ES2318418T3 - Proteinas de fusion recombinantes de la hormona de crecimiento y la albumina de suero. - Google Patents

Proteinas de fusion recombinantes de la hormona de crecimiento y la albumina de suero. Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido que comprende (i) un elemento promoter de levadura y (ii) una secuencia de terminación de transcripción, asociada operativamente en cada caso con un polinucleótido que codifica una proteína de fusion comprendiendo un primer polipéptido al menos 75% idéntico a la hormona de crecimiento (GH) madura humana fusionado a un segundo polipéptido al menos 75% idéntico a una albúmina de suero de vertebrado comprendiendo al menos dos dominios completos de albúmina de suero, en donde dicha levadura es una S. cerevisiae, S. pombe, Pichia (Hansenula) sp., o Kluyveromyces sp.

Description

Proteínas de fusión recombinantes de la hormona de crecimiento y la albúmina de suero.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con proteínas recombinantes de fusión, una hormona de crecimiento (GH), una albúmina de suero y a la producción de proteínas en levadura.
Antecedentes de la invención
La albúmina de suero humano (HSA) es una proteína de 585 aminoácidos, que es responsable de una proporción significativa de la presión de ósmotica de suero y también funciona como un portador de ligandos endógenos y exógenos. Actualmente, HSA es producido para uso clínico desde extracciones de sangre humano. La producción de HA de recombinante (rHA) en microorganismos ha sido descubierto en EP 330 451 y EP 361 991.
El papel de albúmina como una molécula portadora y su naturaleza inerte son las propiedades deseables para ser usado como un estabilizador y transportador de polipéptidos. El uso de albúmina como un componente de una proteína de fusión para otras proteínas estabilizadoras ha sido descubierto en WO 93/15199, WO 93/15200, y EP 413 622. El uso de fragmentos N-terminal de HSA para fusiones de polipéptidos también ha sido descubierto (EP 399 666). La fusión para dichos polipéptidos es lograda por manipulación genética, de forma que el ADN que codifica para HSA, o un fragmento de ella, es unido al ADN que codifica para dicho polipéptido. Un hospedero apropiado es luego transformado o transfectado con la secuencia del nucleótido fusionado, tal arreglo sobre un plásmido apropiado para expresar un polipéptido de fusión. Nomura y col. (1995) intentó expresar la apolipoproteína E humana en S. cerevisiae como una proteína de fusión con HSA o fragmentos de HSA, usando una pre-secuencia de HSA por secreción directa. Mientras la fusión para HSA a longitud completa resultó en la secreción de niveles bajos de la proteína en el medio (se cosecha máximo 6.3 mg/L), la fusión para HSA (1-198) ó HSA (1-390) no resultó en la secreción en al medio.
La hormona de crecimiento humana (examinada por Strobl y Thomas, 1994) consta de un polipéptido simple de 191 aminoácidos, internamente entrelazado por dos puentes disulfuro. Dos moléculas de receptor hGH (Hormona de crecimiento humano, siglas en su expresión inglesa) obligan que cada molécula de hGH facilite la señal de transducción (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992). El C-terminal de la molécula de hGH está involucrado en la unión de primera molécula del receptor, pero en la extensión del N-terminal no es conocido que este involucrado en la unión con el receptor. La hormona es segregada de la glándula pituitaria anterior bajo el control de hipotálamo, y es responsable el N-terminal en un amplio rango de los efectos de promoción del crecimiento en el cuerpo. Clínicamente, el hGH es usado en el tratamiento del enanismo de hipopituiaria, la insuficiencia renal crónica en la infancia, fracturas de hueso y quemaduras. Los métodos en curso para la producción de hGH para uso terapéutico son por la extracción de la glándula pituitaria humana, por expresión en Escherichia coli recombinante como fue descubierto en EP 127 305 (Genentech) o en cultivos de células de mamíferos (Zeisel et al., 1992).
Además, la hGH ha sido expresada intracelularmente en levadura (Tokunaga et al., 1985) y este organismo puede proporcionar medios alternativos de la producción como fue descubierto en EP 60 057 (Genentech). Tsiomenko y col. (1994) reporta sobre el papel de la secuencia de prepro de MF\alpha-1 de la levadura en la secreción de hGH. El adjunto de la secuencia pre-pro para el gene de hGH resultó en la acumulación de hGH en el periplasma y en las vacuolas, mientras el adjunto de la parte pro de hGH resultó en la expresión de un precursor no glicosilado localizado dentro de la célula. Solamente cuando ambas partes de la secuencia leader fueron fijadas al gen de hGH fue secretado la hGH en el medio de cultivo. Otras señales de secreción (pre-secuencias) fueron también menos efectivas que la secuencia pro usada y obtenida de la levadura, sugiriendo que tal secuencia pro es usada como crítica en la secreción eficiente de la hGH en la levadura.
En los seres humanos, la hGH es secretada a la sangre en pulsos, y en la circulación tiene un tiempo de vida media menor de 20 minutos (Haffner et al., 1994). La eliminación de la hormona es principalmente vía el metabolismo en el hígado y los riñones y es más rápido en los adultos que en los niños (Kearns et al., 1991). El tratamiento para la deficiencia de hGH dura de 6 a 24 meses, durante la que se administra la hGH tres veces por semanas intramuscularmente o diariamente en general subcutáneamente. Tal régimen de administración frecuente es necesario debido a la corta vida de la molécula.
Poznansk et al. (1988) incrementan el tiempo de vida de la hormona de crecimiento porcina por la conjugación con albúmina de suero porcina o humana (HSA) para formar un conjugado relativamente grande de aproximadamente 180 kD. La reacción química usando el reactivo glutaraldehído resultó por término medio, en dos moléculas de albúmina complejas con seis moléculas de hormona de crecimiento. El conjugado de 180 kD resultante se observó que tiene un tiempo de vida prolongada en la circulación de ratas de 2 a 3 horas, comparado con los 5 minutos para la hormona de crecimiento no conjugada. El ensayo de actividad muestra que el conjugado retenido completamente conserva la actividad completa, y posiblemente aumenta la actividad in vitro, pero es inactivo in vivo.
Sleep et al. (1990) Biotechnology, 8, 42-46 presentan la secreción de la albúmina humana a partir de S. cerevisiae usando varias secuencias líder.
La EP 387 319 (Delta biotechnology Ltd) presenta la expresión en S. cerevisiae de proteínas de fusión que contienen albúmina usando la secuencia líder factor-\alpha y el terminador y promotor PGK.
Hiramatsu et al. (1990) Appl. Env. Microbiol. 56, 2125-2132 presentan el uso de el pre-pro-péptido Mucor pusillus para proporcionar la secreción de la hormona de crecimiento en S. cerevisiae.
