ES2268363T7

ES2268363T7 -

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Publication number: ES2268363T7
Application number: ES03727359T
Authority: ES
Inventors: Cristina Alonso-Alija; Erwin Bischoff; Klaus Münter; Johannes-Peter Stasch; Elke Stahl; Stefan Weigand; Achim Feurer
Original assignee: Adverio Pharma GmbH
Current assignee: Adverio Pharma GmbH
Priority date: 2002-05-08
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2026-04-28
Anticipated expiration: 2023-04-25
Also published as: CA2485143C; AR039789A1; HK1082247A1; CN1665811A; EP1506193A1; US7173037B2; EP1506193B3; SI1506193T2; LTC1506193I2; DK1506193T3; PE20040197A1; AU2003233061A1; CN1330649C; JP4455321B2; BRPI0309855B8; KR20050003415A; NO2014018I1; EP1506193B9; FR14C0032I2; NO20045277L

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Pirazolopiridinas sustituidas con carbamato

[0003] La presente invención se refiere a compuestos que estimulan la guanilato ciclasa soluble, a su preparación y a su uso como medicamentos, en particular como medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y/o la disfunción sexual.

[0004] Uno de los sistemas de transmisión celular más importantes en las células de mamíferos es el guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Junto con el monóxido de nitrógeno (NO), que se libera del endotelio y transmite señales hormonales y mecánicas, forma el sistema NO/GMPc. Las guanilato ciclasas catalizan la biosíntesis de GMPc a partir del guanosín trifosfato (GTP). Los representantes conocidos hasta la fecha de esta familia pueden dividirse en dos grupos tanto según las características estructurales como según el tipo de ligandos: las guanilato ciclasas particuladas, que pueden estimularse mediante péptidos natriuréticos, y las guanilato ciclasas solubles, que pueden estimularse mediante NO. Las guanilato ciclasas solubles constan de dos subunidades y con la mayor probabilidad contienen un grupo hemo por heterodímero, que es una parte del centro regulador. Esto tiene una importancia central para el mecanismo de activación. El NO puede unirse al átomo de hierro del grupo hemo, lo que aumenta significativamente la actividad de la enzima. Por otra parte, las preparaciones desprovistas de grupo hemo no pueden estimularse mediante NO. El CO también puede atacar al átomo central de hierro del grupo hemo, aunque la estimulación mediante CO es significativamente más reducida que mediante NO.

[0005] Por medio de la formación de GMPc y la regulación de las fosfodiesterasas, los canales iónicos y las proteínas cinasas resultante de la misma, la guanilato ciclasa desempeña un papel determinante en diversos procesos fisiológicos, en particular en la relajación y la proliferación de células del músculo liso, la agregación y adhesión plaquetaria y la transmisión neuronal de señales, así como en enfermedades derivadas de la alteración de los procesos mencionados anteriormente. En condiciones fisiopatológicas, el sistema NO/GMPc puede estar suprimido, lo que puede dar lugar, por ejemplo, a hipertensión, activación plaquetaria, aumento de la proliferación celular, disfunción endotelial, arteriosclerosis, angina de pecho, insuficiencia cardiaca, trombosis, apoplejía, disfunción sexual e infarto de miocardio.

[0006] Una opción de tratamiento independiente de NO para enfermedades de este tipo que tenga como objetivo influir en la vía de señalización de GMPc en organismos es un enfoque prometedor debido a la alta eficiencia esperada y a los bajos efectos secundarios.

[0007] Hasta la fecha, para la estimulación terapéutica de la guanilato ciclasa soluble, se han utilizado exclusivamente compuestos tales como nitratos orgánicos, cuyo efecto se basa en el NO. Este se forma por bioconversión y activa la guanilato ciclasa soluble al atacar al átomo central de hierro del grupo hemo. Además de los efectos secundarios, el desarrollo de tolerancia es una de las principales desventajas de este procedimiento de tratamiento.

[0008] En los últimos años se han descrito algunas sustancias que estimulan directamente la guanilato ciclasa soluble, es decir, sin liberación previa de NO, tales como, por ejemplo, 3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-bencilindazol (YC-1, Wu et al., Blood 84 (1994), 4226; Mülsch et al., Brit. J Pharmacol. 120 (1997), 681), ácidos grasos (Goldberg et al., J. Biol. Chem.252 (1977), 1279), hexafluorofosfato de difenilyodonio (Pettibone et al., Eur. J. Pharmacol.116 (1985), 307), isoliquiritigenina (Yu et al., Brit. J. Pharmacol. 114 (1995), 1587) así como diversos derivados de pirazol sustituidos (documento WO 98/16223).

[0009] Además, en los documentos WO 98/16507, WO 98/23619, WO 00/06567, WO 00/06568, WO 00/06569, WO 00/21954 WO 02/42299, WO 02/42300, WO 02/42301, WO 02/42302, WO 02/092596 y WO 03/004503 se describen derivados de pirazolopiridina como estimuladores de la guanilato ciclasa soluble. Entre otros, se describen en dichos documentos pirazolopiridinas que presentan un resto pirimidina en la posición 3. Los compuestos de este tipo presentan una actividadin vitromuy alta con respecto a la estimulación de la guanilato ciclasa soluble. Sin embargo, se ha demostrado que estos compuestos presentan desventajas con respecto a sus propiedadesin vivo, tales como, por ejemplo, su comportamiento en el hígado, su comportamiento farmacocinético, su relación dosis-efecto o su ruta metabólica.

[0010] Por lo tanto, el objetivo de la presente invención era proporcionar otros derivados de pirazolopiridina que actúen como estimuladores de la guanilato ciclasa soluble, pero que no presenten las desventajas mencionadas anteriormente de los compuestos del estado de la técnica.

[0011] Este objetivo se logra mediante los compuestos según la invención según la reivindicación 1. Esta nueva clase de derivados de pirazolopiridina se caracteriza por un resto pirimidina en la posición 3, que presenta un patrón de sustitución determinado: a saber, un resto carbamato en la posición 5 del anillo de pirimidina y un grupo amino en la posición 4 del anillo de pirimidina.

[0012] En concreto, la presente invención se refiere al compuesto 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinil(metil)carbamato de metilo del ejemplo 8:

[0013]

[0015] El compuesto según la invención también puede presentarse en forma de sus sales. Generalmente, se pueden mencionar sales con bases o ácidos orgánicos o inorgánicos.

[0016] En el ámbito de la presente invención, se prefieren las sales fisiológicamente inocuas. Las sales fisiológicamente inocuas del compuesto según la invención pueden ser sales de las sustancias según la invención con ácidos minerales, ácidos carboxílicos o ácidos sulfónicos. Se prefieren especialmente, por ejemplo, las sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico o ácido benzoico.

[0017] Las sales fisiológicamente inocuas también pueden ser sales metálicas o de amonio del compuesto según la invención que poseen un grupo carboxilo libre. Se prefieren particularmente, por ejemplo, las sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, así como las sales de amonio, que se derivan de amoniaco, o de aminas orgánicas tales como, por ejemplo, etilamina, dietilamina o trietilamina, dietanolamina o trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, arginina, lisina o etilendiamina.

