DK175768B1 - Normalt sporulerence Bacillus stamme uden evne til at udskille subtilisin eller neutral protease og fremgangsmåde til fremstilling af proteiner dermed - Google Patents

Description

DK 175768 B1

Dette patent er udstedt på grundlag af en patentansøgning som er afdelt fra patentansøgning nr. PA1984 03059.

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling og manipulering af proteiner under anvendelse af rekombinant teknik i egnede værter. Nærmere betegnet an-5 går opfindelsen en Baciilus-stamme, som er ude af stand til at udskille enzymatisk aktiv subtilisin eller neutral protease, og en fremgangsmåde til fremstilling af proteiner, som ikke er subtilisin eller neutral protease, ved dyrkning af en sådan Baciilus-stamme.

BAGGRUND

10 Forskellige bakterier vides at secernere proteaser på et eller andet stadium i deres livscyklus. Bacillusarter producerer to mere betydelige ekstracellulære proteaser, en neutral protease (en metalloprotease, som inhiberes af EDTA) og en alkalisk protease (eller subtilisin, en serinendoprotease). Begge produceres almindeligvis i størst mængde efter den eksponentielle vækstfase, når kulturen 15 træder ind i den stationære fase og begynder på sporuleringsprocessen. Disse to proteasers fysiologiske rolle er ikke klar. De er blevet påstået at spille en rolle ved sporulering (J. Hoch, 1976, Adv. Genet. 18 69-98; P. Piggot et al., 1976,

Bact. Rev. 40:908-962; og F. Priest, 1977, Bact. Rev. 41 711-753), at være involveret i reguleringen af cellevægreorganiseringen (L. Jolliffe et al., 1980, J.

20 Bact. 141:1199-1208), og at være affaldsnedbrydningsenzymer (Priest, ibid.).

Reguleringen af ekspressionen af proteasegeneme er kompleks. De synes at reguleres sideordnet sammen med sporulering, da mutanter, som er blokeret i de tidlige stadier af sporulering, udviser reducerede niveauer af både den alkaliske og den neutrale protease. Desuden forekommer der et antal pleiotrope 25 mutationer, som påvirker ekspressionsniveauet af proteaser og andre secerne-. rede genprodukter, såsom amylase og levansucrase (Priest, samme).

Subtilisin har fundet betydelig industriel og kommerciel anvendelse (se US patentskrift nr. 3 623 957 og J. Millet, 1970, J. Appl. Bact. 33:207). F.eks. anvendes subtilisiner og andre proteaser almindeligt i detergenser for at muliggøre 30 fjernelse af proteinbaserede pletter. De anvendes også inden for fødevareforar- | bejdning til at tilpasse proteinstofferne i fødevarepræparateme til deres ønskede virkning i sammensætning.

I DK 175768 B1 I

I 2 I

I Klassisk mutagenese af bakterier med midler som bestråling eller kemikalier har I

I frembragt en overflod af mutantstammer, som udviser forskellige egenskaber

med hensyn til den vækstfase, i hvilken der sker proteaseudskillelse, såvel som I

tidsfaktoren og aktivitetsniveauerne af udskilt protease. Disse stammer kommer I

I 5 imidlertid ikke i nærheden af organismernes endelige potentiale, da den muta- I

I gene proces er i det væsentlige tilfældig, og der kræves omstændelig selektion I

og screening for at identificere organismer, som blot nærmer sig de ønskede . I

I egenskaber. Endvidere er disse mutantstammer i stand til at reversere til ud- I

I gangs- eller vildtype-stammen. I sådanne tilfælde tabes don ønskede egen- I

I 10 skab. Sandsynligheden for reversion er ukendt, når det drejer sig om tilfældig I

I mutagenese, da mutationstypen og -sitet er ukendt eller dårligt karakteriseret. I

I Dette indfører betydelig usikkerhed i den industrielle fremgangsmåde, som ba- I

I seres på den enzymsyntetiserende bakterie. Endelig kobler klassisk mutagene- I

I se ofte en ønskelig fænotype, f.eks. lave-protease-niveauer, med en uønsket I

15 egenskab, såsom for stor og for tidlig cellelyse.

I Specielle problemer forekommer med hensyn til de proteaser, som udskilles af I

I Bacillus. En ting er, at eftersom der eksisterer mindst to sådanne proteaser, er I

1 2 3 4 5 6 screening for tabet af kun den ene vanskelig. Desuden gør det store antal I

I pleiotrope mutationer, som påvirker både sporulering og proteaseproduktion, I

I 20 isoleringen af sande proteasemutationer vanskelig. I

I Temperaturfølsomme mutanter af det neutrale proteasegen er blevet opnået I

ved konventionel mutagen teknik og blev anvendt til at kortlægge positionen af I

I regulerings- og strukturgenet i Bacillus subtilis kromosomet (H. Uehara et al., I

I 1979, J. Bact. 139:583-590). Desuden er der blevet rapporteret en formodet no- I

I 25 sensmutation af det alkaliske proteasegen (C. Roitsch et al., 1983, J. Bact I

I 155:145-152). I

Der er blevet isoleret temperaturfølsomme Bacillus-mutantstammer, som pro- I

2

I ducerer inaktiv serinprotease eller stærkt reducerede niveauer af serinprotease. I

3

I Disse mutantstammer er imidlertid asporogene og udviser en reversionsfre- I

4

30 kvens til vildtypen på fra omkring 10'7 til omkring 10-8 (F. Priest, ibid., side 719). I

5

I Disse mutantstammer er utilfredsstillende til rekombinant produktion af hetero- I

6

I loge proteiner, da asporogene mutanter har tendens til at lysere under tidligere I

7

I stadier af deres vækstcyklus i minimalmedium end sporogene mutanter, hvor- I

DK 175768 B1 ! 3 ved de for tidligt frigiver celieindholdet (inklusive intracellulære proteaser) til kultu rsupematanten. Muligheden af reversion er også uønsket, da vildtype-revertanter vil forurene kultursupernatanten med udskilte proteaser.

Bacillus sp. er blevet foreslået til ekspressionen af heterologe proteiner, men' I

5 tilstedeværelsen af udskilte proteaser og den mulige resulterende hydrolyse af det ønskede produkt har forsinket den kommercielle accept af Bacillus som j vært til ekspressionen af heterologe proteiner. Der er blevet angivet Bacillus I megaterium mutantstammer, som er i stand til sporulering, og som ikke udtryk- I ker en sporuleringsforbundet protease under vækstfaserne. Imidlertid udeluk- 10 kede den anvendte prøvning ikke tilstedeværelsen af andre proteaser, og den pågældende protease udtrykkes under sporuleringsfasen. (C. Loshon et al., 1982, "J. Bact." 150:303-311). Dette er selvfølgelig det tidspunkt, ved hvilket heterologt protein ville være akkumuleret i kulturen og være sårbart.

Det er denne opfindelses formål at konstruere en Bacillus-stamme, som er i det 15 væsentlige fri for ekstracellulær neutral og alkalisk protease under alle faser af ! dens vækstcyklus, og som udviser i det væsentlige normale sporuleringsegen- : skaber. Der er et behov for ikke-revertible, iøvrigt normale proteasemanglende organismer, som derpå kan transformeres med plasmider med højt kopital til ekspression af heterologe eller homologe proteiner.

20 SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt, i det væsentlige normalt sporulerende Bacillus-stamme. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af protein uden ledsagelse af subtilisin eller neutral protease.

De hidtil ukendte Bacillus-stammer kan transformeres med mindst én DNA-del, 25 der koder for et polypeptid, som ikke ellers udtrykkes i værtsstammen, de transformerede stammer dyrkes, og polypeptidet udvindes fra kulturen. Almindeligvis er DNA-delen en dirigeret mutant af et værts-Bacillus-gen, selv om den kan være DNA, der koder for et eukaryotisk (gær- eller pattedyr-) protein. De hidtil ukendte Bacillus-stammer kan tjene som ekspressionsværter for vektorer inde-30 holdende gener som er heterologe gener eller homologe gener fra værtsgeno-met. I det sidstnævnte tilfælde opnås enzymer, såsom amylase, der er frie for

I DK 175768 B1 I

I 4 I

neutral protease eller subtilisin. Desuden er det nu muligt at opnå neutral pro- I

' tease i kultur, som er fri for enzymatisk aktiv subtilisin og vice-versa. I

I Stamansøgningen, PA 1984 03059, for den foreliggende ansøgning er rettet på I

en fremgangsmåde som omfatter frembringelse af en mutation i et Bacillus- I

i . 5 subtil isin-enzym eller dets præ- eller præproenzym i én eller flere bestemte po-

' sitioner og prøvning for en ønsket aktivitetsændring i enzymet som resultat af ; I

I i en sådan mutation, samt på en fremgangsmåde som omfatter fremstillingen af I

I ! et mutant-subtilisin-enzym med en ønsket aktivitetsændring efter dets I

identifikation ved denne procedure. I

I 10 KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE I

I Fig. 1 viser sekvensen af et funktionelt B. amyloliquefaciens subtilisin-gen. I

I Fig. 1A er hele den funktionelle sekvens for B. amyloliquefaciens, inklusive i I

I promotoren og ribosombindingssitet, tilstede på et 1,5 kb fragment af B. amylo- I

I liquefaciens genomet. I

15 Fig. 1B viser nucleotidsekvensen af kodestrengen korreleret med proteinets I

I aminosyresekvens. Promotor-(p), ribosombindingssite-(rbs) og afslutnings- I

I (term) områder af DNA-sekvensen er også vist. I

I Fig. 2 viser resultaterne af kopier af nitrocellulosefiltre med rensede positive I

I kloner sonderet med henholdsvis Pulje 1 (Panel A) og Pulje 2 (Panel B). I

I 20 Fig. 3 viser restriktionsanalysen af subtilisin-ekspressionsplasmidet (pS4). I

I pBS42-vektorsekvenser (4,5 kb) er vist fuldt optrukket, medens indsætningsse- I

I kvensen (4,4 kb) er vist punkteret. I

I Fig. 4 viser resultaterne af SDS-PAGE udført på supematanter fra kulturer I

I transformeret med pBS42 og pS4. I

I 25 Fig. 5 viser konstruktionen af skyttelvektoren pBS42. I

Fig. 6 viser et restriktionskort for en sekvens, der inkluderer B. subtilis subtilisin- I

I genet. I 1

Fig. 7 er sekvensen af et funktionelt B. subtilis subtilisin-gen. I

5 DK 175768 B1

Fig. 8 viser en konstruktionsmetode til opnåelse af en deletionsmutant af et B. subtilis subtilisin-gen.

Fig. 9 angiver restriktionskortet for et B. subtilis neutral-protease-gen.

Fig. 10 er nucleotidsekvensen for et B. subtilis neutral-protease-gen.

5 Fig. 11 viser konstruktionen af en vektor indeholdende et B. subtilis neutral-protease-gen.

'i

Fig. 12,13 og 16 angiver udførelsesformer for den her omhandlede mutagene- ! se-teknik. 1

Fig. 14 viser den forhøjede oxidationsstabilitet af en subtilisin-mutant.

10 Fig. 15 viser en ændring i pH-aktivitetsprofilen af en subtilisin-mutant i sammenligning med vildtype-enzymet.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Den foreliggende opfindelse angår i et første aspekt en i det væsentlige normalt sporulerende Bacillus-stamme, der er særegen ved, at den indeholder mutere-15 de subtilisin- og neutral protease-gener, således at den er ude af stand til at ud-' skille enzymatisk aktiv subtilisin eller neutral protease. Disse mutationer er fortrinsvist ikke-reverterbare. I en foretrukken udførelsesform omfatter hver mutation en deletion, der resulterer i manglende ekspression eller i ekspression af et enzymatisk inaktivt polypeptid. Deletionen er fortrinsvist en deletion af naturligt 20 forekommende codoner i det respektive gen.

Bacillus-stammer ifølge den foreliggende opfindelse er i en foretrukken udførel-* sesform transformeret med mindst én DNA-del, som koder for et polypeptid, der ikke ellers udtrykkes af Bacillus-arten. Den transformerede DNA koder fortrinsvist for en subtilisinmutant eller et eukaryotisk protein.