Resumen de la invención
La invención se relaciona con polinucleótidos como se definen en la Reivindicación 1. Éstos codifican proteínas formadas por la fusión de una molécula de albúmina, o variantes o fragmentos de ella, una molécula de hormona de crecimiento o variantes o fragmentos de ella, proteínas de fusión que tienen un aumento en el tiempo de vida circulatorio sobre la hormona de crecimiento no fusionada. Por conveniencia, haremos referencia a albúmina humana (HA) y a hormona de crecimiento humana (hGH), pero la albúmina y las hormonas de crecimiento de otros vertebrados son incluidas también. Preferentemente, la proteína de fusión comprende HA, o una variante o fragmento de ella, como la parte N-terminal, con hGH o una variante o fragmento de ella, como la parte C-terminal para minimizar cualquier efectos en contra posibles sobre la unión del receptor. Por otra parte, una proteína de fusión que comprende HA, o una variante o fragmento de ella, como la parte C-terminal, con hGH o una variante o fragmento de ella como la parte N-terminal, podría ser también capaz de una señal de transducción. En general, el polipéptido tiene solamente una región derivada HA y una región derivada GH.
Además, las proteínas de fusión de la invención podrían incluir un péptido de enlace entre las dos partes unidas para proporcionar una separación física más grande entre los dos mitades y maximizar la disponibilidad de la parte de hGH, para unir el receptor de hGH. El péptido enlace podría constar de aminoácidos de forma que es flexible o más rígido.
Nosotros hemos descubierto que los polipéptidos de la invención son significativamente más estables en solución que la hGH. El último rápidamente se convierte inactivos cuando se guarda en solución a 4ºC por más de un mes. La hGH actualmente comercializable se vende como un polvo liofilizado.
Convenientemente, los polipéptidos de fusión son producidos como moléculas recombinantes por secreción desde levadura, microorganismos como bacterias línea de células de humanos o levadura. Preferentemente, el polipéptido es secretado del hospedero. Hemos descubierto que uniendo la secuencia de codificación de la hGH a la secuencia de codificación de HA, al extremo 5' o al 3', es posible secretar la proteína de fusión desde la levadura sin el requerimiento de una secuencia pro derivada de la levadura. Esto fue sorprendente, ya que otros autores han descubierto que la secuencia pro derivada de levadura es necesaria para la secreción eficiente de la hGH en levadura. Por ejemplo, Hiramitsu y col. (1990, 1991) descubrió que la parte N-terminal de la secuencia pro Mucor pusillus rennin fue importante. Los otros autores, usan la señal de MF\alpha-1, que tienen siempre incluido la secuencia pro de MF\alpha-1 cuando se secreta la hGH. La secuencia pro se cree que ayuda al plegamiento de la hGH cuando actúa como un chaperone intramolecular. La presente invención muestra que la HA o los fragmentos de HA pueden desempeñar una función similar.
Por tanto, una realización particular de la invención consta de una construcción de ADN que codifica una secuencia señal efectiva para direccionar la secreción en levadura, particularmente una secuencia señal derivada de la levadura (especialmente una que es homologa al hospedero de la levadura), y la molécula fusionada del primer aspecto de esta invención, siendo la secuencia pro no derivada de la levadura entre la señal y el polipéptido maduro.
La señal invertasa de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo preferido de una señal derivada de levadura.
Los conjugados del tipo preparado por Poznansky et al. (1988), en el que los polipéptidos preparados por separado son unidos por acoplamiento químico, no se contemplan.
La albúmina o la hGH podrían ser una variante de HSA/rHA normal (llamada en lo adelante como "HA") o hGH, respectivamente. Por "Variantes" se incluyen las inserciones, las deleciones y las sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, donde no se alteran considerablemente los cambios en una o más presencia de tumores, convenientemente las propiedades de unión al ligando y no inmunogenidad de la albúmina o, en el caso de la hGH, es su no inmunogenicidad y la capacidad de ligar y activar el receptor de hGH. En lo particular, incluimos variantes polimórficas que ocurren naturalmente de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana, por ejemplo esos fragmentos revelan en EP 322 094 (concretamente HA (1-n), donde n es 369 hasta 419). La albúmina o la hormona de crecimiento pueden ser de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo humano, vaca, ovejas, cerdo, gallina o salmonas. La albúmina y las partes de la GH de la fusión pueden ser de animales diferentes.
Por "sustituciones conservadoras" se entienden los intercambios dentro de los grupos tales como Gly, Ala; Val, He, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. La variante de GH tendrá al menos 75% (preferentemente al menos 80%, 90%, 95% ó 99%) de la secuencia idéntica con hormona de crecimiento humana en cuanto la excepción se hace para las deleciones y las inserciones como se acostumbra en el estado de la técnica. Una variante de HA tendrá secuencia de identificación al menos el 75% de los dos dominios enteros de HA, por ejemplo de dominios 1 + 2 (1-387), 2 + 3 (195-585) ó 1 + 3 (1-194, + 388-585). Cada dominio en sí se hace de dos subdominios homologos nombrados 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, concretamente con un subdominio flexible de regiones de enlace que consta de los residuos Lys106 hasta Glu199, Glu292 hasta Val315 y Glu492 hasta Ala511. La variante de hGH que debe tener actividad de GH, y de al menos 150, 180 ó 191 aminoácidos preferentemente manteniendo sus cisteínas para ambos puentes disulfuro internos.
Las moléculas fusionadas de la invención en general tienen un peso molecular de al menos 100 kD, por ejemplo menor que 90 kD o 70 kD. Son por lo tanto mucho más pequeñas que los conjugados de 180 kD de (Poznansky et al. (referidos arriba), que eran inactivo in vivo.
La mayoría entra dentro de un rango de peso molecular de 60-90 kD.
Un segundo aspecto principal de la invención es proporcionar una levadura transformada para expresar una proteína de fusión.
Además de las células del hospedero transformadas en ella misma, la presente invención también considera un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo de monoclonales (clonalmente homogéneo), o un cultivo obtenido desde un cultivo de monoclonal, en un medio nutriente. Especialmente si el polipéptido se secreta, el medio entonces contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células, si ha sido filtrado o centrifugado.
Muchos sistemas de expresión son conocidos, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y bacilo sublilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentoso (por ejemplo Aspergillus), células de planta, células de animal y células de insecto.
La proteína deseada se produce de manera convencional, por ejemplo desde una secuencia de codificación que es insertada en el cromosoma del hospedero o en un plásmido libre.
Las levaduras son transformadas con una secuencia de codificación para la proteína deseada en cualquiera de las maneras acostumbradas, por ejemplo electroporación. Los métodos para la transformación de la levadura por electroporación son revelados en Becker & Guarente (1990) Methods Enzimol. 194, 182.
