ES2210281T3 - Produccion transgenica de anticuerpos en la leche. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES EN LA LECHE DE UN MAMIFERO, MEDIANTE LA CREACION DE ANIMALES TRANSGENICOS QUE EXPRESEN SELECTIVAMENTE GENES DE ANTICUERPOS EXTRAÑOS EN CELULAS EPITELIALES MAMARIAS.

Description

Producción transgénica de anticuerpos en la leche.

Campo de la invención

Esta invención pertenece a un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales en la leche de mamíferos, específicamente a través de la creación de animales transgénicos que expresen de manera selectiva genes de anticuerpos extraños en células epiteliales mamarias.

Antecedentes de la invención

Las inmunoglobulinas son proteínas heteropoliméricas que se sintetizan, modifican, ensamblan y emiten de forma normal en los linfocitos B circulantes. Usando tecnología del ADN recombinante, es posible programar células que no sean linfocitos B para expresar genes de inmunoglobulina. Las dificultades encontradas en este esfuerzo surgen de diferentes factores: 1) tanto las cadenas pesadas como las ligeras de inmunoglobulinas deben co-expresarse a los niveles apropiados; 2) los polipéptidos nacientes sufren una variedad de modificaciones co- y post-traslacionales que no tienen lugar con fidelidad o eficiencia suficiente en células heterólogas; 3) las inmunoglobulinas requieren proteínas de chaperona para su ensamblaje; 4) la capacidad sintética y secretoria de la célula puede resultar inadecuada para secretar grandes cantidades de proteínas heterólogas; y 5) las inmunoglobulinas secretadas pueden ser inestables en el medio extracelular de una célula extraña.

Puesto que las inmunoglobulinas tienen muchas aplicaciones terapéuticas, en diagnóstico e industriales, existe una necesidad en la técnica de sistemas de expresión en los cuáles estas proteínas puedan fabricarse de manera reproducible a un alto nivel, en una configuración funcional, y en una forma que permita cosecharlas y purificarlas fácilmente. El desarrollo de la tecnología de animales transgénicos ha dado lugar a la posibilidad de usar animales grandes como fábricas de proteínas genéticamente programadas. La solicitud de patente P.T.C. WO 90/0436 (publicada 19/4/90) describe el uso de la tecnología transgénica para la expresión de inmunoglobulina. Los documentos WO 92/03918 (19/3/92) y WO 93/12227 (24/6/93) muestran la introducción de genes no reordenados de inmunoglobulina en la línea germinal de animales transgénicos. El uso de genes de inmunoglobulina intactos (incluyendo sus regiones promotoras respectivas) repercutirá en su expresión en los linfocitos y en la secreción en la circulación sanguínea del animal huésped; esto requiere una estrategia para suprimir la expresión en las inmunoglobulinas endógenas del huésped, y da lugar al problema de purificar las inmunoglobulinas a partir del suero, que contiene muchas proteínas distintas, incluyendo enzimas proteolíticos. Además, si se elige la hipótesis transgénica, deben incorporarse tanto los genes de las cadenas ligeras como de las pesadas al genoma huésped, de una forma que permita su expresión concomitante.

Otra opción para crear animales transgénicos es ligar el gen de interés a un promotor de transcripción heterólogo que únicamente funcione en un tipo celular definido perteneciente al huésped. De esta forma, puede programarse la expresión del transgén específica del tejido. La Patente de los EEUU nº 4.873.316 (concedida el 10 de Octubre de 1989) describe la producción de activador de tejido plasminógeno recombinante (TPA) en la leche de ratones transgénicos en los que el gen TPA se liga al promotor de la proteína láctea caseína. Entre otras proteínas que se han expresado en forma similar se incluyen el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis cística, (DiTullio y col., Bio/Technology 10:74, 1992), uroquinasa (Meade y col., Bio/Technology 8: 443, 1990), interleucina-2 (Buhler y col., Bio/Technology 8:140, 1990), y el factor antihemofílico IX (Clark y col., Bio/Technology 7:487, 1989). De forma notable, estas proteínas son todas polipéptidos simples de cadena sencilla que no requieren multimerización o ensamblaje antes de la secreción.