25 Den foreliggende opfindelse angår i et andet aspekt en fremgangsmåde til fremstilling af protein uden ledsagelse af subtilisin eller neutral protease, som er særegen ved, at man dyrker en Bacillus-stamme ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, indtil der er dannet et protein i kulturen, og udvinder pro-

I DK 175768 B1 I

I I

teinet. Proteinet er fortrinsvist ikke subtilisin eller neutral protease. Proteinet kan I I

i en foretrukken udførelsesform være amylase. ; I

Prokaryotiske carbonylhydrolaser er enzymer, som hydrolyserer forbindelser I

indeholdende C(0)-X bindinger, hvori X er oxygen eller nitrogen. De inkluderer I

S hovedsageligt hydrolaser, f.eks. lipaserog peptidhydrolaser, f.eks. subtilisiner I

eller metalloproteaser. Peptidhydrolaser inkluderer α-aminoacylpeptidhydrolase, I

peptidylaminosyrehydrolase, acylaminohydrolase, serincarboxypeptidase, me- I

tallocarboxypeptidase, thiolproteinase, carboxylproteinase og metalloproteina- I

se. Serin-, metallo-, thio- og syreproteaser er inkluderet såsom endo- og exo- I

Η 10 proteaser. I

Subtilisiner er serinproteinaser, som almindeligvis har den virkning at spalte in- I

H dre peptidbindinger i proteiner eller peptider. Metalloproteaser er exo- eller en- I

I do-proteaser, som kræver en metalion-cofaktor for aktivitet. I

I Der findes et antal naturligt forekommende mutanter af subtilisin eller neutral I

1S protease. Disse enzymer og deres gener kan opnås fra mange prokaryotiske I

organismer. Egnede eksempler inkluderer Gram-negative organismer, såsom I

E. coli eller Pseudomonas og Gram-positive bakterier, såsom Micrococcus eller I

Bacillus. I 1

"Ekspressionsvektor” henfører til en DNA-konstruktion indeholdende en DNA- I

I 20 sekvens, som er operabelt forbundet med en egnet styresekvens, som er i I

stand til at frembringe ekspressionen af den nævnte DNA i en egnet vært. Så- I

I danne styresekvenser inkluderer en promotor til frembringelse af transkription, I

I en eventuel operatorsekvens til at styre en sådan transkription, en sekvens, der I

I koder for egnede mRNA-ribosombindingssites, og sekvenser, som styrer afslut- I

I 25 ningen af transkription og translation. Vektoren kan være et plasmid, en fagpar- I

I tikel eller simpelthen en potentiel genomisk indsætning. Når først den er trans- ' I

I formeret ind i en egnet vært, kan vektoren replikeres og fungere uafhængigt af I

I værtsgenomet eller kan i nogle tilfælde integreres i genomet selv. I den forelig- I

gende beskrivelse anvendes "plasmid" og "vektor" somme tider valgfrit, da I

I 30 plasmidet er den mest almindeligt anvendte form af vektor for tiden. "Rekombi- I

nante værtsceller” henfører til celler, som er blevet transformeret eller transfice- I

ret med vektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant DNA-teknik. For I

I den foreliggende opfindelses vedkommende er rekombinante værtsceller dem, I

7 DK 175768 B1 der producerer prokaryotiske carbonylhydrolaser i deres forskellige former som

Ifølge af at være blevet transformeret med ekspressionsvektorer, som koder for disse proteiner. De rekombinante værtsceller kan evt. have produceret en form af carbonylhydrolase inden transformationen.

5 "Opera belt forbundet" betyder, når man beskriver forholdet mellem to DNA- områder, simpelthen at de har en funktionel relation til hinanden. F.eks. er en præsekvens operabelt forbundet med et peptid, hvis den fungerer som signalsekvens, der deltager i sekretionen af den modne form af proteinet, hvilket mest sandsynligt involverer fraspaltning af signalsekvensen. En promotor er opera-10 belt forbundet med en kodesekvens, hvis den styrer transkriptionen af sekvensen; et ribosombindingssite er operabelt forbundet med en kodesekvens, hvis det er anbragt således, at det muliggør translation.

"Prohydrolase" henfører til en hydrolase, som indeholder yderligere N-terminale aminosyrerester, der gør enzymet inaktivt, men hvis de fjernes, giver et enzym.

15 Mange proteolytiske enzymer findes i naturen som translationelle proenzym-produkter og udtrykkes, i fravær af eftertranslationelle produkter, på denne måde.

"Præsekvens" henfører til en signalsekvens af aminosyrer bundet til den N-terminale portion af hydrolasen, som kan deltage i sekretionen af hydrolasen.

20 Præsekvenser kan også modificeres på samme måde som beskrevet her, inklusive indførelsen af forud bestemte mutationer. Når en signalsekvens er bundet til en hydrolase, bliver det pågældende protein en "præhydrolase". Præ-hydrolaser produceres ved deletion af "pro"-sekvensen (eller i det mindste den del af pro-sekvensen, som holder enzymet i dets inaktive tilstand) fra et præpro-25 kodeområde og efterfølgende ekspression af præhydrolasen. På denne måde udskiller organismen det aktive enzym frem for proenzymet.

Transformerede værter indeholdende proteasedeletionsmutanteme kan være nyttige til syntese af produkter, som er inkompatible med proteolytiske enzymer. Disse værter er pr. definition ude af stand til at udskille deleterede proteaser, 30 men er i det væsentlige normalt sporulerende. Endvidere er transformanternes øvrige vækstegenskaber i hovedsagen mage til udgangsorganismens. Sådanne organismer er nyttige derved, at de forventes at udvise mindre inaktivering af heterologe proteiner end stamorganismerne, og disse værter har bedre vækst- I DK 175768 Βϊ Η

Η . egenskaberend kendte protease-deficiente organismer. Imidlertid fjerner dele- I

H : tionen af neutral protease og subtilisin ikke al den proteolytiske aktivitet hos Ba- I

cillus. Det antages, at intracellulære proteaser, som ikke almindeligvis udskilles I

ekstracellulært, "lækker" eller diffunderer fra cellerne under de sene faser af I

H 5 dyrkningen. Disse intracellulære proteaser kan evt. være subtilisin eller neutral I

protease. I overensstemmelse hermed er de her beskrevne hidtil ukendte Bacil- I

lus-stammer ude af stand til at udskille de subtilisin- og/eller neutral-protease- I

’ enzymer, som almindeligvis udskilles ekstracellulært i udgangsstammeme. I

Η I "Ude af stand til" betyder ikke reverterbar til den vilde type. Reversion er en en- I

! 10 demulighed, der eksisterer med de hidtil kendte protease-deficiente, naturligt I

j forekommende stammer, da der ikke er nogen sikkerhed for, at fænotypen af I

: sådanne stammer ikke er en funktion af en let reverterbar mutation, f.eks. en I

; punktmutation. I

; De her omhandlede deletionsmutant-transformerede værtsceller er frie for ge- I

I I 15 ner, der koder for enzymatisk aktiv neutral protease eller subtilisin, hvilke gener H ; er defineret som dem, der er i hovedsagen homologe med de gener, som er an- . ført i fig. 1,7 eller 10. "Homologe" gener indeholder kodeområder, som er i | stand til at hybridisere under meget stramme betingelser med de gener, der er vist i fig. 1, 7 eller 10.

20 Mikroorganismestammer indeholdende carbonylhydrolasedeletionsmutanter er I nyttige ved to hovedfremgangsmåder. For det første er de fordelagtige ved gæ- I ringsproduktion af produkter, som almindeligvis udtrykkes af en vært, som mest I ønskeligt er uforurenet med det protein, som er indkodet af deletionsgenet. For I det andet ved gæringssyntese af amylase, hvor forureningsproteaser er skade- I 25 lige ved mange industrielle anvendelser af amylase. De her omhandlede hidtil I ukendte stammer befrier faget for en del af den byrde at måtte rense sådanne produkter for forurenende carbonylhydrolaser. ' - I en anden hovedudførelsesform er subtilisin- og neutral protease-deletions- I mutantstammer nyttige ved syntesen af protein, som stammen ellers ikke koder I 30 for. Disse proteiner kan være indkodet af gener, der ikke udviser væsentlig præ- I transformationshomologi med værtens gener eller de kan være fra andre proka- I ryoter, men er almindeligvis eukaryotiske proteiner fra gær eller højere eukaryo- I tiske organismer, især pattedyr. De her omhandlede hidtil ukendte stammer tje- * 9 DK 175768 B1 ner som nyttige værter for udtrykkelige vektorer indeholdende gener, der koder for sådanne proteiner, fordi sandsynligheden for proteolytisk nedbrydning af de i udtrykte, ikke-homologe proteiner reduceres.

Mutanter kan fremstilles på følgende måde. Først opnås genet, som koder for 5 hydrolasen, og det sekvensbestemmes helt eller delvist. Derpå skanderes sekvensen for et punkt, hvor det ønskes at frembringe en mutation (deletion, ind- l sætning eller udskiftning) af en eller flere aminosyrer i det udtrykte enzym. Sekvenserne, som flankerer dette punkt, bedømmes for tilstedeværelsen af restriktionssites til erstatning af et kort segment af genet med en oligonucleotid-10 pulje, som, når den udtrykkes, vil indkode forskellige mutanter. Da unikke restriktionssites almindeligvis ikke er tilstede inden for en hensigtsmæssig af-! stand fra det valgte punkt (fra 10-15 nucleotider), frembringes sådanne sites i ved udskiftning af nucleotider i genet på en sådan måde, at hverken aflæs ningsrammen eller de indkodede aminosyrer ændres i den endelige konstrukti-1S on. Opgaven at lokalisere egnede flankeringsområder og bedømme de nød-! vendige ændringer for at nå til to unikke restriktionssitesekvenser gøres til ren i rutine ved den genetiske kodes redundans, et restriktionsenzymkort over genet og det store antal forskellige restriktionsenzymer. Bemærk, at hvis et tilfældigt flankerende unikt restriktionssite er til rådighed, behøver den ovennævnte frem-20 gangsmåde kun at anvendes i forbindelse med det flankerende område, som ikke indeholder et site.

Mutation af genet for at ændre dets sekvens til at stemme overens med den ønskede sekvens gennemføres ved M13-primer-forlængelse i overensstemmelse med almindelig kendte metoder. Når først genet er klonet, nedbrydes det 25 med de unikke restriktionsenzymer, og et antal endekomplementære oligo-nucleotidkassetter ligeres ind i de unikke sites. Mutagenesen simplificeres enormt ved denne metode, fordi alle oligonucleotideme kan syntetiseres, således at de har de samme restriktionssites, og ingen syntetiske linkere er nødvendige for at skabe restriktionssitene.

30 Antallet af kommercielt tilgængelige restriktionsenzymer, for hvilke der ikke forekommer sites i det pågældende gen, er almindeligvis stort. Et egnet DNA-j sekvens-datamatsøgningsprogram simplificerer den opgave at finde potentielle unikke 5'- og 3'-flankerende sites. En hovedbegrænsning er, at enhver mutati-

DK 175768 B1 I

^Η

on, som indføres til skabelse af restriktionssites, må være stille med hensyn til I

den endeligt konstruerede aminosyre-kodesekvens. For et muligt restriktionssite I

5’ for målcodonen må der findes en sekvens i genet, som indeholder mindst alle I

nucleotiderne, undtagen en i genkendelsessekvensen 5’ for det mulige enzyms i

5 skæring. F.eks. ville det stumpt skærende enzym Smal (CCC/GGG) være en 5‘- ! I

kandidat, hvis en 5-sekvens i nærheden indeholdt NCC, CNC eller CCN. Hvis ' endvidere N skal ændres til C, må denne ændring efterlade aminosyre-

kodesekvensen intakt. I tilfælde hvor en permanent stille mutation er nødvendig I

for at indføre et restriktionssite, kan man ønske at undgå indførelse af en sjæl- I

10 dent anvendt codon. En lignende situation for Smal ville gøre sig gældende for I

3'-flankerende sites, undtagen at der må forekomme sekvensen NGG, GNG el- I

ler GGN. Kriterierne for lokalisering af kandidatenzymer er friest for stumpt skæ-

rende enzymer og strengest for enzymer, der danner 4-base-overhæng. I al- I

mindelighed er mange mulige sites til rådighed. For den heri beskrevne målco- I

15 don-222 kunne et Ball-site (TGG/CCA) være blevet frembragt i et basepar 5' fra

Kpnl-sitet. Et 3'-EcoRV-site (GAT/ATC) kunne være blevet anvendt 11 basepar

5' for Pstl-sitet. En kassette med termini varierende fra en stump ende op til et I

4-base-overhæng vil fungere uden vanskelighed. Set bagefter ville dette hypo- I

tetiske EcoRV-site i væsentlig grad have forkortet den anvendte oligonucleotid- I

20 kassette (9 og 13 basepar) og dermed muliggjort større renhed og mindre pul- I

jeskævhedsproblemer. Der bør indlysende nok vælges flankerende sites, som I

ikke selv kan ligere, således at der kan sikres ligering af oligonucleotid kassetten I

i en enkelt orientering. I

Mutationen selv behøver ikke at forudbestemmes. F.eks. mutageneres en oli- I

25 gonucleotidkassette eller -fragment tilfældigt med nitrosoguanidin eller et andet I

mutagen og ligeres derefter på sin side ind i hydrolasegenet på et forud bestemt I

site. I

Ordliste over eksperimentelle manipulationer I

For at simplificere eksemplerne vil visse hyppigt forekommende metoder blive I

30 betegnet ved forkortede udtryk. I

! Plasmider betegnes med et lille p med store bogstaver og/eller tal foran eller I

bagved. Udgangsplasmiderne er kommercielt tilgængelige, er tilgængelige på I

DK 175768 B1 li ubegrænset basis eller kan konstrueres ud fra sådanne tilgængelige plasmider i overensstemmelse med publicerede procedurer.