[0018] El compuesto de la invención puede presentarse en formas tautoméricas. Esto es conocido por los expertos en la técnica, y dichas formas también están comprendidas en el alcance de la invención.

[0019] Además, el compuesto según la invención puede presentarse en forma de sus posibles hidratos.

[0020] Un objeto de la presente invención es también un procedimiento para preparar el compuesto según la invención. Este compuesto puede prepararse

[0021] [A] mediante reacción de compuestos de fórmula (Ia)

[0022]

[0024] en la que

[0025] R<4>es metilo,

[0026] con compuestos de fórmula (II)

[0027] R<3>-X<1>(II),

[0028] en la que

[0029] R<3>es metilo y

[0030] X<1>representa un grupo saliente tal como, por ejemplo, halógeno, preferentemente yodo, o mesilato, dado el caso en un disolvente orgánico con enfriamiento para dar el compuesto del ejemplo 8.

[0031] [B] La presente divulgación también se refiere a la reacción del compuesto de fórmula (III)

[0034]

(III),

[0035] con compuestos de fórmula (IV)

[0037] O

[0038] Cl OR<4>

[0040] (IV),

[0041] en la que

[0042] R<4>representa alquilo (C<1>-C<6>),

[0043] dado el caso en un disolvente orgánico para dar compuestos de fórmula (Ia), o

[0044] [C] mediante reacción del compuesto de fórmula (V)

[0046]

[0048] con compuestos de fórmula (VI)

[0051]

(VI),

[0052] en la que

[0053] R<3>representa hidrógeno o alquilo (C<1>-C<4>), y R<4>se define como anteriormente,

[0054] dado el caso en un disolvente orgánico con calentamiento para dar compuestos de fórmula (Ib)

[0057]

[0059] en la que

[0060] R<3>y R<4>se definen como anteriormente.

[0061] Los compuestos de fórmula (II) y (IV) están disponibles comercialmente, se conocen por la literatura o pueden prepararse de forma conocida por el experto en la técnica.

[0062] El compuesto de fórmula (III) se puede preparar según el siguiente esquema de reacción:

[0065]

[0067] El compuesto (III) se obtiene en una síntesis en dos etapas mediante reacción del compuesto (V) con el compuesto (VII) para obtener el compuesto (VIII) según la etapa del procedimiento [C], y la posterior hidrogenación del compuesto (VIII) con níquel Raney acuoso. La hidrogenación puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico, por ejemplo dimetilformamida, preferentemente a presión elevada, por ejemplo de 50 a 70 bar, preferentemente a 65 bar, y agitando la solución de reacción durante varias horas, por ejemplo durante 22 horas, a temperatura elevada, por ejemplo de 40 a 80 °C, preferentemente de 60 a 65 °C.

[0068] El compuesto (VII) puede prepararse de una forma análoga a L. F. Cavalieri, J. F. Tanker, A. Bendich, J. Am. Chem. Soc., 1949, 71, 533.

[0069] El compuesto (V) se puede preparar según el siguiente esquema de reacción:

[0072]

[0073] El compuesto (V) se obtiene en una síntesis de varias etapas a partir de la sal sódica del éster etílico del ácido cianopirúvico conocida por la literatura (Borsche y Manteuffel, Liebigs. Ann. Chem.1934, 512, 97). Mediante esta reacción con 2-fluorobencilhidrazina con calentamiento en una atmósfera de gas protector en un disolvente inerte tal como dioxano se obtiene éster etílico del ácido 5-amino-1-(2-fluorobencil)-pirazol-3-carboxílico, que puede ciclarse mediante reacción con dimetilaminoacroleína en medio ácido en atmósfera de gas protector y calentamiento para dar el derivado de piridina correspondiente. Este derivado de piridina, el éster etílico del ácido 1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxílico, se convierte en el compuesto (V) mediante una secuencia de varias etapas que consiste en la conversión del éster en la amida correspondiente con amoniaco, la deshidratación con un agente deshidratante tal como anhídrido trifluoroacético para dar el derivado de nitrilo correspondiente, la reacción del derivado de nitrilo con metilato de sodio y la reacción final con cloruro de amonio. Los compuestos de fórmula (VI) pueden sintetizarse a partir de los carbamatos correspondientes mediante reacción con éster etílico del ácido fórmico según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los carbamatos pueden prepararse de forma análoga a Q. Li. Chu, T. W. Daniel, A. Claiborne, C. S. Cooper, C. M. Lee, J. Med. Chem.39 (1996) 3070-3088.

[0074] La reacción de los compuestos de fórmulas (Ia) y (II) para dar el compuesto según la invención se puede llevar a cabo utilizando los reactantes en cantidades equimolares en un disolvente orgánico, por ejemplo dimetilformamida o tetrahidrofurano, preferentemente en presencia de 1 a 2 equivalentes, preferentemente de 1,1 a 1,5 equivalentes de una base, tal como, por ejemplo, hidruro de sodio o sodio-N,N-bistrimetilsililamida, preferentemente a presión normal y agitando la solución de reacción durante algunas horas, por ejemplo durante 1 hora, con enfriamiento, por ejemplo de -10 °C a temperatura ambiente, preferentemente a 0 °C.

[0075] La reacción de los compuestos de fórmulas (III) y (IV) con los compuestos de fórmula (Ia) se puede llevar a cabo utilizando los reactantes en cantidades equimolares en un disolvente orgánico, por ejemplo una base orgánica, preferentemente piridina, preferentemente a presión normal y agitando la solución de reacción durante varias horas, por ejemplo durante 12 horas, de 0 °C a temperatura ambiente, preferentemente a temperatura ambiente. La reacción de compuestos de fórmulas (V) y (VI) para dar compuestos de fórmula (Ib) o, respectivamente, de compuestos de fórmulas (V) y (VII) para dar compuestos de fórmula (VIII) se puede llevar a cabo utilizando los reactantes en cantidades equimolares o, respectivamente, utilizando el compuesto de fórmula (VI) en un ligero exceso en un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, en un hidrocarburo tal como tolueno o xileno o en N,N-dimetilformamida, preferentemente en presencia de 2-3 equivalentes, preferentemente 2 equivalentes de una base, tal como, por ejemplo, trietilamina o metóxido de sodio, preferentemente a presión normal y agitando la solución de reacción durante varias horas, por ejemplo durante 9 horas, a temperatura elevada, por ejemplo a 80-160 °C, preferentemente a 100-150 °C, en particular a 110 °C.

[0076] El compuesto según la invención presenta un espectro de actividad farmacológica impredecible y valioso.

[0077] El compuesto según la invención provoca una vasorrelajación y una inhibición de la agregación plaquetaria, lo que da lugar a una reducción de la presión arterial y a un aumento del flujo sanguíneo coronario. Estos efectos están mediados mediante la estimulación directa de la guanilato ciclasa soluble y un aumento del GMPc intracelular. Además, el compuesto según la invención potencia el efecto de sustancias que aumentan los niveles de GMPc, tales como, por ejemplo, EDRF (factor relajante derivado del endotelio), donantes de NO, protoporfirina IX, ácido araquidónico o derivados de fenilhidrazina.

