JPS6225992A - マルトテトラオ−スの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はバチルス属細菌の生産する新規なアミラーゼに
よるマルトトリースの製造方法に関するものである。

〔従来技術〕

澱粉をグルコースに分解するグルコアミラーゼ、マルト
ースに分解するβ−アミラーゼやα−アミラーゼは自然
界に広く存在することが知らているが、より分子量の大
きい、例えば、マルトトリオース（Ｇ３）。

マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ
５）マルトヘキサオース（Ｇ６）などのオリゴ糖単位で
切断するアミラーゼについての報告は少ない。

これらオリゴ糖は、食品の増量剤、賦形剤あるいは甘味
調整剤とじて注目されている。特に、Ｇ４〜Ｇ７の各オ
リゴ糖は、診断用アミラーゼの活性測定用基質としても
注目されている。

〔目的及び効果〕

本発明者は、これらオリゴ糖の製法を確立することを目
的として、広く自然界より微生物の検索を行ってきた結
果、アミロース、アミロペクチン、澱粉などのα−グル
カンを特異的にマルトテトラオース（Ｇ４）に加水分解
する新規なアミラーゼがバシルス・す〜キュランス、（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）と同定した
細菌により生産（されることを認めた。

澱粉からマルトテトラオースを生成するアミラーゼとし
ては、シュードモナス　スツツエリ　（ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　５ｔｕｚｅｒｉ）の生産するアミラーゼが
、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端からマル
トテトラオース単位で加水分解することが知られている
。

しかし、この酵素はアミロペクチンやグリコーゲンから
は高分子量のリミットデキストリンを残すと報告されて
いる。〔アーカイブ　バイオケミストリー　アンド　バ
イオフィジクス（ＡｒｃｈｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｆｓｔ
ｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｊｏｐｈｙｓｉｃｓ）１４５巻１
０５頁（１９７１））。そして、この酵素による澱粉か
らのマルトテトラオースの収量は約５５％、アミロペク
チンからの収量は５２％、と報告されている〔アメリカ
合衆国特許ＵＳＰ３，６５４，０８２゜（１９７２）、
アミラーゼ　シンポジウム、６巻、３１頁（１，９７１
））。

しかるに、本発明のバシルス属細菌の生産するアミラー
ゼは、澱粉から約６５％〜７５％の極めて高い収量でマ
ルトテトラオースを生成することが認められた。マルト
テトラオースの収量は、使用する澱粉の種類、液化度（
ＤＥ）、酵素量などにより影響されるが、通常、グルコ
〜ス１〜５％、マルトース５〜１５％ 第１表 マルトトリオース５〜１５％、マルトテトラオース６５
〜７５％、マルトペンタオース１〜５％、その他のｔＪ
Ｍ＠１〜１５％である。

たとえば、ＤＥ４２％のポテトスターチを使用したとき
の糖組成は第１表に示す通りである。

表から明らかなように、本発明の酵素は、澱粉に作用さ
せたとき、高分子量のりミツトデキストリンを殆ど残す
ことなく、澱粉からマルトテトラオースを極めて高い収
量で生成する。

これは、本発明の酵素がシュードモナス　スッツェリの
酵素とは、基知見に基づいてなされたものである。

〔構　成〕

本発明は、澱粉からマルトテトラオースを主成分として
生成するアミラーゼＧ４を、澱粉、アミロース、アミロ
ペクチン、グリコーゲンまたは、このらの部分分解物に
作用させることを特徴とする。バチルス属アミラーゼＧ
４によるマルトテトラオースの製造法に関するものであ
る。

以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明する。

本発明により、生産される酵素は下記の酵素的性質を有
する。

４１１　　作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオースを主成
分とする分解物に分解する。

本酵素はエンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約６５〜７５％
の収量でマルトテトラオースが得られる。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性澱粉
、０．０５Ｍリン、％、、：＋−衝液の下で作用させた
とき、約７５℃まで作用し、最適作用温度は最適作用１
）Ｈは６〜８．５である（０．０５Ｍ酢酸またはリン酸
環、１％可溶性澱粉下で作用、第１図（ｂ））。