"Klenow-behandling" henfører til den fremgangsmåde at udfylde en tilbagetrukken 3-ende af dobbeltstrenget DNA med deoxyribonucleotider, som er kom-5 plementære til de nucleotider. der udgør den udragende 5-ende af DNA- strengen. Denne fremgangsmåde anvendes sædvanligvis til at udfylde en tilbagetrukken ende, som stammer fra en restriktionsenzymspaltning af DNA. Dette skaber en stump ende, som kan kræves til yderligere ligeringer. Klenow-behandling gennemføres ved omsætning (almindeligvis i 15 minutter ved 15 °C) 10 af de passende komplementære deoxyribonucleotider med DNA’en, som skal udfyldes, under den katalytiske aktivitet (sædvanligvis 10 enheder) af Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I ("Klenow"). Klenow og de andre nødvendige reagenser er kommercielt tilgængelige. Proceduren er blevet publiceret i udstrakt grad; se f.eks. T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, side 107-15 108.

"Nedbrydning” af DNA henfører til katalytisk spaltning af DNA’en med et enzym, der kun virker ved visse sites i DNA'en. Sådanne enzymer kaldes restriktionsenzymer, og de sites, for hvilke hvert enzym er specifikt, kaldes restriktionssi tes. "Delvis" nedbrydning henfører til en ufuldstændig nedbrydning med et re-20 striktionsenzym, dvs. der vælges tilstande, som resulterer i spaltning af nogle, men ikke alle sitene for en given restriktionsendonuclease i et DNA-substrat. De forskellige restriktionsenzymer, som anvendes i denne beskrivelse med krav, er kommercielt tilgængelige, og der anvendtes de reaktionsbetingelser, cofaktorer og andre krav, som er fastsat for dem af enzymleverandøren. Restriktionsen-25 zymer betegnes almindeligvis ved forkortelser sammensat af et stort bogstav efterfulgt af andre bogstaver og derpå almindeligvis et tal, som repræsenterer den mikroorganisme, hvorfra hvert restriktionsenzym oprindeligt blev opnået. I almindelighed anvendes omkring 1 pg plasmid eller DNA-fragment med omkring 1 enhed enzym i omkring 20 pL pufferopløsning. Passende puffere og 30 substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret af producenten. Der anvendes almindeligvis inkubationstider på omkring 1 time ved 37 °C, men de kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Efter inkubation fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og den nedbrudte nucleinsyre udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med

I DK 175768 B1 I

I 12 I

ethanol. Nedbrydning med et restriktionsenzym efterfølges i enkelte tilfælde af I

hydrolyse af de terminale 5-phosphater med bakteriel alkalisk phosphatase for I

at forhindre de to restriktionsspaltede ender af et DNA-fragment i at "cirkularise- I

I re" eller danne en lukket løkke, som ville forhindre indsætning af et andet DNA- I

5 fragment ved restriktionssitet. Med mindre andet er anført, efterfølges nedbryd- I

ning af plasmider ikke af 5'-terminal dephosphorylering. Procedurer og reagen- I

ser for dephosphorylering er konventionelle (T. Maniatis et a/., ibid, side 133- I

134). I

"Udvinding" eller "isolering" af et givet fragment af DNA fra en restriktionsned- I

10 brydning betyder adskillelse af nedbrydningen ved elektroforese på 6% po- I

I lyacrylamidgel, identifikation af det interessante fragment ved molekylvægt (un- I

H der anvendelse af DNA-fragmenter med kendt molekylvægt som markører), ud- I

i tagning af den gelsektion, som indeholder det ønskede fragment og adskillelse I

1 af gelen fra DNA. Denne procedure er alment kendt; se f.eks. R. Lawn et al., I

I 15 1981, Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 og D. Goeddel et al., (1980) Nucleic I

I Acids Res. 8:4057. I

I "Southem-analyse" er en metode, hvorved tilstedeværelsen af DNA-sekvenser I I

I en nedbrydning eller DNA-holdig blanding bekræftes ved hybridisering til et I

I kendt, mærket oligonucleotid eller DNA-fragment. Til opfindelsens formål skal I

I 20 Southern-analyse betyde adskillelse af nedbrydninger på 1 % agarose og depu- I

I rinering som beskrevet af G. Wahl et al., 1979, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. I

I 76:3683-3687, overførsel til nitrocellulose ved den metode, som er beskrevet af I

I E. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517, og hybridisering som beskrevet af I

I T. Maniatis et al., 1978, Cell 15:687-701. I

25 "Transformation" betyder indførelse af DNA i en organisme, således at DNA’en I

er replikerbar, enten som et ekstrakromosomalt element eller integrereret i kro- I

I mosomet. Med mindre andet er anført, er den heri anvendte metode til trans- I

I formation af E. coli CaCI2-metoden beskrevet af Mandel et al., 1970, J. Mol. I

Biol. 53:154, og til Bacillusmetoden beskrevet af Anagnostopolous et al., 1961, I

I 30 J. Bact. 81:791-746. I

“Ligering" henfører til den fremgangsmåde at danne phosphodiesterbindinger I

I mellem to dobbeltstrengede nucleinsyrefragmenter (T. Maniatis et al., ibid., side I

I 146). Med mindre andet er anført, blev ligering gennemført under anvendelse af I

13 DK 175768 B1 kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase ("ligase”) pr. 0,5 pg tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de DNA-fragmenter, som skal lige res. Plasmider fra transformanterne blev præpareret, analyseret ved restriktionskortlægning og/eller sekvensbestemt ved den metode, som er beskrevet af ! 5 Messing et al., 1981, Nucleic Acids Res. 9:309.

"Præparation" af DNA fra transformanter betyder isolering af plasmid-DNA fra mikroorganismekultur. Med mindre andet er anført, anvendtes alkali/SDS-metoden beskrevet af Maniatis et al., ibid., side 90.

"Oligonucleotider" er korte enkelt- og dobbeltstrengede polydeoxynucleotider, 10 som blev kemisk syntetiseret ved metoden beskrevet af Crea et al., 1980,

Nucleic Acids Res. 8:2331-2348 (undtagen at der anvendtes mesitylennitrotria-zol som kondensationsmiddel) og derpå renset på polyacrylamidgeler.

De følgende eksempler er medtaget for bedre at illustrere det heri beskrevne. Eksemplerne 6 samt 8-12 illustrerer den foreliggende opfindelse 15 EKSEMPEL 1 (ikke ifølge opfindelsen)

Præparation af et aenomisk DNA-bibliotek fra B. amvloliauefaciens og isolering af dens subtilisin-gen

Den kendte aminosyresekvens af det ekstracellulære B. amyloliquefiaciens sub-tilisin muliggør konstruktionen af en egnet sondeblanding. Sekvensen af det 20 modne subtilisin er inkluderet (sammen med den yderligere information tilført af det foreliggende arbejde) i fig. 1. Al codonusikkerhed for sekvensen af aminosyre fra position 117 til 121 dækkes af en pulje af 8 oligonucleotider med sekvensen AA(?) AA(t)ATGGA(t) GT.

25 Kromosomal DNA isoleret fra B. amyloliquefaciens (ATCC No. 23844) som beskrevet af J. Marmur, J. Mol, Biol. 3:208, blev delvis nedbrudt med Sau 3A, og fragmenterne blev udvalgt efter størrelse og ligeret ind i BamHI sitet i dephosphoryleret pBS42. (pBS42 er en skyttelvektor indeholdende replikation-soriginer, som er effektive både i E. coli og Bacillus. Den fremstilles som be-30 skrevet i eksempel 4). De Sau3A-fragment-holdige vektorer blev transformeret

I DK 175768 B1 I

I I

I ind i E. coli K12 stamme 294 (ATCC No. 31446) ved metoden beskrevet af Μ. I

I Mandel et al., 1970, J. Mol. Bio. 53:154 under anvendelse af 80-400 ng biblio- I

I teks-DNA pr. 250 pL kompetente celler. ^ I

I Celler fra transformationsblandingen blev udsået i en tæthed på 1-5 x 103 trans- '! I

I 5 formanter pr. 150 mm plade indeholdende LB-medium + 12,5 pg/mL chlo- I

I ramphenicol og dyrket natten over ved 37 °C, indtil der viste sig synlige koloni- I

I er. Pladerne blev derpå replika-udsået på BA85-nitrocellulosefiltre, som var lagt I

I ovenpå LB/chloramphenicolplader. Replika-pladerne blev dyrket 10-12 timer I

I ved 37 °C, og filtrene overført til friske plader indeholdende LB og 150 pg/mL I

I 10 spectinomycin for at forstærke plasmidpuljen. I

I Efter inkubation natten over ved 37 °C blev filtrene forarbejdet i hovedsagen I

I som beskrevet af Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) I

I 72:3961. Ud af omkring 20000 heldige transformanter fandtes 25 positive kolo- I

nier. Otte af disse positive blev udstrøget for at rense individuelle kloner. 24 I

I 15 kloner fra hver streg blev dyrket i mikrotiterhuller, stemplet over på to replika- I

I filtre og sonderet som beskrevet ovenfor med enten I

I AACAA(?) ATGGA(?) GT (pulje 1) eller AATAA(?) ATGGA(?) GT (pulje 2), I

I som kun er forskellige ved ét nucleotid. Som vist i fig. 2 hybridiserede pulje 1 i I

I en meget større grad til alle positive kloner end pulje 2, hvilket tyder på specifik I

I 20 hybridisering. I

Fire ud af fem miniplasmid-præparationer (Maniatis et al., ibid.) fra positive klo- I

I ner gav identiske restriktionsnedbrydningsmønstre, når de blev nedbrudt med I

I Sau3A eller Hindi. Plasmidet, som blev isoleret fra en af disse fire identiske ko- I

I lonier ved metoden beskrevet af Maniatis et al., ibid., havde hele den korrekte I

25 gensekvens og blev betegnet pS4. Dette plasmids egenskaber som bestemt I

I ved restriktionsanalyse er vist i fig. 3. I

I ! EKSEMPEL 2 (ikke ifølge opfindelsen) I

I . Ekspression af subtilisin-aenet I

I Bacillus subtilis 1-168 (Catalog No. 1-A1, Bacillus Genetic Stock Center) blev I

I 30 transformeret med pS4, og en enkelt chloramphenicol-resistent transformant I

15 DK 175768 B1 i blev derpådyrket i minimalmedium. Efter 24 timer blev kulturen centrifugeret, og både supematanten (10-200 pL) og pillen blev prøvet for proteolytisk aktivitet ved måling af ændringen i absorbans pr. minut ved 412 nm under anvendelse af 1 mL af det kromogene substrat succinyl-L-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilid (0,2 5 pM) i 0,1 M natriumphosphat (pH 8,0) ved 25 °C. En B. subtilis 1-168 kultur transformeret med pBS42 der blev anvendt som kontrol, viste mindre end 1/200 af den aktivitet, som blev vist af den pS4-transformerede kultur. Over 95% af pS4-kulturens proteaseaktivitet var tilstede i supematanten og blev fuldstændigt inhiberet ved behandling med phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), men ikke 10 med EDTA.

i Aliquoter af supematanterne blev behandlet med PMSF og EDTA for at inhibere

al proteaseaktivitet og analyseret ved 12% SDS-PAGE ifølge metoden beskre- I

vet af Laemmli, U. K., 1970 Nature, 227:680. Til præparering af supematanter- I ne blev 16 pL supernatant behandlet med 1 mM PMSF, 10 mM EDTA i 10 mi- j 15 nutter og kogt med 4 pL 5x koncentreret SDS-prøvepuffer minus β-mercapto- ethanol. Resultaterne af Coomassiefarvning på forsøg under anvendelse af su-pematanter af celler transformeret med henholdsvis pS4 og pBS42 og af utransformeret B. amyloliquefaciens er vist i fig. 4. Bane 3 viser autentisk subti- I lisin fra B. amyloliquefaciens. Bane 2, som er supematanten fra pBS42- 20 transformeret B. subtilis, giver ikke det med subtilisin forbundne bånd ved molekylvægt 31 000, som udvises af bane 1 fra pS4-transformerede værter. Båndet ved molekylvægt ca. 31 000 for subtilisin er karakteristisk for den langsommere mobilitet, som vises af de kendte subtilisinpræparater med molekylvægt 27 500 i almindelighed.