Las células con éxito transformadas, es decir las células que contienen una construcción de ADN de la invención actual, puede ser identificado por las técnica conocidas. Por ejemplo, las células que resultan con la introducción de una construcción de expresión pueden ser cultivadas para producir el polipéptido deseado. Las células pueden ser cosechadas y lisadas y su contenido de ADN se examina la presencia del ADN usando un método tales como describe Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 ó Berent y col. (1985) Biotech. 3, 208. Alternadamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante puede ser detectado usando anticuerpos.
Los vectores de plásmido de levadura útiles incluyen pRS403-406 y pRS413- 416 y están en general disponible desde Stratagrene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrados a la levadura (Yips) y se incorporan marcadores de selección de la levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. El pRS413 - 416 son de Yeast Centromere (YCps).
Una variedad de métodos han sido desarrollados para operar la unión del ADN a vectores de vía complementaria y cohesiva a terminales. Por ejemplo la región de homopolímero complementario puede ser adicionando al segmento de ADN e insertar al vector de ADN. El vector y el segmento de ADN son unidos por enlaces de hidrógeno entre las colas de homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Los enlazadores sintéticos que contienen uno ó más sitios de restricción proporcionan un método alternativo de unión al segmento de ADN para los vectores. El segmento de ADN, generado por la digestión de restricción de endonucleasa, se trata con un bacteriográfo de ADN T4 polimerasa o polimerasa I de ADN E. coli, las enzimas que se remueven salen del sitio, extremo terminal de hebra simple 3' con su actividad exonucleoliticas 3'- 5' y completa recesa su actividad polimerasa en el extremo 3'.
La combinación de estas actividades genera los segmentos de ADN punta y extremo. Los segmentos punta - extremo son incubados y luego con un exceso molar grande de enlace de las moléculas en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligación de moléculas de ADN punta - extremo, como ADN ligasa bacteriofago T4. Por lo tanto, los productos de la reacción son los segmentos de ADN que traen secuencias de enlaces poliméricas a sus extremos. Estos segmentos de ADN son cortados luego con enzima de restricción apropiada y ligados a un vector de expresión que ha sido cortado con una enzima que produce extremos compatibles con esos segmentos de ADN.
Enlaces sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasas de restricción están comercialmente disponibles de varias fuentes incluyendo Internacional Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.
Una forma deseable de modificar el ADN según la invención, por ejemplo, las variantes de HA son y serán preparadas, usando la reacción en cadena de polimerasa como se revela por Saiki et al. en Science 239, 487-491 (1988). En este método el ADN será amplificado enzimaticamente y está flanqueado por dos plantillas de oligonucleótido específicas en la que ellos mismos se incluyen en el ADN amplificado. Dicha plantilla específica podría contener sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción que pueden ser usados para reproducir vectores de expresión que usando métodos conocidos en el estado de la técnica.
Los ejemplos de géneros de levadura que se contemplan y son útiles en la práctica de la presente invención como hospederos para expresar las proteínas de fusión son Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y semejantes. Los géneros preferidos son aquellos seleccionados del grupo que consta de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Torulaspora. Ejemplos de Saccharomyces spp. S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora apropiada es T. Delbrueckii. Ejemplos de Pichia (Hansenula) spp son P. Angusta (antes H. polimorpha), P. Anomala (antes H. anomala) y P. Pastoris.
Los métodos para la transformación de S. cerevisiae son enseñados en general en EP 251 744, EP 258 067 y WO 90/01063, todas ellas incluidas aquí en las referencias.
Los promotores apropiados para S. cerevisiae incluyen aquellos relacionados con el gen PGK1, gen GAL1 o GAL10, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, fosfato triosa isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, factor
\alpha-mating feromona, factor a-mating feromona, el promotor PRB1, el promotor GUT2, el promotor GPD1, y los promotores híbridos que involucran híbridos de las partes de las regiones reguladores de 5' con partes de las regiones reguladoras de 5' de otros promotores o con sitios de activación agues arriba (por ejemplo el promotor de EP-A-258 067).
Los promotores regulables convenientes para el uso en Schizosaccharomyces pombe son el promotor del gen represor de tiamina desde el gen nmt como se describe por Maundrell (1990) J. Biol Chem. 265, 10857-10864 y el promotor del gen fbpl represor de glucosa como describe Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.
Los métodos de transformación de Pichia para la expresión de genes foráneos son enseñados, por ejemplo, Cregg et al. (1993), y varias patentes de Phillips (por ejemplo US 4 857 467, incorporada esta en la referencia), y el equipo de expresión de Pichia comercialmente disponible son Invitrogen BV, Leek, Netherlands and Invitrogen Corp., San Diego, California. Los promotores apropiados incluyen AOX1 y AOX2.
Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 incluye la información sobre los vectores de Hansenula, transformación y los promotores apropiados siendo MOX1 y FMD1; mientras que en EP 361 991, Fleer et al. (1991) y otras publicaciones de Rhone-Poulenc Rorer enseñan cómo expresar proteínas fóraneas en Kluyveromyces spp., siendo un promotor apropiado PGK1.
La señal de terminación de transcripción es preferentemente la secuencia de flanqueo 3' de un gen eucariota que contiene las señales propias para la terminación de la transcripción y poliadenilación 3'. Las secuencias de flanqueo apropiadas podrían ser aquellos genes unidos a la secuencia de control de la expresión usada naturalmente, por ejemplo, podría corresponderse con la del promotor. Por otra parte, podrían ser diferentes y en tal caso la señal de terminación del gen ADH1 de S. cerevisiae es preferida.
La proteína de fusión deseada puede ser expresada inicialmente con una secuencia guía efectiva de secreción, que puede ser cualquier guía efectivo en la levadura escogida. Guías útiles de S. cerevisiae incluyen desde el polipéptido del factor de apareamiento (MF\alpha-1) y el guía híbrido de la EP-A-387 319. Tales guías (o señales) son cortados por la levadura antes de que la albúmina madura sea liberada en el entorno circundante. Además tales guías incluyen la invertasa S. cerevisiae (SUC2) que reveló en JP 62-096086 (conferida como 91/036516), ácido fosfatasa (PHO5), la pre-secuencia de MF\alpha-1, \beta-glucanasa (BGL2) y toxina asesina; glucoamilasa II de S. diastaticus; \alpha-galactosidasa de S carlsbergensis (MEL1); toxina asesina de K. lactis; y glucoamilasa de Candida.
La proteína de fusión de la invención o una formulación de ella misma puede ser administrada por cualquier método convencional incluyendo la parenteral (por ejemplo subcutanea o intramuscular) la inyección o la infusión intravenosa. El tratamiento podría constar de una sola dosis o una pluralidad de dosis durante un período de
tiempo.