[0078] Por lo tanto, se puede utilizar en medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tal como, por ejemplo, para el tratamiento de hipertensión e insuficiencia cardíaca, angina de pecho estable e inestable, enfermedades vasculares periféricas y cardiacas, de arritmias, para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas e isquemias tales como infarto de miocardio, apoplejía, ataques transitorios e isquémicos, trastornos de la circulación sanguínea periférica, prevención de reestenosis tal como después de terapias trombolíticas, angioplastias transluminales percutáneas (ATP), angioplastias coronarias transluminales percutáneas (ACTP), derivación, así como para el tratamiento de arteriosclerosis, enfermedades asmáticas y enfermedades del sistema urogenital tales como, por ejemplo, hipertrofia prostática, disfunción eréctil, disfunción sexual femenina, osteoporosis, glaucoma, hipertensión pulmonar, gastroparesia e incontinencia.

[0079] El compuesto según la invención también es adecuado para combatir enfermedades del sistema nervioso central que se caracterizan por alteraciones del sistema NO/GMPc. En particular, es adecuado para mejorar la percepción, la capacidad de concentración, la capacidad de aprendizaje o la capacidad de memoria después de trastornos cognitivos, tales como los que se presentan, en particular, en situaciones/enfermedades/síndromes tales como "deterioro cognitivo leve", trastornos del aprendizaje y de la memoria relacionados con la edad, pérdida de memoria relacionada con la edad, demencia vascular, lesión craneoencefálica, apoplejía, demencia, que se presenta después de apoplejías ("demencia post-apoplejía"), lesión craneoencefálica postraumática, trastornos generales de concentración, trastornos de concentración en niños con problemas de aprendizaje y memoria, enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia con degeneración de lóbulos frontales, incluido el síndrome de Pick, enfermedad de Parkinson, parálisis nuclear progresiva, demencia con degeneración corticobasal, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, degeneración talámica, demencia de Creutzfeldt-Jacques, demencia por VIH, esquizofrenia con demencia o psicosis de Korsakoff. También son adecuados para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central tales como miedo, tensión y depresión, disfunciones sexuales relacionadas con el sistema nervioso central y trastornos del sueño, así como para regular trastornos patológicos de la ingesta de alimentos, estimulantes y sustancias adictivas. Además, el compuesto según la invención también es adecuado para regular el flujo sanguíneo cerebral y, por lo tanto, representa un medio eficaz para combatir las migrañas.

[0080] El compuesto de la invención también es adecuado para la profilaxis y la lucha contra las consecuencias de infarto cerebral (apoplejía cerebral), tales como apoplejía, isquemias cerebrales y lesiones craneoencefálicas. También puede utilizarse para combatir estados de dolor.

[0081] Además, el compuesto según la invención tiene un efecto antiinflamatorio y, por lo tanto, puede utilizarse como agente antiinflamatorio.

[0082] Además, la presente invención también comprende la combinación del compuesto según la invención con uno o más nitratos orgánicos o donantes de NO.

[0083] Los nitratos orgánicos y los donantes de NO, dentro del ámbito de la invención, son generalmente sustancias que ejercen su efecto terapéutico mediante la liberación de NO o, respectivamente, especies de NO. A modo de ejemplo y preferentemente se pueden mencionar: nitroprusiato de sodio, nitroglicerina, dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida, molsidomina y SIN-1.

[0084] Además, la presente invención también comprende la combinación con uno o más compuestos que inhiben la degradación del guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Estos son preferentemente inhibidores de las fosfodiesterasas 1, 2 y 5; nomenclatura según Beavo y Reifsnyder (1990) TiPS 11 páginas 150 a 155. Se prefieren especialmente los inhibidores de la fosfodiesterasa 5 (inhibidores de la PDE V), especialmente uno de los compuestos sildenafilo (Viagra™, documentos EP-A 0 463 756, WO 94/28902), vardenafilo (documento WO 99/24433) o tadalafilo (documento WO 95/19978). Estos inhibidores potencian el efecto de los compuestos según la invención y aumentan el efecto farmacológico deseado.

[0085] Investigaciones biológicas

[0086] Efecto vasorrelajantein vitro

[0087] Se aturden conejos mediante un golpe en la nuca y se desangran. Se extrae la aorta, se libera del tejido adherido, se divide en anillos de 1,5 mm de anchura y se colocan individualmente bajo una tensión inicial en baños de órganos de 5 ml con una solución de Krebs-Henseleit calentada a 37 °C, gaseada con carbógeno, con la siguiente composición (mM): NaCl: 119; KCl: 4,8; CaCl<2>x 2 H<2>O: 1; MgSO<4>x 7 H<2>O: 1,4; KH<2>PO<4>: 1,2; NaHCO<3>: 25; glucosa: 10. La fuerza de contracción se registra con celdas UC2 de Statham, y se amplifica y se digitaliza mediante un convertidor A/D (DAS-1802 HC, Keithley Instruments, Múnich) y se registra en paralelo en un registrador de línea. Para generar una contracción, se añade fenilefrina al baño de forma acumulativa en concentraciones crecientes. Tras varios ciclos de control, se examina la sustancia de ensayo en cada paso posterior en cada caso a una dosis creciente, y la magnitud de la contracción se compara con la magnitud de la contracción obtenida en el paso anterior. A partir de esto se calcula la concentración necesaria para reducir la magnitud del valor de control en un 50% (CI<50>). El volumen de aplicación estándar es de 5 µl y la proporción de DMSO en la solución del baño corresponde al 0,1%.

[0088] El valor de CI<50>para el compuesto del ejemplo 1 (ejemplo de referencia) es de 670 nM, el valor correspondiente para el compuesto del ejemplo 8 es de 500 nM.

[0089] Modelo de conejo

[0090] Se aclimatan conejos chinchilla machos adultos, de 3 a 5 kg de peso, en alojamientos individuales durante varios días tras su recepción. Tienen acceso libre a agua y pueden tomar alimento dos horas al día. Se mantienen en un ciclo de día/noche de 10/14 horas (luz encendida a partir de las 8:00 h) y la temperatura ambiente es de 22 - 24 °C.

[0091] Se utilizan de tres a seis animales por grupo de tratamiento, que se pesan inmediatamente antes del inicio del ensayo. Para la administración intravenosa, las sustancias se disuelven en Transcutol (GATTEFOSSE GmbH) y se diluyen en una proporción de 3:7 con una solución de Cremophor al 20% (Cremophor (BASF), agua). Se inyecta un volumen de 0,5 ml/kg en la vena auricular. Las sustancias hidrosolubles se inyectan en solución salina al 0,9%.

[0092] Para la administración oral, las sustancias de ensayo se disuelven en una mezcla de glicerina: agua: polietilenglicol 6: 10: 9,69 y se administran por sonda nasogástrica en un volumen de 1 ml/kg.

