ES2344592T3 - Anticuerpos frente al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina i. - Google Patents

Anticuerpos frente al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina i. Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o una porción del mismo de unión al antígeno que se une específicamente al receptor del factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR), en el que dicho anticuerpo o porción inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR e inhibe el crecimiento tumoral in vivo; y en el que dicho anticuerpo o porción del mismo de unión al antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada y cadena ligera son: a) la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 2.13.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2788); b) la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 4.9.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2789); c) una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6; o d) una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14; o e) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 45 sin la secuencia señal y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 47 sin la secuencia señal.

Description

Anticuerpos frente al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I.
Antecedentes de la invención
El factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) es un polipéptido de 7,5 kD que circula en plasma a concentraciones elevadas y se puede detectar en la mayoría de los tejidos. El IGF-I estimula la diferenciación celular y la proliferación celular, y es necesario para la mayoría de los tipos de células de mamífero para una proliferación sostenida. Estos tipos de células incluyen, entre otros, fibroblastos diploides humanos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células neurales, células mieloides, condorcitos, osteoblastos y células madre de médula ósea. Para una revisión de la amplia variedad de tipos celular para los que la interacción con IFG-I/receptor de IGF media la proliferación celular, véase Goldring y col., Eukar. Gene Express., 1:31-326 (1991).
La primera etapa en la vía de transducción que conduce a la proliferación o diferenciación celular estimuladas por IGF-I es la unión del IGF-I o el IGF-II (o de la insulina a concentraciones suprafisiológicas) al receptor de IGF-I. El receptor de IGF-I está compuesto por dos tipos de subunidades: una subunidad alfa (una proteína 130-135 kD que es completamente extracelular y funciona en la unión al ligando) y una subunidad beta (una proteína transmembrana de 95 kD, con dominios transmembrana y citoplásmicos). El IGF-IR pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento tirosina quinasa (Ullrich y col., Cell 61: 203-212, 1990), y es estructuralmente similar al receptor de la insulina (Ullrich y col., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). El IGF-IR se sintetiza inicialmente en forma de un polipéptido proreceptor de una sola cadena, que se procesa mediante glicosilación, escisión proteolítica y unión covalente para montar un heterotetrámero maduro de 460 kD que comprende dos subunidades alfa y dos subunidades beta. La(s) subunidad(es) beta poseen actividad de tirosina quinasa activada por ligando. Esta actividad está implicada en las vías de señalización que median la acción del ligando, que implican autofosforilación de la subunidad beta y fosforilación de los sustratos del IGF-IR.
In vivo, los niveles séricos de IGF-I dependen de la presencia de la hormona de crecimiento hipofisiaria (GH). Aunque el hígado es un sitio predominante de síntesis de IGF-I dependiente de GH, trabajos recientes indican que la mayoría de los tejidos normales también producen IGF-1. Una variedad de tejidos neoplásicos también pueden producir IGF-I. Por tanto, el IFG-1 puede actuar como regulador de la proliferación celular normal y anormal mediante mecanismos autocrinos o paracrinos, así como endocrinos. El IGF-I y el IGF-II se unen a las proteínas de unión al IGF (IGFBP) in vivo. La disponibilidad del IGF libre para la interacción con IGF-1R está modulada por las IGFBP. Para una revisión de las IGFBP y del IGF-I, véase Grimberg y col., J. Cell. Physiol. 183 1-9, 2000.
Existe una evidencia considerable de la existencia de un papel del IGF-I y/o IGF-IR en el mantenimiento de las células tumorales in vitro e in vivo. Los niveles de IGF-IR están elevados en los tumores de pulmón (Kaiser y col., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody y col., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley y col., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), de mama (Pollak y col., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens y col., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen y col., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga y col., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), de próstata y de colon (Remaole-Bennet y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo y col., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). La alteración de la expresión del IGF-I en el epitelio prostático conduce a neoplasia en ratones transgénicos (DiGiovanni y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Además, el IGF-I parece ser un estimulador autocrino de gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist y col., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), mientras que el IGF-I estimuló el crecimiento de fibrosarcomas que sobreexpresaron IGF-IR (Butler y col., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Además, individuos con niveles "normales altos" de IGF-I tienen un mayor riesgo de sufrir cánceres comunes en comparación con los individuos con niveles de IGF-I en el intervalo de niveles "normales bajos" (Rosen y col., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Muchos de estos tipos de células tumorales responden al IGF-I con una señal proliferativa en cultivo (Nakanishi y col., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed y col., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989), y se han postulado bucles autocrinos o paracrinos para la proliferación in vivo (LeRoith y col., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee y col., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Para una revisión del papel que la interacción IGF-I/receptor IGF-I desempeña en el crecimiento de diversos tumores humanos, véase Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
El incremento de los niveles de IGF-I también se correlaciona con varios estados patológicos no cancerosos, incluidos acromegalia y gigantismo (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), mientras que la función anormal del IGF-I/receptor IGF-I se ha implicado en la psoriasis (Wraight y col., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), aterosclerosis y reestenosis del músculo liso de los vasos sanguíneos tras angioplastia (Bayes-Genis y col., Cire. Res. 86: 125-130,2000). Los niveles mayores de IGF-I también pueden ser un problema en la diabetes o en complicaciones de la misma, tales como proliferación microvascular (Smith y col., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). La disminución de los niveles de IGF-I que se produce, entre otros, en los casos en los que los niveles de GH en suero han disminuido o cuando existe una insensibilidad o resistencia a la GH, está asociada con trastornos tales como estatura pequeña (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatía, disminución de la masa muscular y osteoporosis (Rosen y col., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Usando vectores de expresión antisentido u oligonucleótidos antisentido frente al ARN del IGF-IR se ha demostrado que la interferencia con el IGF-R conduce a la inhibición del crecimiento celular mediado por IGF-I o mediado por IGF-II (véase, p. ej., Wraight y col., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). La estrategia de los antisentido tuvo éxito en la inhibición de la proliferación celular en varios tipos de células normales y en líneas celulares de tumores humanos. Asimismo, el crecimiento se puede inhibir usando análogos peptídicos del IGF-I (Pietrzkowski y col., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992; y Pietrzkowski y col., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) o un vector que expresa un ARN antisentido del ARN del IGF-I (Trojan y col., Science 259: 94-97, 1992). Además, los anticuerpos frente al IGF-IR (Arteaga y col., Breast Cane. Res. Treatm., 22 101-106, 1992; y Kalebic y col., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) y los mutantes negativos dominantes del IGF-IR (Prager y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 2181-2185, 1994; Li y col., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 y Jiang y col., Oncogene 18: 6071-77,1999) pueden invertir el fenotipo transformado, inhibir la tumorigénesis e inducir pérdida del fenotipo metastásico.
El IGF-I es también importante en la regulación de la apoptosis. La apoptosis, que es la muerte celular programada, está implicada en diversos procesos del desarrollo, incluida la maduración de los sistemas nervioso e inmunológico. Además de su papel en el desarrollo, la apoptosis también se ha implicado como un salvaguarda celular importante contra la tumorigénesis (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786-787, 1993). La supresión del programa apoptótico, mediante diversas lesiones genéticas, puede contribuir al desarrollo y la progresión de neoplasias malignas.
El IGF-I protege de la apoptosis inducida por la retirada de citoquinas en células hematopoyéticas dependientes de IL-3 (Rodríguez-Tarduchy, G. y col., J. Immunol. 149: 535-540, 1992), y de la retirada de suero en células Rat-1/mycER (Harrington, E., y col., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). La función antiapoptótica del IGF-I es importante en la etapa post-compromiso del ciclo celular y también en células bloqueadas en la progresión del ciclo celular mediante etopósido o timidina. La demostración de que los fibroblastos dirigidos por c-myc dependen del IGF-I para su supervivencia sugiere que existe un papel importante del IGF-IR en el mantenimiento de células tumorales mediante la inhibición específicamente de la apoptosis, un papel distinto de los efectos proliferativos del IGF-I o el IGF-IR. Esto sería similar al papel que se pensaba que desempeñaban otros genes anti-apoptóticos, tales como bcl-2, en la estimulación de la supervivencia tumoral (McDonnell y col., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry y col., Nature 348: 334-336,1990).