Mientras es posible que una proteína de fusión de la invención se administre sola, es preferible presentarla como una formulación farmacéutica, con uno o más portadores aceptables. El portador (s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con la proteína de fusión y no nocivo a los receptores de ella. Típicamente, los portadores son el agua o salina que será estéril y libre de pirógenos. La formulación debe ser no inmunogénica; formulaciones tipo vacuna que involucran adyuvantes no son consideradas.
Las formulaciones pueden ser presentadas en la forma de dosis unitaria convenientemente y pueden ser preparados por alguno de los métodos conocidos en el arte de farmacia. Tales métodos incluyen el paso de traer la proteína de fusión en la asociación con el portador que constituye uno ó más ingredientes de accesorios. En general las formulaciones son preparadas uniformemente e íntimamente traen en asociación el ingrediente activo con el portador líquidos o sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dar forma al producto.
Las formulaciones apropiadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas ó no acuosas de inyección estériles que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que dan la formulación isotónica con la sangre del receptor futuro; y suspensiones estériles acuosas y no acuosa que pueden incluir agentes suspendidos y agentes espesante. Las formulaciones pueden ser presentadas en dosis unitaria o contenedores multidosis, por ejemplo ampolletas selladas y viales, pueden ser almacenadas en una condición liofilizada que requiere solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo el agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Soluciones de inyección extenporaneas y suspensiones pueden ser preparadas como polvos estériles.
Las formulaciones de dosis unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad la subdosis diaria o una fracción apropiada de ella misma, de un ingrediente activo.
Las proteínas de fusión de la invención pueden ser usadas en el tratamiento de cualquier condición en la que la hormona de crecimiento es muestrada por ejemplo la deficiencia de hormona de crecimiento aislada, panhipopituitarismo, irradiación craneal (por ejemplo en el tratamiento de la leucemia o los tumores cerebrales), el síndrome de Turner, el síndrome de Down, el retardo de crecimiento intrauterino, la deficiencia de crecimiento idiopático, la insuficiencia renal crónica, acondroplasia, varios trastornos catabólicos como infertilidad del sexo femenino. También pueden ser usados en la estimulación del crecimiento, y/o aumento de la proporción de carne sin grasa, en animales de granja como vacas, ovejas, cabras y cerdos.
La proteína de fusión puede ser administrada junto con factores de crecimiento como insulina (IGF-I).
La dosis puede ser calculada sobre la base de la potencia relativa de la proteína de fusión en comparación con la potencia de la hGH, mientras tomamos en cuentas la prolongación del tiempo de vida en suero de las proteínas de fusión comparadas con la hGH nativa. La hormona de crecimiento es administrada típicamente de 0,3 a 30,0 IU/kg/semana, por ejemplo 0,9 a 12,0 IU/kg/semana, en tres o siete dosis divididas por un año ó más. En una proteína de fusión que consta de la HA fusionada completa unida a la GH completa, la dosis equivalente en término de unidades, representa un peso mayor pero la frecuencia de dosis puede ser reducida, por ejemplo a dos veces a la semana, una vez a la semana ó menos.
Los ejemplos preferidos de la invención serán descritos en forma de ejemplo con las referencias a las figuras que lo acompañan, en las cuales:
Figura 1 muestra la secuencia de cADN de la hormona de crecimiento humana, codificando para la hGH madura;
Figura 2 muestra un mapa de enzima de restricción del pHGH1;
Figura 3 muestra un mapa de enzima de restricción de pBST (+) y la secuencia de ADN del policonectador;
Figura 4 muestra la construcción de pHGH12;
Figura 5 muestra la construcción de pHGH16;
Figura 6 muestra la secuencia de ADNc de HSA, más particularmente la región que codifica para la proteína madura;
Figura 7 muestra la construcción de pHGH14;
Figura 8 muestra la construcción de pHGH38;
Figura 9 muestra la construcción de pHGH31;
Figura 10 muestra la construcción de pHGH58 o pHGH59 (ejemplo 7);
Figura 11 es un esquema para formular construir separadores que tienen fusiones (ejemplo 7); y
Figura 12 muestra los resultados de un estudio farmacocinético mostrando que la eliminación de rHA-hGH marcada conI comparándola con la inyección IV en ratas. Los datos son de dos ratas en cada grupo, e incluyen la radiactividad total y la radiactividad que podían ser precipitada por TCA, es decir que esta relacionada con la proteína preferentemente como ^{125}I libre. El período de vida calculado para la hGH es aproximadamente 6 minutos, comparado con los aproximadamente 60 minutos para la proteína de fusión de rHA - hGH. Ver ejemplo 3.
\sqbullet - hGH (conteo total)
\blacksquare - hGH (conteo TCA precipitado)
\ding{116} - rHA-hGH (conteo total)
\ding{115} - rHA-hGH (conteo TCA precipitado).
Descripción detallada de la invención
Todos los procedimientos de ADN recombinante usados como se describe en Sambrook y col. (1989) a menos de otra manera por lo demás. Las secuencias de ADN que codifican HSA fueron obtenidas desde el ADNc revelado en la EP 201 239.
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Ejemplo 1
Clonación del ADNc de hGH
El ADNc de la hGH fue obtenido de una librería de ADNc de glándula pituitaria humano (número de catálogo HL1097v, Clontech Laboratories, Inc) por la amplificación de PCR. Dos oligonucleótidos apropiados para la amplificación de PCR del ADNc de hGH, HGH1 y HGH2, fueron sintetizados usando un Applied Biosystems 380B Oligonucleotido Synthesiser.
HGH1:
5' - CCCAAGAATTCCCTTATCCAGGC - 3'
HGH2:
5' - GGGAAGCTTAGAAGCCACAGGATCCCTCCACAG - 3'
Las HGH1 y HGH2 son diferidos de la parte equivalente de la secuencia de ADNc de la hGH (Figura 1, Martial et al., 1979) por dos y tres nucleótidos, respectivamente, de forma que después de la amplificación de PCR a un sitio de EcoRI se introduce en el extremo 5' del ADNc y un sitio de BamHI sería introducido en el extremo 3' del ADNc. Además, la HGH2 contenía un sitio HindIII inmediatamente aguas abajo de la secuencia de la
hGH.
La amplificación de PCR usando un Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cycler 9600 and a Perkin-Elmer-Cetus PCR kit, fue llevada a cabo usando una plantilla de ADN de una sola hebra aislada desde partículas de fage de una librería de ADNc de la siguiente manera: 10 \muL de partículas de fago fueron rotas por la adición de 10 \muL de tampón de ruptura para fago (280 \mug/mL de proteínasa k en tampón TE) y la incubación a 55ºC durante 15 minutos seguido por 85ºC por 15 minutos. Después de la incubación de 1 minuto sobre hielo, debris de fago fue comprimido por centrifugación a 14,000 rpm durante 3 minutos. La mezcla de PCR conteniendo 6 \muL de esta plantilla de ADN, 0,1 \muM de de cada plantilla y 200 \muM de cada deoxiribonucleótido. El PCR fue llevado a cabo por 30 ciclos, desnaturalizando a 94ºC por 30 s, y endureciendo a 65ºC por 30 s y extendiendo a 72ºC por 30 s, incrementando el tiempo de extensión por 1 s por ciclo. El análisis de la reacción por electroforesis en gel muestra un solo producto con el tamaño esperado (589 pares de bases).