[0093] En condiciones de reposo, el pene del conejo no es visible en la región púbica y está completamente cubierto por la piel del pene. La erección se evalúa midiendo la longitud del pene saliente con un pie de rey. Las mediciones se toman a los 5, 10, 15, 30, 45, 60 y 120 minutos después de la administración de la sustancia; tras la administración oral, también se toman mediciones a las 3, 4, 5 y 6 horas. Cada vez, se retira a los animales de sus jaulas, se les sujeta por el pellejo de la nuca y las patas traseras, se les coloca boca arriba y se realiza la medición. Se llevan a cabo los controles de disolvente pertinentes. (Literatura comparativa: E. Bischoff, K. Schneider, Int. J. of Impotence Res. 2001, 13, 230-235; E. Bischoff, U. Niewoehner, H. Haning, M. Es Sayed, T. Schenke, K. H. Schlemmer, The Journal of Urology, 2001, 165, 1316-1318; E. Bischoff, Int. J. Impotence Res.2001, 13, 146-148).

[0094] La dosis eficaz mínima del compuesto del ejemplo 8 es 0,03 mg/kg cuando se administra por vía oral (con administración concomitante de 0,2 mg/kg i.v. de nitroprusiato de sodio SNP).

[0095] Determinación de parámetros farmacocinéticos tras la administración intravenosa y oral

[0096] La sustancia sometida a ensayo se administra a animales (por ejemplo, ratones, ratas y perros) por vía intravenosa en forma de solución, la administración oral se realiza en forma de solución o suspensión mediante sonda gástrica. Tras la administración de la sustancia, se extrae sangre de los animales en puntos temporales establecidos, esta se hepariniza y se obtiene plasma por centrifugación a partir de la misma. La sustancia se cuantifica analíticamente en el plasma mediante CL/EM/EM. A partir de los perfiles de concentración en plasma-tiempo resultantes, se calculan los parámetros farmacocinéticos mediante un programa farmacocinético validado

[0097] Tras la administración oral de 0,3 y 1,0 mg/kg (como una solución en solutol:EtOH:agua 1:1:8) a la rata, el compuesto del ejemplo 8 muestra las siguientes concentraciones en plasma (AUC):

[0098] AUCnorm (0,3 mg/kg) = 0,326 [kg*h/l];[0099] AUCnorm (1,0 mg/kg) = 0,548 [kg*h/l]

[0100] Inhibición de las enzimas P450 del citocromo

[0101] El potencial de inhibición de las isoenzimas P-450, importantes para el metabolismo, se investiga automáticamente en un formato de 96 pocillos. A este respecto, se utilizan dos ensayos diferentes.

[0102] En el ensayo basado en la formación de metabolitos fluorescentes, se utilizan enzimas recombinantes (por ejemplo, CYP1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 o 3A4) y sustratos que generalmente contienen subestructuras de fluoresceína o cumarina. Se emplea una concentración de sustrato y 8 concentraciones del inhibidor potencial. Tras la incubación con la enzima CYP recombinante respectiva, se determina la medida en metabolitos fluorescentes mediante un lector de fluorescencia en comparación con el control (sin inhibidor) y se calcula el valor de CI<50>[Anal. Biochem.

[0103] 248, 188 (1997)].

[0104] En el 2º ensayo, se utilizan microsomas hepáticos humanos como fuente enzimática, y fenacetina (CYP1A2), diclofenaco (CYP2C9), dextrometorfano (CYP2D6) y midazolam (CYP3A4) como sustratos selectivos de isoformas de CYP. La formación de los respectivos metabolitos se mide mediante CL-EM/EM. Suponiendo una inhibición competitiva, a partir de la reducción en la formación de metabolitos en comparación con el control se calculan los valores de K<i>(1 concentración de sustrato, 3 concentraciones de inhibidor).

[0105] Inducción de enzimas P450 del citocromo en cultivos de células hepáticas humanas

[0106] Para investigar el potencial de efectos secundarios de las sustancias según la invención con respecto a la inducción de enzimas P450 del citocromo, se cultivan hepatocitos humanos primarios con una densidad celular de 2,5 x 10<5>células entre dos capas de colágeno en placas de microvaloración de 24 pocillos a 37 °C al 5% de CO₂ durante 8 días. El medio de cultivo celular se cambia a diario.

[0107] Tras 48 horas de cultivo, los hepatocitos se tratan por duplicado durante 5 días con diferentes concentraciones de las sustancias de ensayo, en comparación con los inductores rifampicina (RIF; 50 µM), omeprazol (OME; 100 µM) y fenobarbital (PB; 2 mM). Las concentraciones finales de las sustancias de ensayo se encuentran entre 0,01 y 10 µg/ml.

[0108] A partir de los cultivos celulares se determina el efecto inductivo de las sustancias de ensayo sobre las enzimas P450 del citocromo (CYP) 1A2, 2B6, 2C19 y 3A4 mediante la adición a los sustratos de 7-etoxiresorufina (CYP1A2), [<14>C]-S-mefenitoína (CYP2B6 y 2C19) y [<14>[C]-testosterona (CYP3A4) el día 8. Se determina el potencial inductivo de las sustancias de ensayo a partir de las actividades enzimáticas de CYP1A2, 2B6, 2C19 y 3A4 así medidas en células tratadas en comparación con células no tratadas. La tabla 1 siguiente muestra los resultados del compuesto del ejemplo 8 en comparación con los inductores RIF, PB y OME.

[0109] Tabla 1: Efecto inductivo sobre actividades de enzimas hepáticas en cultivos de hepatocitos humanos después de 8 días de incubación (normalizado)

[0112]

[0114] Otro objeto de la presente invención son medicamentos que contienen el compuesto según la invención, preferentemente junto con uno o varios excipientes o vehículos farmacológicamente inocuos, y su uso para los fines mencionados anteriormente.

[0115] El principio activo puede actuar sistémica y/o localmente. Para este fin puede administrarse de forma adecuada, tal como, por ejemplo, por vía oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, transdérmica, conjuntival, tópica o en forma de implante.

[0116] Para estas vías de aplicación, el principio activo puede administrarse en formas de administración adecuadas. Para la administración oral son adecuadas las formas de administración conocidas que liberan el principio activo de forma rápida y/o modificada, tales como, por ejemplo, comprimidos (tanto recubiertos como no recubiertos, por ejemplo comprimidos provistos de recubrimiento gastrorresistente o comprimidos recubiertos con película), cápsulas, grageas, granulados, microgránulos, polvos, emulsiones, suspensiones, soluciones y aerosoles.

[0117] La administración parenteral puede realizarse omitiendo la etapa de resorción (intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intraespinal o intralumbar) o incluyendo una resorción (intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitoneal). Las formas de administración adecuadas para la administración parenteral incluyen, entre otras, preparaciones inyectables y para infusión en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizados y polvos estériles.

[0118] Otras formas de administración incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas para inhalación (por ejemplo, inhaladores de polvo, nebulizadores), gotas/soluciones nasales, aerosoles, comprimidos o cápsulas para administración lingual, sublingual o bucal, supositorios, preparaciones para oídos y ojos, cápsulas vaginales, suspensiones acuosas (lociones, mezclas agitadas), suspensiones lipofílicas, ungüentos, cremas, leches, pastas, polvos espolvoreables o implantes tales como, por ejemplo, prótesis endovasculares.