熱安定性ｉｏ、ＩＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，０）の下で
加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱で約４０％失活
し、５５℃、１０分間の加熱で約８５％失活した〔第１
図（Ｃ）〕。

（５１ｐＨ安定性；Ｏ，’１Ｍ緩衝液の下で、室温（２
５℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。その結果
、ｐＨ６〜９範囲で安定であった〔第１図（ｄ）〕。

（６）安定化；カルシウムイオンが存在するとき、熱安
定性の増加が認められた〔第１図（Ｃ）の破線〕。

（７）阻害剤；本酵素は、５×１０−３ＭのＨｇ　ＣＩ
　２　、　　Ｃｕ　Ｓ　Ｏａ　。

Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏａ　、　Ａ　ｇ　Ｎ　Ｏｓにより、それ
ぞれ、約１００％、約９５％、約５０％、約３０％阻害
された。

（８）精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄液が
ら、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）カラム　りｏマドグラフィーとバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ）Ａｏ、５ｍカラム　クロマトグラフィー及
び同ゲルによる再クロマトグラフィーにより電気泳動的
に均一以上の酵素的性質について、本発明以前に知られ
ているシュードモナス　スツツエリのマルトテトラオー
ス生成アミラーゼと比較すると（１）最適作用ｐＨは（
本発明の酵素はｐＨ６〜８．５の広いｐＨ範囲にあるの
に対し、シュードモナス　スッツェリの酵素はｐＨ８付
近にあること、（２）本発明の酵素を澱粉に作用させた
とき、約６５〜７５％の収量でマルトテトラオースが得
られるのに対し、シュードモナス　スッツェリの酵素の
場合は約５５％であること、（３）本発明の酵素の分子
量は１万前後にあるのに対し、シュードモナス　スツツ
エリの酵素は、４．８，０００と５８，０００にある〔
バイオケミストリー　アンド　バイオフィジクス　アク
タ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄＢｉｏｐｈｙ
ｓｉｃｓ　　Ａｃｔａ）５６６９．８８頁（１９７９）
）など、本発明の酵素とシュードモナス　スツツエリの
酵素とは、澱粉からのマルトテトラオースの収量、最適
作用ｐ　Ｈ１分子量などの性質におい口習亀顕著な違い
のあるものであり、新規な酵素ということができる。

甲 、￥缶院微生物工業技術研究所に寄託されている。

（； 二（（１）形態；桿菌、巾０．５〜１×５〜６μ、運動
性なし、ダラム陰性。

ハ ”（２）胞子；通常、末端近くに１個、胞子溝のふくら
みは認められない。

（３）肉汁；混濁、沈降する。

（４）肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及び表
面凹凸あり。

（５）グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色。

（６）グルコース硝酸寒天；生育悪い。

（７）ボテＩ・；生育良好、乳白色に生育。

（８）グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり良く
ない。淡黄〜黄褐色。

（９）チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐色。

（１０）ミルク；ゆっくり凝固、ペプトン化。

（１１）インドール；生成しない。

（１２）カタラーゼ；生成する。

（１３）アセチルメチルカルビノール；生成しない。

（１４）硫化水素；生成しない。

クロース、澱粉などから酸を生成するが、ガスの生成は
ない。

Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−ソルボースの利
用性は良くない。

（２０）最適生育温度；２６℃前後。

（２１）最高生育温度；約６０’Ｃ （２２）死滅温度；１００°Ｃで３０分間加熱しても死
滅しない。

以上の菌学的性質について、バージェイス　マニュアル
　オブ　デタミネーティブ　バクテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’　　ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　　Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の第
７版及び第８版〔ザ　ウィリアムス　アンド　ゥイルキ
ンス　カンパニー　（Ｔｈｅ　　Ｗｉ　１　］　ｉａｍ
ｓ　　ａｎｄ　　Ｖ／ｉ　Ｉｋｉｎｓにｏｍｐａｎｙ）
、（１９５７年及び１９７４年）を参照し、木菌をバチ
ルス　サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｆｒｃ
ｕｌａｎＳ）の９−力使ニされ　灰素源としては　澱粉
　アキストノ／　マ　ト　ス　り、シュークロースなど
が使用される。そして、これに補足する栄養源として、
無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩と各種金属塩を
含む培地が使用される。培養はｐＨ５〜９、温度２０〜
６０°Ｃで好気的に行われる。