Los efectos protectores del IGF-I sobre la apoptosis dependen de tener IGF-IR presente en las células para interaccionar con el IGF-I (Resnicoff y col., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). El soporte de una función anti-apoptótica del IGF-IR en el mantenimiento de las células tumorales también se proporcionó a través de un estudio usando oligonucleótidos antisentido del IGF-IR que identificaron una relación cuantitativa entre los niveles de IGF-R, la extensión de la apoptosis y el potencial tumorigénico de un tumor singeneico de rata (Rescinoff y col., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Se ha encontrado que la sobreexpresión de IGF-R protege a las células tumorales in vitro de la apoptosis inducida por etopósido (Sell y col., Cancer Res. 55: 303-306,1995) e, incluso más espectacularmente, que una disminución de los niveles de IGF-1R por debajo de los niveles salvajes causaba una apoptosis masiva de células tumorales in vivo (Resnicoff y col., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Entre las potenciales estrategias para inducir la apoptosis o para inhibir la proliferación celular asociada con el incremento de los niveles de IGF-I, el incremento de los niveles de IGF-II y/o incremento de los niveles del receptor IGF-IR se incluyen la supresión de los niveles de IGF-I o de los niveles de IGF-II o la prevención de la unión de IGF-I al IGF-IR. Por ejemplo, se ha empleado el análogo de acción prolongada de la somatostatina octreotida para reducir la síntesis y/o la secreción de IGF. En un sistema experimental con animales se ha usado IGF-IR soluble para inducir apoptosis en células tumorales in vivo e inhibir la tumorigénesis (D'Ambrosio y col., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Además, se han usado oligonucleótidos antisentido de IGF-IR, análogos peptídicos de IGF-I y anticuerpos contra el IGF-IR para disminuir la expresión de IGF-I o IGF-IR (véase ant.). No obstante, ninguno de estos compuestos ha sido adecuado para administrar a largo plazo a pacientes humanos. Además, aunque se ha administrado IGF-I a pacientes para el tratamiento de estatura corta, osteoporosis, disminución de la masa muscular, neuropatía o diabetes, la unión de IGF-I a las IGFBP a menudo ha hecho que el tratamiento con IGF-I sea difícil o ineficaz.
De acuerdo con esto, en vista de los papeles que el IGF-I y el IGF-IR tienen en trastornos tales como cáncer y otros trastornos proliferativos en los que existe sobreexpresión de IGF-I y/o IGF-IR y los papeles que demasiado poco IGF-I e IGF-IR tiene en trastornos tales como estatura corta y fragilidad cuando hay subexpresión de IGF-I y/o IGF-IR, sería deseable generar anticuerpos frente al IGF-IR que pudieran usarse para inhibir o estimular el IGF-IR. Aunque se ha comunicado que se han encontrado anticuerpos anti-IGF-IR en ciertos pacientes con enfermedades autoinmunitarias, ninguno de estos anticuerpos se ha purificado y no se ha demostrado que alguno sea adecuado para inhibir la actividad del IGF-I para procedimientos diagnósticos o clínicos. Véase, por ejemplo, Thompson y col., Pediat. Res. 32: 455-459,1988; Tappy y col., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman y col., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage y col., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. Por tanto, sería deseable obtener anticuerpos humanos anti-IGF de alta afinidad que puedan usarse para tratar enfermedades en seres humanos.
Li y col., Cancer Immunology and Immunotherapy, 49(4/5):243-252, 2000 se refieren a la producción de anticuerpos de una cadena (scFv) contra el IGF-IR y constructos quiméricos en los que el scFv se condensa con una región Fc humana para obtener scFv-Fc. De acuerdo con Li y col., el anticuerpo scFv-Fc se une al IGF-IR, bloquea su interacción con los ligandos IGF-I e IGF-II, estimula la autofosforilación e inhibe el crecimiento de ciertas células tumorales in vitro e in vivo. Los autores concluyen que el scFv-Fc quimérico parece ser una herramienta de primera generación útil para el potencial desarrollo de futuras terapéuticas con IGF-IR. Kaliman y col., J. Biol. Chem., 267(15): 10645-10651, 1992 se refieren a anticuerpos de conejo dirigidos a una secuencia carboxi terminal (aa 1232-1246 o aa 985-998) de IGF-IR. De acuerdo con Kaliman y col., ningún anticuerpo inhibe la unión de IGF-I a IGF-IR. Kaliman y col. aseveran además que el anticuerpo dirigido a la secuencia del IGF-IR aa 1232-1246 inhibe la autofosforilación de IGF-IR y la fosforilación de sustratos exógenos, mientras que el anticuerpo dirigido a la secuencia del IGF-IR aa 985-998 no tiene estos efectos. Xiong y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89(1):5356-5360, 1992 se refieren a la producción de anticuerpos anti-IGF-IR de ratón (designados 3B7, ID4, 2D1). De acuerdo con Xiong y col., estos anticuerpos estimulan la unión de IGF-I e IGF-II a IGF-IR, en contraste con el anticuerpo anti-IGF-IR \alphaIR-3, que inhibe la unión del ligando al IGF-IR. Xiong y col. asevera además que el anticuerpo 3B7 estimula la incorporación de ADN, mientras que el anticuerpo \alphaIR-3 inhibe la incorporación de ADN y la división de las células tumorales. Por último, Xiong y col. aseveran que tanto 3B7 como \alphaIR-3 aumentan la autofosforilación de IGF-IR.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1A-1C muestra alineaciones entre sí y con las secuencias de las líneas germinales de las secuencias nucleotídicas de las regiones variables de la cadena ligera de seis anticuerpos humanos anti-IGF-IR. La figura 1A muestra la alineación de las secuencias nucleotídicas de la región variable de la cadena ligera (VL) de los anticuerpos 2.12.1 (SEC ID Nº 1) 2.13.2 (SEC ID Nº 5), 2.14.3 (SEC ID Nº 9) y 4.9.2 (SEC ID Nº 13) entre sí y con la secuencia de la línea germinal V\kappaA30 (SEC ID Nº 39).
La figura 1B muestra la alineación de la secuencia nucleotídica de la VL del anticuerpo 4.17.3 (SEC ID Nº 17) con la secuencia de la línea germinal V\kappa012 (SEC ID Nº 41). La figura 1C muestra la alineación de la secuencia nucleotídica de la VL del anticuerpo 6.1.1 (SEC ID Nº 21) con la secuencia de la línea germinal V\kappaA27 (SEC ID Nº 37). Las alineaciones también muestran las regiones CDR de la VL de cada anticuerpo. Las secuencias consenso de las figuras 1A-1C se muestran en las SEC ID Nº 53-55, respectivamente.
Las figuras 2A-2D muestran alineaciones entre sí y con las secuencias de las líneas germinales de las secuencias nucleotídicas de las regiones variables de la cadena pesada de seis anticuerpos humanos anti-IGF-IR. La figura 2A muestra la alineación de la secuencia nucleotídica de la VH del anticuerpo 2.12.1 (SEC ID Nº 3) con la secuencia de la VH de la línea germinal DP-35 (SEC ID Nº 29). La figura 2B muestra la alineación de la secuencia nucleotídica de la VH del anticuerpo 2.14.3 (SEC ID Nº 11) con la secuencia de la línea germinal VIV-4/4.35 (SEC ID Nº 43). Las figuras 2C-1 y 2C-2 muestran las alineaciones de las secuencias nucleotídicas de la VH de los anticuerpos 2.13.2 (SEC ID Nº 7), 4.9.2 (SEC ID Nº 15 y 6.1.1 (SEC ID Nº 23) entre sí y con la secuencia de la VH de la línea germinal DP-47 (SEC ID Nº 31). La figura 2D muestra la alineación de la secuencia nucleotídica de la VH del anticuerpo 4.17.3 (SEC ID Nº 19) con la secuencia de la VH de la línea germinal DP-71 (SEC ID Nº 35). La alineación también muestra las regiones CDR de los anticuerpos. Las secuencias consenso de las figuras 2A-2D se muestran en las SEC ID Nº 56-59, respectivamente.
La firma 3 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2, 4.9.2 y 2.12.1 inhiben la unión de IGF-I a las células 3T3-IGF-IR.
La figura 4 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 4.9.2 inhibe la fosforilación de la tirosina del receptor inducida por IGF-I (panel superior) e induce la regulación por disminución del IGF-IR en la superficie celular (panel
inferior).
La figura 5 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 y 4.9.2 reducen la señal de fosfotirosina IGF-R en tumores 3T3-IGF-IR.
La figura 6 muestra que los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 y 4.9.2 reducen el IGF-R en tumores 3T3-IGF-IR.
La figura 7 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento tumoral 3T3-IGF-IR in vivo solo (panel izquierdo) o en combinación con adriamicina (panel derecho).
La figura 8 muestra la relación entre los niveles séricos del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 y la regulación por disminución de IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR.
La figura 9 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento de tumores grandes in vivo solo o en combinación con adriamicina.
La firma 10 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento de tumores grandes in vivo en combinación con adriamicina.
La figura 11 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento de tumor Colo 205 in vivo solo o en combinación con 5-desoxiuridina (5-FU).
La figura 12 muestra que múltiples dosis del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor Colo 205 in vivo solo o en combinación con 5-FU.
La figura 13 muestra que múltiples dosis del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo solo o en combinación con taxol.
La figura 14 muestra que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhibe el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo solo (panel izquierdo) o en combinación con adriamicina (panel derecho).
La figura 15 muestra que múltiples dosis del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 inhiben el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo solo o en combinación con tamoxifeno.
La figura 16 muestra que múltiples dosis del anticuerpo 2.13.2 anti-IGF-IR inhiben el crecimiento del tumor A431 in vivo solo o en combinación con el inhibidor de tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) CP-358.774.
La figura 17 muestra una evaluación farmacocinética de una única inyección intravenosa del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 en monos Cynomologus.
La figura 18 muestra que la combinación del anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 y adriamicina incrementa la regulación por disminución del IGF-IR en tumores 3T3-IGF-IR in vivo.
La figura 19A muestra el número de mutaciones en regiones diferentes de las cadenas pesada y ligera de 2.13.2 y 2.12.1 en comparación con las secuencias de la línea germinal.