[0119] Los principios activos pueden transformarse en las formas de administración mencionadas mediante procedimientos conocidos. Esto se realiza utilizando excipientes inertes, no tóxicos y farmacéuticamente adecuados. Estos incluyen, entre otros, vehículos (por ejemplo, celulosa microcristalina), disolventes (por ejemplo, polietilenglicoles líquidos), emulsionantes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), dispersantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona), biopolímeros sintéticos y naturales (por ejemplo, albúmina), estabilizantes (por ejemplo, antioxidantes tales como el ácido ascórbico), colorantes (por ejemplo, pigmentos inorgánicos tales como óxidos de hierro) o correctores del sabor y/o el aroma. El principio activo también puede estar presente, dado el caso, en forma microencapsulada en uno o más de los vehículos indicados anteriormente.

[0120] El compuesto terapéuticamente activo del ejemplo 8 debe estar presente en las preparaciones farmacéuticas enumeradas anteriormente en una concentración de aproximadamente el 0,1 al 99,5, preferentemente de aproximadamente el 0,5 al 95% en peso de la mezcla total.

[0121] Las preparaciones farmacéuticas enumeradas anteriormente pueden contener otros principios activos farmacéuticos además del compuesto según la invención.

[0122] En general, se ha demostrado que es ventajoso, tanto en medicina humana como veterinaria, administrar el principio activo según la invención en cantidades totales de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 50, preferentemente de 0,001 a 10 mg/kg de peso corporal cada 24 horas, dado el caso en varias dosis individuales, para lograr los resultados deseados. Una dosis individual contiene preferentemente el principio activo según la invención en cantidades de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 30, en particular de 0,001 a 3 mg/kg de peso corporal.

[0123] La presente invención se describe con más detalle a continuación, con referencia a ejemplos preferidos no limitativos. Salvo indicación contraria, todos los datos de cantidades se refieren a porcentajes en peso. Las relaciones de disolventes, las relaciones de dilución y los datos de concentración de las soluciones líquido/líquido se refieren en cada caso al volumen.

[0124] Abreviaturas:

[0125] ACN acetonitrilo

[0126] BABA acetato de n-butilo/n-butanol/ácido acético glacial/tampón de fosfato pH 6 (50:9:25:15; fase orgánica) DC cromatografía en capa fina

[0127] DCI ionización química directa (en EM)

[0128] DCM diclorometano

[0129] DIEAN,N-diisopropiletilamina

[0130] DMSO dimetilsulfóxido

[0131] DMFN,N-dimetilformamida

[0132] d. t. del valor teórico

[0133] EE acetato de etilo (éster etílico del ácido acético)

[0134] EI ionización por impacto de electrones (en EM)

[0135] ESI ionización por electropulverización (en EM)

[0136] Pf. Punto de fusión

[0137] sat. saturado

[0138] h hora

[0139] HPLC cromatografía líquida de alta presión - alto rendimiento

[0140] conc. concentrado

[0141] CL-EM espectroscopia de masas acoplada a cromatografía líquida

[0142] LDA diisopropilamida de litio

[0143] MCPBA ácido m-cloroperoxibenzoico

[0144] EM Espectroscopia de masas

[0145] RMN espectroscopia de resonancia nuclear

[0146] porc. porcentaje

[0147] R<f>índice de retención (en DC)

[0148] RP- HPLC de fase inversa

[0149] HPLC TA temperatura ambiente

[0150] T<r>tiempo de retención (en HPLC)

[0151] THF tetrahidrofurano

[0152] Eluyente para la cromatografía en capa fina:

[0153] T1 E1: tolueno - éster etílico del ácido acético (1:1)

[0154] T1 EtOH1: tolueno - etanol (1:1)

[0155] C1 E1: ciclohexano - éster etílico del ácido acético (1:1)

[0156] C1 E2: ciclohexano - éster etílico del ácido acético (1:2)

[0157] Procedimientos CLEM y HPLC:

[0158] Procedimiento 1 (CLEM)

[0159] Instrumento: Micromass PlatformLCZ, HP1100; columna: Symmetry C18, 50 mm x 2,1 mm, 3,5 µm; eluyente A: acetonitrilo ácido fórmico al 0,1%, eluyente B: agua ácido fórmico al 0,1%; gradiente: 0,0 min 10% de A 4,0 min 90% de A 6,0 min 90% de A; horno: 40 °C; caudal: 0,5 ml/min; detección UV: 208-400 nm.

[0160] Procedimiento 2 (LCMS)

[0161] Instrumento: Micromass Quattro LCZ, HP1100; columna: Symmetry C18, 50 mm x 2,1 mm, 3,5 µm; eluyente A: acetonitrilo ácido fórmico al 0,1%, eluyente B: agua ácido fórmico al 0,1%; gradiente: 0,0 min 10% de A 4,0 min 90% de A 6,0 min 90% de A; horno: 40 °C; caudal: 0,5 ml/min; detección UV: 208-400 nm.

[0162] Procedimiento 3 (LCMS)

[0164] Instrumento: Waters Alliance 2790 LC; columna: Symmetry C18, 50 mm x 2,1, 3,5 µm; eluyente A: agua ácido fórmico al 0,1%, eluyente B: acetonitrilo ácido fórmico al 0,1%; gradiente: 0,0 min 5% de B 5,0 min 10% de B  6,0 min 10% de B; temperatura: 50 °C; caudal: 1,0 ml/min; detección UV: 210nm.

[0165] Procedimiento 4 (HPLC)

[0166] Instrumento: HP 1100 con detección DAD; columna: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3,5 µm; eluyente: A=5 ml de HClO<4>/l de H<2>O, B=ACN; gradiente: 0 min 2% de B, 0,5 min 2% de B, 4,5 min 90% de B, 6,5 min 90% de B; caudal: 0,75 ml/min; temp.: 30 °C; detección UV 210 nm.

[0167] RP-HPLC preparativa

[0168] Columna: YMC-Gel; eluyente: acetonitrilo/agua (gradiente); caudal: 50 ml/min; temp.: 25 °C; detección UV 210 nm. Compuestos de partida

[0169] Ejemplo 1A

[0170] Éster etílico del ácido 5-amino-1-(2-fluorobencil)-pirazol-3-carboxílico

[0173]

[0175] Se añaden 100 g (0,613 mol) de sal sódica del éster etílico del ácido cianopirúvico (preparado de forma análoga a Borsche y Manteuffel, Liebigs Ann.1934, 512, 97) a 111,75 g (75 ml, 0,98 mol) de ácido trifluoroacético en 2,5 l de dioxano a temperatura ambiente, en atmósfera de argón y con agitación vigorosa, y se agita durante 10 minutos, disolviéndose una gran parte del educto. A continuación, se añaden 85,93 g (0,613 mol) de 2-fluorobencilhidrazina y se calienta a reflujo durante la noche. Tras enfriar, los cristales precipitados de trifluoroacetato de sodio se separan mediante filtración con succión, se lavan con dioxano y la solución se hace reaccionar posteriormente en bruto.

