren er inaktiveringen af det foreliggende enzym væsentligt langsommere end af de andre glucoamylaser.

På basis af de ovenstående kendsgerninger, kan det konkluderes, at glucoamylasen ifølge opfindelsen er en hidtil 10 ukendt termophil glucoamylase.

Fremstillingen af denne glucoamylse skal beskrives nærmere i det følgende.

Den glucoamylase-producerende mikroorganisme, Talaromyces duponti stamme G45-632, FRI 4566, blev isoleret fra jorden.

15 De mikrobiologiske egenskaber af denne stamme beskrives nedenfor.

Stammens morphologiske egenskaber blev bestemt i overensstemmelse med de metoder, som er beskrevet af de neden-20 for anførte forskere: D.G. Cooney and R. Emerson, THERMOPHILIC FUNGI.

W.H, Freeman and Company, San Francisco & London.

K.B. Raper and C. Thom A MANUAL OF PENICILLIA.

Hafner Publishing Company, New York and London (1968).

25 T. Awao and K. Mitsugi Trans. Mycol. Soc.

Japan 14, 145 - 160 (1973)· K. Minoura, M. Yokoe, T. Nehira.

Trans. Mycol. Soc. Japan 14, 352 - 361 (1973).

148831 8 9. Morphologiske egenskaber af stamme G45-632

Stammen blev dyrket på to slags medier i Petri-skåle. De følgende afsnit angiver de morphologiske egenskaber, som blev iagttaget for isolerede kolonier.

5 a) Kartoffeldextrose-agar-medium

Efter incubation ved 40° C i tre dage er kolonierne cirkulære med en dimater på 6 - 7 cm. De vegetative hypher er farveløse. De vokser tyndt i koloniernes periferi, men bliver tottede i centrum med en tykkelse på 1 - 2 mm, 10 og talrige conidier. De er grålig-hvide med svagt grønne deistothecier på mindre end 0,3 mm i diameter, der ligger tilfældigt i koloniens centrale og perifere dele.

Koloniernes bund er gullig brun, men den del, som danner cleistothecieme, er rødlig brun og sekreterer et gullig 15 brunt pigment. De vegetative hypher er 2 - 4,5/um tykke og har septa. De består af forgrenede fibre, hvorfra coni-diophorer med septa rager ud. Conidiophorerne har en glat overflade og er 30 - 2000 yum x 2 x 3 /um i størrelse; de længere conidiophorer er ofte tilfældigt forgrenede.

20 Dannelsen af conidier er meget uregelmæssig, sommetider skyder de direkte fra toppen af conidiophorerne, og sommetider skyder de fra toppen af 1 - 4 phialider. Sommetider er phialideme dobbelte. Phialiderne er 10 - 15 ^um x 2 - 3,5 /um i størrelse og har opsvulmede bunde.

25 Conidierne løber i en række, sommetider på mere end 10 enheder. De er ovale eller langstrakt ovale med en glat overflade og er 5 x 3 /um eller mindre i størrelse og har en brunlig farve under transparent lys.

Ascocarpeme er sfæriske eller elliptisk sfæriske, mindre 30 end 300^um i diameter. Asci har ingen ascusvæg og er 10 x 146631 9 8 yum i størrelse. Ascosporerne er gullige og er 3 - 4 yum i størrelse, cirkulære set fra oven, men en ækvations-fure er synlig set fra siden.

b) Gærekstrakt-stivelse-agar-medium

Procent 5 Difco gærekstrakt q 4

Opløselig stivelse 1,5 k2hpo4 0,1

MgS04* 7H20 0,05

Agar 2 10 Efter incubation ved 40° C i tre dage er kolonierne cirku lære med en diameter på 6 - 7 cm. Kolonierne er tottede og 1 - 2 mm i tykkelse. Unge kolonier er hvide, men de får gradvis en grålig hvid svagt grøn farve. Parallelt med dette dannes talrige conidier, og overfladen bliver pul-15 - veragtig. Koloniernes bund er rødlig brun i vækstens be gyndelsesstadium, men bliver gradvis mørkebrun og sekreterer et mørkebrunt pigment i mediet. På dette dyrkningsmedium dannes ingen ascocarper.