Las figuras 19A-D muestran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos 2.13.2 y 2.12.1 con las secuencias de la línea germinal de las que derivan. La figura 19B muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.13.2 (SEC ID Nº 45) con la de la secuencia de la línea germinal DP-47(3-23)/D6-19/JH6 (SEC ID Nº 46). La figura 19C muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.13.2 (SEC ID Nº 47) con la de la secuencia de la línea germinal A30/Jk2 (SEC ID Nº 48). La figura 19D muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1 (SEC ID Nº 49) con la de la secuencia de la línea germinal DP-35(3-11)/D3-3/JH6 (SEC ID Nº 50). La figura 19E muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1 (SEC ID Nº 51) con la de la secuencia de la línea germinal A30/Jk1 (SEC ID Nº 52). Para las figuras 19B-E, las secuencias señal están en cursiva, las CDR se han subrayado, los dominios variables están en negrita, las mutaciones del marco (FR) están realzadas con un signo más ("+") encima del residuo de aminoácido y las mutaciones en la CDR están realizadas con un asterisco encima del residuo de aminoácido.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o una porción del mismo de unión al antígeno que se une al IGF-IR, preferentemente uno que se una al IGF-IR de primates o de humanos, en la que dicho anticuerpo anti-IGF-IR inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR e inhibe el crecimiento tumoral in vivo; y en la que dicho anticuerpo o porción del mismo de unión al antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada y cadena ligera son: a) la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 2.13.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2788); o b) la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 4.9.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2789); o c) una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 8 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6; o d) una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14; o e) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 45 sin la secuencia señal y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 47 sin la secuencia señal.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente otro componente, tal como un agente anti-tumoral o un reactivo de imagen.
El anticuerpo, o porción del mismo, de la invención se puede usar en procedimientos diagnósticos y terapéuticos. Los procedimientos diagnósticos incluyen un procedimiento para diagnosticar la presencia o localización de un tejido que expresa IGF-IR usando un anticuerpo anti-IGF-IR. Un procedimiento terapéutico comprende administrar el anticuerpo a un sujeto que lo necesite, preferentemente junto con la administración de otro agente terapéutico.
La invención proporciona una línea celular aislada, tal como un hibridoma, que produce el anticuerpo anti-IGF-IR de la invención.
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y ligera o sus porciones de unión a antígeno del anticuerpo anti-IGF-IR de la invención.
La invención proporciona vectores y células huésped que comprenden las moléculas de ácido nucleico, así como procedimientos de producir de forma recombinante los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido
nucleico.
También se proporcionan animales transgénicos no humanos que expresan la cadena pesada y ligera o sus porciones de unión a antígeno de un anticuerpo anti-IGF-IR. La invención también proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y ligera o sus porciones de unión a antígeno del anticuerpo anti-IGF-IR de la invención para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto con cáncer.
Descripción detallada de la invención Definiciones y técnicas generales
A menos que se defina lo contrario en la presente memoria descriptiva, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención deberán tener los significados normalmente entendidos por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán plurales y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación, y las técnicas, con cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química proteica y de ácidos nucleicos e hibridación descritos en la presente memoria descriptiva son las bien conocidas y de uso habitual en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente especificación a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como normalmente se efectúan en la técnica o tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente memoria descriptiva son las bien conocidas y usadas habitualmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y liberación, y tratamiento de pacientes.
Se entenderá que los términos siguientes, a menos que se indique lo contrario, tienen los significados siguientes:
El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos polipeptídicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
La expresión "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que, en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con los componentes naturales que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie (3) se expresa en una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina de forma natural se "aislará" de sus componentes asociados de forma natural. Asimismo, una proteína se puede hacer sustancialmente libre de sus componentes asociados de forma natural mediante aislamiento usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.
Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente del 60 al 75% de una muestra exhibe una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérica o multimérica. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá, normalmente, aproximadamente 50%, 60, 70%, 80% o 90% P/P de una muestra proteica, más normalmente aproximadamente el 95% y, preferentemente, tendrá una pureza del 99%. La pureza u homogeneidad de la proteína se puede indicar a través de una serie de medios bien conocidos en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguido por visualización de una única banda polipeptídica tras la tinción del gel con una tinción bien conocida en la técnica. Para ciertos fines se puede proporcionar mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación.
El término "fragmento polipeptídico", tal como se refiere en la presente memoria descriptiva, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción en el amino terminal y/o el carboxi terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las correspondientes posiciones en la secuencia natural. Normalmente, los fragmentos tienen una longitud de al menos 5, 6, 7 ó 10 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 14 aminoácidos, más preferentemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, normalmente una longitud de al menos 50 aminoácidos, incluso más preferentemente una longitud de al menos 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos.
La expresión "análogo polipeptídico", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un polipéptido que está compuesto por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las propiedades siguientes: (1) unión específica a IGF-IR en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión de IFG-I o IGF-II a IGF-IR o (3) capacidad para reducir la expresión en la superficie celular de IGF-IR o fosforilación en tirosina in vitro o in vivo. Normalmente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución (o inserción o deleción) aminoacídica conservadora con respecto a la secuencia natural. Normalmente, los análogos tienen una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferentemente una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos o más largos y, a menudo, pueden ser tan largos como el polipéptido natural de longitud completa.
Las sustituciones aminoacídicas preferidas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta a la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, las sustituciones sencillas o múltiples de aminoácidos (preferentemente sustituciones conservadoras de aminoácidos) pueden realizarse en la secuencia natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del(los) dominio(s) que forman contactos intermoleculares. Una sustitución conservadora de aminoácido no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (p. ej., un reemplazo de aminoácido no debería tender a romper una hélice que se encuentre en la secuencia parental o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Ejemplos se estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York. N.Y. (1991)); y Thornton y col. Nature 354: 105 (1991).
Los análogos no peptídicos se usan habitualmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans y col. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987).
Dichos compuestos a menudo se desarrollan con la ayuda de modelación molecular computerizada. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo constituido por: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}-, y -CH_{2}SO-, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo, mediante la adición de residuos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en el que cada par tiene una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras \kappa y \lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como \mu, \Delta, \gamma, \alpha o \varepsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, generalmente, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)).
Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión al anticuerpo tal como una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.
Las cadenas de inmunoglobulina exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas mediante tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas De cada par están alineadas por las regiones marco, lo que permiten la unión a un epítopo específico. Del extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia y col. Nature 342:878-883 (1989).
Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión al antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por una unión específica. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, dAb t fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de una cadena (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir al polipéptido unión específica al antígeno.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un anticuerpo al que se hace referencia como 2.12.1, 2.13.2. 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 y 6.1.1 es un anticuerpo que deriva del hibridoma del mismo nombre. Por ejemplo, el anticuerpo 2.12.1 deriva del hibridoma 2.12.1.
Un fragmento Fab es un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab')_{2} es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consta de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; u un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341:544-546, 1989) consta de un dominio VH.
Un anticuerpo de una sola cadena (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH están apareadas para formar moléculas monovalentes a través de un ligador sintético que les permite formarse en forma de una proteína de una cadena (Bird y col., Science 242:423-426, 1988 y Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica pero usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de este modo a que los dominios se apareen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, y Poljak, R. J., y col., Structure 2:1121-1123, 1994). Una o más CDR se pueden incorporar en una molécula bien covalente o no covalentemente para formar una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir de forma covalente las CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno concreto de interés.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de una cadena o un fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes naturales, incluidos otros anticuerpos naturales, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa en una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-IGF-IR que se ha purificado mediante afinidad usando IGF-IR como un anticuerpo aislado, un anticuerpo anti-IGF-IR que se ha sintetizado mediante un hibridoma u otra línea celular in vitro y un anticuerpo humano anti-IGF-IR derivado de un ratón transgénico.
La expresión "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una forma de realización preferida, todos los dominios variables y constantes derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de varios modos, tal como se describe a continuación.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que deriva de una especie no humana, en la que ciertos aminoácidos en el marco y los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se han mutado para evitar o anular una respuesta inmunitaria en seres humanos. Como alternativa se puede producir un anticuerpo humanizado mediante condensación de los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de cómo elaborar anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos nº 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos. Una o más de las CDR pueden derivar de un anticuerpo humano anti-IGF-IR o todas las CDR derivan de un anticuerpo humano anti-IGF-IR. Las CDR de más de un anticuerpo humano anti-IGF-IR se pueden mezclar y aparear en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano anti-IGF-TR se puede combinar con CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano anti-IGF-IR, y las CDR de la cadena pesada pueden derivar de un tercer anticuerpo anti-IFG-IR. Además, las regiones marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-IGF-IR, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado.