25 EKSEMPEL 3 (ikke ifølge opfindelsen)

Sekvensbestemmelse af B. amyloliquefaciens subtilisin-qenet

Hele sekvensen af et EcoRI-BamHI-fragment (hvori EcoRI-sitet var konstrueret ved omdannelse af Hinell-sitet) af pS4 blev bestemt ved metoden beskrevet af F. Sanger, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 74:5463. Idet der henvises til det i 30 fig. 3 viste restriktionskort fandtes BamHI-Pvull-fragmentet at hybridisere med pulje 1 oligonucleotider ved Southern-analyse. Data opnået fra sekvensbestemmelse af dette fragment dirigerede sekvensbestemmelsen af de resterende fragmenter (f.eks. Pvull-Hincll og Aval-Aval). Resultaterne er vist i fig. 1.

DK 175768 B1 I

I 16 I

Undersøgelse af sekvensen bekræfter tilstedeværelsen af codoner for det mod- I

ne subtilisin svarende til det, der secerneres af B. amyloliquefaciens. Umiddel- I

bart ovenfor denne sekvens er en række på 107 codoner begyndende med I

GTG-startcodonen ved -107. Fra codon -107 til omkring codon -75 koder for en I

5 aminosyresekvens, hvis karakteristika svarer til kendte signalsekvenser. (De I

fleste sådanne signalsekvenser er 18-30 aminosyrer lange, har hydrophobe I

kerner og ender i en lille hydrophob aminosyre). I overensstemmelse hermed I

tyder undersøgelsen af sekvensdataene på, at codonerne fra -107 til omkring - I

75 koder for signalsekvensen; de resterende codoner mellem -75 og -1 koder I

10 antageligvis for en prosekvens. I

EKSEMPEL 4 (ikke ifølge opfindelsen) I

I Konstruktion af pBS42 I

I pBS42 dannes ved trevejsligering af fragmenter afledt fra pUB110, pC194 og I

I pBR322 (se fig. 5). Fragmentet fra pUB110 er fragmentet på omkring 2600 ba- I

15 separ mellem Hpall-sitet ved 1900 og BamHI-sitet ved 4500 og indeholder et I

replikationsorigin, som er operabel i Bacillus: T. Grycztan et al., 1978, J. Bade- I

I nol 134:318 (1978); A. Jalanko et al, 1981, Gene 14:325. BamHI-sitet blev I

I prøvet med Klenow. pBR322-portionen er fragmentet på 1100 basepar mellem I

I Pvull-sitet ved 2067 og Sau3A-sitet ved 3223, som indeholder E. coli replika- I

20 tionsoriginet: F. Bolivar et al, 1977, Gene 2:95; J. Sutcliffe, 1978, Cold Spring I

I Harbor Symposium 43:l, 77. pC194-fragmentet er fragmentet på 1200 basepar I

I mellem Hpall-sitet ved 973 og Sau3A-sitet ved 2006, som indeholder genet for I

I chloramphenicol-resistens, som er udtrykkeligt i både E. coli og B. subtilis: S. I

I Ehrlich, Proc. Natl Acad. Sd. (USA) 74:1680; S. Horynuchi et al, 1982, J. Bac- , I

I 25 teriol 150:815. I

I pBS42 indeholder således replikationsoriginer, som er operable både i E. coli I

og i Bacillus, og et udtrykkeligt gen for chloramphenicol-resistens. I

I EKSEMPEL 5 (ikke ifølge opfindelsen) I

I Isolering og sekvensbestemmelse af B. subtilis subtilisin-qenet I

17 DK 175768 B1

Kromosomal DNA fra B. subtilis 1168 blev nedbrudt med EcoRI og fragmenterne adskilt ved gelelektrophorese. Et enkelt 6 kb fragment hybridiserede til et [a-32P]-nicktranslationsmærket fragment opnået fra C-enden af subtilisin-struktur-genet i pS4, som er beskrevet ovenfor. 6 kb fragmentet blev elektroelueret og 5 ligeret ind i pBS42, som var blevet nedbrudt med EcoRI og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. E. coli ATCC 31446 blev transformeret med ligeringsblandingen, og transformanter selekteret ved vækst på LB-agar indeholdende 12,5 pg chloramphenicol/mL. Plasmid-DNA blev præpareret fra en sammenhældt suspension af 5000 transformerede kolonier. Denne DNA blev trans-10 formeret ind i B. subtilis BG84, en protease-deficient stamme, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 8 nedenfor. Kolonier, som producerede protease, blev screenet ved udsåning på LB-agar +1,5 vægt-% Camation-pulveriseret ikke- ’ fedtholdig skummetmælk og 5 pg chloramphenicol/mL (i det følgende betegnet skummetmælksselektionsplader) og iagttagelse for klarhedszoner, som er bevis 15 på proteolytisk aktivitet.

Plasmid-DNA blev præpareret ud fra proteaseproducerende kolonier, nedbrudt med EcoRI og undersøgt ved Southem-analyse for tilstedeværelsen af 6 kb EcoRI-indsætningen ved hybridisering til det 32P-mærkede C-ende-fragment af subtilisin-strukturgenet fra B. amyloliquefaciens. En positiv klon blev identifice-20 ret, og plasmidet blev betegnet pS168.1. B. subtilis BG84 transformeret med pS168.1 udskilte serinprotease i et niveau 5 gange over det, som blev produceret i B. subtilis 1168. Tilsætning af EDTA til supernatanteme påvirkede ikke prøvningsresultaterne, men tilsætning af PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) til supernatanteme reducerede proteaseaktiviteten til ikke-sporbare niveauer ved 25 den prøvning, som er beskrevet i eksempel 8 for stamme BG84.

Et restriktionskort over 6,5 kb EcoRI-insætningen er vist i fig. 6. Subtilisin-genet blev lokaliseret til inden for 2,5 kb Kpnl-EcoRI-fragmentet véd subkloning af for-I skellige restriktionsenzym-nedbrydninger og prøvning for ekspression af subtili- sin i B. subtilis BG84. Southern-analyse med det mærkede fragment fra C-30 enden af B. amyloliquefaciens subtilisin-genet som sonde lokaliserede C-enden af B. subtilis-genet til inden for eller en del af 631 bp Hincll-fragment B i midten af denne subklon (se fig. 6). De på hinanden følgende Hinell-fragmenter B, C og D og HincIl-EcoRI-fragment E (fig. 6) blev ligeret ind i M13-vektoreme mp8 eller mp9 og sekvensbestemt på kendt måde (J. Messing et al., 1982, Gene

I DK 175768 B1 I

I i

19:209-276) under anvendelse af dideoxykædeafslutningsmetoden (F. Sanger I

et al., 1976, Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467). Sekvensen af dette I

område er vist i fig. 7. De første 23 aminosyrer antages at være et signalpeptid. I

De resterende 82 aminosyrer mellem signalsekvensen og den modne kodese- I

5 kvens udgør den formentlige "pro"-sekvens. De understregede nucleotider ved I

3-enden af genet antages at være transkriptionsterminatorområder. To mulige I

Shine-Dalgarno-sekvenser er understreget ovenfor den modne startcodon. : I

I EKSEMPEL 6 (ifølge opfindelsen) I

Frembringelse af en inaktiverende mutation af B. subtilis subtilisin-qenet I

10 En to-trins ligering, vist i fig. 8, var nødvendig for at konstruere et plasmid bæ- I

rende et defekt gen, som ville integreres i Bacillus-kromosomet. I det første trin I

blev pS168.1, som indeholdt den 6,5 kb indsætning, der oprindeligt blev udvun- I

I det fra det genomiske B. subtilis bibliotek som beskrevet i eksempel 5 ovenfor, I

I nedbrudt med EcoRI, reaktionsprodukterne behandlet med Klenow, DNA’en I

I 15 nedbrudt med Hindi, og EcoRI-Hindl-fragment E på 800 bp (se fig. 6), som I

I delvis indeholder 5-enden af B. subtilis subtilisin-genet, blev udvundet. Dette I

I fragment blev ligeret ind i pJH101 (pHJ101 kan fås fra J. Hoch (Scripps) og er I

I beskrevet af F. A. Ferrari et al., 1983, J. Bact. 134:318-329), som var blevet I

I nedbrudt med Hindi og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Det re- I

I 20 suiterende plasmid, plDV1, indeholdt fragment E i den i fig. 8 viste orientering. I I

det andet trin blev pS168.1 nedbrudt med Hindi, og Hindl-fragment B på 700 I

I bp, som indeholder 3-enden af subtilisin-genet, blev udvundet. plDV1 blev spal- I

I tet ved dets unikke Hincll-site, og fragment B ligeret til det lineariserede I

plasmid, transformeret ind i E. coli ATCC 31446 og selekteret på LB-plader in- I

I 25 deholdende 12,5 pg chloramphenicol/mL eller 20 pg ampicillin/mL. Et resulte- I

I rende plasmid, betegnet plDV1.4, indeholdt fragment B i den korrekte oriente- I

I ring med hensyn til fragment E. Dette plasmid, plDV1.4, vist i fig. 8, er et dele- I

tionsderivat af subtilisin-genet, der også indeholder dele af 5' og 3-flankerende I

sekvenser. I

I 30 B. subtilis BG77, en delvis protease-deficient mutant (Prt+/'), fremstillet i eksem- I

I pel 8 nedenfor, blev transformeret med plDV1.4. Der blev opnået to klasser af I

chloramphenicol-resistente (Cmr) transformanter. 75% viste det samme niveau I

I af proteaser som BG77 (Prt+/*) og 25% var næsten fuldstændigt protease- I

19 DK 175768 B1 deficiente (Prt*) som iagttaget ved relative klaringszoner på plader indeholdende LB-agar plus skummetmælk. Cmr-Prt*-transformanterne kunne ikke skyldes en enkelt krydsintegration af plasmidet ved de homologe områder for fragment E eller B, fordi genet i så fald ville være uden afbrydelse, og fænotypen ville være 5 Prt+/\ Faktisk blev den protease-deficiente fænotype ikke iagttaget, når det ene eller det andet af fragmenterne E eller B blev ligeret uafhængigt ind i pHJ101 og derefter transformeret ind i B. subtilis BG77. Cmr-fænotypen af Cmr-Prf- | plDVM .4-transformanter var ustabil, idet Cms-Prt*-derivater kunne isoleres fra Cmr-Prt*-kulturer i en hyppighed på omkring 0,1% efter 10 generationers vækst i 10 minimalmedium i fravær af antibiotisk selektion. Et sådant derivat blev opnået og betegnet BG2018. Deletionen blev overført til IA84 (en BGSC-stamme bærende to auxotrophe mutationer flankerende subtilisin-genet) ved PBS1-transduktion. Derivatorganismen blev betegnet BG2019.

EKSEMPEL 7 (ikke ifølge opfindelsen) 15 Fremstilling af et qenomisk DNA-bibliotek fra B. subtilis oq isolering af dens neutral-protease-qen

Den delvise aminosyresekvens af en neutral protease fra B. subtilis er angivet af P. Levy et al., 1975, Proc. Nat. Acad. Sti. USA 72:4341-4345. Fra denne publicerede sekvens (τ'! udvalgtes et område af enzymet (Asp Gin c 20 Met Ile Tyr Gly), hvori der fandtes den mindste redundans i de VA/ potentielle codoner for aminosyrerne i området. 24 kombinationer var nødvendige for at dække alle de potentielle kodesekvenser som beskrevet nedenfor.

