JPH09506779A - 乳汁中における抗体の形質転換的な産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乳房上皮細胞において異種抗体遺伝子を選択的に発現する形質転換動物を製作することによって、哺乳動物の乳汁中に単クローン抗体を産生する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 乳汁中における抗体の形質転換的な産生発明の分野 本発明は、特に、乳房上皮細胞において異種の抗体を選択的に発現する形質転 換動物の製作による、哺乳動物の乳汁中における単クローン抗体の産生方法に関 する。発明の背景 免疫グロブリンは、通常循環Ｂリンパ球により合成され、変性され、組み立て られ、分泌されるヘテロ重合性タンパク質（heteropolymeric proteins）である 。ＤＮＡの組換え技術を用いて、Ｂ−リンパ球以外の細胞を免疫グロブリン遺伝 子を発現するようにプログラムすることが可能である。この試みの中では、幾つ かの以下の因子に由来する困難なことがあった：１）重鎖および軽鎖両方の免疫 グロブリンは適切なレベルで同時に発現（co-expressed）しなければならない； ２）発生期の免疫グロブリンポリペプチドは翻訳と同時およびその後に様々な変 性を受け、かかる変性は異種細胞中において十分な適合度または効率で起こらな いかもしれない；３）免疫グロブリンは組み立てのためのアクセサリー・シャペ ロン・タンパク質（accessory chaperone proteins）を必要とする；４）大量の 異種タンパク質を分泌するには、細胞の合成および分泌能力は不十分であるかも しれない；および５）分泌した免疫グロブリンは異種細胞の細胞外環境下におい て不安定であるかもしれない。 免疫グロブリンには数多くの治療用途、診断用途および産業的な用途があるた め、これらのタンパク質を、高レベルで、機能的な配置で、容易に採取でき精製 できる形態で再現可能に製造できる発現系の必要性が当該分野には存在する。形 質転換動物技術（transgenic animal technology）の発達により、大型動物を遺 伝的にプログラムされたタンパク質工場として用いる可能性が増大している。Ｐ ＣＴ出願ＷＯ９０／０４０３６（公開４／１９／９０）では、免疫グロブリン発 現のための形質転換技術の使用が開示されている。ＷＯ９２／０３９１８（３／ １９／９２）およびＷＯ９３／１２２２７（６／２４／９３）では、形質転換動 物の生殖細胞へ未転位の免疫グロブリン遺伝子を導入することが開示されている 。無傷の免疫グロブリン遺伝子（それぞれのプロモーター領域を含む）の使用は 、リンパ球におけるそれらの発現や宿主動物の血流への分泌を引き起こすだろう ；これでは、宿主の内生免疫グロブリンの発現を抑えることが必要になり、タン パク質の加水分解酵素を含む他の多くのタンパク質を含む血清から免疫グロブリ ンを精製する問題が起こる。さらに、形質転換的なアプローチを選択する場合、 重鎖および軽鎖遺伝子はいずれも、それらの伴行性の発現（comcomittant expre ssion）が可能な方法で、宿主ゲノムへ編入されなければならい。 形質転換動物を製作するときの別の方法では、興味のある遺伝子を、宿主内の 規定の細胞タイプ内のみで機能する異種転写プロモーターに結合させる。この方 法においでは、組換え遺伝子の組織−特異的発現がプログラムされ得る。米国特 許第４,８７３,３１６号（１９８９年１０月１０日公開）では、形質転換マウス の乳汁中における組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）の製造 が開示されており、そこでＴＰＡ遺伝子は乳汁タンパク質カゼインのプロモータ ーに結合する。同様の方法で発現する他のタンパク質には、嚢胞性線維症膜間コ ンダクタンスレギュレーター（cystic fibrosis transmembrane conductance re gulator）（ジツリオ(DiTullio)等、バイオ／テクノロジー１０：７４、１９９ ２）、ウロキナーゼ（urokinase）（メーデ(Meade)等、バイオ／テクノロジー８ ：４４３、１９９０）、インターロイキン−２（ブーラー(Buhler)等、バイオ／ テクノロジー８：１４０、１９９０）、および抗血友病性因子IX（クラーク(Cla rk)等、バイオ／テクノロジー７：４８７、１９８９）が含まれる。