Un "anticuerpo neutralizante" o un "anticuerpo inhibidor" es un anticuerpo que inhibe la unión de IGF-IR a IGF-I cuando un exceso del anticuerpo anti-IGF-IR reduce la cantidad de IGF-I unido a IGF-IR en al menos aproximadamente un 20%. En una forma de realización preferida, el anticuerpo reduce la cantidad de IGF-I unido a IGF-IR en al menos un 40%, más preferentemente un 60%, incluso más preferentemente un 80% o incluso más preferentemente un 85%. La reducción de la unión puede medirse por cualquier medio conocido para un experto en la técnica, por ejemplo medida en un ensayo de unión competitiva in vitro. Un ejemplo de medición de la reducción de la unión de IGF-I a IGF-IR se presenta más adelante en el Ejemplo IV. Un "anticuerpo activador" es un anticuerpo que activa el IGF-IR en al menos aproximadamente un 20% cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa IGF-IR. El anticuerpo puede activar el IGF-IR en al menos 40%, 60%, 80% u 85%. El anticuerpo activador puede añadirse en presencia de IGF-I o IGF-II. La actividad del anticuerpo activador puede medirse mediante la determinación de la cantidad de autofosforilación en tirosina del IGF-IR.
Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las indicaciones de esta especificación. Los extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparación de los datos de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferentemente se usan procedimientos de comparación computerizada para identificar los motivos de la secuencia o los dominios previstos de conformación de la proteína que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen procedimientos para identificar las secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie y col. Science 253:164 (1991).
La expresión "resonancia en plasmón superficial", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, usando, por ejemplo, el sistema BIAcore system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, véase Jonsson, U., y col. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., y col. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., y col. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131: y Johnnson, B., y col. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
El término "K_{off}" se refiere a la constante Off de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "K_{d}" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos normalmente constan de grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es \leq 1 \muM, preferentemente \leq 100 nM y más preferentemente \leq 10 nM
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edición, E.S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991 )). Estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha-, \alpha-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-N,N,N-trimetillisina, \varepsilon-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada en la presente memoria descriptiva, la dirección izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección derecha es la dirección carboxiterminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.
El término "polinucleótido" como se hace referencia en la presente memoria descriptiva significa una forma
polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o una forma
modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de
ADN.
La expresión "polinucleótido aislado", como se usa en la presente memoria descriptiva, significará un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operablemente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más larga.
El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en la presente memoria descriptiva incluye nucleótidos naturales y modificados unidos por enlaces oligonucleotídicos naturales y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de los polinucleótidos que generalmente comprenden una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y, más preferentemente, una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o de 20 a 40 bases. Normalmente, los oligonucleótidos son monocatenarios, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo para usar en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido.
La expresión "oligonucleótidos naturales" a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados" a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces oligonucleotídicos" a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, dosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanchc y col. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein y col. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon y col. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y col. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991 )); Stec y col. Patente de EE.UU. nº 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990).
Un oligonucleótido puede incluir un marcador para detección, si se desea.
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Secuencias "operablemente unidas" incluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés y secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. La expresión "secuencia de control de la expresión" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a secuencias polinucleotídica que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias de codificación a las que están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias adecuadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficientes del procesamiento de ARN, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencias la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad proteica; y, cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen, por lo general, promotor, sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" está destinada a incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
El término "vector", como se usa en la presente memoria descriptiva, está destinado a hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Otro tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular bicatenario en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, En el que se pueden ligar en el genoma viral segmentos adicionales de ADN. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. En la presente memoria descriptiva, dichos vectores se denominan "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). Eh general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante suelen estar en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector usada con más frecuencia. No obstante, la invención está destinada a incluir esas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven funciones equivalentes.
La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en la presente memoria descriptiva, está destinada a referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos están destinados a hacer referencia no sólo a la célula sujeto concreta, sino también a la progenie de dicha célula. Dado que se pueden producir ciertas modificaciones en las generaciones posteriores debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía está incluida en el alcance del término "célula huésped", tal como se usa en la presente memoria descriptiva.
La expresión "hibrida de forma selectiva" a la que se hace referencia en la presente memoria descriptiva significa que se une de forma detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan de forma selectiva con hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y de lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" se pueden usar para alcanzar condiciones de hibridación selectiva como se conocen en la técnica y se tratan en la presente memoria descriptiva. Un ejemplo de condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" es un procedimiento de incubar un polinucleótido con otro polinucleótido, en el que un polinucleótido se puede fijar a una superficie sólida, tal como una membrana, en un tampón de hibridación de 6X SSPE o SSC, 50% de formamida, 5X de reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de espera de salmón fragmentado y desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado dos veces a 55ºC usando un tampón de lavado de 1X SSC, 0,5% de SDS. Véase también Sambrook y col., ant., pp 9.50-9.55.
La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleido se refiere a los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alineas para una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de la identidad de secuencia puede estar en una medida de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y, preferentemente, al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. En la técnica se conoce una serie de algoritmos diferentes que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas de Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias solicitadas y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Metholds Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998).
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A menos que se especifique lo contrario, se usan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo concreto. Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de letra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto tal como se proporciona en GCG Versión 6.1.
Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia concreta abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria.
En la técnica de biología molecular, los investigadores usan las expresiones "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia" y "porcentaje de homología de secuencia" de forma intercambiable. En esta solicitud, estos términos tendrán el mismo significado con respecto a las secuencias de ácido nucleico únicamente.
La expresión "similitud sustancial" o "similitud sustancial de secuencia", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con las adecuadas inserciones o deleciones de nucleótidos con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 85%, preferentemente al menos aproximadamente 90% y, más preferentemente, al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotídicas, medido mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha tratado en lo que antecede.
Como se aplica a polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de gap por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos 75% u 80%, preferentemente una identidad de secuencia de al menos 90% o 95%, incluso más preferentemente una identidad de secuencia de al menos 98% o 99%. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la que un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituidos conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los expertos en la técnica conocen bien los medios para efectuar este ajuste. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: Glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: Fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Grupos preferidos para la sustitución conservadora de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.
Como alternativa, una sustitución conservadora es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz similar a PAM250 Log divulgada en Gonnet y col., Science 256: 1443-45 (1992). Una sustitución "moderadamente conservadora" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz similar a PAM250 Log.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, normalmente se mide usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas aparea secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit", que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos relacionados estrechamente, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína salvaje y una muteína de la misma. Por ejemplo, véase GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también se pueden comparar usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG versión 6.1 FASTA (P. EJ., FASTA 2 y FASTA3) proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias solicitadas y de búsqueda (Pearson (1990); Pearson (2000) Otro algoritmo preferido a la hora de comparar una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa para ordenador BLAST, especialmente blastp o tblastn usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).
La longitud de las secuencias polipeptídicas cuya homología se ha comparado será, en general, de al menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, normalmente de al menos aproximadamente 20 residuos, más normalmente de al menos aproximadamente 24 residuos, habitualmente de al menos aproximadamente 28 residuos, y, preferentemente, más de al aproximadamente 35 residuos. En la búsqueda de una base de datos que contenga secuencias de un número grande de organismos diferentes, es preferible comparar las secuencias de aminoácidos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "marca" o "marcado" se refiere a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una forma de realización, la marca es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la fijación a un polipéptido de restos de biotiniló que se puede detectar mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). En otra forma de realización, la marca o marcador puede ser terapéutica, por ejemplo un conjugado farmacológico o una toxina. En la técnica se conocen varios procedimientos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas y se pueden usar. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., ^{3}H, ^{14}C, ^{15}N, ^{35}S, ^{90}Y, ^{99}Tc, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I), marcas fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos lantánidos), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., pares de secuencias en cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, colas del epítopo), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como la toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. En algunas formas de realización, las marcas están unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir la potencial hidrancia estérica.
En la presente memoria descriptiva, el término "agente" se usa para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos. La expresión "agente farmacéutico o fármaco", tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos de la presente memoria descriptiva se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se pone de ejemplo en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
En la presente memoria descriptiva, La expresión "agente antineoplásico" se usa para hacer referencia a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o progresión de una neoplasia en un ser humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. Con frecuencia, la inhibición de metástasis es una propiedad de los agentes antineoplásicos.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
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Anticuerpos humanos anti-IGF-IR y caracterización de los mismos
Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables de ratón o rata. La presencia de dichas secuencias derivadas de ratón o rata puede conducir a un rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por parte de un paciente. Por tanto, en la presente memoria descriptiva se describen anticuerpos anti-IGF-IR humanizados.
En una forma de realización preferida, la invención proporciona anticuerpos anti-IGF-IR completamente humanos mediante la introducción de genes de inmunoglobulina humana en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos. Más preferidos son los anticuerpos anti-IGF-IR humano completamente humanos. Cabe esperar que los anticuerpos anti-IGF-IR completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales (AcMo) de ratón o derivados de ratón y, por tanto, que incrementen la eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados. Cabe esperar que el uso de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación y cáncer, que pueden requerir administraciones repetidas de anticuerpos. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-IFG-IR de la invención no se une al complemento.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID Nº 6 ó 14, o las menos las CDR de una de estas secuencias de aminoácidos. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID Nº 8 ó 16, o las menos las CDR de una de estas secuencias de aminoácidos.
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Clase y subclase de anticuerpos anti-IGF-IR
El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es una IgG y es un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es de la subclase IgG2. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es de la misma clase y subclase que el anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2, que es IgG2.
La clase y subclase de los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden determinar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar usando anticuerpos que sean específicos de una clase y subclase concretas de un anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase se pueden determinar mediante ELISA, transferencia de tipo western, así como por otras técnicas. Como alternativa, la clase y subclase se pueden determinar mediante secuenciación de todo o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparación de sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas y determinación de la clase y subclase de los anticuerpos.