Se ha encontrado en la actualidad que cuando se crea un animal mamífero transgénico portando genes de cadenas ligeras y pesadas emparejadas de inmunoglobulina bajo el control del promotor de la caseína, dicho animal produce grandes cantidades de inmunoglobulinas ensambladas que se segregan en su leche. Usando construcciones de ADN de acuerdo con la presente invención se observa de forma sorprendente una co-integración de alta eficiencia entre los genes de cadenas ligeras y pesadas. Usando tales construcciones a partir del procedimiento, es posible por primera vez programar una célula epitelial mamaria para producir y ensamblar glicoproteínas tetraméricas complejas y segregarlas en grandes cantidades.

De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar procedimientos para la producción a gran escala de inmunoglobulinas en la leche de mamíferos transgénicos.

Otro objeto de la invención es proporcionar procedimientos para el diseño de inmunoglobulinas sintéticas que puedan producirse en grandes cantidades en leche.

La presente invención proporcionaría procedimientos para administrar anticuerpos terapéuticamente beneficiosos a lactantes, mediante la creación de mamíferos hembra que excreten dichos anticuerpos en su leche.

La presente invención usa un mamífero no humano transgénico teniendo células germinales y somáticas con secuencias de ADN recombinante codificando cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, en las que las mencionadas secuencias de ligan de forma operativa en su término 5' a un promotor mamario específico y en su extremo 3' a una secuencia comprendiendo un emplazamiento de poliadenilación.

La presente invención usa preferiblemente un casete promotor de caseína comprendiendo en la dirección 5' a 3':

a) 5' secuencias de promotor a partir del gen de beta caseína

b) un emplazamiento de restricción XhoI

c) 3' secuencias no traducidas a partir del gen de beta caseína de cabra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática del plásmido Bc62, que contiene un fragmento Sal I de 13,9 kb que comprende ADNc codificando una cadena ligera de inmunoglobulina, flanqueada en sus termini 5' y 3' por secuencias de beta caseína de cabra.

La Figura 2 es una representación esquemática del plásmido Bc61, que contiene un fragmento Sal I de 14,6 kb que comprende ADNc codificando una cadena pesada de inmunoglobulina, flanqueada en sus termini 5' y 3' por secuencias de beta caseína de cabra.

La Figura 3 representa la detección por inmunotransferencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana en la leche de ratones transgénicos que se crearon usando el promotor de beta caseína ligado a los genes de inmunoglobulina mostrados en Figuras 1 y 2.

La Figura 4 representa la detección por inmunotransferencia de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana en la leche de ratones transgénicos que se crearon usando el promotor de beta caseína ligado a los genes de inmunoglobulina mostrados en Figuras 1 y 2.

Resumen de la invención

En un aspecto, esta invención comprende un procedimiento para obtener inmunoglobulinas heterólogas a partir de la leche de mamíferos transgénicos. La presente invención implica la creación de mamíferos transgénicos introduciendo en su línea germinal ADNc de inmunoglobulina ligado a un promotor lácteo específico.

Dichos animales transgénicos tienen células germinales y células somáticas teniendo secuencias de ADN recombinante comprendiendo ADNc de inmunoglobulina ligado a un promotor lácteo específico.

La presente invención usa preferiblemente un ADN aislado comprendiendo un casete de expresión teniendo secuencias 5' y 3' no codificantes derivadas del gen de beta caseína de cabra ligado mediante un único emplazamiento de restricción que sirve con un emplazamiento de clonación conveniente para secuencias codificando inmunoglobulinas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para obtener una inmunoglobulina heteróloga y ensamblada a partir de la leche de un mamífero transgénico no humano que se caracteriza en que comprende:

(a) introduciendo en la línea germinal del mencionado mamífero ADN comprendiendo de forma separada las secuencias codificadoras de proteína de las cadenas ligera y pesada de la mencionada inmunoglobulina, siendo ligado el ADN de forma operativa a una secuencia de promotor de beta caseína de cabra que soporte la expresión preferencial de la mencionada secuencia codificadora de proteína en células epiteliales de la glándula mamaria y en su término 3' a una secuencia conteniendo un emplazamiento de poliadenilación;

(b) obteniendo leche conteniendo la mencionada inmunoglobulina heteróloga y ensamblada a partir del mencionado mamífero transgénico no humano;

siendo la mencionada inmunoglobulina heteróloga y ensamblada una configuración funcional de beta caseína de cabra y siendo producida a una concentración de al menos 1 mg/ml en la leche del mencionado mamífero.