特に、これ らのタンパク質は全て、分泌前にマルチメリゼイション（multimerization）ま たは組み立てを必要としない簡単な一本鎖ポリペプチドである。 カゼインプロモーターの制御下で対になった免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺 伝子を有する形質転換動物を製作すると、かかる動物は乳汁中に分泌される免疫 グロブリンを大量に産生することが現在わかっている。本発明のＤＮＡ構築物（ c onstructs）を用いると、驚くことに重鎖および軽鎖遺伝子の非常に有効な同時 の統合（co-integration）が観察される。本発明の方法および構築を用いると、 複合四量体糖タンパク質（complex tetrameric glycoproteins）を産生および集 合し、それらを大量に分泌するよう乳房上皮細胞をプログラムすることが初めて 可能になる。 従って、本発明は、形質転換哺乳動物の乳汁中において免疫グロブリンを大量 に産生するための方法を提供することを目的とする。 また、本発明は、乳汁中において大量に産生できる合成免疫グロブリンをデザ インするための方法を提供することを目的とする。 さらに、本発明は、治療学的に有効な抗体を乳汁中に排泄する雌の哺乳動物を 製作することにより、かかる抗体を哺乳児に投与するための方法を提供すること を目的とする。 さらに、本発明は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコード化するＤＮＡの組 換え配列であって、５'末端が哺乳動物特異的プロモーターに結合され、３'末端 がポリアデニル化部位を含む配列に結合されている配列を有する生殖細胞および 体細胞をもつヒト以外の形質転換哺乳動物を提供することを目的とする。 さらに、本発明は、５'〜３'の順に、 ａ）ベータカゼイン遺伝子由来の５'プロモーター配列、 ｂ）Ｘｈｏｌ制限部位、および ｃ）ヤギベータカゼイン遺伝子由来の３'未翻訳配列 を含むカゼインプロモーターカセットを提供することを目的とする。 本発明の上記目的および他の目的は、本明細書、図面および請求項を見ると当 該分野の通常の知識を有する者には明らかだろう。図面の簡単な説明 図１は、免疫グロブリン軽鎖をコード化するｃＤＮＡを含む１３.９kb Ｓａｌ Ｉ断片を含み、その５'および３'末端上にヤギベータカゼイン配列が配置されて いるＢｃ６２プラスミドの概略図を示す。 図２は、免疫グロブリン重鎖をコード化するｃＤＮＡを含む１４.６kb Ｓａｌ Ｉ断片を含み、その５'および３'末端上にヤギベータカゼイン配列が配置されて いるＢｃ６１プラスミドの概略図を示す。 図３は、図１および図２で示されたベータカゼインプロモーター−結合免疫グ ロブリン遺伝子を用いて製作された形質転換マウスの乳汁中におけるヒトの免疫 グロブリン重鎖のイムノブロット検出を表す。 図４は、図１および図２で示されたベータカゼインプロモーター−結合免疫グ ロブリン遺伝子を用いて製作された形質転換マウスの乳汁中におけるヒトの免疫 グロブリン軽鎖のイムノブロット検出を表す。発明の概要 本発明の１つの側面によれば、本発明は、形質転換哺乳動物の乳汁から異種免 疫グロブリンを得る方法を含む。本発明の別の側面によれば、本発明は、生殖細 胞系列に、乳汁−特異的プロモーターに結合した免疫グロブリンｃＤＮＡを導入 することにより、形質転換哺乳動物を製作する方法を含む。 別の側面によれば、本発明は、乳汁−特異的プロモーターに結合した免疫グロ ブリンｃＤＮＡを含むＤＮＡの組換え配列を有する生殖細胞および体細胞をもつ 形質転換哺乳動物を含む。 さらに別の側面によれば、本発明は、便利なクローニング部位として免疫グロ ブリンコード化配列に有用な唯一の制限部位によって結合したヤギベータカゼイ ン遺伝子から誘導される５'および３'非コード化配列を有する発現カセットを含 む単離ＤＮＡを含む。