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Selectividad de especie y molécula
En otro aspecto de la invención, en anticuerpo anti-IGF-IR de la invención demuestra la selectividad tanto de especie como de molécula. En una forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se une al IGF-IR humano, de mono cynomologous o rhesus. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no se une al IGF-IR de perro o de conejo. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no se une a una especie de mono del nuevo mundo, como el tití. Siguiendo las indicaciones de la especificación, se puede determinar selectividad de especie para el anticuerpo anti-IGF-IR usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar selectividad de especie usando transferencia de tipo western, FACS, ELISA o RIA. En una forma de realización preferida, se puede determinar la selectividad de especie usando transferencia de tipo western.
En otra forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una selectividad por IGF-IR que es al menos 50 veces mayor que su selectividad por el receptor de la insulina. En una forma de realización preferida, la selectividad del anticuerpo anti-IGF-IR es superior a 100 veces mayor que su selectividad por el receptor de la insulina. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR no exhibe ninguna unión específica apreciable a ninguna otra proteína distinta del IGF-IR. Se puede determinar que la selectividad del anticuerpo anti-IGF-IR por el IGF-IR usando procedimientos bien conocidos en la técnica siguiendo las indicaciones de la especificación. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad usando transferencia de tipo western, FACS, ELISA o RIA. En una forma de realización preferida, se puede determinar la selectividad molecular usando transferencia de tipo western.
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Afinidad de unión de anti-IGF-IR a IGF-IR
En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-IGF-IR se unen al IGF-IR con afinidad elevada. En una forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR se une al IGF-IR con una K_{d} de 1 x 10^{-8} M o menor. En una forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una K_{d} de 1 x 10^{-9} M o menor. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una K_{d} de 5 x 10^{-10} M o menor. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una K_{d} de 1 x 10^{-10} M o menor. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{d} que el anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2.
En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{d} que un anticuerpo que comprende una o más CDR del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización preferida más, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{d} que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{d} que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una tasa de disociación baja. En una forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una a K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor. En una forma de realización preferida, la K_{off} es 5 x 10^{-5} s^{-1} o menor. En otra forma de realización preferida, la K_{off} es sustancialmente la misma que la del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{off} que un anticuerpo que comprende una o más CDR del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización preferida más, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{off} que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{off} que un anticuerpo que comprende una o más CDR de un
anticuerpo que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID Nº 6, 8,14 ó 16.
La afinidad de unión y la tasa de disociación de un anticuerpo anti-IGF-IR al IGF-IR se pueden determinar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. En una forma de realización, la afinidad de unión se puede medir mediante ELISA competitivo, RIA o resonancia de plasmón superficial, tal como BIAcore. La tasa de disociación también se puede medir mediante resonancia de plasmón superficial. En una forma de realización más preferida, la afinidad de unión y la tasa de disociación se miden mediante resonancia de plasmón superficial. En una forma de realización todavía más preferida, la afinidad de unión y la tasa de disociación se miden usando BIAcore. Un ejemplo de determinación de la afinidad de unión y la tasa de disociación se describe más adelante en el Ejemplo II.
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Semivida de los anticuerpos anti-IGF-IR
De acuerdo con otro objeto de la invención, el anticuerpo anti-IGF-IR tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo. En una forma de realización preferida, el anticuerpo o porción del mismo tiene una semivida de al menos tres días. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo o porción del mismo tiene una semivida de cuatro días o más prolongada. En una forma de realización, el anticuerpo o porción del mismo tiene una semivida de ocho días o más prolongada. En otra forma de realización, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se deriva o modifica de tal forma que tenga una semivida más prolongada, como se trata más adelante. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales para incrementar la semivida sérica, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.
La semivida del anticuerpo se puede medir por cualquier medio conocido para un experto en la técnica. Por ejemplo, la semivida del anticuerpo se puede medir mediante transferencia de tipo western, ELISA o RIA durante un periodo de tiempo adecuado. La semivida del anticuerpo se puede medir en cualquier animal adecuado, por ejemplo un mono, tal como un mono cynomologous, un primate o un ser humano.
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Identificación de epítopos de IGF-IR reconocidos por un anticuerpo anti-IGF-IR
El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se une preferentemente al mismo antígeno o epítopos que el anticuerpo anti-IGF-IR 2.13.2 o 4.9.2. Además, la invención proporciona un anticuerpo anti-IGF-IR que compite de forma cruzada con el anticuerpo anti-IGF-IR humano 2.13.2 o 4.9.2. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano es 2.13.2 o 4.9.2, en otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR humano de la invención comprende una o más CDR de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16.
Se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR se une al mismo antígeno usando varios procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR de prueba se une al mismo antígeno usando un anticuerpo anti-IGF-IR para capturar un antígeno que se sabe que se une al anticuerpo anti-IGF-IR, tal como IGF-IR, eluyendo el antígeno del anticuerpo y, después, determinando si el anticuerpo de prueba se unirá al antígeno eluido. Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-IGF-IR mediante la unión del anticuerpo anti-IGF-IR al IGF-IR en condiciones de saturación, y, después, midiendo la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse al IGF-IR. Si el anticuerpo de prueba se puede unir al IGF-IR al mismo tiempo que el anticuerpo anti-IGF-IR, el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-IGF-IR. No obstante, si el anticuerpo de prueba no se puede unir al IGF-IR al mismo tiempo, el anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que el anticuerpo humano anti-IGF-IR. Este experimento se puede realizar usando ELISA, RIA o resonancia de plasmón superficial. En una forma de realización preferida, el experimento se realiza usando resonancia de plasmón superficial. En una forma de realización más preferida se usa BIAcore. También se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR compite de forma cruzada con un anticuerpo anti-IGF-IR. En una forma de realización preferida, se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR compite de forma cruzada con otro usando el mismo procedimiento que se usa para medir si en anticuerpo anti-IGF-IR se puede unir al mismo epítopo que otro anticuerpo anti-IGF-IR.
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Uso de las cadenas ligera y pesada
Preferentemente, el anticuerpo anti-IGF-IR de la invención comprende secuencias variables codificadas por un gen \kappa humano.
En una forma de realización preferida, las secuencias variables están codificadas por una familia génica V\kappaA30 humana. En una forma de realización más preferida, la cadena ligera comprende no más de diez sustituciones de aminoácidos de la línea germinal V\kappaA30, preferentemente no más de seis sustituciones de aminoácidos y, más preferentemente, no más de tres sustituciones de aminoácidos. En una forma de realización preferida, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras.
Las SEC ID Nº: 2, 6, 10, 14, 18 y 22 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de seis cadenas ligeras \kappa anti-IGF-IR. Las SEC ID Nº: 38, 40 y 42 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las tres cadenas ligeras \kappa de la línea germinal a partir de las cuales derivan las seis cadenas ligeras \kappa anti-IGF-IR. Las figuras 1A-1C muestran las alineaciones de las secuencias nucleotídicas de las regiones variables de las cadenas ligeras de los seis anticuerpos anti-IGF-IR entre sí y con las secuencias de la línea germinal de la que derivan. Siguiendo las indicaciones de esta especificación, un experto en la técnica podría determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las seis cadenas ligeras \kappa anti-IGF-IR y de las cadenas ligeras \kappa de la línea germinal y determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo.
En una forma de realización preferida, la VL del anticuerpo anti-IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal que la VL del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2. Por ejemplo, la VL del anticuerpo anti-IGR-IR puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son iguales que las presentes en el anticuerpo 2.13.2 y otra sustitución de aminoácido que es la misma que el anticuerpo 4.9.2. De este modo, se pueden mezclar y aparear características diferentes de unión a anticuerpo con el fin de alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por el IGF-IR o su tasa de disociación del antígeno. En otra forma de realización, las sustituciones de aminoácidos se realizan en la misma posición que las encontradas en la VL del anticuerpo 2.13.2 o 4.92., pero se realizan sustituciones conservadoras de aminoácidos en lugar de usar el mismo aminoácido. Por ejemplo, si la sustitución de aminoácido comparada con la línea germinal en el anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2 es glutamato, se puede sustituir de forma conservadora el aspartato. De forma similar, si la sustitución de aminoácido es serina, se puede sustituir de forma conservadora la treonina.
En otra forma de realización preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la VL de 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización altamente preferida, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos que son iguales que las regiones CDR de la cadena ligera de 2.13.2 o 4.9.2.
En otra forma de realización preferida, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 6 ó 14. En otra forma de realización, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 5 ó 13, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de 1-10 aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra forma de realización, el anticuerpo o porción del mismo comprende una cadena ligera lambda.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-IGF-IR o porción del mismo que comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una cadena pesada humana. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la cadena pasada deriva de una familia génica V_{H} DP-47 humana. En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos de la cadena pasada deriva de una familia génica V_{H} DP-47 humana. En una forma de realización más preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de aminoácidos de la línea germinal V_{H} DP-47, más preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos e, incluso más preferentemente, no más de tres cambios de aminoácidos.