[0176] Ejemplo 2A

[0177] Éster etílico del ácido 1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxílico

[0180]

[0182] A la solución obtenida a partir del ejemplo 1A se añaden 61,25 ml (60,77 g, 0,613 mol) de dimetilaminoacroleína y 56,28 ml (83,88 g, 0,736 mol) de ácido trifluoroacético y se hierve en atmósfera de argón durante 3 días. A continuación, el disolvente se evapora al vacío, el residuo se disuelve en 2 l de agua y se extrae tres veces con, cada vez, 1 l de éster etílico del ácido acético. Las fases orgánicas combinadas se secan con sulfato de magnesio y se concentran en el evaporador rotatorio. Se cromatografía en 2,5 kg de gel de sílice y la mezcla se eluye con un gradiente de tolueno/tolueno-éster etílico del ácido acético de 4:1. Rendimiento: 91,6 g (49,9% d. t. en dos etapas).

[0183] Punto de fusión 85 °C

[0184] T<r>(SiO<2>, T1 E1): 0,83.

[0185] Ejemplo 3A

[0186] 1-(2-Fluorobencil)-1 H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-carboxamida

[0189]

[0191] Se disponen 10,18 (34 mmol) del éster obtenido en el ejemplo 2A en 150 ml de metanol, que está saturado con amoniaco a 0- 10 °C. La mezcla se agita durante dos días a temperatura ambiente y a continuación se concentra al vacío.

[0192] T<r>(SiO<2>, T1 E1): 0,33.

[0193] Ejemplo 4A

[0194] 3-Ciano-1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina

[0197]

[0199] Se disuelven 36,1 g (133 mmol) de 1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxamida del ejemplo 3A en 330 ml de THF y se añaden 27 g (341 mmol) de piridina. A continuación, durante 10 minutos, se añaden 47,76 ml (71,66 g, 341 mmol) de anhídrido trifluoroacético, elevándose la temperatura hasta 40 °C. La mezcla se agita durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, se vierte la preparación en 1 l de agua y se extrae tres veces con 0,5 l de éster etílico del ácido acético cada vez. La fase orgánica se lava con una solución saturada de bicarbonato sódico y con ácido clorhídrico 1 N, se seca con sulfato de magnesio y se concentra en un evaporador rotatorio.

[0200] Rendimiento: 33,7 g (100% d. t.)

[0201] Punto de fusión: 81 °C

[0202] T<r>(SiO<2>, T1 E1): 0,74.

[0203] Ejemplo 5A

[0204] Éster metílico del ácido (2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboximida

[0207]

[0209] Se disuelven 30,37 g (562 mmol) de metilato de sodio en 1,5 l de metanol y se añaden 36,45 g (144,5 mmol) de 3-ciano-1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (del ejemplo 4A). Se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y se utiliza la solución resultante directamente en la etapa siguiente.

[0210] Ejemplo 6A

[0211] 1-(2-Fluorobencil)1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxamidina

[0214]

[0216] La solución de éster metílico del ácido (2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]-piridina-3-carboximida obtenida del ejemplo 5A en metanol se trata con 33,76 g (32,19 ml, 562 mmol) de ácido acético y 9,28 g (173 mmol) de cloruro de amonio y se agita a reflujo durante la noche. El disolvente se evapora al vacío, el residuo se tritura completamente con acetona y el sólido precipitado se separa mediante filtración con succión. Se vierte en 2 litros de agua, se añaden 31,8 g de carbonato de sodio con agitación y se extrae tres veces con un total de 1 litro de éster etílico del ácido acético, se seca la fase orgánica con sulfato de magnesio y se evapora al vacío.

[0217] Rendimiento 27,5 g (76,4% d. t. en dos etapas)

[0218] P. de fus: 86 °C

[0219] T<r>(SiO<2>, T1 EtOH1): 0,08.

[0220] Ejemplo 7A

[0221] 2-[1-(2-Fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-[(E)fenildiazenil]-4,6-pirimidindiamina

[0222]

[0224] A una solución agitada de 21,92 g (71,7 mmol) de 1-(2-fluorobencil)1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxamidina en N,N-dimetilformamida del ejemplo 6A, se añaden 3,87 g de metóxido de sodio, seguidos de 12,2 g (71,7 mmol) de fenilazolomonitrilo (L. F. Cavalieri, J. F. Tanker, A. Bendich, J. Am. Chem. Soc., 1949, 71, 533). La mezcla se agita durante la noche a 110 °C y se deja enfriar. El sólido precipitado a este respecto se separa mediante filtración con succión y se lava con etanol. Tras el secado, se obtienen 23 g (73% d. t.) del compuesto objetivo.

[0225] Ejemplo 8A

[0226] Triclorhidrato de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-4,5,6-pirimidintriamina

[0229]

[0231] Se hidrogenan 5 g (11,38 mmol) de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-[(E)-fenildiazenil]-4,6-pirimidindiamina del ejemplo 7A con 800 mg de níquel Raney al 50% en agua en 60 ml de DMF durante 22 horas a 65 bar de presión de hidrógeno y 62 °C. El catalizador se separa mediante filtración con succión sobre tierra de diatomeas, la solución se evapora al vacío y se agita con ácido clorhídrico 5 N. El precipitado marrón amarillento resultante se separa mediante filtración con succión y se seca. Se obtienen 3,1 g (59,3% d. t.) del compuesto objetivo. La base libre se obtiene mediante extracción con solución diluida de bicarbonato sódico y extracción con éster etílico del ácido acético. El sólido, insoluble en ambas fases, se separa mediante filtración con succión. La fase de éster etílico del ácido acético también contiene pequeñas cantidades de la base libre.

[0232] Ejemplo 9A

[0233] Cianometil(metil)carbamato de metilo

[0234]

[0236] Preparación análoga a: Q. Li. Chu, T.W. Daniel, A. Claiborne, C.S. Cooper, C.M. Lee, J. Med. Chem.1996, 39, 3070-3088.

[0237] Ejemplo 10A

[0238] (E)-2-Ciano-2-[(metoxicarbonil)(metil)amino]etenolato de sodio

[0241]

[0243] En atmósfera de argón, se añaden 0,46 g (0,01 mmol) de metilato de sodio a tetrahidrofurano (solución A). A continuación, se añaden 1,00 g (0,01 mmol) de cianometil(metil)carbamato de metilo del ejemplo 9A a 1,73 g (0,02 mmol) de éster etílico del ácido fórmico. La solución A se añade lentamente gota a gota a esta mezcla. La mezcla se agita durante a noche a temperatura ambiente. El disolvente se concentra al vacío en un evaporador rotatorio y se añade al residuo dietil éter. Los cristales precipitados se separan mediante filtración con succión y se secan al alto vacío.

[0244] Rendimiento: 1,05 g (76% d. t.)

[0245] HPLC (Procedimiento 4): T<r>= 1,3 min.

[0247] <1>H-RMN (200 MHz, DMSO-d<6>): δ = 2,90 (d, 1H), 3,35 (s, 3H), 3,47 (s, 3H).