El producto de PCR fue purificado usando como Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp) y luego digerido con EcoRI y el Hind III después de la purificación posterior del fragmento EcoRI - HindIII por gel de electroforesis, el producto fue clonado en pUC19 (GIBCO BRL) digerido con EcoRI e HindIII, para dar pHGH1 (Figura 2). Secuencia de ADN de la región EcoRI - HindIII muestra que el producto de PCR era idéntico a la secuencia de la hGH (Martial y col., 1979), excepto en los extremos 5' y 3', donde los sitios de EcoRI y BamHI son introducidos, respectivamente.
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Ejemplo 2
Expresión del ADNc de hGH
La secuencia del polilinker del fagomidio pBluescribe (+) (Stratagene) fue reemplazado insertando un oligonucléotido de enlace, constituido alineación de dos oligonucleótidos 75 mer, entre los sitios de EcoRI y lo HindIII para formar pBST (+) (Figura 3). El nuevo polilinker incluye un sitio de NotI único (la secuencia completa en la región del polilinker es dada en la Figura 3).
La expresión del cartucho NotI HSA de pAYE309 (EP 431 880) consta de el promotor de PRB1, secuencia de ADN que codifica la secuencia líder híbrida de HSA/MF\alpha-1, la secuencia que codifica ADN de la HSA y el terminador ADH1, fue transferido a pBST (+) para formar pHA1 (Figura 4). La secuencia de codificación de HSA fue retirada desde este plásmido por la digestión con HindIII seguida por religación para formar pHA2 (Figura
4).
Clonar el ADNc de hGH, como se describe en Ejemplo 1, proporciona la región de codificación de hGH que carece de la secuencia pro-hGH y los primeros 8 pares de basa (bp) de la secuencia desde la hGH madura. Para construir un plásmido de expresión para la secreción de la hGH de levadura, un promotor de levadura, muestra un péptido señal y los primeros 8 bp de la secuencia de hGH fueron fijadas al extremo 5' de la secuencia de hGH clonada de la siguiente manera:
\newpage
El fragmento HindIII - SfaNI desde pHA 1 fue fijado al extremo 5' del fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1 vía dos oligonucleótidos sintéticos, HGH3 y HGH4:
HGH3:
5' - GATAAAGATTCCCAAC - 3'
HGH4:
5' - AATTGTTGGGAATCTTT - 3'
El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido por HindIII para hacer pHGH2 (Figura 4), de forma que el ADNc de hGH fue colocado aguas abajo del promotor PRB1 y la secuencia líder de fusión de HSA/MFa - 1 (WO 90/01063). El cartucho de expresión NotI contenido en pHGH2, que incluye el terminador ADH1 aguas abajo del ADNc de hGH, fue clonada en pSAC35 digerido por NofI (Sleep et al., 1990) para hacer pHGH12 (Figura 4). Este plásmido consta del plásmido entero 2 \mum para proporcionar las funciones de replicación y el gen LEU2 para la selección de transformantes.
El pHGH12 fue introducido en S. cerevisiae DB1 (Sleep et al., 1990) por la transformación y transformantes individuales fueron crecidas por 3 días en 30ºC en 10 ml de medio YEPD (1% w/v extracto de levadura, 2% w/v peptone, 2% w/v de dextrosa). Después de la centrifugación de las células, los sobrenadantes fueron revisados por (SDS - PAGE) gel de electroforesis de SDS - poliacrilamida y fue encontrado que contiene proteína, el que era del tamaño esperado y que fue reconocida por antiserum anti-hGH (Sigma, Poole, R.U.) sobre Western blots.
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Ejemplo 3
Clonación y expresión de una proteína de fusión de HSA - hGH
Para unir el ADNc de HSA al extremo 5' del ADNc de hGH, el fragmento de HindIII - Bsu361 de pHA1 (contiene la mayor parte del ADNc de HSA) se une al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1 (contiene la mayor parte del ADNc de hGH) vía los dos oligonucleótidos, HGH7 y HGH8:
HGH7:
5' - TTAGGCTTATTCCCAAC - 3'
HGH8:
5' - AATTGTTGGGAATAAGCC - 3'
El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido con HindIII para formar el pHGH10 (Figura 5), y el cartucho de expresión NotI de este plásmido fue clonado dentro de NotI digerido en pSAC35 para hacer el pHGH16 (Figura 5).
El pHGH16 usado para transformar S. cerevisiae DB1 y sobrenadantes de las cultivos fueron analizados como en el Ejemplo 2. Una banda predominante se observa que tiene un peso molecular de aproximadamente 88 kD, correspondiendo a la masa combinada de HA y hGH. El ensayo de Western blot usando un antisuero anti-HSA y anti-hGH (Sigma) confirma la presencia de los dos partes componentes de la proteína de fusión.
La proteína de fusión fue purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografia de intercambio catiónico, seguida por cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de gel filtración. El análisis de N-terminal de la proteína por secuencia de aminoácido confirma la presencia de la secuencia de albúmina esperada.
El ensayo de actividad de la hormona de crecimiento in vitro (Ealey et al., 1995) muestra que la proteína de fusión posee actividad de hGH completa, pero que la potencia fue reducida comparada con el padrón de hGH. En un modelo de aumento de peso de la rata hipofisectomisado, efectuado esencialmente como se describe Farmacopea Europea (1987, monografía 556), la molécula de fusión es más potente que la hGH cuando el mismo número de unidades de actividad se administra diariamente (sobre la base del ensayo in vitro anterior). Los experimentos posteriores en los que la proteína de fusión fue administrada una vez cada cuatro días mostraron un rendimiento similar en la respuesta al crecimiento para la administración diaria de hGH. Los experimentos farmacocinéticos en la que la proteína marcada con ^{125}I se administra a ratas demuestra un aumenta aproximadamente diez veces en el tiempo de vida circulatorio para la proteína de fusión comparado con la hGH (Figura 12).
Un plásmido similar se construye en el que la secuencia líder de ADN que codifica para la invertasa de S. cerevisiae (SUC2) se reemplaza la secuencia para el líder híbrido, de forma tal que el líder codificado y el cruce con la secuencia de HSA es como sigue:
1
Sobre la introducción en S. cerevisiae DB1, este plásmido direcciona la expresión y la secreción de la proteína de fusión en un nivel similar al que se obtiene con pHGH16. El análisis de N-terminal de la proteína de fusión demuestra el anclaje preciso y eficiente de la secuencia líder de la proteína madura.