発明の詳細な説明 本明細書中に引用した全ての特許出願、特許および文献を出典開示して本明細 書の一部とみなす。矛盾する場合は本明細書が克服するだろう。 本発明は、形質転換動物の乳汁中に排泄される単クローン抗体の産生方法、お よびかかる動物の生産方法に関する。これは、特定の対の免疫グロブリン重鎖お よび軽鎖をコード化するＤＮＡセグメントを、乳房上皮細胞にて優先的に発現す るプロモーター配列の下流にクローン化させるＤＮＡの構築技術により達成され る。その後、プロモーター−結合重鎖および軽鎖遺伝子を含む組換えＤＮＡを同 時に着床前の受精卵に注入する。両方の組換え遺伝子の存在について、その子孫 を調査する。その後、これらの血筋出身の典型的な雌の乳汁を搾り、その乳汁中 の単クローン抗体の存在について分析する。その抗体が存在するためには、重鎖 および軽鎖遺伝子両方は同じ細胞内で同時に発現しなければならない。抗体を乳 汁から精製してもよく、または免疫グロブリンを含む乳汁自体を用いて抗体をレ シピエントに運搬してもよい。このことについては以下で述べる。 本発明に有用な免疫グロブリン遺伝子は天然源、例えば、個体のＢ細胞クロー ンまたはそれらから誘導されるハイブリドーマから得てよい。代わりに、それら は軽および重鎖の可変領域が単一ポリペプチドの部分として発現する合成一本鎖 抗体を含んでよい。さらに、アミノ酸配列が変わるか、または変わらないヌクレ オチド置換、配列の付加または削除、またはポリペプチドの異なる領域が異なる 源から誘導されるハイブリッド遺伝子の産生により、予期したように変化させた 組換え抗体遺伝子を用いてよい。抗体遺伝子は本来かなり多様であり、従って自 然に多くの変異に耐性がある。当該分野の当業者は、本発明の方法により抗体を 産生するにあたっての制限としては、機能的な配置に組み立てられ、安定な形態 で乳汁に分泌されなければならないということだけであることが理解できるであ ろう。 本発明の実施に有用な転写プロモーターは乳房上皮細胞中で優先的に活性化す る転写プロモーターであり、乳汁タンパク質、例えば、カゼイン、ベータラクト グロブリン（クラーク(Clark)等、（１９８９）バイオ／テクノロジー７：４８ ７−４９２）、乳清酸タンパク質（ゴードン(Gordon)等、（１９８７）バイオ／ テクノロジー５：１１８３−１１８７）、およびラクトアルブミン（ショウラー (Soulier)等、（１９９２）エフ・イー・ビー・エス・レッツ(FEBS Letts.)２９ ７ ：１３）をコード化する遺伝子を制御するプロモーターが挙げられる。カゼイ ンプロモーターは、いかなる哺乳動物種のアルファ、ベータ、またはカッパーカ ゼイン遺伝子由来であってよい；ヤギベータカゼイン遺伝子由来のプロモーター が好ましい（ジツリオ(DiTullio)、（１９９２）バイオ／テクノロジー１０：７ ４−７７）。 本発明の使用にあたっては、唯一のＸｈｏＩ制限部位をプロモーター配列の３ '末端に導入し、免疫グロブリンコード化配列を従来のように挿入する。好まし くは、挿入された免疫グロブリン遺伝子には、乳房−特異的遺伝子由来の同血族 のゲノムの配列（cognate genomic sequences）が、その３'側に配置されており 、これによってポリアデニル化部位および転写−安定化配列が提供される。イン ・ビボにおける構築物の転写の結果、免疫グロブリン遺伝子の翻訳開始コドンの 上流にカゼイン−由来５'未翻訳配列、および免疫グロブリン遺伝子の翻訳停止 コドンの下流に３'未翻訳配列を含む安定なｍＲＮＡが産生する。最終的には、 全体のカセット（すなわち、プロモーター−免疫グロブリン−３'領域）には、 プロモーター−ｃＤＮＡカセットを単一断片として容易に切断できる制限部位が 配置される。これにより、受精卵への注入前の、望ましくない原核ベクター−由 来ＤＮＡ配列の除去が促進される。 その後、プロモーター−結合免疫グロブリン重鎖および軽鎖ＤＮＡを、哺乳動 物、例えば、メウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、オウシ、ラクダ、またはブタの生 殖細胞系列に導入する。