[0248] Ejemplos

[0249] Ejemplo 1 (Ejemplo de referencia)

[0250] 4-Amino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinil-(metil)carbamato de etilo

[0253]

[0254] En atmósfera de argón, se disuelven 0,80 g (2,61 mmol) de 1-(2-fluorobencil)1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-carboxamidina del ejemplo 6A, 0,51 g (2,86 mmol) de (E)-2-ciano-2-[(metoxicarbonil)(metil)amino]etenolato de sodio del ejemplo 10A y 0,53 g (5,23 mmol) de trietilamina en 50 ml de tolueno. La mezcla se calienta a reflujo durante 9 horas. A continuación, se enfría a temperatura ambiente, se añade diclorometano y agua, y se extrae. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se separa mediante filtración y se concentra al vacío en un evaporador rotatorio. Al residuo se añaden 5 ml de dietil éter y, a este respecto, cristaliza. Los cristales se separan mediante filtración con succión, se secan y se purifican mediante RP-HPLC preparativa.

[0255] Rendimiento: 20,2 mg (2% d. t.)

[0256] CL/EM (Procedimiento 2): T<r>= 3,01 min

[0257] EM (EI): m/z = 408 (M+H)<+>

[0259] <1>H-RMN (300 MHz, DMSO-d<6>): δ = 3,09 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 5,83 (s, 2H), 7,09-7,42 (m, 5H), 8,20 (s, 1H), 8,64 (dd, 1H).8,94 (dd, 1H), 9,27 (s a, 2H).

[0260] Ejemplo 2 (Ejemplo de referencia)

[0261] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de etilo

[0263]

[0265] Se añaden 107,35 mg (0,31 mmol) de triclorhidrato de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-4,5,6-pirimidintriamina del ejemplo 8A a 5 ml de piridina y la mezcla se enfría a 0 °C. A continuación, se añaden 33,25 mg (0,31 mmol) de éster etílico del ácido clorofórmico y se deja la reacción con agitación durante toda la noche a TA. La piridina se concentra en el evaporador rotatorio al vacío y el residuo se purifica mediante RP-HPLC preparativa.

[0266] Rendimiento: 56,2 mg (43% d. t.)

[0267] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 2,66 min

[0268] EM (EI): m/z = 423 (M+H)<+>

[0270] <1>H-RMN (300 MHz, DMSO-d<6>): δ = 1,17-1,33 (m, 3H), 3,97-4,14 (m, 2H), 5,80 (s, 2H), 6,14 (s a, 4H), 7,07-7,17 (m, 2H), 7,22 (t, 1H).7,29-7,40 (m, 2H), 7,97 (s a, 1H), 8,60 (d, 1H), 9,07 (d, 1H).

[0272] )

[0273] empo empo e re erenca

[0275] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de isopropilo

[0278]

[0280] Preparación análoga a la del ejemplo 2, utilizando 150 mg (0,43 mmol) de triclorhidrato de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-4,5,6-pirimidintriamina del ejemplo 8A, 7,5 ml de piridina y 52,47 mg (0,43 mmol) de cloroformiato de isopropilo. El residuo se recoge en una mezcla de diclorometano/metanol, se separa mediante filtración y se seca.

[0281] Rendimiento: 165 mg (88% d. t.)

[0282] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 2,84 min

[0283] EM (EI): m/z = 437 (M+H)<+>

[0285] <1>H-RMN (300 MHz, DMSO-d<6>): δ = 1,26 (d, 6H), 4,82 (quin., 1H), 5,92 (s, 2H), 7,07-7,20 (m, 2H), 7,25 (t, 1H).

[0286] 7,31-7,43 (m, 2H), 7,47-7,57 (m, 1H), 8,16 (s a, 1H), 8,74 (dd, 1H), 8,98 (dd, 1H).

[0287] Ejemplo 4 (Ejemplo de referencia)

[0288] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de neopentilo

[0289]

[0291] Preparación análoga a la del ejemplo 2, utilizando 100 mg (0,29 mmol) de triclorhidrato de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-4,5,6-pirimidintriamina del ejemplo 8A, 5 ml de piridina y 43 mg (0,29 mmol) de clorurocarbonato de neopentilo.

[0292] Rendimiento: 54 mg (41% d. t.)

[0293] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 3,10 min

[0294] EM (EI): m/z = 465 (M+H)<+>

[0296] <1>H-RMN (400 MHz, DMSO-d<6>): δ = 0,95 (s a, 9H), 3,74 (s, 2H), 5,79 (s, 2H), 6,10 (s a, 4H), 7,08-7,17 (m, 2H).

[0297] 7,22 (t, 1H), 7,29-7,39 (m, 2H), 8,00 (s a, 1H), 8,60 (dd, 1H), 9,06 (dd, 1H).

[0298] Ejemplo 5

[0299] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de metilo

[0300]

[0303] Se disuelven 30,5 g (87,0 mmol) de triclorhidrato de 2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,-b]piridin-3-il]-4,5,6-pirimidintriamina del ejemplo 8A en 30 ml de piridina. La solución resultante se enfría a 0 °C. Se añaden 8,22 g (87,0 mmol) de éster metílico del ácido clorofórmico y la mezcla se agita durante 2 horas más a 0 °C. A continuación, se deja calentar a temperatura ambiente y se agita durante 12 horas adicionales. Tras la concentración al vacío, el residuo se lava con agua y se seca. Para una purificación adicional, se agita en 300 ml de dietil éter hirviendo. El producto precipitado se separa mediante filtración con succión y se seca al vacío. Rendimiento: 32,6 g (92% d. T.)

[0304] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 2,61 min

[0305] EM (EI): m/z = 409 (M+H)<+>

[0307] <1>H-RMN (400 MHz, DMSO-d<6>): δ = 3,61 (s, 3H), 5,80 (s, 2H), 6,19 (s a, 4H), 7,08-7,16 (m, 2H).7,22 (t, 1H), 7,28-7,39 (m, 2H), 7,99 (s a, 1H), 8,60 (dd, 1H), 9,05 (dd, 1H).

[0308] Ejemplo 6 (Ejemplo de referencia)

[0309] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinil(metil)carbamato de etilo

[0310]

[0312] Se añaden 54 mg (0,13 mmol) de 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo-[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de etilo del ejemplo 3 a 5 ml de DMF, se enfría la mezcla a 0 °C y se añaden 7,67 mg (0,19 mmol) de hidruro sódico. A continuación, se añaden gota a gota 18,14 mg (0,13 mmol) de yodometano y se agita la mezcla durante una hora. Se añade agua a la mezcla y se extrae con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio y se concentran en el evaporador rotatorio. El residuo se purifica en primer lugar mediante cromatografía en columna (eluyente: diclorometano/metanol = 10:1) y, a continuación, mediante RP-HPLC preparativa.

[0313] Rendimiento: 32 mg (58% d. t.)