GA (i) CA (? ) AT G AT TA (J) GG

25 Asp Gin Met Ile Tyr Gly

Fire puljer, som hver indeholdt seks alternativer, blev fremstillet som beskrevet ovenfor i eksempel 1. Puljerne blev mærket ved phosphorylering med [y-32P] ATP.

Den mærkede pulje indeholdende sekvenser, der stemte nærmest overens med 30 en unik sekvens i et B. subtilis genom, blev selekteret ved nedbrydning af B.

I DK 175768 B1 I

I I

I subtilis DNA (1A72, Bacillus Genetic Stock Center) med forskellige restriktions- I

I enzymer, adskillelse af nedbrydningerne på en elektrophoresegel og hybridise- I

ring af hver af de fire sondepuljer til hver af de afduppede nedbrydninger under I

I stadig mere stringente betingelser, indtil et enkelt bånd sås at hybridisere. Sta- I

I 5 dig mere stringente betingelserer sådanne, som har tendens til at modvirke hy- I

I bridisering, f.eks. forøgelser i formamid-koncentration, nedsættelser i saltkon- I

I centration og forøgelser i temperatur. Ved 37 °C i en opløsning af 5x Denhardt's I

I medium, 5 x SSC, 50 mM NaP04 (pH 6,8) og 20% formamid, ville kun pulje 4 I

hybridisere til en afduppet nedbrydning. Disse blev selekteret som de rigtige

I i 10 hybridiseringsbetingelser til anvendelse for neutral-protease-genet, og pulje 4 I

i blev anvendt som sonden. I

I ' Et lambda-bibliotek af B. subtilis stamme BGSC 1-A72 blev fremstillet på kon- I

I ventionel måde ved delvis nedbrydning af den Bacillus-genomiske DNA med I

I Sau3A, adskillelse af den delvise nedbrydning efter molekylvægt på en elek- I

I 15 trophoresegel, eluering af 15-20 kb fragmenter (R. Lawn et al., 1981, Nucleic I

I Acids Res. 9:6103-6114) og ligering af fragmenterne til BamHI-nedbrudt charon I

I 30 fag under anvendelse af af et "Packagene kit" fra Promega Biotec. I

I E. coli DP50supF blev anvendt som vært for fagbiblioteket, selv om enhver I

I kendt vært for charon-lambda-fag er tilfredsstillende. E. coli værten blev udsået I

I 20 med biblioteksfagen og dyrket, hvorefter plakker blev prøvet for tilstedeværel- I

I sen af neutral-protease-genet ved overførsel til nitrocellulose og screening med I

I sondepulje 4 (Benton and Davis, 1977, Science 196:180-182. Positive plakker I

I blev renset igennem to runder af enkelt-plak-rensning, og to plakker betegnet I

I ! λΝΡΡΘΙ og XNPRG2, blev valgt til yderligere undersøgelser. DNA blev præpa- I

I I 25 reret for hver fag ved restriktionsenzymhydrolyse og adskillelse på elektropho- I

I resegeler. De adskilte fragmenter blev afduppet og hybridiseret til mærkede pul- I

I je-4-oligonucleotider. Dette afslørede, at XNPRG1 indeholdt et 2400 bp Hindlll- I

I hybridiserende fragment, men intet 4300 bp EcoRI-fragment, medens λNPRG2 I

I indeholdt et 4300 bp EcoRI-fragment, men intet 2400 bp Hind I Il-fragment. I

I 30 λΝΡΡΰΙ-fragmentet på 2400 bp blev subklonet ind i Hindlll-sitet af pJH101 ved I

I den følgende metode. λΝΡΗΰΙ blev nedbrudt med Hindlll, nedbrydningen blev I

I fraktioneret ved elektrophorese, og 2400 bp fragmentet udvundet fra gelen.

I Fragmentet blev ligeret til alkalisk-phosphatase-behandlet Hindlll-nedbrudt 21 DK 175768 B1 pJH101, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli ATCC 31446 ved calciumchlorid-shock-metoden beskrevet af V. Hershfield et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 79:3455-3459). Transformanter blev identificeret ved selektering af kolonier, som var i stand til at vokse på plader inde-5 holdende LB-medium + 12,5 pg chloramphenicol/mL.

Transformantkolonierne gav flere plasmider. Orienteringen af 2400 bp fragmentet i hvert plasmid blev bestemt ved konventionel restriktionsanalyse (orienteringen er meningsaflæsningen eller transkriptionsretningen af genfragmentet i forhold til læseretningen af den ekspressionsvektor, hvori det er ligeret ind). Der 10 blev opnået to plasmider med modsatte orienteringer, som blev betegnet pNPRsubH6 og pNPRsubHI.

4300 bp EcoRI-fragmentet fra XNPRG2 blev subklonet ind i pBR325 ved den metode, som er beskrevet ovenfor for 2400 bp fragmentet, undtagen at XNPRG2 blev nedbrudt med EcoRI, og at plasmidet var alkalisk-phosphatase-15 behandlet, EcoRI-nedbrudt pBR325. pBR325 er beskrevet af F. Bolivar, 1978,

Gene 4:121-136. Der blev identificeret to plasmider, hvori 4300 bp indsætningen var tilstede i forskellige orienteringer. Disse to plasmider blev betegnet pNRPsubRI og pNPRsubRIb.

EKSEMPEL 8 (ifølge opfindelsen) 20 Karakterisering af B. subtilis neutral-orotease-gen pNPRsubHI -indsætningen blev sekventielt nedbrudt med forskellige restrik-tionsendonucleaser og afdupningshybridiseret med mærket pulje 4 for at fremstille et restriktionskort over indsætningen (m.h.t. almene procedurer for restriktionskortlægning se T. Maniatis et al., ibid., side 377). Et 430 bp Rsal-fragment 25 var det mindste fragment, som hybridiserede til sondepulje 4. Rsal-fragmentet blev ligeret ind i Smal-sitet i M13 mp8 (J. Messing et al., 1982, Gene 19:269-276 og J. Messing i Methods in Enzymology, 1983, R. Wu et al., Eds., 101:20-78), og sekvensen blev bestemt ved kædeafslutnings-dideoxy-metoden (F.

Sanger et al., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467). Andre restrik-30 tionsfragmenter fra pNPRsubHI -indsætningen blev ligeret ind i passende sites i M13 mp8 eller M13 mp9 vektorer, og sekvenserne blev bestemt. Som krævet, anvendtes dITP til at reducere kompressionsartefakter (D. Mills et al., 1979,

I DK 175768 B1 I

I 22 I

Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A) 76:2232-2235). Restriktionskortet for I

pNPRsubHI-fragmentet er vist i fig. 9. Sekvenserne af de forskellige fragmenter I

I fra restriktionsenzymnedbrydninger blev sammenlignet, og en åben læseramme I

spændende over en codonsekvens, som er translaterbar til amino- og carboxyl- I

I 5 enderne af proteasen (P. Levy et al., ibid.), blev bestemt. En åben læseramme I

er en DNA-sekvens begyndende ved et kendt punkt, som i læseramme (hver tre I

I nucleotider) ikke indeholder nogen indre afslutningscodoner. Den åbne læse- I

I ramme strakte sig forbi amino-enden til enden af 2400 bp Hind I Il-fragmentet. I

I Bglll-Hindlll-fragmentet på 1300 bp blev fremstillet ud fra pNPRsubRIb (som in- I

I 10 deholdt 4300 bp EcoRI-fragmentet af XNPRG2) og klonet ind i M13 mp8. Se- I

I kvensen af dette fragment, som indeholdt den portion af neutral-protease- I

I lederområdet, som ikke var indkodet af 2400 bp fragmentet af pNPRsubHI, I

I blev bestemt for 400 nucleotider opad fra Hindlll-sitet. I

I Hele nucleotidsekvensen som bestemt for dette neutral-protease-gen, inklusive I

15 den formodede sekretorisk-leder- og præpro-sekvens, er vist i fig. 10. Tallene I

I over linien henfører til aminosyrepositioner. De understregede nucleotider i fig. I

I 10 antages at udgøre ribosombindings-(Shine-Dalgamo)-sitet, medens nucleo- I

tiderne med streg over udgør en potentiel hårnål-struktur, som antages at være I

I en terminator. De første 27-28 af de afledte aminosyrer antages at være signa- I

I 20 let for den neutrale protease, med et spaltningspunkt ved ala-27 eller ala-28.

"Pro"-sekvensen af en proenzymstruktur strækker sig til den aminoterminal I

I aminosyre (ala-222) af det modne aktive enzym. I 1

Et høj-kopi-plasmid bærende hele neutral-protease-genet blev konstrueret (fig.

11) ved ligering af Bglll-fragmentet af pNPRsubRI, som indeholder 1900 bp (fig. I

I 25 9), med Pvull-Hindlll-fragmentet af pNPRsubHI, som indeholder 1400 bp. I

I pBS42 (fra eksempel 4) blev nedbrudt med BamHI og behandlet med bakteriel I

I alkalisk phosphatase for at forhindre plasmid-recirkulanisering. pNPRsubRI I

I blev nedbrudt med Bglll, 1900 bp fragmentet blev isoleret fra gelelektrophorese I

I og ligeret til de åbne BamHI-sites i pBS42. Det ligerede plasmid blev anvendt til I

I 30 at transformere E. coli ATCC 31446 ved calciumchlorid-shock-metoden (V. I

I Hershfield et al., samme), og transformerede celler blev selekteret ved vækst I

I på plader indeholdende LB-medium med 12,5 pg/ml chloramphenicol. Et I

I plasmid med Bglll-fragmentet i den i fig. 11 viste orientering blev isoleret fra I

I transformanterne og betegnet pNPRsubBI. pNPRsubBI blev nedbrudt (lineart- I

9 23 DK 175768 B1 seret) med EcoRI, repareret til stumpe ender ved Klenow behandling og derpå 1 ! nedbrudt med Hindlll. Det største fragment fra Hindlll-nedbrydningen (indehol dende sekvensen, der koder for det aminoterminale område og området ovenfor) blev udvundet.

5 Det carboxylterminale område af genet blev leveret af et fragment fra pNPRsubHI, opnået ved nedbrydning af pNPRsubHI med Pvull og Hindlll og

S

udvinding af 1400 bp fragmentet. Den stumpe Pvull-ende og Hindlll-sitet i 1400 bp fragmentet blev ligeret til henholdsvis det udfyldte EcoRI-site og Hindlll-sitet i pNPRsubBI, som vist i fig. 11. Denne konstruktion blev anvendt til at transfor-j 10 mere B. subtilis stamme BG84, som ellers ikke udskilte proteolytisk aktivitet ved j de nedenfor beskrevne prøvninger. Transformanter blev selekteret på plader indeholdende LB-medium + 1,5% fedtfrit "Carnation’-mælkepulver og 5 pg/mL ! chloramphenicol. Plasmider fra kolonier, som klarede en stor ring, blev analyse ret. Plasmid pNPR10, som indeholder strukturgenet og flankerende områder af 15 neutral-protease-genet blev ved restriktionsanalyse bestemt at have den i fig.

11 viste struktur.

B. subtilis stamme BG84 blev frembragt ved N-methyl-N'-nitro-N-! nitrosoguanidin-(NTG) mutagenese af B. subtilis 1168 ifølge den almene teknik I beskrevet af Adelberg et al., 1965, "Biochem. Biophys. Res. Commun." 18:788- 20 795. Den mutagenerede stamme 1168 blev udsået på skummetmælksplader (uden antibioticum). Kolonier som frembragte en mindre ring, blev opsamlet til yderligere analyse. Hver koloni blev karakteriseret for proteaseproduktion på skummetmælksplader og amylaseproduktion på stivelsesplader. Et sådant iso-lat, som var delvis protease-deficient, amylase-positivt og i stand til at sporulere, 25 blev betegnet BG77. Proteasedeficiens-mutationen blev betegnet prt-77. prt-77-allelen blev flyttet til en spoOA-baggrund ved kongression som beskrevet nedenfor til frembringelse af stamme BG84, en sporuleringsdeficient stamme.