La presente invención pertenece a un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales que se excretan en la leche de animales transgénicos y al procedimiento para la producción de dichos animales. Esto se consigue diseñando construcciones de ADN en las cuales los segmentos de ADN codifican de forma separada cadenas emparejadas específicas ligeras y pesadas de inmunoglobulina aguas abajo de una secuencia de promotor que se expresa preferentemente en células epiteliales mamarias. Los ADNs recombinantes conteniendo los genes de las cadenas ligeras y pesadas ligadas al promotor se co-inyectan en embriones antes de la implantación. La progenie se somete a cribado buscando la presencia de ambos transgenes. Hembras representativas de estas líneas se ordeñan, y se analiza la leche buscando la presencia del anticuerpo monoclonal. Para considerar que el anticuerpo está presente, los genes de las cadenas pesada y ligera deben expresarse de manera concurrente en la misma célula. Los anticuerpos pueden purificarse a partir de la leche, o bien la leche misma conteniendo los anticuerpos puede usarse para suministrar los anticuerpos a un paciente. Esto se discute más adelante.

Los genes de inmunoglobulina útiles en la presente invención pueden obtenerse a partir de fuentes naturales, por ejemplo, clones individuales de células B o hibridomas derivados de las anteriores. Además, pueden usarse genes de anticuerpo recombinante que se hayan alterado predictivamente mediante sustitución de nucleótidos que produzcan o no produzcan cambios en la secuencia de aminoácidos, por adición o borrado de secuencias, o mediante creación de genes híbridos en los cuales las distintas regiones del polipéptido se deriven de distintas fuentes. Los genes de anticuerpo, por su naturaleza, son extremadamente diversos, y por tanto toleran de forma natural un importante grado de variación. Será apreciado por aquellos expertos en la materia que la única limitación para producir un anticuerpo según el procedimiento de la presente invención es que éste se ensamble en una configuración funcional y se excrete en una forma estable en la leche.

Los promotores de transcripción útiles en la práctica de la presente invención son aquellos promotores que se activen preferentemente en células del epitelio mamario, en particular el promotor derivado del gen de la beta caseína de cabra (DiTullio (1992) Bio/Technology 10:74-77).

Para uso en la presente invención, se introduce un único emplazamiento de restricción XhoI en el término 3' de la secuencia del promotor para permitir la inserción rutinaria de las secuencias codificadoras de inmunoglobulina. Preferiblemente, el gen de inmunoglobulina insertado está flanqueado en su lado 3' por secuencias genómicas cognadas de un gen mamario específico, para proporcionar un emplazamiento de poliadenilación y secuencias de transcripto - estabilización. La transcripción in vivo de la construcción resulta en la producción de un ARNm estable conteniendo secuencias derivadas de caseína 5' no traducidas aguas arriba del codón iniciador de la transducción y secuencias 3' no traducidas aguas abajo del codón terminador de la transducción del gen de la inmunoglobulina. Finalmente, el casete entero (es decir, (promotor - inmunoglobulina - región 3') se flanquea mediante emplazamientos de restricción que permiten que el casete promotor - ADNc se excite fácilmente como un único fragmento. Esto facilita la eliminación de secuencias indeseadas derivadas del ADN del vector procariótico antes de su inyección a los óvulos fertilizados.

El promotor ligado a las cadenas de ADN de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina se introduce a continuación en la línea germinal de un mamífero, por ejemplo vaca, oveja, cabra, ratón, buey, camello o cerdo. Los mamíferos que se definen en la presente invención son todos los animales, humanos excluidos, que tienen glándulas mamarias y producen leche. Se prefieren las especies de mamífero que producen leche en grandes cantidades durante largos periodos de tiempo. Típicamente, el ADN se inyecta en el pronúcleo de óvulos fertilizados, que se implantan a continuación en el útero de una hembra receptora y se prosigue la gestación. Tras el nacimiento, el posible animal transgénico se investiga para buscar la presencia del ADN introducido. Esto se consigue fácilmente mediante hibridación por transferencia Southern del ADN extraído de células sanguíneas u otro tejido disponible, usando como sonda un segmento del gen inyectado que no muestre hibridación cruzada con el ADN de la especie receptora. La progenie que muestre evidencia de al menos una copia de los genes de inmunoglobulina de la cadena gruesa y de la pesada, se seleccionan para análisis con más detalle.