Las SEC ID Nº: 4, 8, 12, 16, 20 y 24 proporcionan las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de seis cadenas pesadas anti-IGF-IR. Las SEC ID Nº: 30, 32, 34, 36 y 44 proporcionan las secuencias de aminoácidos y las SEC ID Nº 29, 31, 33, 35 y 43 proporcionan las secuencias nucleotídicas de las cadenas pesadas de la línea germinal DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 y VIV-4, respectivamente. Las figuras 2A-2D muestran las alineaciones de la secuencias de aminoácidos de la región variable de los seis anticuerpos anti-IGF-IR con sus correspondientes secuencias de la línea germinal. Siguiendo las indicaciones de esta especificación, un experto en la técnica podría determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las seis cadenas pesadas anti-IGF-IR y de las cadenas pesadas de la línea germinal y determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo.
En una forma de realización preferida, la VH del anticuerpo anti-IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, como la VH del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2.
De un modo similar a lo tratado en lo que antecede, la VH del anticuerpo anti-IGF-IR puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son las mismas que las presentes en el anticuerpo 2.13.2 y otra sustitución de aminoácido que es la misma que la del anticuerpo 4.9.2. De este modo, se pueden mezclar y aparear diferentes características de unión a anticuerpo con el fin de alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por el IGF-IR o su tasa de disociación del antígeno. En otra forma de realización, las sustituciones de aminoácidos se realizan en la misma posición que las encontradas en la VH del anticuerpo 2.13.2 o 4.92., pero se realizan sustituciones conservadoras de aminoácidos en lugar de usar el mismo aminoácido.
En otra forma de realización preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la VH de 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización altamente preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son iguales que las regiones CDR de la cadena pesada de 2.13.2 o 4.9.2.
En otra forma de realización preferida, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 ó 16. En otra forma de realización, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 7 ó 15, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la misma. En otra forma de realización, las sustituciones son sustituciones conservadoras de aminoácidos.
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Inhibición de la actividad del IGF-IR por un anticuerpo anti-IGF-IR Inhibición de la unión del IGF-I al IGF-IR
El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención inhibe la unión de IGF-I a IGF-IR o la unión de IGF-II a IGF-1 IR. En una forma de realización preferida, el IGF-IR es humano. En otra forma de realización, el anticuerpo o porción del mismo inhibe la unión entre el IGF-IR y el IGF-I con una CI_{50} no superior a 100 nM. En una forma de realización preferida, la CI_{50} no es superior a 10 nM En una forma de realización más preferida, la CI_{50} no es superior a 5 nM. La CI_{50} se puede medir mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Normalmente, una CI_{50} se puede medir mediante ELISA o RIA. En una forma de realización preferida, la CI_{50} se mide mediante RIA.
En otra forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR de la invención previene la activación del IGF-IR en presencia de IGF-I. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe la fosforilación de tirosina inducida por IGF-IR que se produce las la ocupación del receptor. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe que se produzcan los acontecimientos celulares posteriores. Por ejemplo, el anti-IGF-IR puede inhibir la fosforilación de tirosina de She y del sustrato del receptor de la insulina (IRD) 1 y 2, los cuales se fosforilan con normalidad cuando las células se tratan con IGF-I (Kim y col., J. Biol. Ghem. 273: 34543-34550, 1998). Se puede determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR puede prevenir la activación de IGF-IR en presencia de IGF-I determinando los niveles de autofosforilación para IGF-IR, Shc, IRS-1 o IRS-2 mediante transferencia de tipo western o inmunoprecipitación. En una forma de realización preferida, se determinarían los niveles de autofosforilación del IGF-IR mediante transferencia de tipo western. Véase, por ejemplo, el ejemplo VII.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo produce la regulación por disminución del IGF-IR de una célula tratada con el anticuerpo. En una forma de realización, el IGF-IR se internaliza en el citoplasma de la célula. Después de que el anticuerpo anti-IGF-IR se una al IGF-IR, el anticuerpo se internaliza, como se muestra mediante microscopia confocal. Si desear quedar anclado por teoría alguna, se cree que el complejo anticuerpo-IGF-IR se internaliza en un lisosoma y se degrada. Se puede medir la regulación por disminución del IGF-IR mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos inmunoprecipitación, microscopia confocal o transferencia de tipo western. Véase, por ejemplo, el ejemplo VII. En una forma de realización preferida, el anticuerpo se selecciona de 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.
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Inhibición de la fosforilación de tirosina del IGF-IR, niveles de IGF-IR y crecimiento de células tumorales in vivo por los anticuerpos anti-IGF-IR
De acuerdo con otra forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR de la invención inhibe la fosforilación de tirosina del IGF-IR y los niveles del receptor in vivo. En una forma de realización, la administración de anticuerpo anti-IGR-IR a un animal produce una reducción de la señal de fosfotirosina del IGF-IR en tumores que expresan IGF-IR. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR produce una reducción de la señal de fosfotirosina en al menos un 20%. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR produce una disminución de la señal de fosfotirosina en al menos un 60%, más preferentemente un 50%. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo produce una disminución de la señal de fosfotirosina en al menos un 40%, más preferentemente un 30%, incluso más preferentemente un 20%. En una forma de realización preferida, el anticuerpo se administra aproximadamente 24 horas antes de medir los niveles de fosforilación de tirosina. Los niveles de fosforilación de tirosina pueden medirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tales como los que se describe más adelante. Véase, por ejemplo, el Ejemplo III y la figura 5. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.
En otra forma de realización, la administración de anticuerpo anti-IGR-IR a un animal produce una reducción de los niveles de IGF-IR en tumores que expresan IGF-IR. En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR produce una reducción de los niveles del receptor en al menos un 20% en comparación con un animal no tratado. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR produce una disminución de los niveles del receptor en al menos un 60%, más preferentemente un 50% de los niveles del receptor en un animal sin tratar. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo produce una disminución en los niveles del receptor en al menos un 40%, más preferentemente un 30%. En una forma de realización preferida, el anticuerpo se administra aproximadamente 24 horas antes de medir los niveles del IGF-IR. Los niveles de IGF-IR pueden medirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tales como los que se describe más adelante. Véase, por ejemplo, el Ejemplo VIII y la figura 6. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.
El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención inhibe el crecimiento de células tumorales in vivo. La célula tumoral puede derivar de cualquier tipo de célula, incluidas, sin limitaciones, células epidérmicas, epiteliales, endoteliales, de leucemia, de sarcoma, de mieloma múltiple o mesodérmicas. Ejemplos de células tumorales incluyen células A549 (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), células MCF-7, células Colo 205, células 3T3/IGF-IR y células A431. En una forma de realización preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en comparación con el crecimiento del tumor en un animal no tratado. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en un 50%. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en un 60%, 65%, 70% ó 75%. En una forma de realización, la inhibición del crecimiento de células tumorales se mide al menos 7 días después de que los animales han iniciado el tratamiento con el anticuerpo. En una forma de realización más preferida, la inhibición del crecimiento de células tumorales se mide al menos 14 días después de que los animales han iniciado el tratamiento con el anticuerpo. En otra forma de realización preferida, otro agente antineoplásico se administra al animal con el anticuerpo anti-IGF-IR. En otra forma de realización preferida, el agente antineoplásico es capaz de inhibir adicionalmente el crecimiento de las células tumorales. En una forma de realización todavía más preferida, el agente antineoplásico es adriamicina, taxol, tamoxifeno, 5-fluorodesoxiuridina (5-FU) o CP-358.774. En una forma de realización preferida, la co-administración de un agente antineoplásico y el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe el crecimiento de células tumorales en al menos un 50%, más preferentemente 60%, 65%, 70% o 75%, más preferentemente 80%, 85% o 90% tras un periodo de 22-24 días. Véase, por ejemplo, la figura 7 y el ejemplo IX.
En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o porción de unión a antígeno del mismo.
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Inducción de la apoptosis por anticuerpos anti-IGF-IR
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR de la invención induce muerte celular. En una forma de realización, el anticuerpo producir apoptosis. El anticuerpo puede inducir apoptosis in vivo o in vitro. En general, las células tumorales son más sensibles a la apoptosis que las células normales, de modo que la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR produzca apoptosis de una célula tumoral antes que de una célula normal. En otra forma de realización, la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR disminuye los niveles de una enzima, akt, que está implicada en la vía de la fosfatidilinositol (PI) quinasa. La vía de la PI quinasa, a su vez, está implicada en la proliferación celular y la prevención de la apoptosis. Por tanto, la inhibición de akt puede producir apoptosis. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo se administra in vivo para producir apoptosis de una célula que expresa IGF-IR. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o porción de unión a antígeno del mismo.
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Procedimientos de producir anticuerpos y líneas celulares productoras de anticuerpos Inmunización
En una forma de realización, los anticuerpos humanos de la presente invención se producen mediante inmunización de un animal no humano que comprende algunos o todos los locus de inmunoglobulina humana con un antígeno de IGF-IR. En una forma de realización preferida, el animal no humano es XENOMOUSE^{TM}, que es una cepa de ratón sometida a ingeniería que comprende fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Green, y col. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las patentes de Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Véase también el documento WO 91/10741, publicado el 25 de julio de 1991, el documento WO 94/02602, publicado el 3 de febrero de1994, el documento WO 96/34096 y el documento WO 96/33735, ambos publicados el 31 de octubre de 1996, el documento WO 98/16654, publicado el 23 de abril de1998, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, el documento WO 98/50433, publicado el 12 de noviembre de 1998, el documento WO 99/45031, publicado el 10 de septiembre de 1999, el documento WO 99/53049, publicado el 21 de octubre de 1999, el documento WO 00.09560, publicado el 24 de febrero de 2000 y el documento WO 00/037504, publicado el 29 de junio de 2000. El XENOMOUSE^{TM} produce un repertorio humano similar al de adultos de anticuerpos completamente humanos y general AcMo humanos específicos de antígeno. Un XENOMOUSE^{TM} de segunda generación contiene aproximadamente un 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea genn de tamaño megabases de los loci de la cadena pesada humana y los loci de la cadena ligera \kappa. Véase Méndez y col. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med 188:483-495 (1998).