TABEL A

Stamme Relevant genotype_ Oprindelse_ 30 1168 trpC2 JH703 trpC2, pheA12, spoOAA677 Trousdale et al.a BG16 purB6, metB5, leuA8, lys-21, hisA, thr-5 Pb 1665 sacA321 BG77 trpC2, prt-77 NTGxl168

I DK 175768 B1 1 I

Η

I 24 I

I j BG81 metB5, prt-77 BG16-DNA x BG77 I

: BG84 spo0677, prt-77 JH703-DNA x BG81 I

I 3 Mol. Gen. Genetics 173:61 (1979). I

I BG84 var fuldstændigt uden proteaseaktivitet på skummetmælksplader og pro- ι I

i 5 ducerer ikke detekterbare niveauer af hverken subtilisin eller neutral protease, : I

I : når den prøves ved måling af ændringen i absorbans ved 412 nm/minut efter I

I inkubering med 0,2 pg/mL succinyl-(-L-ala-L-ala-L-pro-L-phe)-p-nitroanilid (Ve- I

I i ga) i 0,1 M natriumphosphat (pH 8) ved 25 °C. BG84 blev deponeret i ATCC I

I under deponeringsnummeret 39382 den 21. juli 1983. Prøver til subtilisinprøv- I

10 ning blev taget fra supematanter af sen logaritmisk vækstfase af kulturer dyrket I

I i modificeret Schaeffer's medium (T. Leighton et al., 1971, J. Biol. Chem. I

I 246:3189-3195). I

I EKSEMPEL 9 (ifølge opfindelsen) I

Ekspression af neutral-orotease-genet I

I 15 BG84 transformeret med pNPRIO blev indpodet i minimalmedier suppleret med I

0,1% caseinhydrolysat og 10 pg chloramphenicol og dyrket i 16 timer. 0,1 mL I

I kultursupernatant blev udtaget og sat til en suspension af 1,4 mL/mL "Azocoll” I

I proteolytisk substrat (Sigma) i 10 mM "Tris'-HCI, 100 mM NaCI (pH 6,8) og in- I

I kuberet under omrøring. Unedbrudt substrat blev fjernet ved centrifugering, og I

20 den optiske tæthed blev aflæst ved 505 nm. Baggrundsværdier af en "Azocoll"- I

I substrat-suspension blev trukket fra. Mængden af protease udskilt af en stan- I

I dard protease-udtrykkende stamme, BG16, blev anvendt til at fastlægge et ar- I

I bitrært niveau på 100. Resultaterne med BG16 og med BG84 transformeret I

Η H

med kontrolplasmider og neutral-protease-gen-holdige plasmider er vist i tabel I

I 25 B i eksempel 12 nedenfor. Transformation af B. subtilis stamme BG84, som ik- I

I ke udskiller protease, resulterer i udskillelse af proteaseaktivitet i betydeligt hø- I

; jere niveauer end for BG16, vildtype-stammen. I

I EKSEMPEL 10 (ifølge opfindelsen) I

I Frembringelse af en inaktiverende mutation af neutral-protease-aenet I

25 DK 175768 B1

De to Rsal-afgrænsede områder i 2400 bp indsætningen i pNPRsubHI, på i alt 527 bp, kan deleteres for at frembringe et ufuldstændigt strukturgen. Translati-onsprodukteme af dette gen er enzymatisk inaktive. Et plasmid med denne deletion blev konstrueret som følger. pJH101 blev spaltet ved nedbrydning med 5 Hindlll og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Fragmenterne af neu-tral-protease-genet til inkorporering i lineariseret pHJ101 blev opnået ved nedbrydning af pNPRsubHI med Hindlll og Rsal og udvinding af 1200 bp Hindlll-Rsal og 680 bp Rsal-Hindlll fragmenterne ved gelelektrophorese. Disse fragmenter blev ligeret ind i lineariseret pHJ101 og anvendt til at transformere E. co-10 li ATCC 31446. Transformanter blev selekteret på plader indeholdende LB- medium og 20 pg ampicillin/mL. Plasmider blev udvundet fra transformanteme og prøvet ved restriktionsenzymanalyse for at identificere et plasmid med de to fragmenter i den samme orientering som i pNPRsubHI-udgangsplasmidet. Plasmidet, der mangler de indre Rsal-fragmenter, blev betegnet pNPRsubHI Δ.

15 EKSEMPEL 11 (ifølge opfindelsen)

Erstatning af neutral-protease-qenet med en deletionsmutant

Plasmidet pNPRsubHIA blev transformeret ind i B. subtilis stamme BG2019 (den subtilisin-deleterede mutant fra eksempel 6), og kromosomale integranter blev selekteret på skummetmælksplader. Der blev bemærket to typer af Cmr-20 transformanter, dem med udgangsniveauer af proteolyse omkring kolonien, og dem med næsten ingen proteolyse-zone. De, der manglede proteolyse-zone, blev opsamlet, udstrøget igen for at rense individuelle kolonier, og deres pro-tease-deficiente karakter på skummetmælksplader blev bekræftet. En af de pro-teolyse-deficiente Cmr-kolonier blev valgt til yderligere undersøgelser (betegnet 25 BG2034). Spontane Cms-revertanter af BG2034 blev isoleret ved vækst natten over i LB-medier uden indhold af Cm, udsåning til isolering af individuelle kolo- * · nier og replika-udsåning på medier med og uden Cm. Tre Cms-revertanter blev isoleret, hvoraf to var protease-proficiente, og en var protease-deficient (betegnet BG2036). Hybridiseringsanalyse af BG2036 bekræftede, at plasmidet var 30 blevet tabt fra denne stamme, sandsynligvis ved rekombination og kun efterlod deletionsfragmenteme af B. subtilisin og neutral protease.

EKSEMPEL 12 (ifølge opfindelsen)

I DK 175768 B1 I

I I

I Fænotype af stammer, der mangler funktionel subtilisin oo neutral protease I

I Væksten, sporuleringen og ekspressionen af proteaser blev undersøgt i stam- I

I mer, der mangler et funktionelt gen for enten den neutrale eller den alkaliske I

I protease eller begge. Ekspressionen af proteaser blev undersøgt ved en kla- I

5 ringszone omkring en koloni på en skummetmælksplade og ved måling af pro- I

I tease-niveaueme i væskekultur-supernatanter (tabel B). En stamme (BG2035) I

I bærende subtilisin-gen-deletionen viste et 30% reduktionsniveau af proteaseak- I

I tivitet og en normalring på skummetmælksplader. Stamme BG2043 bærende I

I det deleterede neutral-protease-gen og aktivt subtilisin-gen og konstrueret ved I

I 10 transformation af BG16 (eksempel 8) med DNA fra BG2036 (eksempel 11) viste I

I en 80% reduktion i protease-aktivitet og kun en lille ring på skummetmælkspla- I

I den. Stamme BG2054, der ansås for ækvivalent med BG2036 (eksempel 11) I

I ved at den bar de foranstående deletioner i begge gener, viste ingen detekter- I

I bar protease-aktivitet ved denne prøvning og ingen detekterbar ring på skum- I

I 15 metmælksplader. Deletionen af et af eller begge protease-geneme havde ingen I

I åbenbar virkning på hverken vækst eller sporulering. Stammer bærende disse I

deletioner havde normale væksthastigheder på både minimal-glucose- og LB- I

medier. Stammerne sporulerede ved frekvenser, som er sammenlignelige med I

I udgangsstammen BG16. Undersøgelse af disse stammers morphologi viste in- I

I 20 gen åbenbare forskelle fra stammer uden sådanne deletioner. I

I TABEL B I

I Virkning af protease-deletioner på protease-ekspression oa sporulering I

Genotype3 Protease-aktivitet %-sporulerinq I

I BG16 vildtype 100 40 I

I 25 BG2035 aprA684 70 20 I

BG2043 nprEA522e 20 20 I

I BG2054 aprA684,nprEA522 ND 45 I

BG84(pBS42) spoOAA677,prt-77 ND I

I BG84(pNPR10) spoOM677,prt-77 3000 - I

30 3 Kun de loci, som er relevante for protease-fænotypen er vist. I

I b Protease-aktivitet er udtrykt i arbitrære enheder, BG16 blev tildelt et niveau I

H på 100. ND angiver, at niveauet af protease ikke var detekterbart ved den an- I

vendte prøvning. I

27 DK 175768 B1 EKSEMPEL 13 (ikke ifølge opfindelsen)

Site-specifik mætninqsmutaqenese af B. amvloliquefaciens subtilisin-qenet ved position 222: fremstilling af genet til kassetteindsætninq i · j i pS4-5, et derivat af pS4 fremstillet ifølge Wells et al., Nucleic Acids Res. 1983, 5 11:7911 -7924, blev nedbrudt med EcoRI og BamHI, og 1,5 kb EcoRI-BamHI- fragmentet blev udvundet. Dette fragment blev ligeret ind i replikativ form M-13 mp9, som var blevet nedbrudt med EcoRI og BamHI (Sanger et al. 1980, J.

Mol. Biol. 143, 161-178; Messing et al. 1981, Nucleic Acids Research 9, 304-321; Messing, J. and Vieira, J. (1982), Gene 19, 269-276). M-13 mp9 fag-10 ligeringeme, betegnet M-13 mp19 SUBT, blev anvendt til at transformere E. coli stamme JM101, og enkeltstrenget fag-DNA blev præpareret fra en 2 mL kultur dyrket natten over. Der blev syntetiseret en oligonucleotid-primer med sekvensen 5’-GTACAACGGTACCTCACGCACGCTGCAGGAGCGGCTGC-3\ 15 Denne primer stemmer overens med sekvensen af subtilisin-gen-fragmentet, ! der koder for aminosyrerne 216-232, undtagen at de 10 bp af codoner for ami-nosyrerne 222-225 var deleteret, og codoneme for aminosyrerne 220,227 og 228 var muteret til at indføre et Kpnl-site 5' for met-222 codonen og et Pstl-site 3’ for met+222 codonen; se fig. 12. Substituerede nucleotider er angivet ved 20 stjerner, de understregede codoner i linie 2 repræsenterer de nye restriktionssites, og den markerede sekvens i linie 4 repræsenterer de indsatte oligonucleo-tider. Primeren (omkring 15 μΜ) blev mærket med [32P] ved inkubation med [γ-32P]-ATP (10 pL i 20 pL reaktionsblanding) Amersham 5000 Ci/mmol, 10218) | og T4-polynucleotidkinase (10 enheder) efterfulgt af ikke-radioaktivt APT (100 !. . 25 μΜ) for at tillade fuldstændig phosphorylering af mutageneseprimeren. Kinasen blev inaktiveret ved opvarmning af phosphoryleringsblånd ingen til 68 °C i 15 minutter.