[0314] CL/EM (Procedimiento 2): T<r>= 2,91 min

[0315] EM (EI): m/z = 437 (M+H)<+>

[0317] <1>H-RMN (200 MHz, DMSO-d<6>): δ = 1,08 (t, 3H), 2,99 (s, 3H), 2,93-4,11 (m, 2H), 5,79 (s, 2H), 6,35 (s a, 4H), 7,06-7,14 (m, 2H), 7,16-7,28 (m, 1H), 7,28-7,32 (m, 2H).8,59 (dd, 1H), 9,06 (dd, 1H).

[0318] Ejemplo 7 (Ejemplo de referencia)

[0319] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinil(metil)carbamato de isopropilo

[0321] Preparación análoga al ejemplo 6 con 75 mg (0,17 mmol) de 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de isopropilo del ejemplo 3, 10,31 mg (0,26 mmol) de hidruro de sodio y 24,4 mg (0,17 mmol) de yodometano. El residuo se purifica mediante RP-HPLC preparativa.

[0322] Rendimiento: 32 mg (41% d. t.)

[0323] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 2,97 min

[0324] EM (EI): m/z = 451 (M+H)<+>

[0326] <1>H-RMN (300 MHz, DMSO-d<6>): δ = 1,09 (d, 6H), 2,98 (s, 3H), 4,80 (quin., 1H), 5,79 (s, 2H), 6,31 (s a, 4H), 7,05-7,16 (m, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 8,59 (dd, 1H), 9,07 (dd, 1H).

[0327] Ejemplo 8

[0328] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-il]-5-pirimidinil(metil)carbamato de metilo

[0331]

[0332] Preparación análoga a la del ejemplo 6 con 310 mg (0,76 mmol) de 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de metilo del ejemplo 5, 27,32 mg (1,14 mmol) de hidruro de sodio y 215,5 mg (1,52 mmol) de yodometano. Para el procesamiento, a la mezcla se añade agua y una solución de hidróxido de potasio 2 M y se extrae con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se secan con sulfato de magnesio y se concentran en el evaporador rotatorio. El residuo se purifica mediante RP-HPLC preparativa. Rendimiento: 93 mg (29% d. t.)

[0333] También se pueden preparar cantidades mayores del compuesto del ejemplo 8 de acuerdo con el siguiente procedimiento de síntesis:

[0334] Se disuelven 20,0 g (49,0 mmol) de 4,6-diamino-2-(1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]-piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de metilo del ejemplo 5 en 257 ml de tetrahidrofurano y se enfrían a 0 °C. Se añaden gota a gota 53,9 ml (49,0 mmol de una solución 1 M en tetrahidrofurano) de bis-(trimetilsilil)-amida de litio durante 15 minutos. La mezcla se agita durante 20 min a 0 °C y después se añaden 6,95 g (53,9 mmol) de yodometano. Después de una hora, se deja que la mezcla alcance la temperatura ambiente y se detiene la reacción mediante la adición de una solución acuosa saturada de cloruro de amonio. Se separan las fases. La fase acuosa se extrae varias veces con éster etílico del ácido acético y diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se concentran al vacío. El residuo así obtenido se suspende en una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano (1:1). Los cristales insolubles se separan mediante filtración con succión y se recogen en metanol. La mezcla se calienta a reflujo durante una hora. Tras enfriar, se separa mediante filtración el precipitado obtenido. El sólido rojo resultante se suspende en 100 ml de una mezcla de dioxano y diclorometano (1:1) y, en el punto de ebullición, se añaden 20 ml de metanol hasta que se forma una solución transparente. Se añade carbón activado, se deja hervir brevemente y se separa por filtración en caliente sobre tierra de diatomeas. La solución así obtenida se concentra a sequedad. La suspensión se disuelve en metanol y se agita durante una hora a temperatura ambiente. Los cristales blancos se separan mediante filtración con succión.

[0335] Rendimiento: 14,9 g (72% d. t.)

[0336] CL/EM (Procedimiento 3): T<r>= 1,85 min

[0337] EM (EI): m/z = 423 (M+H)<+>

[0339] <1>H-RMN (200 MHz, DMSO-d<6>): δ = 3,01 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 5,92 (s, 2H), 7,05,7.17 (m, 2H), 7,18-7,46 (m, 3H), 7,47-7,61 (m, 2H), 7,59-7,97 (m, 2H), 8,71-8,81 (m, 1H), 8,97 (dd, 1H).

[0340] Ejemplo 9 (Ejemplo de referencia)

[0341] 4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinil(etil)carbamato de isopropilo

[0344]

[0345] Preparación análoga al ejemplo 6 con 60 mg (0,14 mmol) de 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il]-5-pirimidinilcarbamato de isopropilo del ejemplo 3, 4,95 mg (0,21 mmol) de hidruro de sodio y 21,4 mg (0,17 mmol) de yodoetano. Para una conversión completa, se añaden de nuevo las mismas cantidades de hidruro de sodio y yodoetano. El residuo se purifica mediante RP-HPLC preparativa.

[0346] Rendimiento: 43 mg (67% d. t.)

[0347] CL/EM (Procedimiento 1): T<r>= 2,97 min

[0348] EM (EI): m/z = 465 (M+H)<+>

[0350] <1>H-RMN (200 MHz, DMSO-d<6>): δ = 0,96-1,06 (m, 3H), 1,09 (d, 6H), 2,79-2,93 (m, 2H), 4,82 (quin., 1H), 5,80 (s, 2H), 6,25 (s a, 4H), 7,01-7,14 (m, 2H), 7,15-7,50 (m, 3H), 8,60 (dd, 1H), 9,09 (dd, 1H).

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Compuesto con la estructura siguiente:

4,6-Diamino-2-[1-(2-fluorobencil)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-3-il]-5-pirimidinil(metil)carbamato de metilo

así como sus sales, isómeros e hidratos.

2. Procedimiento de preparación del compuesto tal como se define en la reivindicación 1, caracterizado por que se hacen reaccionar

[A] compuestos de la fórmula (la)

en la que

R<4>es metilo,

con compuestos de fórmula (II)

R<3>-X<1>(II),

en la que

R<3>es metilo,

y

X<1>representa un grupo saliente.

3. Compuesto tal como se define en la reivindicación 1 para el tratamiento de enfermedades.

4. Medicamento que contiene al menos el compuesto tal como se define en la reivindicación 1 y al menos un excipiente adicional.

5. Medicamento que contiene al menos el compuesto tal como se define en la reivindicación 1 en combinación con al menos un nitrato orgánico o donante de NO.

6. Medicamento que contiene al menos el compuesto tal como se define en la reivindicación 1 en combinación con al menos un compuesto que inhibe la degradación del guanosín monofosfato cíclico (GMPc).

7. Uso del compuesto tal como se define en la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

8. Uso del compuesto tal como se define en la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de hipertensión.

9. Uso del compuesto tal como se define en la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades tromboembólicas e isquemia.

10. Uso del compuesto tal como se define en la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la disfunción sexual, en particular la disfunción eréctil y la disfunción sexual femenina.

11. Uso según una de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el compuesto tal como se define en la reivindicación 1 se utiliza en combinación con al menos un nitrato orgánico o donante de NO o en combinación con al menos un compuesto que inhibe la degradación de guanosín monofosfato cíclico (GMPc).