ここでは、哺乳動物とは、乳腺を有し、乳汁を生産する 、ヒト以外の全ての動物を意味するものとする。長期間にわたって大量に乳汁を 生産する哺乳動物種が好ましい。典型的には、ＤＮＡを受精卵の前核（pronucle i）に注入し、これをその後、レシピエントとしての雌の子宮に着床し、妊娠さ せる。出産後、推定上の形質転換動物を、導入したＤＮＡの存在についてテスト する。これは、血液細胞または他の入手可能な組織から抽出したＤＮＡのサザー ン・ブロット・ハイブリダイゼーションにより容易に行われ、ここでは調査に、 レシピエント種のＤＮＡとクロス・ハイブリダイゼーションを全く示さない注入 遺伝子のセグメントを用いる。重鎖および軽鎖両方の免疫グロブリン遺伝子の少 なくとも１つの複製を明らかに示す子孫を、さらなる分析用に選択する。 当該分野の標準的ないずれかの免疫学的技術（例えば、ウエスタン・ブロット 、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ）を用いて、形質転換雌を乳汁への免疫グ ロブリン分泌についてテストすればよい。この分析に用いられる抗−免疫グロブ リン抗体は、単離した重鎖、軽鎖、または完全に組み立てられた（Ｈ２Ｌ２）免 疫 グロブリンとだけ反応する他のものを検出する多クローンまたは単クローン抗体 であってよい。 組換え免疫グロブリンは、それらの機能、すなわち結合特異性および特定の抗 原との親和力等に関しても特徴付けられる。これは、当該分野の標準的な免疫学 的方法、例えば、スカッチャード分析（Scatchard analysis）を用いて、固定化 抗原等に結合させて行われる。ある種の乳汁中での免疫グロブリンの安定特性は 、動物から回収した後、増加する時間培養した乳汁へ上述の検出方法を適用する ことによりアッセイされる。 本発明の方法により産生した免疫グロブリンは、固定化タンパク質Ｇへの吸収 、カラムクロマトグラフィー、および抗体精製の分野における通常の知識を有す るものに既知の方法を用いて、乳汁から精製すればよい。 個体の形質転換哺乳動物での組換え免疫グロブリンの産生レベルは、主に受精 卵への注入後の組換え遺伝子の統合（integration）の部位および方法により決 定される。従って、異なった注入卵由来の形質転換子孫は、このパラメーターに 関して変化し得る。それゆえに、乳汁中の組換え免疫グロブリンの量は典型的な 子孫で測定され、最も産生量の多い雌が好ましい。 当該分野の当業者は、本発明の方法を用いて、天然および合成免疫グロブリン の産生を最適化できることを理解するだろう。形質転換動物を製作する段階、重 鎖および軽鎖遺伝子両方の存在をテストする段階、雌の子孫の乳汁中への免疫グ ロブリンの分泌をアッセイする段階、および最後にその結果得られた抗体の特性 を調査する段階を、不適当な実験をすることなく、その後繰り返して、様々な用 途に適した好ましい構築物を確立することができる。 本発明によれば、組換え免疫グロブリンの性質およびそれらの特定の使用モー ドは変化させ得る。ある具体例では、本発明には、乳汁から採取され精製され、 精製形態で用いられる抗体の高レベルの発現が含まれる。ここで、高レベルの発 現とは、約１mg/mlのタンパク質が産生することを意味するものとする。他の具 体例では、感染病に対するヒトへの保護を提供する抗体が設計される；そのとき 、治療学的投与は乳汁を飲ませることにより為される。さらなる具体例では、授 乳 動物がそれらの子孫に特に有益な抗体を産生するよう設計され、かかる動物は乳 汁を飲むことによって抗体を得る。さらなる具体例では、動物は、乳房の病原体 、例えば、乳腺炎を引き起こすバクテリアに対して授乳性哺乳動物自身を保護す る抗体を産生する。 本発明の方法および構築物を用いた免疫グロブリンの驚くほど多量の発現によ り、製薬学的および化学的調整法（pharmaceutical and chemical settings）に おけるかかる免疫グロブリンの使用も可能になる。以下の例に制限されないが、 本発明の方法を用いて、様々な病原体（例えば、Ｅ.