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Ejemplo 4
Clonación y expresión de una proteína de fusión de hGH - HSA
Para unir el ADNc de hGH al extremo 5' del ADNc de HSA (Figura 6), el ADNc de HSA primero se modifica por mutagénesis dirigida por el sitio cercano EcoNI se introduce en la región que codifica al extremo 5 '. Esto fue hecho por el método de Kunkel y col. (1987) que usa una plantilla de ADN de una sola hebra preparada desde pHA1 y un oligonucleótido sintético, LEU4:
LEU4:
5' - GAGATGCACACCTGAGTGAGG - 3'
La mutagénesis dirigida al sitio usando este oligonucleótido cambia la secuencia de codificación del ADNc de HSA de Lys4 para Leu4 (K4L). Sin embargo, este cambio fue reparado cuando el ADNc de hGH fue unido posteriormente al extremo 5' por unión del fragmento NofI - BamHI de pHGH2 con el fragmento EcoNI - NofI del pHA1 mutado, vía los oligonucleótidos HGH5 de y HGH6:
HGH5:
5' - GATCCTGTGGCTTCGATGCACACAAGA - 3'
HGH6:
5' - CTCTTGTGTGCATCGAAGCCACAG - 3'
El fragmento NotI formado es clonado en pSAC35 digerido por NotI para hacer pHGH14 (Figura 7). El pHGH14 fue usado para transformar S. cerevisiae DB1 y el sobrenadante de cultivo fue analizado como en el Ejemplo 2. Una banda predominante ser observa que tiene un peso molecular de aproximadamente 88 kD, correspondiendo a la masa combinada de hGH y HA. El ensayo de Western blot usa antisuero de anti-HSA y anti-hGH y confirma la presencia de las dos partes componentes de la proteína de fusión.
La proteína de fusión fue purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografia de intercambio catiónico, seguida por cromatografia de intercambio aniónico y cromatografia de gel filtración. El análisis del N-terminal de la proteína por secuencia de aminoácido confirma la presencia de la secuencia de hGH esperada.
Los estudios in vitro muestran que la proteína de fusión conserva la actividad de hGH, pero es significativamente menos potente que una proteína de fusión que consta de la HA normal completa (1-585) tanto la parte de N-terminal y la hGH como la parte C-terminal, se describe en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 5
Construcción de plásmidos para la expresión de fusiones de hGH para dominios de HSA
Los polipéptidos de fusión se hacen en el que la molécula de hGH fue unida a los primeros dos dominios de HA (residuos 1 a 387). La fusión al N-terminal de hGH se consigue uniendo el fragmento HindIII-SapI de pHA1, que contiene la mayor parte de la secuencia de codificación para los dominios 1 y 2 de HA, al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1, vía los oligonucleótidos HGH11 y HGH12:
HGH11:
5' - TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTATTCCCAAC - 3'
HGH12:
5' - AATTGTTGGGAATAAATTCTGAGGCTCTTCC - 3'
El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido por HindIII para hacer el pHGH37 (Figura 8) y el cartucho de expresión Nod de este plásmido fue clonado NorI digerido pSAC35. El plásmido da como resultado, el pHGH38 (Figura 8), que contiene un cartucho de expresión que fue descubierto para direccionar la secreción del polipéptido de fusión en el sobrenadante cuándo se transformó en S. cerevisiae DB1. El ensayo de western blot usa antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos partes de componente de la proteína de
fusión.
La proteína de fusión es purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografia de intercambio catiónico seguida por cromatografia de gel filtración. Los estudios in vivo con proteína purificada muestran que el tiempo de vida en circulación es más largo que la de hGH, y similar a la proteína de fusión que consta de HA normal completa (1-585) como la parte N-terminal y la hGH como la parte C-terminal, como se describe en Ejemplo 3. Los estudios in vitro muestran que la proteína de fusión conservaba la actividad de hGH.
Usando una estrategia similar como se detalla arriba, una proteína de fusión que consta del primer dominio de HA (residuos 1-194) como la parte N-terminal y la hGH como la parte C-terminal, fue clonada y expresada en S. cerevisiae DB1. El western blot correspondiente al sobrenadante de cultivo usa antisera anti-HSA y anti- hGH y se confirma la presencia de las dos partes componente de la proteína de fusión.
\newpage
Ejemplo 6
Expresión de hGH por introducción de un sitio de anclaje entre HSA y hGH
La introducción de una secuencia de péptido que es reconocida por la proteasa de Kex2, entre la proteína de fusión de HA - hGH, admite la secreción de hGH. Una secuencia de codificación Ser Asp Lys Arg de fue presentado usando dos oligonucleótidos, HGH14 y HGH15:
HGH14:
5' - TTAGGCTTAAGCTTGGATAAAAGATTCCCAAC - 3'
HGH15:
5' - AATTGTTGGGAATCTTTTATCCAAGCTTAAGCC - 3'
Éstos fueron usados para unir el fragmento HindIII - Bsu36I de pHA1 al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1, los que fueron clonados luego en pHA2 digerido por HindIII para hacer el pHGH25 (Figura 9). El cartucho de expresión NotI en la que de este plásmido fue clonado en pSAC35NotI - digerido para hacer el pHGH31 (Figura 9).
S. cerevisiae DB1 transformado con pHGH31 se encuentra para ocultar dos especies muy importantes, como se determina por el análisis de SDS - PAGE de sobrenadantes de cultivo. Las dos especies tienen pesos moleculares de aproximadamente de 66 kD, correspondiendo para HA (la longitud completa), y 22 kDa, corresponden a la (la longitud completa) de la hGH demostrando el anclaje de la proteína de fusión in vivo por la proteasa de Kex2, o una actividad equivalente. El ensayo de western blot usando antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos especies por separado. El análisis de secuencia N-terminal de la mitad de la hGH confirma el anclaje preciso y eficiente de la mitad de HA.
La mitad de la hGH se purifica desde el sobrenadante de cultivo por cromatografia de intercambio aniónico seguida por cromatografia de gel filtración. Los estudios in vitro con la hGH purificada muestran que la proteína es activa y completamente potente.
Usando una estrategia similar, proteínas de fusión que constan con el primer dominio de HA (residuos 1-194) o los primeros dos dominios de HA (residuos 1-387), seguida de una secuencia reconocida por la proteasa Kex2p, seguida por el ADNc de la hGH, se clonan y expresan S. cerevisiae DB1. El ensayo de western blot del sobrenadante de cultivo que usa el antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos especies por separado.