La invención también proporciona un procedimiento para fabricar los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención a partir de animales no humanos, no ratones mediante la inmunización de animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Se pueden producir dichos animales usando los procedimientos descritos justo en lo que antecede. Los procedimientos divulgados en estas patentes pueden modificarse tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5.994.619. En una forma de realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos.
En otra forma de realización, el animal no humano que comprende loci del gen de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque del minilocus, se simula un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig. Por tanto, uno o más genes de V_{H}, uno o más genes de D_{H}, uno o más genes de J_{H}, una región constante mu y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) se forman en un constructo para su inserción en un animal. Este enfoque se describe en, entre otros, la patente de EE.UU. Nº 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y 5.643.763.
Una ventaja del enfoque del minilocus es la rapidez con la que se pueden generar constructos que incluyen porciones del locus de Ig e introducir en animales. No obstante, una potencial desventaja del enfoque del minilocus es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulinas para soportar el desarrollo de células B completas, de modo que puede haber menor producción de anticuerpos.
Con el fin de producir un anticuerpo humano anti-IGF-IR, se inmuniza a un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de inmunoglobulina humana con un antígeno del IGF-IR y el anticuerpo o la célula productora del anticuerpo se aíslan del animal. El antígeno del IGF-IR puede ser IGF-IR aislado y/o purificado y, preferentemente, es un IGF-IR humano. En otra forma de realización, el antígeno de IGF-IR es un fragmento de IGF-IR, preferentemente el dominio extracelular de IGF-IR. En otra forma de realización, el antígeno de IGF-IR es un fragmento que comprende al menos un epítopo de IGF-IR. En otra forma de realización, el antígeno de IGF-IR es una célula que expresa IGF-IR sobre su superficie celular, preferentemente una célula que sobreexpresa IGF-IR sobre su superficie celular.
La inmunización de animales se puede realizar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. En la técnica se conocen bien procedimientos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno y caballos. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane y la patente de EE.UU. 5.994.619. En una forma de realización preferida, el antígeno de IGF-IR se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muranilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida mediante su secuestro en un depósito local o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para que secrete factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, extendidas durante varias semanas.
El ejemplo I proporciona un protocolo para inmunizar un XENOMOUSE^{TM} con IGF-IR humano de longitud completa en solución salina tamponada con fosfato.
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Producción de anticuerpos y líneas celulares productoras de anticuerpos
Tras la inmunización de un animal con un antígeno de IGF-IR, se pueden obtener del animal los anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos. Un suero que contiene anticuerpos anti-IGF-IR se obtiene del animal mediante sangrado o sacrificio del animal. El suero se puede usar tal como se obtiene del animal, una fracción de inmunoglobulina se puede obtener del suero o los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden purificar del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de este modo son policlonales, que suponen una desventaja porque la cantidad de anticuerpos que se puede obtener es limitada y el anticuerpo policlonal tiene una serie heterogénea de propiedades.
En otra forma de realización se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Tras la inmunización, se sacrifica al animal y las células B esplénicas se condensan con células de mieloma inmortalizadas como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, ant. En una forma de realización preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretoras). Tras la fusión y la selección con antibiótico, los hibridomas se pasan por detección selectiva usando IGF-IR, una porción del mismo, o una célula que expresa IGF-IR. En una forma de realización preferida, la detección selectiva inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferentemente un ELISA. Un ejemplo de detección selectiva con ELISA se proporciona en el documento WO 00/37504.
En otra forma de realización, las células productoras de anticuerpos se pueden preparar a partir de un ser humano que tiene un trastorno autoinmunitario y que expresa anticuerpos anti-IGF-IR. Las células que expresan anticuerpos anti-IGF-IR se pueden aislar aislando los glóbulos blancos y sometiéndolos a clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o mediante fijación (panning) sobre placas recubiertas con IGF-IR o una porción del mismo. Estas células pueden condensarse con un mieloma no secretor humano para producir hibridomas humanos que expresan anticuerpos humanos anti-IGF-IR. En general, esta es una forma de realización menos preferida porque es probable que los anticuerpos anti-IGF-IR tengan una baja afinidad por IGF-IR.
Los hibridomas productores de anticuerpos anti-IGF-IR, clonados y seleccionados después según características deseables, incluido el crecimiento sólido del hibridoma, producción elevada de anticuerpos y características deseables de anticuerpos, como se tratada con más detalle más adelante. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de un sistema inmunitario, por ejemplo ratones desnudos, o en cultivo celular in vitro. Procedimientos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Preferentemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana y las células B esplénicas se condensan con un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. Más preferentemente, el animal inmunizado es un XENOMOUSE^{TM} y la línea celular de mieloma es un mieloma de ratón no secretor, tal como la línea celular de mieloma es NSO-bcl2. Véase, por ejemplo, el ejemplo I.
En un aspecto, la invención proporciona hibridomas que producen anticuerpos humanos anti-IGF-IR. En una forma de realización preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, tal como se ha descrito en lo que antecede. En otra forma de realización preferida, los hibridomas se producen en una especie no humana no ratón, tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra forma de realización, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que un mieloma humano no secretor se condensa con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-IGF-IR.
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Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y procedimientos recombinantes para fabricar anticuerpos Ácidos nucleicos
Se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-IGF-IR de la invención. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y ligera de una inmunoglobulina anti-IGF-IR. La inmunoglobulina codificada es una inmunoglobulina humana, preferentemente una IgG humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena \lambda o una cadena \kappa, preferentemente una cadena \kappa.
La molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera puede derivar del gen A30V\kappa.
En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la región de unión derivada de J\kappa1, J\kappa2 o J\kappa4. En una forma de realización todavía más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera contiene no más de diez cambios de aminoácidos del gen de la línea germinal V\kappaA30, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos y, más preferentemente, no más de tres cambios de aminoácidos.
La invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera (VL) que contiene al menos tres cambios de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, en la que los cambios de aminoácido son idénticos a los cambios de aminoácidos de la secuencia de la línea germinal de la VL del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena ligera 2.13.2 o 4.9.2.
La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDR de la cadena ligera de2.13.2 O 4.9.2. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 6 ó 14 o comprende una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 5 ó 13. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDR de SEC ID Nº 6 o 14, o comprende una secuencia de ácido nucleico de todas la CDR de SEC ID Nº 5 o 13.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una secuencia de aminoácidos de una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 6 ó 14. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 5 ó 13. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico codifica una VL que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 ó 14. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una VL que hibrida en condiciones altamente
rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 5 ó 13.
La molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada (VH) puede derivar del gen DP-7 VH. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH comprende la región de unión derivada de JH6 o JH5, más preferentemente JH6. En otra forma de realización preferida, el segmento D deriva de 3-3, 6-19 o 4-17. en una forma de realización todavía más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene no más de diez cambios de aminoácidos del gen DP-47 de la línea germinal, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos, e incluso más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En una forma de realización altamente preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, en la que el cambio de aminoácido es idéntico al cambio de aminoácido de la secuencia de la línea germinal de la cadena pesada del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2.
En una forma de realización todavía más preferida, la VH contiene al menos tres cambios de aminoácido en comparación con las secuencias de la línea germinal, en la que los cambios son idénticos a los cambios de la secuencia de la línea germinal de la VH del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2.
En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la VH de 2.13.2 o 4.9.2.
La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos de todas las CDR de la cadena pesada de 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de SEC ID Nº 8 o 16 o que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 ó 15. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos de todas
las CDR de SEC ID Nº 8 ó 16 o comprende una secuencia de ácido nucleico de todas las CDR de SEC ID Nº 7 ó 15.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una secuencia de aminoácidos de una VH que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 ó 16. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 ó 15.
En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico codifica una VH que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de ácido nucleico que codifica una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 ó 16. La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una VH que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 o 15.