Las hembras transgénicas puede analizarse buscando secreción de inmunoglobulina en la leche, usando cualquiera de las técnicas inmunológicas habituales en la técnica (por ejemplo, transferencia Western, radioinmunoensayo, ELISA). Los anticuerpos de anti-inmunoglobulina usados en este ensayo pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales que detectan cadenas aisladas ligeras o pesadas o distintas que reaccionan únicamente con las inmunoglobulinas completamente ensambladas (H2L2).

Las inmunoglobulinas recombinantes se caracterizan también con relación a su funcionalidad, es decir, especificidad de ligando u afinidad para un antígeno particular. Esto se consigue usando procedimientos inmunológicos habituales en la técnica, tales como análisis de Scatchard, enlace a un antígeno inmovilizado, etc. Las características de estabilidad de una inmunoglobulina en la leche de una especie dada también se ensayan, aplicando los procedimientos de detección anteriormente descritos a leche que se haya incubado durante tiempos crecientes tras su obtención del animal.

Las inmunoglobulinas producidas mediante los procedimientos de la presente invención pueden purificarse a partir de la leche, usando adsorción en Proteína G inmovilizada, cromatografía en columna, y otros procedimientos conocidos por aquellos que sean normalmente expertos en la técnica de la purificación de anticuerpos.

El nivel de producción de inmunoglobulinas recombinantes en un mamífero transgénico individual está determinado principalmente por el emplazamiento y forma de integración del transgén tras la inyección en el óvulo fertilizado. Así, la progenie transgénica derivada a partir de diferentes óvulos inyectados puede variar con relación a este parámetro. La cantidad de inmunoglobulina recombinante en leche se controla por tanto en la progenie representativa, y se prefieren las hembras con la más alta producción.

Aquellos que sean expertos en la técnica reconocerán que los procedimientos de la presente invención pueden usarse para optimizar la producción de inmunoglobulinas naturales y sintéticas. Las etapas de crear un animal transgénico, buscar la presencia de los genes tanto de la cadena gruesa como de la ligera, evaluar la secreción de inmunoglobulina en la leche de la progenie hembra, y, finalmente, evaluar la calidad de los anticuerpos resultantes, puede repetirse secuencialmente, con la experimentación debida, para establecer las construcciones preferidas para distintas aplicaciones.

De acuerdo con la presente invención, la naturaleza de las inmunoglobulinas recombinantes y su modo específico de uso puede variar. En una forma de realización, la presente invención acompasa la expresión de alto nivel de los anticuerpos que se cosechan y purifican a partir de la leche y se usan en forma purificada. Expresión de alto nivel se define en la presente invención como la producción de aproximadamente 1 mg/ml de proteína. De forma alternativa, se diseñan los anticuerpos que proporcionen protección a los humanos contra enfermedades infectivas; se realiza a continuación la administración terapéutica bebiendo la leche. En otra posibilidad, se diseñan animales productores de leche para producir anticuerpos específicamente benéficos para sus crías, que los adquieren a través de la lactancia. En otra posibilidad adicional, los animales producen un anticuerpo que protege al propio animal productor de leche contra patógenos de las ubres, por ejemplo, las bacterias que producen mastitis.

La inesperada expresión de alto volumen de inmunoglobulinas de acuerdo con la presente invención también permite el uso de tales inmunoglobulinas en aplicaciones químicas y farmacéuticas. Por el procedimiento de ejemplo no limitante, el procedimiento de la presente invención puede usarse para producir elevados niveles de anticuerpos tetraméricos dirigidos contra diferentes patógenos (por ejemplo, E. Coli, Salmonella, virus de la hepatitis B), péptidos biológicamente activos (por ejemplo, eritropoyetina, activador del plasminógeno tisular, gamma interferón) y para uso en reacciones químicas dirigidas contra diferentes enzimas. Pueden usarse anticuerpos monoclonales que se enlazan con el estado de transición de una reacción química para producción a escala industrial. Además, los anticuerpos monoclonales se usan muy a menudo inmovilizados en columnas para uso en la producción de fármacos biotecnológicos; en estos casos, la producción de anticuerpos representa una fracción significativa del coste de la purificación. Los procedimientos de la presente invención facilitan la producción de reservas de anticuerpos de alto volumen y bajo coste para uso es estos tipos de aplicaciones.

La presente invención se describe en detalle en los siguientes ejemplos de trabajo.