Primeren blev hybridiseret til M-13 mp9 SUBT som modificeret fra Norris et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 5103-5112 ved at kombinere 5 pL af den mærkede 30 mutageneseprimer (ca. 3 pM), ca. 1 pg M-13 mp19 SUBT skabelon, 1 pL 1 pM M-13-sekvensbetemmelsesprimer (17-mer) og 2,5 pL puffer (0,3 M ’Tris" (pH), 40 mM MgCI2,12 mM EDTA, 10 mM DTT, 0,5 mg/mL BSA). Blandingen blev j opvarmet til 68 °C i 10 minutter og afkølet til stuetemperatur på 10 minutter. Til /

DK 175768 B1 I

anneleringsblandingen tilsattes 3,6 pL 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP og dTTP, I

1,25 pL 10 mM ATP, 1 pL ligase (4 enheder) og 1 pL Klenow (5 enheder). Pri- I

merforlængelses- og ligeringsreaktionen {totalvolumen 25 pL) foregik i 2 timer I

ved 14 °C. Klenow-polymerasen og ligasen blev inaktiveret ved opvarmning til I

5 68 eC i 20 minutter. Den opvarmede reaktionsblanding blev nedbrudt med I

BamHI og EcoRI, og en aliquot af nedbrydningen blev sat på en 6% polyacry- I

lamidgel, og radioaktive fragmenter blev gjort synlige ved autoradiografi. Dette I

viste, at [32P]-mutageneseprimeren faktisk var blevet inkorporeret i EcoRI- I

BamHI-fragmentet indeholdende det nu muterede subtilisin-gen. I

10 Resten af den nedbrudte reaktionsblanding blev fortyndet til 200 pL med 10 mM I

"Tris" (pH8) indeholdende 1 mM EDTA, ekstraheret en gang med en phe- I

nol/chloroform-blanding i volumenforholdet 1:1 og derpå en gang med chloro- I

form, og den vandige fase blev udvundet. Der tilsattes 15 pL 5 mM ammonium- I

acetat (pH 8) sammen med to volumener ethanol for at udfælde DNA'en fra den I

15 vandige fase. DNA’en blev pelleteret ved centrifugering i 5 minutter i mikro- I

centrifuge, og supematanten blev smidt væk. Der tilsattes 300 pL 70% ethanol I

til vaskning af DNA-pillen, vaskeopløsningen blev smidt væk, og pillen lyofilise- I

pBS42 fra eksempel 4 blev nedbrudt med BamHI og EcoRI og renset på en I

20 acrylamidgel for at udvinde vektoren. 0,5 pg af den nedbrudte vektor, 50 pM

ATP og 6 enheder ligase blev opløst i 20 pL ligeringspuffer. Ligeringen foregik I

natten over ved 14 °C. DNA’en blev transformeret ind i E. coli 294 rec+, og I

; transformanteme blev dyrket i 4 mL LB-medium indeholdende 12,5 pg/ml chlo- I

! ramphenicol. Plasmid-DNA blev præpareret fra denne kultur og nedbrudt med I

25 Kpnl, EcoRI og BamHI. Analyse af restriktionsfragmenterne viste, at 30-50% af I

molekylerne indeholdt det forventede Kpnl-site programmeret af mutagene- I

seprimeren. Der blev fremsat den hypotese, at den plasmidpopulation, som ikke I

inkluderede Kpnl-sitet, stammede fra M-13-replikation før bakteriel reparation af I

mutagenesesitet, således at der produceredes en heterogen population af I

30 ΚρηΓ og Kpnl' plasmider i nogle af transformanteme. For at opnåen ren kultur I

af ΚρηΓ plasmidet blev DNA’en transformeret en anden gang ind i E. coli for at I

klone plasmider indeholdende det nye Kpnl-site. DNA blev præpareret fra 16 I

sådanne transformanter, og seks fandtes at indeholde det forventede Kpnl-site. I

H

29 DK 175768 B1

Præparative mængder af DNA blev fremstillet ud fra en af disse seks transfor-manter (betegnet ρΔ222), og restriktionsanalyse bekræftede tilstedeværelse og lokalisering af de forventede Kpnl- og Pstl-site. 40 pg ρΔ222 blev nedbrudt i 300 pL Kpnl-puffer + 30 pL Kpnl (300 enheder) i 1,5 time ved 37 °C. DNA’en blev | 5 udfældet med ethanol, vasket med 70% ethanol og lyofiliseret. DNA-pillen blev optaget i 200 pL Hindll-puffer og nedbrudt med 20 pL (500 enheder) Pstl i 1,5 time ved 37 °C. Den vandige fase blev ekstraheret med phenol/chloroform, og i DNA’en udfældet med ethanol. DNA’en blev opløst i vand og renset ved po- lyacrylamidgel-elektrophorese. Efter elektroeluering af vektorbåndet (120 V i 2 10 timer ved 0 °C i 0,1 gange TBE (Maniatis ét al., ibid.)) blev DNA'en renset ved phenol/chloroform-ekstraktion, ethanolfældning og ethanolvaskning.

Selv om pA222 kunne nedbrydes til fuldførelse (>98%) med enten Kpnl eller Pstl separat, var en omfattende dobbeltnedbrydning ufuldstændig («50%). i Dette kan være et resultat af, at disse sites lå så tæt (10 bp), at nedbrydning I 15 med Kpnl tillod "ånding" af DNA'en i nærheden af Pstl-sitet, dvs. strengsepara tion eller -optrævling. Da Pstl kun vil spalte dobbeltstrenget DNA, kunne strengseparation inhibere efterfølgende Pstl-nedbrydning.

EKSEMPEL 14 (ikke ifølge opfindelsen) ' Liqerinq af oliaonucleotidkassetter ind i subtilisin-aenet 20 10 pM af fire komplementære oligonucleotidpuljer (A-D, tabel 1 nedenfor), som ikke var 5-phosphoryleret, blev anneleret i 20 pL ligase-puffer ved opvarmning i 5 minutter til 68 °C og efterfølgende afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. 1 ; pM af hver anneleret oligonucleotidpulje, ca. 0,2 pg Kpnl og Pstl-nedbrudt :' ρΔ222 opnået i eksempel 13, 0,5 mM ATP, ligase-puffer og 6 enheder T4-DNA- 25 ligase i 20 pL totalvolumen blev omsat natten over ved 14 °C for at ligere pulje-kassetterne ind i vektoren. Der anvendtes et stort overskud af kassetter (ca.

300 x over pA222-enderne) ved ligeringen for at hjælpe til at forhindre intramo-lekylær Kpnl-Kpnl-ligering. Reaktionsblandingen blev fortyndet ved tilsætning af 25 pL 10 mM ’Tris" (pH 8) indeholdende 1 mM EDTA. Blandingen blev annele-30 ret igen for at undgå mulig kassette-concatemer-dannelse ved opvarmning til 68 °C i fem minutter og afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Ligeringsblan-dingeme fra hver pulje blev transformeret separat ind i E. coli 294 rec+ celler.

En lille aliquot fra hver transformationsblanding blev udsået for at bestemme an- 1^·

DK 175768 B1 I

tallet af uafhængige transformanter. Det store antal transformanter tydede på I

en høj sandsynlighed for flerdobbelt mutagenese. Resten af transformanteme I

(ca. 200-400 transformanter) blev dyrket i 4 mL LB-medium + 12,5 pg chlo- I

ramphenicol/mL. DNA blev præpareret fra hver transformationspulje (A-D). I

5 Denne DNA blev nedbrudt med Kpnl, ca. 0,1 pg blev anvendt til retransformere I

E. coli rec+, og blandingen blev udsået for at isolere individuelle kolonier fra I

hver pulje. Ligering af kassetterne ind i genet og bakteriel reparation efter trans-

formation ødelagde Kpnl- og Pstl-sitene. Således blev kun ρΔ222 skåret, når I

transformant-DNA’en blev nedbrudt med Kpnl. Det skårne plasmid ville ikke I

10 transformere E. coli. Individuelle transformanter blev dyrket i kultur, og DNA I

blev præpareret fra 24-26 transformanter pr. pulje til direkte plasmid sekvens- I

bestemmelse. En syntetisk oligonucleotidprimer med sekvensen 5'- I

GAGCTTGATGTCATGGC-3' blev anvendt til at prime dideoxysekvensbestem- I

melsesreaktionen. Mutanterne, som blev opnået, er beskrevet i tabel C neden- I

15 for. I

To codon+222 mutanter (dvs. gin og ile) blev ikke fundet efter den beskrevne I

screening. For at opnå disse syntetiseredes et enkelt 25mert oligonucleotid for I

i hver mutant svarende til den øvre oligonucleotidstreng i fig. 12. Hvert blev I

' phosphoryleret og anneleret til den nedre streng af dets respektive ikke-

20 phosphorylerede oligonucleotidpulje (dvs. pulje A for gin og pulje D for ile). I

Denne blev ligeret ind i Kpnl- og Pstl-nedbrudt ρΔ222 og forarbejdet som be- I

skrevet for de oprindelige oligonucleotidpuljer. Hyppigheden af forekomst for I

enkelte mutanter opnået på denne måde var 2/8 og 0/7 for henholdsvis gin og I

ile. For at undgå denne øjensynlige skævhed blev den øvre streng phosphoryle- I

25 ret og anneleret med dens ikke-phosphorylerede komplementære pulje. Den I

heterophosphorylerede kassette blev ligeret ind i skåret ρΔ222 og forarbejdet I

som før. Hyppigheden af forekomst af gin og ile mutanter var nu henholdsvis I

7/7 og 7/7. I

Datene i tabel C viser en skævhed i hyppigheden af mutanter opnået fra puljer- I

30 ne. Dette skyldes sandsynligvis ulige repræsentation af oligonucleotider i puljen. I

Dette kan være forårsaget af ulige kobling af de bestemte trimere over mutage- I

nesecodonen i puljen. Et sådant skævhedsproblem kunne afhjælpes ved pas- I

sende indstilling af trimere niveauer under syntesen til at afspejle lige reaktion. I - I hvert tilfælde blev mutanter, som ikke var isoleret ved hoved screeningen, opnå- I

31 DK 175768 B1 et ved syntese af et enkeltstrengsoligonucleotid repræsenterende den ønskede mutation, phosphorylering af begge ender, annelering med puljen af ikke-phosphorylerede komplementære strenge og ligering ind i kassettesitet. En skæv heterodupleks reparation iagttaget for den fuldstændigt uphosphorylerede 5 kassette kan stamme fra, at position 222 er nærmere ved 5’-enden af den øvre streng end ved 5'-enden af den nedre streng (se fig. 12). Eftersom der findes et gab ved de uphosphorylerede 5'-ender, og fejltilpasningsboblen i den dobbeltstrengede DNA er ved position 222, ville udskæringsreparation af gabet i den øvre streng lettere holde en cirkulært hybridiseret dobbeltstreng i stand til repli-10 kation. Overensstemmende med denne hypotese er det, at den øvre streng kunne bevares fuldstændigt ved selektiv 5'-phosphorylering. I dette tilfælde indeholdt kun den nedre streng et 5'-gab, som kunne fremme udskæringsrepera-tion. Denne metode er nyttig til dirigering af forskudt inkorporering af syntetiske oligonucleotidstrenge, når der anvendes mutagene oligonucleotidkassetter.

15 EKSEMPEL 15 (ikke ifølge opfindelsen)

Site-specifik mutaqenese af subtilisin-oenet ved position 166 i

Proceduren fra eksemplerne 13 og 14 fulgtes ret detaljeret, undtagen at muta-geneseprimeren var forskellig (der anvendtes den i fig. 13 viste 37mer), de to restriktionsenzymer var Sacl og Xmalll i stedet for Pstl og Kpnl, og de resulte-20 rende konstruktioner var forskellige, som vist i fig. 13.

Bacillus-stammer, som udskiller mutantsubtilisiner muteret ved position 166, blev opnået som beskrevet nedenfor i eksempel 16. Mutantsubtilisineme, der udviser udskiftninger af vildtype-resten med ala, asp, gin, phe, his, lys, asn, arg og val, blev udvundet.

25 EKSEMPEL 16 (ikke ifølge opfindelsen)

Fremstilling af mutant-subtilisin-enzvmer B. subtilis stamme BG2036 opnået ved den i eksempel 11 beskrevne fremgangsmåde blev transformeret med plasmiderne fra eksempel 14,15 eller 20 og med pS4-5 som kontrol. Transfomnanter blev udsået eller dyrket i rystekolber 30 i 16-48 timer ved 37 °C i LB-medier + 12,5 pg/mL chloramphenicol. Enzymatisk

I DK 175768 B1 I

I 32 I

I aktivt mutant-subtilisin blev udvundet ved dialyse af cellevæske over for 0,01 Μ I

I natriumphosphatpuffer (pH 6,2). Den dialyserede væske blev derpå titreret til I

I pH 6,2 med 1 N saltsyre og påført en 2,6 x 2 CM søjle af CM-cellulose ("CM- I

I 52", Whatman). Efter vaskning med 0,01 M natriumphosphat (pH 6,2) blev sub- I

I 5 tilisineme (undtagen mutanter ved position ->-222) elueret med den samme puf·

I fer gjort 0,08 N med hensyn til NaCI. Mutantsubtiiisinerne ved position +222 I

I blev hver elueret med 0,1 M natriumphosphat (pH 7,0). De rensede mutant- og I

I vildtype-enzymer blev derpå anvendt ved undersøgelser af oxidationsstabilitet, - I

I Km, Kcat, Kcat/Km-forhold, pH-optimum og ændringer i substratspecificitet. I

33 DK 175768 B1

TABEL C

Oligonucleotidpulje-organisation og hyppighed af opnåede mutanter Pulje Aminosyrer Codon-2223 Hyppiqhedb A asp GAT 2/25 5 met ATG 3/25 cys TGT 13/25 arg AGA 2/25 gin G AA 0/25 uventede mutanter3 5/25 10 B leu CTT 1/25 pro CCT 3/25 phe TTC 6/25 tyr TAC 5/25 his CAC 1/25 15 uventede mutanter 9/25 C glu GAA 3/17 ala GCT 3/17 thr ACA 1/17 lys AAA 1/17 20 asn AAC 1/17 uventede mutanter 8/17 ! D gly GGC 1/23 trp TGG 8/23 ile ATC 0/23 25 ser AGC 1/23 val GTT 4/23 uventede mutanter 9/23 3 Codoner blev valgt på basis af hyppig anvendelse i den klonede subtili-sin-gen-sekvens (Wells et al. 1983, ibid.).