10. Fysiologiske egenskaber af stamme G45-632 20 a) Væksttemperatur

Stammen er i stand til at vokse over et temperaturområde på 25 - 50° C, men den vokser ikke ved 55° C, og den optimale væksttemperatur er i nærheden af 40° C.

b) Vækst-pH

25 Stammen er i stand til at vokse over et pH-område på 3-9, men dens optimale vækst-pH er mellem 6 og 7.

c) Carbonkilde

Stammen er i stand til at assimilere sådanne carbonkilder 10 146631 som dextrose, fructose, galactose, mannose,saccharose, maltose og stivelse.

På basis af de ovenstående mikrobiologiske resultater og beskrivelsen i "Thermophilic Fungi" (D.G. Cooney and 5 R. Emerson) og "Trans. Mycol. Soc. Japan, 14" (T. Awao and Mitsugi), blev stamme 45-632 identificeret som Tala-romyces duponti.

Talaromyces duponti stamme G 45-632 opbevares i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science 10 & Technology, Chiba Citu, Japan med deponeringsnummer 4566.

Hvad angår dyrkningen af mikroorganismen til fremstilling af glucoamylasen ifølge opfindelsen, kan den almindelige viden og teknik med hensyn til dyrkning af svampe anvendes.

Som næringsmedium er det muligt at anvende de medier, 15 som anvendes til dyrkning af almindelige svampe. F.éks. kan forskellige stivelser, stivelsehydrolysater, majsmel, hvedemel, melasse osv. anvendes som carbonkilde, medens pepton, affedtet bomuldsfrømel, kødekstrakt, gærekstrakt, casein, majsstøbevand, maltekstrakt, sojabønnemel, skum-20 met mælk, uorganiske ammoniumsalte, uorganiske nitrater osv. kan anvendes som nitrogenkilde. Som uorganiske salte er det muligt at anvende calciumchlorid, magnesiumsulfat, phosphater, natriumchlorid, kaliumchlorid osv. Endvidere kan disse carbonkilder, nitrogenkilder og uorgani-25 ske salte anvendes enten enkeltvis eller i passende kombinationer. Desuden er det, hvis man ønsker at fremme mikroorganismens vækst og medføre en forøgelse i dens enzymproduktion, muligt at anvende spormængder af metalsalte, aminer, aminosyrer osv.

11 1A 6 6 31

De dyrkningsbetingelser, der sædvanligvis anvendes til svampe, er også anvendelige til dyrkning af denne mikroorganisme. Hvis mikroorganismen dyrkes i væskekultur i 3-10 dage ved pH 5 - 8 og 30 - 45°C, dannes enzymet 5 ifølge opfindelsen i dyrkningsvæsken. Fast kultur er også mulig ved anvendelse af faste materialer, såsom klid.

I tilfælde af væskekultur fjernes myceliet ved enhver af de velkendte metoder, såsom filtrering, hvorefter filtratet kan koncentreres under formindsket tryk, eller en-10 zymet kan udsaltes med de andre proteiner ved tilsætning af uorganiske salte, såsom ammoniumsulfat, eller enzymet kan udfældes ved tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone eller isopropanol.

I tilfælde af fast kultur ekstraheres enzymet fra det dyr-15 kede materiale ved hjælp af vand eller en pufferopløs-ning. Derefter er det muligt ligesom ved væskekultur at opnå enzymet i koncentreret form.

De rå præparater af den således fremstillede hidtil ukendte thermophile glucoamylase kan renses ifølge den proce-20 dure, som er beskrevet i eksemplet.

Den thermophile glucoamylase ifølge opfindelsen kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af en sirup med højt glucoseindhold, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at smeltet stivelse saccharificeres 25 ved en temperatur over ca. 60 °C i nærvær af glucoamyla- sen ifølge opfindelsen. Saccharificeringen udføres fortrinsvis ved en pH-værdi på fra omkring 4,0 til omkring 5>0.

Især hvis denne glucoamylase immobiliseres, og der udføres kontinuert saccharificering under anvendelse af den immobili-30 serede glucoamylase, er den så fordelagtig, at lang tids kontinuert saccharificering ved 60 - 65°C er mulig med et højt udbytte.

12 146631

Opfindelsen belyses nærmere ved det efterfølgende eksempel, hvori alle dele og procenter er beregnet på vægt, medmindre andet er anført.