コリ、サルモネラ、Ｂ型肝 炎ウイルス）、生物学的に活性なタンパク質（例えば、エリトロポイエティン、 組織プラスミノーゲンアクチベーター、ガンマーインターフェロン）および化学 反応において用いられる様々な酵素に対する高レベルの四量体抗体を生産するこ とができる。化学反応における遷移状態の分子に結合する単クローン抗体は、工 業規模の製造に用いることができる。さらに、単クローン抗体はしばしば、生物 製薬学的（biopharmaceuticals）な精製に使用するカラムに固定化される；この 場合、抗体の産生において精製コストは有意に低い。本発明の方法により、抗体 の低コストでの多量な産生が促進され、上述の用途での使用のために貯蔵される 。 本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、これらにより本発明は本発 明の範囲を制限されるものではない。 実施例１：乳汁−特異的プロモーターカセットの構築 本発明には、多くの様々な免疫グロブリン遺伝子が交換可能に挿入できるレシ ピエントベクター（recipient vector）が含まれる。ベクターはＸｈｏＩクロー ニング部位に配置される５'乳汁−特異的プロモーター配列および３'未翻訳ゲノ ム配列を含む。このクローニング部位は特有であり、それは、ベクターにたった １つしか存在しないためである。好ましくは、全体の発現カセットには、プロモ ーター−結合免疫グロブリン遺伝子の切断を容易にする制限部位が配置されるべ きである。 この実施例では、プロモーターおよび３'ゲノム配列は、ヤギベータカゼイン 遺伝子から誘導された。この遺伝子をクローン化し、ロバーツ（Roberts）等、 １９９２、ジーン（Gene）１２１：２５５−２６２で記載されているように特徴 付けた。ここで、この文献を出典開示して本発明の一部とみなす。 免疫グロブリン遺伝子の挿入前、発現カセットはベータカゼインコード化配列 の６.２kb上部翻訳開始部およびベータカゼイン遺伝子の７.１kbゲノム配列下部 翻訳終了部を含む。翻訳開始コドンのすぐ上流のＴａｑＩ部位はＸｈｏＩ部位に 変換された。この唯一のＸｈｏＩクローニング部位は上部配列と下部配列との連 結部である。組換え免疫グロブリン遺伝子が挿入されるのは、配列： に含まれる上記ＸｈｏＩ部位である（ディー・ツリオ(D.Tullio)、（１９９２） バイオ／テクノロジー１０：７４−７７）。 ３'ベータカゼイン領域は、エクソン（Exon）７に見られるＰｐｕＭＩ部位で 始まり、７.１kb下部に続く。この配列において含まれるのは、エクソン７の残 留１８bp、およびエクソン８およびエクソン９の全てである。これらは、ヤギベ ータカゼイン遺伝子の３'未翻訳領域をコード化し、および末端が配列： である。 カゼインカセットへ配置する制限部位を設計するために、最初にヤギベータカ ゼイン制御配列を、ＮｏｔＩおよびＳａＩＩ部位が配置しているスーパーコスル （SuperCosl）ベクター（＃２５１３０１、ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ ジョルＡ(La JollA)、ＣＡ）にクローン化した。その後、ＮｏｔＩ部位をＳａＩ Ｉ部位に変換することにより、このプラスミドを変性させた。これにより、ｇｂ ｃ１６３ベクター内にベータカゼイン発現カセットを含む１３.３kbＳａＩＩ断 片が産生した。 実施例２：プロモーター−結合単クローン抗体遺伝子の構築 この実施例では、結腸癌細胞−表面マーカー（makerer）に対するヒト単クロ ーン抗体をコード化する遺伝子をカゼインプロモーターに結合した。この抗体の 重鎖および軽鎖をコード化するｃＤＮＡを、抗体−分泌性ハイブリドーマセルラ インからｐＵＣ１９−誘導ベクターへクローン化した。軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ はそれぞれ、７０２bpおよび１４１６bpのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片上に 存在した。 カゼインプロモーターカセットへの挿入に遺伝子を適合させるために、Ｘｈｏ Ｉ制限部位を、後述するようにして、それぞれのＤＮＡセグメントの両端に設計 した。