Ejemplo 1 Construcción de un casete de promotor lácteo específico

La presente invención acompasa un vector receptor en el cual se han insertado varios genes de diferentes inmunoglobulinas en forma intercambiable. El vector contiene secuencias 5' de promotor lácteo específico y secuencias genómicas 3' no traducidas que flanquean un emplazamiento de clonación XhoI. Esta clonación es única porque es el único presente en el vector. Preferiblemente, el casete de expresión entero debería estar flanqueado por emplazamientos de restricción que permitan la escisión sencilla del gen de inmunoglobulina ligado al promotor.

En este Ejemplo, el promotor y las secuencias genómicas 3' se derivaron del gen de beta caseína de cabra. El gen se clonó y caracterizó como se describe en Roberts y col., 1992 Gene 121:255-262.

El casete de expresión, antes de la inserción de los genes de inmunoglobulina, consiste en 6,2 kb aguas arriba del inicio de la traducción de la secuencia codificando la beta caseína y 7,1 kb de secuencia genómica aguas abajo del fin de la traducción del gen de beta caseína. El emplazamiento TaqI justo aguas arriba del codon de inicio de la traducción se cambió a un emplazamiento XhoI. Este único emplazamiento de clonación XhoI está en la unión de las secuencias aguas arriba y aguas abajo. Es en este emplazamiento XhoI, incluido en la secuencia CGCGGATCCTCGAGGACC en el cual se insertan los genes de inmunoglobulina recombinante (D. Tullio (1992) Bio/Technology 10:74-77).

La región 3' de beta caseína comienza en el emplazamiento PpuMi encontrado en Exon 7 y continua durante 7,1 kb aguas abajo. Están incluido en esta secuencia los restantes 18 bp de Exon 7, así como todo Exon 8 y Exon 9. Esto codifica las regiones 3' no traducida del gen de beta caseína de cabra, y finaliza con la secuencia: TAAGGTCCACA
GACCGAGACCCACTCACTAGGCAACTGGTCCGTCCAGCTGTTAAGTGA.

Para diseñar los emplazamientos de restricción flanqueando el casete de caseína, se clonaron en primer lugar las secuencias de control de la beta caseína de cabra en el vector SuperCosl (#251301, Stratagene, La Jolla, Ca) con emplazamientos flanqueantes NotI y SalI. Este plásmido se modificó a continuación cambiando el emplazamiento NotI a un emplazamiento SalI. Esto creó un fragmento SalI de 13,3 kb conteniendo el casete de expresión de la beta caseína en el interior del vector gbc163.

Ejemplo 2 Construcción de genes de anticuerpo monoclonal ligado al promotor

En este Ejemplo, los genes codificando un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el marcador de la superficie celular de un cáncer de colon se ligaron al promotor de caseína. Los ADNc codificando las cadenas ligera y pesada de este anticuerpo se clonaron a partir de una línea celular de hibridoma segregando anticuerpo en un vector pUC19 - derivado. Los ADNc de las cadenas ligera y pesada estaban presentes en fragmentos de HindIII/EcoRI de 702 bp y 1.416 bp, respectivamente.

Para adaptar los genes para inserción en el casete del promotor de caseína, se diseñaron emplazamientos de restricción XhoI en ambos extremos de cada segmento de ADN como se detalla a continuación. En la misma etapa, se modificó la región aguas arriba del codon de iniciación de la traducción de la inmunoglobulina de forma que contenía secuencias similares a aquellas en la región análoga del gen de la beta caseína.

Gen de la cadena ligera: El plásmido pUC19 conteniendo insertado el ADNc de la cadena ligera se digirió con HindIII, con el extremo romo mediante tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I, ligado a un oligonucleótido conteniendo una secuencia de reconocimiento XhoI (#1030, New England Biolabs, Beverly, MA).

La región inmediatamente aguas arriba del ATG iniciador se mutagenó a continuación usando un oligonucleótido con la siguiente secuencia: 5' AGT GAA TTC ATG CTC GAG AGC CAT GGC CTG GATC 3'. La digestión del plásmido final con XhoI produjo el ADNc de cadena ligera modificado que se flanqueó con finales cohesivos Xhol.

El ADNc de la cadena ligera se insertó a continuación en el único emplazamiento de clonación XhoI del vector de expresión gbcl63 descrito en Ejemplo1, produciendo el plásmido Bc62 (Figura 1).

Gen de la cadena pesada: El plásmido pUC19 conteniendo el ADNc de la cadena pesada se mutagenó usando un oligonucleótido con la siguiente secuencia: 5' AGT GAA TTC ATG CTC GAG AGC CAT GAA GCA CCTG 3'. El plásmido resultante contiene un emplazamiento XhoI aguas arriba del codon de iniciación de la traducción de la cadena pesada.