EKSEMPEL

5 Et næringsmedium bestående af 5% opløselig stivelse, 2% majsstøbevand, 0,5% bomuldsfrømel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,01% calcium-chlorid i vand blev indstillet til pH 7,0, og 100 ml af dette næringsmedium blev anbragt i en 500 ml Erlenmeyer-10 kolbe. Mediet blev steriliseret ved 121°C i 20 minutter, podet med Talaromyces duponti stamme G45-632, FRI 4566,

Og inkuberet ved 40°C i 7 dage på et rysteapparat. Efter at dyrkningen var fuldført, blev myceliet fjernet fra dyrkningsvæsken ved filtrering. Filtratet fandtes at indeholde 60 15 enheder glucoamylase-aktivitet pr. ml.

Filtratets pH-værdi blev indstillet til 6,0 med 2 N HC1, hvorefter der tilsattes aktivt ler i en mængde på 0,01 g/ ml filtrat. Efter omrøring i 15 minutter ved stuetemperatur blev det aktive ler fjernet ved filtrering. Derpå sattes 20 2 volumener koldt isopropanol til filtratet for at ud fælde enzymet. Bundfaldet blev centrifugeret fra og opløst i en lille mængde Tris-HCl puffer (pH 7,5). Denne enzym-holdige opløsning blev derefter dialyseret over for den samme puffer i en nat ved 4°C, DEAE-cellulose, som var 25 blevet ækvilibreret med den samme pufferopløsning, sattes til den dialyserede enzymopløsning, og enzymet blev adsorber et på denne bærer. Enzymet blev elueret fra bæreren under anvendelse af en opløsning af den samme puffer ved lineært at forøge dens NaCl-indhold fra nul til 0,5 M.

30 Derefter sattes to volumener koldt isopropanol til eluatet for at udfælde enzymet, og dette bundfald blev opløst i en 0,05 M Tris-HCl puffer (pH 5,5).

Denne enzymopløsning blev adsorberet til en CM-cellulose- 13 U6631 søjle, og enzymet blev elueret fra den under anvendelse af en opløsning af den samme puffer ved lineært at forøge dens NaCl-indhold fra 0 til 0,5 M. De eluerede fraktioner, som indeholdt enzymet, blev hældt sammen, og enzymet blev 5 udfældet med to volumener isopropanol.

Bundfaldet blev derpå opløst i 0,05 M Tris-HCl puffer (pH 7,5), og denne enzymopløsning blev adsorberet på en "Sephadex" '^G-150"-søjle, som var blevet ækvilibreret med den samme puffer, og enzymet blev elueret under anven-10 delse af den samme puffer. Fraktionerne som viste den en zymatiske aktivitet, blev hældt sammen, og enzymet blev udfældet ved tilsætning af 2 volumener isopropanol. Bundfaldet blev derpå opløst i en lille mængde 0,05 M acetatpuffer (pH 4,5). Den således fremstillede rensede enzym-15 opløsning havde en glucoamylase-aktivitet på 100 enheder/ mg protein.

Den ovennævnte enzymopløsning i Tris-HCl-puffer, opnået ved at opløse bundfaldet med isopropanol efter behandlingen med aktivt ler, blev immobiliseret ved binding med 20 AE-cellulose under anvendelse af glutaraldehyd ifølge den metode, som er beskrevet af Glassmeyer et al., Biochemistry 10. 786 (1971). Der blev således opnået et immobiliseret enzym med en enzymatisk aktivitet på 2 000 enheder pr. g bærer. 3 g af dette immobiliserede enzym blev pakket i en 25 søjle, som holdtes ved 60°C, og der udførtes en sacchari- ficeringsprøvning ved kontinuert at sende en 25% opløsning af stivelsehydrolysat (D.E. ca. 10), som var blevet indstillet til pH 5,0 med 2 N HC1, igennem søjlen med en hastigheden på 0,5 lagvolumener pr. time. Glucoseindholdet 30 af den saccharificerede opløsning fandtes at være 96,5% bestemt ved højydelsesvæskechromatografi. Efter en måneds kontinuert saccharificering fandtes ikke noget fald i glu-coseudbyttet.

Til sammenligning blev en A. niger glucoamylase med den