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Ejemplo 7
Fusión de HSA para la hGH usando una secuencia de unión flexible
Uniones flexibles, que consta de unidades repetitivas de [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{n}, donde n es 2 ó 3, se introducen entre el HSA y la proteína de fusión de la hGH por clonación de los oligonucleótidos HGH16, HGH17, HGH 18 y HGH 19:
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2 
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El fusión de HGH16 con HGH17 resulta en n = 2, mientras que el HGH18 fusionado para HGH19 resulta n = 3. Después de la fusión, el oligonucleótidos de doble trenza se clonó con el fragmento aislado EcoRI - Bsu361 desde pHGH 1 en pHGH10 Bsu361 digerido para hacer el pHGH56 (donde n = 2) y pHGH57 (donde n = 3) (Figura 10). EL cartucho de expresión de NotI desde estos plásmidos se clonan en NotI digerido pSAC35 para hacer pHGH58 y pHGH59, respectivamente.
Clonar los oligonucleótidos para hacer pHGH56 y pHGH57 presenta un sitio de BamHI en las secuencias de enlace, como muestra la Figura 11. Por lo tanto es posible construir las secuencias de enlace en que n = 1 y n = 4, uniendo el fragmento HindIII - BamHI desde pHGH56 para el fragmento BamHI - HindIII de pHGH57 (hace n = 1), o el fragmento de HindI - II - BamHI de pHGH57 al fragmento BamHI - HindIII de pHGH56 (hace n = 2). Clonando éstos fragmentos en el sitio de HindIII de pHA2 (descrito en Ejemplo 2), resulta en el pHGH60 (n = 1) y pHGH61 (n = 4) (ver Figura 11). El cartucho de expresión de NotI de pHGH60 y pHGH61 son clonados en pSAC35 digerido para hacer pHGH62 y pHGH63, respectivamente.
La transformación de S. cerevisiae con pHGH58, pHGH59, pHGH62 y pHGH63 resulta en transformantes que secretan los polipéptidos de fusión en el sobrenadante.
El ensayo de Western blot usa antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos partes de componente de las proteínas de fusión.
Las proteínas de fusión se purifican desde el sobrenadante de cultivo por cromatografia de intercambio aniónico, seguido por el intercambio aniónico y cromatografia de gel filtración. El análisis de N-terminal de las proteínas por el secuenciación de los aminoácido confirma la presencia de la secuencia de albúmina esperada. El análisis de las proteínas purificadas por espectrometría de masa de destellos confirma un aumento en la masa de 315 Da (n = 1), 630 Da (n = 2), 945 Da (n = 3) y 1260 Da (n = 4) comparado con la proteína de fusión de HSA - hGH descrita en el Ejemplo 3, como era de esperar. La proteína purificada se encuentra activa in vitro.
Referencias
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La presente invención y sus diversas realizaciones incluyen los siguientes aspectos:
Un polipéptido que consta de una región continua de aninoácidos ligados por uniones peptídicas y comprendiendo una primera región de al menos 10 aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con una región de la misma longitud de hormona de crecimiento (GH) y una segunda región de al menos 10 aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con una región de la misma longitud de albúmina de suero.
El polipéptido debe ser tal que cada una de dichas primera y segunda regiones tenga al menos 95% de identidad de secuencia con dichas longitudes de GH y albúmina, respectivamente. Cada una de dichas primera y segunda región debe tener una longitud de al menos 50 aminoácidos.
La primera región puede consistir de aminoácidos ininterrumpidos de la parte C-terminal de GH, o una modificación conservadora de ellos, y el polipéptido liga y activa el receptor GH. La primera región puede tener una longitud de 191 aminoácidos.
La albúmina y/o la hormona de crecimiento puede ser humana.
La segunda región puede comprender al menos un dominio ininterrumpido de albúmina o una modificación conservadora de ello. Más específicamente, la segunda región puede comprender aminoácidos ininterrumpidos 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491, 512-585, 1-194, 195-387, 388-585, 1-387 o 195-585 de albúmina humana o una modificación conservadora de ello.
La parte N-terminal del polipéptido puede comprender dicha primera región y la parte C-terminal comprende dicha segunda región; o la parte N-terminal del polipéptido puede comprender dicha segunda región y la parte C-terminal comprende dicha primera región.
El polipéptido puede consistir de dichas primera y segunda regiones, opcionalmente con aminoácidos adicionales y otros compuestos añadidos a cualquier extremos del polipéptido.
En otro aspecto, la invención provee un medio de cultivo microbiano que comprende células transformadas y el polipéptido. Alternativamente, el medio de cultivo microbiano puede comprender solamente el polipéptido.
Un aspecto adicional provee un polinucleótido que codifica el polipéptido; y un huésped microbiano que comprende tal polinucleótido, dispuesto para expresión en el huésped. Preferentemente, el polipéptido se segrega desde el huésped.
La invención también provee un proceso para obtener el polipéptido cultivando el huésped y purificando el polipéptido. El polipéptido puede después incluirse en una formulación farmacéutica que comprenda un portador farmacéuticamente aceptable.
Los pacientes que tienen una condición que es tratable con hormona de crecimiento puedes tratarse administrando al paciente una cantidad no tóxica del polipéptido a fin de aliviar esa condición.
La invención también provee un método de incrementar más de lo normal la tasa de crecimiento de, o ratio de carne magra a carne grasa en un animal que comprende administrar al animal una cantidad efectiva del polipéptido.
Se puede producir hormona de crecimiento mediante la expresión de dicho polinucleótido en un huésped microbiano, preferentemente levadura, teniendo el polipéptido codificado por ello un lugar entre dichas dichas primera y segunda regiones cuyo lugar es separable por un enzima presente en el huésped, o por otro enzima, o químicamente.