同じ段階で、免疫グロブリン翻訳開始コドンの上部領域を変性させて、ベ ータカゼイン遺伝子の類似領域における配列と同様の配列を含むようにした。 軽鎖遺伝子：軽鎖ｃＤＮＡ挿入を含むｐＵＣ１９プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ（Klenow）断片での処理により末端 をブラントエンドとし、ＸｈｏＩ認識配列を含むオリゴヌクレオチド（＃１０３ ０、ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)、ベバリー(Be verly)、ＭＡ）へ連結させた。 開始ＡＴＧのすぐ上部の領域を、配列： を有するオリゴヌクレオチドを用いて変異させた。ＸｈｏＩによる最終プラスミ ドの消化により、Ｘｈｏｌ結合性末端が配置された変性軽鎖ｃＤＮＡが産生した 。 その後、軽鎖ｃＤＮＡを、実施例１で記載のｇｂｃ１６３発現ベクターの唯一 のＸｈｏＩクローニング部位へ挿入し、プラスミドＢｃ６２（図１）を得た。 重鎖遺伝子：重鎖ｃＤＮＡを含むｐＵＣ１９プラスミドを、配列： を有するオリゴヌクレオチドを用いて変異させた。その結果得られたプラスミド は、重鎖翻訳開始コドンの上部でＸｈｏＩ部位を含む。 下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、配列： を有する合成アダプターを用いてＸｈｏｌ部位に変換した。ＸｈｏＩを有する変 性プラスミドの消化により、ＸｈｏＩ結合性末端にはさまれた１.４kb変性重鎖 ｃＤＮＡが産生した。その後、この断片を、ｇｂｃ１６３の唯一のＸｈｏＩクロ ーニング部位へ挿入し、Ｂｃ６１（図２）を得た。 注入前、プロモーター−結合軽鎖および重鎖遺伝子を、それぞれＢｃ６１およ びＢｃ６２からＳａｌＩでの消化により単離した。その後、断片をゲル電気泳動 により精製し、さらにＣｓＣｌ平衡勾配遠心分離により精製した。定量前、ＤＮ Ａを蒸留水に対して広範囲にわたって透析した。 実施例３：形質転換マウスの生産 実施例２記載の方法で得られた、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコード化す るカゼインプロモーター−結合ＤＮＡ断片を、ホーガン・ビー（Hogan B.）、コ ンスタンチニ・エフ（Constantini F.）、およびラセイ・イー（Lacey E.）、マ ニプレイティング・ザ・マウス・エンブリオ（Manipulating the Mouse Embryo ）：エイ・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、（コールド・ スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratories)、 １９８６）で記載されているような、当該分野で標準的な方法を用いてマウスの 受精卵に注入した。その後、その結果得られた子孫を、両方の抗体遺伝子配列の 存在について分析した。ＤＮＡをテイル生検材料から抽出し、サザーン・ブロッ ト分析を用いて調査した。調査では、ハイブリダイゼーションにおいて、重鎖お よび軽鎖をコード化するオリジナルのｃＤＮＡを用いた。表１で示されるように 、ほとんどの第一世代形質転換子孫は両方の組換え遺伝子を有していた。 実施例４：乳汁中の組換え免疫グロブリンの分析 実施例３記載の方法で得られた形質転換マウス由来の乳汁サンプルを、ウエス タン・ブロットにより異種免疫グロブリンの存在について分析した。抗体の重鎖 を、図３で示されるようにヒトガンマ重鎖に対するホースラディッシュ・ペルオ キシド−結合多クローン抗体（抗体＃６２−８４２０、ジームト(Zymed)、サウ スサンフランシスコ、ＣＡ）を用いて検出した。軽鎖を、図４で示されるように ヒトラムダ軽鎖への抗体（抗体＃０５−４１２０、ジームト(Zymed)、南サンフ ランシスコ、ＣＡ）を用いて検出した。これらの図より、免疫反応性重鎖および 軽鎖は、数種の動物の乳汁中で検出できるが、ネガティブな対照動物ＣＤ−１で は検出できないことが理解できる。