El emplazamiento HindIII aguas abajo se convirtió en un emplazamiento Xhol usando un adaptador sintético con la secuencia 5' AGC TCC TCG AGG CC 3'. La digestión del plásmido modificado con XhoI produjo el ADNc de la cadena gruesa modificado de 1,4 kb, flanqueado con finales cohesivos XhoI. Este fragmento se insertó a continuación en el único emplazamiento de clonación XhoI del gbc163 para producir Bc61 (Figura 2).

Antes de la inyección, los genes de las cadenas ligera y pesada ligados al promotor se aislaron a partir de Bc61 y Bc62, respectivamente, mediante digestión con SalI. Los fragmentos se purificaron a continuación mediante electroforesis en gel seguido de centrifugación en gradiente de equilibrio con CsCl. Se dializó el ADN extensamente contra agua destilada antes de la cuantificación.

Ejemplo 3 Producción de ratones transgénicos

Los fragmentos de ADN ligados al promotor codificando las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, obtenidas como se ha descrito en Ejemplo 2, se inyectaron en óvulos de ratón fertilizados usando procedimientos que son habituales en la técnica, como se describen en Hogan, B., Constantini, F., y Lacey, E., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1986). La progenie resultante se analizó a continuación para buscar la presencia de ambas secuencias de gen de anticuerpo. Se extrajo el ADN a partir de material de biopsia de la cola y se sondeó usando análisis de transferencia Southern. Las sondas usadas en la hibridación fueron los ADNc originales codificando las cadenas ligera y pesada. Como se ve en Tabla 1, la mayor parte de la progenie de la primera generación había incorporado ambos transgenes.

TABLA 1 Resumen de ratones Bc61 - Bc62

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Ejemplo 4 Análisis de inmunoglobulinas recombinantes en leche

Muestras de leche de los ratones transgénicos obtenidos como se describe en Ejemplo 3 se analizaron para buscar la presencia de inmunoglobulina heteróloga mediante transferencia Western. La cadena pesada del anticuerpo se detectó usando un anticuerpo policlonal ligado a peróxido de marango dirigido contra la cadena pesada gamma humana (anticuerpo #62-8420, Zymed, South San Francisco, CA.) como se muestra en Figura 3. La cadena ligera se detectó usando anticuerpos de la cadena ligera lambda humana (anticuerpo #05-4120, Zymed, South San Francisco, CA.) mostrada en Figura 4. En estas Figuras, puede verse que las cadenas ligera y pesada inmunoreactivas pueden detectarse en la leche de varios animales, pero no en el animal de control negativo CD-1. La inmunoglobulina humana puede detectarse en leche procedente del fundador 1-23 y a partir de la progenie de los fundadores 1-76 y 1-72. Estos animales son las hembras de segunda generación 2-76, 2-82, 2-92 y 2-95. Los niveles de expresión oscilan de 0,2 mg/ml a superiores a 1 mg/ml (Tabla 1).

Claims (4)

1. Un procedimiento para obtener una inmunoglobulina heteróloga y ensamblada a partir de la leche de un mamífero transgénico no humano caracterizado en que comprende:

(a) introducir en la línea germinal del mencionado mamífero ADN comprende de forma separada las secuencias codificadoras de proteína de las cadenas ligera y pesada de la mencionada inmunoglobulina, siendo ligado el ADN de forma operativa a una secuencia de promotor de beta caseína que soporte la expresión preferencial de la mencionada secuencia codificadora de proteína en células epiteliales de la glándula mamaria y en su término 3' a una secuencia que contiene un emplazamiento de poliadenilación;

(b) obtener leche que contiene la mencionada inmunoglobulina heteróloga y ensamblada a partir del mencionado mamífero no humano;

siendo la mencionada inmunoglobulina heteróloga y ensamblada en una configuración funcional de beta caseína de cabra y siendo producida a un nivel de al menos 1 mg/ml en la leche del mencionado mamífero.

2. Un procedimiento como el que se reivindica en la reivindicación 1 en el que el mencionado mamífero se seleccionan entre ratones, vacas, ovejas, cabras, camellos y cerdos.

3. Un procedimiento como el que se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 en el que la mencionada inmunoglobulina es de origen humano.

4. Un procedimiento como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la mencionada inmunoglobulina se purifica partir de la leche del mencionado mamífero.