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Referencias citadas en la descripción Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet EP 330451 A
\bullet EP 361991 A
\bullet WO 9315199 A
\bullet WO 9315200 A
\bullet EP 413622 A
\bullet EP 399666 A
\bullet EP 127305 A
\bullet EP 60057 A
\bullet EP 387319 A
\bullet EP 322094 A
\bullet EP 251744 A
\bullet EP 258067 A
\bullet WO 9001063 A
\bullet US 4857467 A
\bullet EP 1991 A
\bullet JP 62096086 A
\bullet JP 3036516 A
\bullet EP 201239 A
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<140> 05077642.6
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<141> 19 Diciembre 1996
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<150> GB 9526733.2
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<151> 30 Diciembre 1995
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<160> 26
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<223> Secuencia de proteínas híbridas basada en la secuencia líder intvertasa de Saccharomyces cerevisiae y en albúmina de suero humano
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<223> péptido reconocido por proteasa Kexs2
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<213> Secuencia Artificial
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<223> péptido enlazador flexible sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> enlazador oligonucleótido HGH19
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<211> 576
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<212> ADN
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<213> ADNc hormona de crecimiento de Homo sapiens 
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<210> 23
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<211> 191
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<212> PRT
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<213> Hormona de crecimiento de Homo sapiens 
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11 
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<210> 24
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<211> 81
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> pBST+ sitio de multi-clonado
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<400> 24
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12 
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<211> 1758
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens serum albumin cADN
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13 
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<210> 26
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<212> ADN
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<213> Albúmina de suero de Homo sapiens 
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15 
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LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9526733.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 30 Diciembre 1995
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR HGH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagaatt cccttatcca ggc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR HGH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaagctta gaagccacag gatccctcca cag 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gataaagatt cccaac 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgttggg aatcttt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaggcttat tcccaac 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgttggg aataagcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 604
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de proteínas híbridas basada en la secuencia líder intvertasa de Saccharomyces cerevisiae y en albúmina de suero humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
16 
\hskip0,8cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido LEU4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagatgcaca cctgagtgag g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido HGH5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcctgtgg cttcgatgca cacaaga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido HGH6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcttgtgtg catcgaagcc acag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtggaagag cctcagaatt tattcccaac 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgttggg aataaattct gaggctcttc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido reconocido por proteasa Kex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Asp Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaggcttaa gcttggataa aagattccca ac 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgttggg aatcttttat ccaagcttaa gcc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido enlazador flexible sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido enlazador flexible sintético - 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH16
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaggcttag gtggcggtgg atccggcggt ggtggatctt tcccaac 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgttggg aaagatccac caccgccgga tccaccgcca cctaagcc 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip0,8cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador oligonucleótido HGH19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip0,8cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADNc hormona de crecimiento del Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip0,8cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hormona de crecimiento del Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
24 
\hskip0,8cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pBST+ sitio de multi-clonado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1758
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADNc Albúmina de suero de Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Albúmina de suero de Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
28

Claims (15)

1. Un polinucleótido que comprende (i) un elemento promoter de levadura y (ii) una secuencia de terminación de transcripción, asociada operativamente en cada caso con un polinucleótido que codifica una proteína de fusion comprendiendo un primer polipéptido al menos 75% idéntico a la hormona de crecimiento (GH) madura humana fusionado a un segundo polipéptido al menos 75% idéntico a una albúmina de suero de vertebrado comprendiendo al menos dos dominios completos de albúmina de suero, en donde dicha levadura es una S. cerevisiae, S. pombe, Pichia (Hansenula) sp., o Kluyveromyces sp.
2. Un polinucleótido según la Reivindicación 1 en el que dicho elemento promoter de levadura se selecciona
de:
(a)
el elemento promotor S. cerevisiae PRB1;
(b)
el elemento promotor S. cerevisiae PGK1;
(c)
el elemento promotor S. cerevisiae GAL1;
(d)
el elemento promotor S. cerevisiae GAL10;
(e)
el elemento promotor S. cerevisiae CYC1;
(f)
el elemento promotor S. cerevisiae PHO5;
(g)
el elemento promotor S. cerevisiae TRP1;
(h)
el elemento promotor S. cerevisiae ADH1;
(i)
el elemento promotor S. cerevisiae gliceraldehide-3-fosfato dehidrogenasa;
(j)
el elemento promotor S. cerevisiae hexoquinasa;
(k)
el elemento promotor S. cerevisiae piruvato decarboxilasa;
(l)
el elemento promotor S. cerevisiae fosfofructoquinasa;
(m)
el elemento promotor S. cerevisiae triose fosfato isomerasa;
(n)
el elemento promotor S. cerevisiae phosphoglucose isomerase;
(o)
el elemento promotor S. cerevisiae glucoquinasa;
(p)
el elemento promotor S. cerevisiae \alpha-feromona factor apareamiento;
(q)
el elemento promotor S. cerevisiae \alpha-feromona factor apareamiento;
(r)
el elemento promotor S. cerevisiae GUT2;
(s)
el elemento promotor S. cerevisiae GPD1;
(t)
el elemento promotor S. pombe tiamina-reprimible desde el gen nmt;
(u)
el elemento promotor S. pombe glucosa-reprimible fbp1;
(v)
el elemento promotor Pichia sp. MOX1;
(w)
el elemento promotor Pichia sp. FMD1;
(x)
el elemento promotor Pichia sp. AOX1;
(y)
el elemento promotor Pichia sp. AOX2; y
(z)
el elemento promotor Kluyveromyces PGK1.
3. Un polinucleótido según la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2 en el que dicha secuencia de terminación de transcripción es la secuencia de terminación S. cerevisiae ADH1.
4. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho polinucleotido codifica además una secuencia de señal efectiva para dirigir la secreción de la proteína de fusión desde la célula huésped.
5. Un polinucleótido según la Reivindicación 4, en el que la secuencia de señal se selecciona de:
(a)
la secuencia líder de invertasa de S. cerevisiae;
(b)
la secuencia líder de fosfatasa ácida de S. cerevisiae;
(c)
la secuencia líder MF\alpha-1 de S. cerevisiae o la pre-secuencia de ella;
(d)
la pre-secuencia de \beta-glucanasa de S. cerevisiae;
(e)
la pre-secuencia de toxina matadora de S. cerevisiae;
(f)
la secuencia líder de glucoamilasa II de S. diastaticus;
(g)
la secuencia líder de \alpha-galactosidasa de S. carlsbergensis;
(h)
la secuencia líder de toxina matadora de K. lactis;
(i)
la secuencia líder de glucoamilasa de Candida; y
(j)
una secuencia líder de HSA/MF\alpha-1 híbrida.
6. Un polinucleótido según la Reivindicación 3 en el que la secuencia de señal es una secuencia líder de HSA/MF\alpha-1 híbrida.
7. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 en el que la albúmina de suero es albúmina de suero humano.
8. Un polinucleótido según la Reivindicación 5 en el que la albúmina de suero humano es albúmina madura de suero humano.
9. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 en el que la hormona de crecimiento es hormona humana de crecimiento.
10. Un polinucleótido según la Reivindicación 7 en el que la hormona humana de crecimiento es hormona humana de crecimiento madura.
11. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 en el que la parte C-terminal de la albúmina de suero está fusionada a la la parte N-terminal de la hormona de crecimiento.
12. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 en el que la parte N-terminal de la albúmina de suero está fusionada a la la parte C-terminal de la hormona de crecimiento.
13. Un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10 en el que el polinucleótido además codifica una secuencia de unión flexible introducida entre la albúmina de suero y la hormona de crecimiento de dicha proteína de fusión.
14. Un polinucleótido según la Reivindicación 11 en el que la secuencia de unión flexible es [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{2} o [Gly-Gly-Gly-Ser]_{3}.
15. Un método de producir una proteína de fusión de albúmina de suero y hormona de crecimiento que comprende:
(a)
expresar la proteína de fusion desde una célula huésped de S. cerevisiae, en donde la célula huésped comprende un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12; y
(b)
recuperar la proteína de fusión.
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