30 b Hyppigheden blev bestemt ud fra enkeltsporsanalyse ved direkte plasmidsekvensbestemmelse.

c Uventede mutanter omfattede almindeligvis dobbeltmutanter med ændringer i codoner nærmest ved 222 eller ved ligeringspunkterne. Disse blev antaget at stamme fra urenheder i oligonucleotidpuljerne og/eller fejlagtig reparati-35 on af de gabende ender.

DK 175768 B1 I

EKSEMPEL 17 (ikke ifølge opfindelsen) I

Mutantsubtilisin. der udviser forbedret oxidationsstabilitet I

Subtilisiner med cystein og alanin indført i 222-positionen i stedet for vildtypens I

methionin (eksempel 16) blev prøvet for resistens over for oxidation ved inkuba- I

5 tion med forskellige koncentrationer af natriumhypochlorit (Clorox Bleach). I

Til et totalvolumen på 400 pL 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7) indeholdende I

de angivne blegemiddelkoncentrationer (fig. 14) blev tilsat tilstrækkeligt enzym I

til at give en endelig koncentration på 0,016 mg/mL enzym. Opløsningerne blev I

inkuberet ved 25 °C i 10 minutter og prøvet for enzymaktivitet som følger: 120 I

10 pL af enten ala+222 eller vildtypen eller 100 pL af cys+222-inkubationsblan- I

dingen blev kombineret med 890 pL 0,1 M Tris'-puffer ved pH 8,6 og 10 pL af I

en sAAPFpN-(eksempel 18)-substratopløsning (20 mg/mL i DMSO). Hastig- I

hedsforøgelsen i absorbans ved 410 nm på grund af frigørelsen af p-nitroanilin H

(Del Mar, E.G., et al. 1979, Anal. Biochem. 99, 316-320) blev kontrolleret. Re-

15 sultaterne er vist i fig. 14. Udskiftningen med alanin producerede betydeligt me- H

re stabilt enzym end såvel vildtype-enzymet som en mutant, .hvori en labil cy- H

steinrest var indført i stedet for methionin. Overraskende nok indvirkede udskift- H

ningen med alanin ikke væsentligt på enzymaktiviteten over for prøvningssub- I

stratet, men overførte alligevel relativ oxidationsstabilitet på enzymet. Serin I

20 +222-mutanten udviste også forbedret oxidationsstabilitet. i I

EKSEMPEL 18 (ikke ifølge opfindelsen) I

Mutantsubtilisiner der udviser modificerede genetiske egenskaber og substrat- I

specificitet I

Forskellige mutanter for glycin+166 blev screenet for modificerede Kcat, Km og I

25 Kcat/Km-forhold. Kinetiske parametre blev opnået ved analyse af kurverover I

reaktionernes fremadskriden. Reaktionshastigheden blev målt som funktion af ' I

substratkoncentration. Data blev analyseret ved tilpasning til Michaelis-Menton- I

ligningen under anvendelse af Marquardt's ikke-lineære regressionsalgorithme I

(Marquardt, D. W. 1963, J. Soc. Ind. Appl. Math. 11, 431-441). Alle reaktioner I

30 blev gennemført ved 25 °C i 0,1 M "Tris,,-puffer (pH 8,6) indeholdende benzoyl- I

L-valyl-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid (BVGRpN; Vega Biochemicals) i begyndel- ; I

35 DK 175768 B1 seskoncentrationer på 0,0025 M til 0,00026 M (afhængigt af værdien af Km for det interessante enzym blev koncentrationerne indstillet i hver måling, således at de overskred Km) eller succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (sAAPFpN; Vega Biochemicals) i begyndelseskoncentrationer på 5 0,0010 M til 0,00028 M (varierende som beskrevet for BVGRpN).

Resultaterne, der blev opnået ved disse forsøg, var som følger:

TABEL D

Substrat Enzym Kcat (s~1) Km (M) Kcat/Km sAAPFpN gly-166 (vildtype) 37 1,4x 104 3x 105 10 ala+166 1 9 2,7 x 105 7x 105 asp+166 3 5,8 x104 5x103 glu+166 11 3,4 x104 3x104 phe+166 3 1,4 x105 2x105 hys+166 1 5 1,1 x104 1 x 105 15 lys+166 15 3,4 x105 4x105 asn+166 26 1,4x104 2x105 arg+166 19 6,2 x105 3x105 val+166 1 1,4 x104 1 x104 BVGRpN vildtype 2 1,1 x 103 2x 103 20 asp+166 2 4,1 x105 5x104 glu+166 2 2,7 x105 7x104 asn+166 1 1,2 x104 8x103

Kcat/Km-forholdet for hver af mutanterne varierede fra forholdet for vildtype-enzymet. Som et mål for katalytisk effektivitet viser disse forhold, at enzymer 25 med meget højere aktivitet over for et givet substrat let kan udformes og selekteres ved screening i overensstemmelse med denne opfindelse. F.eks. udviser A166 over to gange aktiviteten af vildtypen på sAAPFpN.

Disse data påviser også ændringer i substratspecificitet efter mutation af vildty-pe-enzymet. F.eks. er Kcat/Km-forholdet for mutanterne D166 og E166 højere 30 end for vildtype-enzymet med BVGpN-substratet, men kvalitativt modsatte resultater blev opnået ved inkubation med sAAPFpN. I overensstemmelse hermed var mutanterne D166 og E166 relativt mere specifikke for BVGRpN end for sAAPFpN.

I DK 175768 B1 I

I 36 I

EKSEMPEL 19 (ikke ifølge opfindelsen) I

I Mutantsubtilisin, der udviser modificeret pH-aktivitetsprofil I

I pH-profilen af den i eksempel 16 opnåede cys+222-mutant blev sammenlignet I

I med profilen af vildtype-enzymet, 10 pL 60 mg/mL sAAPFpN i DMSO, 10 pL I

I 5 Cys+222 (0,18 mg/mL) eller vildtype (0,5 mg/mL) blev kombineret med 980 pL I

I puffer (til målinger ved pH 6,6, 7,0 og 7,6; 0,1 M natriumphosphatpuffer; ved pH I

I 8,2, 8,6 og 9,2; 0,1 M "Tris"-puffer; og ved pH 9,6 og 10,0; 0,1 M glycin-puffer), I

I hvorefter begyndelseshastigheden af ændring i absorbans ved 410 nm pr. mi- I

I nut blev målt ved hver pH-værdi, og dataene afsat på en kurve som vist i fig. 15. I

I 10 Cys+222-mutanten udviser et skarpere pH-optimum end vildtype-enzymet. I

I EKSEMPEL 20 (ikke ifølge opfindelsen) I

Site-specifik mutaqense af subtilisin-genet ved position 169 I

Proceduren fra eksemplerne 13 og 14 blev fulgt ret detaljeret, undtagen at mu- I

tageneseprimeren var forskellig (der anvendtes den i fig. 16 viste primer), de to I

15 restriktionsenzymer var Kpnl og EcoRV i stedet for Pstl og Kpnl, og de resulte- I

I rende konstruktioner var forskellige, som vist i fig. 16. I

Bacillus-stammer, der udskilte mutantsubtilisiner muteret ved position 169, blev I

opnået som beskrevet i eksempel 16. Mutantsubtilisinerne, som havde fået vild- I

I type-resten udskiftet med ala og ser, blev udvundet og prøvet for ændringer i I

20 kinetiske egenskaber. Prøvningen anvendte sAAPFpN ved pH 8,6 på samme I

måde som angivet i eksempel 18. Resultaterne var som følger: I

TABEL E I

I Enzym Kcat (s'1) Km (Ml Kcat/Km I

I ala+169 58 7,5 x10'5 8x 105 I

25 ser+169 38 8,5 x10'5 4x 105 I

DK 175768 B1 37 EKSEMPEL 21 (ikke ifølge opfindelsen) Ændringer i specifik aktivitet på et proteinsubstrat

Position 166-mutanter fra eksemplerne i 5 og 16 blev prøvet for ændring af specifik aktivitet på et naturligt forekommende proteinsubstrat. Eftersom disse 5 mutantproteaser kunne udvise ændret specificitet såvel som ændret specifik aktivitet, skulle substratet indeholde tilstrækkeligt mange forskellige spaltningssites, dvs. sure, basiske, neutrale og hydrophobe, for ikke at forskyde prøvningen henimod en protease med én type specificitet. Substratet skulle også være frit for derivatiserede rester, som resulterer i maskering af visse spaltningssites. De 10 vidt og bredt anvendte substrater, såsom hæmoglobin, azocollogen, azocasein, dimethylcasein osv., blev forkastet på denne basis. Oksecasein, a- og cx2-kæder, blev valgt som et egnet substrat.

Der fremstilledes en 1% (vægt/vol.) caseinopløsning i en 100 mM Tris"-puffer (pH 8,0), 10 mM EDTA. Prøvningsprotokollen er som følger: 15 790 pL 50 mM "Tris" (pH 8,2) 100 pL 1 % caseinopløsning (Sigma) 10 pL prøveenzym (10-200 pg).

Denne prøvningsblanding blev sammenblandet og fik lov at inkubere ved stuetemperatur i 20 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 100 pL 20 100% trichloreddikesyre, efterfulgt af ihkubation i 15 minutter ved stuetempera tur. Det udfældede protein blev pelleteret ved centrifugering, og supernatantens optiske tæthed blev bestemt spektrofotometrisk ved 280 nm. Den optiske tæthed er en afspejling af mængden af ikke-udfældet, dvs. hydrolyseret, casein i reaktionsblandingen. Den mængde casein, som blev hydrolyseret af hver mu-25 tantprotease, blev sammenlignet med en række standarder indeholdende forskellige mængder af vildtype-proteaseme, og aktiviteten udtrykkes som procent af den tilsvarende vildtype-aktivitet. Enzymaktiviteter blev omregnet til specifik aktivitet ved division af caseinhydrolyseaktiviteten med absorbansen ved 280 nm af den enzymopløsning, som anvendtes ved prøvningen.

30 Alle mutanterne, som blev prøvet, viste mindre specifik aktivitet på casein end vildtype-enzymet med undtagelse af Asn+166, som var 26% mere aktivt på ca-

I DK 175768 B1 I

I I

sein end vildtype-enzymet. Den mutant, som viste den mindste specifikke aktivi- I

tet, var lle+166 ved 0,184 af vildtype-aktiviteten. I

H

I

I i i

Claims (9)

39 DK 175768 B1

1. En i det væsentlige normalt sporulerende Bacillus-stamme kendetegnet ved. at den indeholder muterede subtilisin- og neutral protease-gener, således at den er ude af stand til at udskille enzymatisk aktiv subtilisin eller neutral protea- 5 se.

2. Bacillus-stamme ifølge krav 1 kendetegnet ved, at mutationerne er ikke-reverterbare.

3. Bacillus-stamme ifølge krav 1 eller 2 kendetegnet ved, at hver mutation omfatter en deletion, der resulterer i manglende ekspression eller i ekspression af 10 et enzymatisk inaktivt polypeptid.

4. Bacillus-stamme ifølge krav 3 kendetegnet ved, at hver deletion er af naturligt forekommende codoner i det respektive gen.

5. Bacillus-stamme ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav som er kendeteoent ved, at den er transformeret med mindst én DNA-del, som koder 15 for et polypeptid, der ikke ellers udtrykkes af Bacillus-arten.

6. Bacillus-stamme ifølge krav 5 kendetegnet ved, at den transformerende DNA koder for en subtilisinmutant eller et eukaryotisk protein.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af protein uden ledsagelse af subtilisin eller neutral protease kendetegnet ved, at man dyrker en Bacillus-stamme ifølge et 20 hvilket som helst af de forudgående krav, indtil der er dannet et protein i kulturen, og udvinder proteinet.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7 kendeteoent ved, at proteinet ikke er subtilisin eller neutral protease.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 kendetegnet ved, at proteinet er amylase.