ヒト免疫グロブリンは、ファウンダー１−２ ３、 ならびに１−７６および１−７２ファウンダーの子孫由来の乳汁中で検出できる 。これらの動物は第二世代の雌、２−７６、２−８２、２−９２、および２−９ ５である。発現レベルは０.２mg/mlから１mg/mlを越える範囲である（表１）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ディチューリオ、ポール アメリカ合衆国01701マサチューセッツ、 フレミンガム、エドゲル・ロード・ナンバ ー68、915番 (72)発明者 ポーロック、ダニエル アメリカ合衆国02053マサチューセッツ、 メドウェイ、レッドゲート・ドライブ４番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．形質転換哺乳動物の乳汁から異種免疫グロブリンを得る方法であって、 ａ）該免疫グロブリンのタンパク質−コード化配列を有するＤＮＡであって、 その５'末端が乳腺上皮細胞における遺伝子の優先的な発現を支持するプロモー ター配列と結合されており、その３'末端がポリアデニル化部位を含む配列と結 合されているＤＮＡを、該哺乳動物の生殖細胞へ導入する工程、および ｂ）該哺乳動物から乳汁を得る工程 を含む方法。 ２．哺乳動物がマウス、メウシ、ヒツジ、ヤギ、オウシ、ラクダおよびブタか らなる群から選択される、請求項１記載の方法。 ３．プロモーターがカゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモー ター、乳清酸タンパク質プロモーター、およびラクトアルブミンプロモーターか らなる群から選択される、請求項１記載の方法。 ４．免疫グロブリンが重鎖および軽鎖を含む、請求項１記載の方法。 ５．免疫グロブリンが一本鎖ポリペプチドを含む、請求項１記載の方法。 ６．免疫グロブリンがヒト由来である、請求項１記載の方法。 ７．免疫グロブリンが哺乳動物の乳汁から精製される、請求項１記載の方法。 ８．全ての生殖細胞および体細胞が、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコード 化する組換えＤＮＡ配列であって、５'末端が乳腺上皮細胞における遺伝子の優 先的な発現を支持するプロモーター配列と結合されており、３'末端がポリアデ ニル化部位を含む配列と結合されている配列を含んでいるヒト以外の形質転換哺 乳動物。 ９．哺乳動物がマウス、メウシ、ヒツジ、ヤギ、オウシ、ラクダおよびブタか らなる群から選択される、請求項８記載の形質転換哺乳動物。 １０．プロモーターがカゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモ ーター、乳清酸タンパク質プロモーター、およびラクトアルブミンプロモーター からなる群から選択される、請求項８記載の形質転換哺乳動物。 １１．免疫グロブリンが重鎖および軽鎖を含む、請求項８記載の形質転換哺乳 動物。 １２．免疫グロブリンが一本鎖ポリペプチドを含む、請求項８記載の形質転換 哺乳動物。 １３．免疫グロブリンがヒト由来である、請求項８記載の形質転換哺乳動物。 １４．５'〜３'の順に ａ）ベータカゼイン遺伝子由来の５'プロモーター配列 ｂ）唯一のＸｈｏＩ制限部位、および ｃ）ヤギベータカゼイン遺伝子由来の３'未翻訳配列 を含む、単離した精製ＤＮＡであって、ａ）はヤギベータカゼインのヌクレオチ ド−６１６８〜−１を含み、ヌクレオチド１はベータカゼイン翻訳開始コドンの 最初のヌクレオチドであり、ｂ）は配列 を含み、ｃ）は、ベータカゼインｃＤＮＡ配列のbp６４８にあるＰｐｕＭＩで始 まり、７.１kb下部で継続し、配列 で終わる配列を含むＤＮＡ。 １５．免疫グロブリンｃＤＮＡがｂ）に挿入されており、該ＤＮＡが形質転換 動物において免疫グロブリンの乳腺特異的発現を支配する、請求項１４記載のＤ ＮＡ。 １６．免疫グロブリンが重鎖および軽鎖を含む、請求項１５記載のＤＮＡ。 １７．免疫グロブリンが一本鎖ポリペプチドを含む、請求項１５記載のＤＮＡ 。 １８．免疫グロブリンがヒト由来である、請求項１５記載のＤＮＡ。