アミラーゼＧ４は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。必要により濃縮し、硫安、硫酸ナトリウ
ムによる塩析によるか、または、アセトン、イソプロパ
ツール、エタノール、メタノールなどの有機溶媒を加え
て、酵素を沈澱物として収得し、乾燥、保存する。

アミラーゼＧ４を用いて、澱粉を糖化する反応は次のよ
うにして行う。

澱粉は、酸または、α−アミラーゼにより液化される。

液化度はマルトテトラオースの収量に影響するので、望
ましくはＤＥ２０以下の液化澱粉が使用される（ＤＥは
固形分中の還元力をグルコースとして表した百分率）。

基質濃度は、通常、５〜４０％で行われる。反応ｐＨは
、通常５〜９、’ｉＪＡ度は４０〜６０℃である。本酵
素は、カルシウムイオンの存次に、実施例により本発明
の詳細な説明する。

実施例　１ ポリペプトン１％、リン酸２カリ０．３％、硫酸マグネ
シウム（７水塩）０．１％、可溶性澱粉１％からなる培
地３０ｍｌ１を２００ｍ７！容三角フラスコに入れ、１
２０℃で１０分間殺菌したのち、バチルス・サーキュラ
ンスＧ４（微工研条寄第８２０号）を接種し、３０℃で
４日間振盪培養（１６０ｒｐｍ）した。

培養後、遠心分離して得た上澄液について生産されたア
ミラーゼＧ４を測定した結果、培地１ｍＡ当たり６．４
単位であった。

実施例　２ 実施例１で得られた酵素液を使用して、澱粉の糖化を行
った。

基質としては、ＤＥ４．２の液化澱粉１００ｍｇ（固形
分）に塩化カル酵素量４ｕ／ｇ基質で、４４時間目にお
ける糖化物の糖組成は、グルコース０．０％、マルトー
ス４．６％、マルトトリオース０．０％、マルトテトラ
オース７２．６％、その他のＦ２２．８％であった。

実施例３ 実施例２において、アミラーゼＧ４の他に、クレブシラ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のプルラナーゼ（天野製薬
製）の共存下で反応を行った。得られた結果を第３表に
示す。

第１図（ａ）、　　（ｂ）、　　（Ｃ）と（ｄ）はそれ
ぞれ、アミラーゼＧ４の最適作用温度、最適作用ｐＨ１
熱安定性とｐＨ安定性を示す。

第２図は、高速液体クロマトグラフにより分離した糖化
物のｔａＵ成を示す。１；グルコース、２；マルトース
、３；マルトトリオース、４：マルトテトラオース。

ダ２．回 官庁出願 手続補正書（自発） 昭和６１年８月２２日 １、事件の表示　　　昭和６０年特許願第　　１４３５
２０号２、発明の名称 マルトテトラオースの製造法 ３、補正をする者 ６、補正により増加する発明の数　　な　し７、補正の
対象　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄８、補正の
内容　　別紙のとおり 別紙 （１）明細書第１頁第１１行目の「バチルス」を「バシ
ルス」に訂正する。

（２）明細書第３頁丁未より第１行目のｒＤＥ４２％」
をｒＤＥ４．２％」に訂正する。

（３）明細書第４頁第１７行目の「バチルス」を「バシ
ルス」に訂正する。

（４）明細書第５頁第１６行目のｒｐＨ６〜９」をｒｐ
Ｈ６〜９の」に訂正する。

ＱＡ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 澱粉から、マルトテトラオースを主成分とするバシルス
   属アミラーゼＧ４を、アミロース、アミロペクチン、グ
   リコーゲンまたは、これらの部分分解物に作用させるこ
   とを特徴とするアミラーゼＧ４によるマルトテトラオー
   スの製造法。