La molécula de ácido nucleico que codifica las cadenas completas pesada y ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR o las regiones variables del mismo puede obtenerse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo anti-IGF-IR. En la técnica se conocen bien procedimientos de aislar ARNm que codifica un anticuerpo. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. El ARNm puede usarse para producir ADNc para usar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o clonación en ADNc de los genes de los anticuerpos. En una forma de realización de la invención, las moléculas de ácido nucleico se pueden obtener de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-IGF-IR, como se ha descrito en lo que antecede, preferentemente un hibridoma que tiene como una de sus parejas de fusión una célula de animal transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana, tal como un XENOMOUSE^{TM}, un animal transgénico ratón no humano o un animal transgénico no humano no ratón. En otra forma de realización, el hibridoma deriva de un animal no transgénico no humano, que se puede usar para, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una molécula de ácido nucleico que codifica toda la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR puede construirse condensando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena pesada o un dominio de unión a antígeno del mismo con un dominio constante de una cadena pesada. De forma similar, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR puede construirse condensando una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera o un dominio de unión a antígeno del mismo con un dominio constante de una cadena ligera. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena VH y VL pueden convertirse en genes de los anticuerpos de longitud completa insertándolas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de la cadena pesada y constante de la cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH está operativamente unido al(los) segmento(s) de la región constante de la cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL está unido operablemente al segmento de la región constante de la cadena ligera (CL) dentro del vector. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH o VL se convierten en genes de anticuerpos de longitud completa mediante la unión, por ejemplo ligando, de la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH a una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH usando técnicas de biología molecular estándar. Se puede conseguir lo mismo usando moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes humanos de la región constante de las cadenas pesada y ligera se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., NIH Nº de Publ. 91-3242, 1991. A continuación, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa pueden expresarse en una célula en la que se han introducido y aislarse el anticuerpo anti-IGF-IR.
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 ó 16, y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de las cadenas ligeras codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 ó 14. La SEC ID Nº 28 representa la secuencia de aminoácidos y la SEC ID Nº 27 representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena pesada de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 y 4.9.2. La SEC ID Nº 26 representa la secuencia de aminoácidos y la SEC ID Nº 25 representa la secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de la cadena ligera de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 y 4.9.2. Por tanto, en una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada codifica la SEC ID Nº 28 y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena ligera codifica la SEC ID Nº 26. En una forma de realización más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante de la cadena pesada tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 27 y la molécula de ácido nucleico que codifica el dominio constante tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 25.
Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR o un dominio de unión a antígeno del mismo o la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR o un dominio de unión a antígeno del mismo pueden aislarse de un animal no humano no ratón que expresa genes de inmunoglobulina humana y que se ha inmunizado con un antígeno de IGF-IR. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico puede aislarse de una célula productora de anticuerpos anti-IGF-IR derivada de un animal no transgénico o de un paciente humano que produce anticuerpos anti-IGF-IR. Procedimientos de aislar ARNm de las células productoras de anticuerpos anti-IGF-IR pueden aislarse mediante técnicas estándar, clonarse y/o amplificarse usando PCR y técnicas de construcción de biblioteca y realizarse la detección selectiva usando protocolos estándar para obtener moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera anti-IGF-IR.
Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar de forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-IGF-IR, como se describe más adelante. Las moléculas de ácido nucleico también se pueden usar para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe adicionalmente más adelante. Si las moléculas de ácido nucleico derivan de un animal no transgénico no humano, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para la humanización de anticuerpos, también como se describe más adelante.
En otra forma de realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse como sondas o cebadores para PCR para secuencias de anticuerpo específicas. Por ejemplo, una sonda molecular de ácido nucleico puede usarse en procedimientos diagnósticos o un cebador para PCR de molécula de ácido nucleico puede usarse para amplificar regiones de ADN que podrían usarse, entre otros, para aislar secuencias de ácido nucleico para usar en la producción de dominios variables de anticuerpos anti-IGF-IR. En una forma de realización preferida, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En una forma de realización más preferida, los oligonucleótidos proceden de regiones altamente variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de interés. En una forma de realización todavía más preferida, los oligonucleótidos codifican toda o parte de una o más de las CDR.
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Vectores
La invención proporciona vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada y la cadena ligera o porciones de unión al antígeno de las mismas.
Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpos de la invención, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, obtenidos como se ha descrito en lo que antecede, se insertan en vectores de expresión de modo que los genes están operablemente unidos a secuencias de control de la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, epitomas derivados del EBV, y similares. El gen del anticuerpo está ligado en un vector tal que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirven a la función prevista de regulación de la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se escogen de modo que sean compatibles con la célula huésped usada para la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores distintos. En una forma de realización preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos estándar (p. ej., ligando sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y en el vector, o ligando los extremos romos si no hay sitios de restricción presentes).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa con los adecuados sitios de restricción producidos por ingeniería de modo que cualquier secuencia de VH o VL se pueda insertar y expresar fácilmente, como se ha descrito en lo que antecede. En dichos vectores, el corte y empalme normalmente se produce entre el sitio donante del corte y empalme en la región J insertada y el aceptor del corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que se producen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en los sitios cromosómicos nativos posteriores a las regiones de codificación. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal esté unido dentro del marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulínica).
Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Entre las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huésped de mamífero se incluyen elementos víricos que dirigen niveles elevados de expresión proteica en células de mamífero, tal como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador del CMV), virus 40 de simios (SV40) (tal como el promotor/potenciador del SV40), adenovirus (p. ej., el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)), promotores fuertes de polioma y de mamíferos tales como promotores de la inmunoglobulina nativa y de la actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales, y de sus secuencias, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.168.062 de Stinski, la patente de EE.UU. Nº. 4.510.245 de Bell y col. y la patente de EE.UU. Nº 4.968.615 de Schaffner y col.
Además de los genes de la cadena del anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel y col.) Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Entre los genes marcadores seleccionables preferidos se incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr- con selección con metotrexato/amplificación) y el gen neo (para la selección de G418).
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Células huésped que no son hibridomas y procedimientos de producir proteínas de forma recombinante
Para a transformación de una célula huésped de mamífero adecuada se pueden usar moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada, o una porción de unión a antígeno de la misma, y/o la cadena ligera, o una porción de unión a antígeno de la misma, de un anticuerpo anti-IFG-IR y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico. La transformación puede ser mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped. En la técnica se conocen bien procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación en fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(los) polinucleótido(s) en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además se pueden introducir moléculas de ácido nucleico en las células de mamífero a través de vectores virales. En la técnica se conocen bien procedimientos para transformar células Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455.
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En la técnica se conocen bien líneas de células de mamífero disponibles como huéspedes e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLA, células de riñón de hámster neonato (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células A549, células 3T3 y una serie de otras líneas celulares. Entre las células huésped de mamífero se incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, de ganado bovino, de caballo y de hámster. Líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen niveles de expresión elevados. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insectos, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión que codifican la cadena pesada o una porción de unión al antígeno de la misma, la cadena ligera, y/o una porción de unión al antígeno de la misma, se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen mediante cultivo de las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando procedimientos de purificación proteica estándar.
Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otros restos de los mismos) en las líneas celulares de producción se puede potenciar usando una serie de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque habitual para potenciar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se trata todo o en parte en relación con las patentes europeas nº 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la solicitud de patente europea nº 89303964.4.
Es probable que anticuerpos expresados por líneas celulares diferentes o en animales transgénicos tengan diferente glicosilación entre sí. No obstante, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria descriptiva, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria descriptiva, con parte de la presente invención, con independencia de la glicosilación de los anticuerpos.
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Animales transgénicos
La invención también proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que se pueden usar para producir anticuerpos de la invención. Los anticuerpos se pueden producir, y recuperar, en tejido o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. Como se ha descrito en lo que antecede se pueden producir animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana mediante inmunización con IGF-R o una porción del mismo.
En otra forma de realización, los animales transgénicos no humanos se producen mediante la introducción en el animal de una o más moléculas de ácido nucleico de la invención mediante técnicas transgénicas estándar. Véase, Hogan, ant. Las células transgénicas usadas para fabricar el animal transgénico pueden ser células madre embrionarias o células somáticas. Los organismos transgénicos no humanos pueden ser quiméricos, heterocigotos no quiméricos y homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo, Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson y col., Mose Genetics and Transgenies: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En otra forma de realización, los organismos transgénicos no humanos pueden tener una alteración dirigida y sustitución que codifica una cadena pesada y/o cadena ligera de interés. En una forma de realización preferida, los animales transgénicos comprenden u expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras que se unen específicamente al IGF-IR, preferentemente el IGF-IR humano. En otra forma de realización, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado, tal como un anticuerpo de una cadena, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-IGF-IR pueden producirse en cualquier animal transgénico. En una forma de realización preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales.
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Bibliotecas de expresión en fagos
El anticuerpo anti-IGF-IR o la porción de unión al antígeno del mismo de la invención se puede producir en un procedimiento que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, seleccionar la biblioteca con un IGF-IR, o una porción del mismo, aislar el fago que se une al IGF-R, y obtener el anticuerpo del fago. Un procedimiento para preparar la biblioteca de anticuerpos comprende las etapas de inmunizar un animal huésped no humano que comprende un locus de inmunoglobulina humana con IGF-R, o una porción antigénica del mismo, para crear una respuesta inmunitaria, extraer las células del animal huésped las células que son responsables de la producción de anticuerpos; aislar ARN de las células extraídas, realizar una transcripción inversa del ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando un cebador e insertar el ADNc en el vector de expresión en fagos de modo que los anticuerpos se expresen en el fago. De ese modo se pueden obtener anticuerpos anti-IGF-R recombinantes de la invención.
Los anticuerpos humanos anti-IGF-IR recombinantes de la invención además de los anticuerpos anti-IGF-IR divulgados en la presente memoria descriptiva se pueden aislar mediante detección selectiva de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, preferentemente una biblioteca de expresión en fagos de scFv, preparada usando los ADNc de VL y VH preparados a partir del ARNm derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y seleccionar dichas bibliotecas se conocen en la técnica. Existen kit comercialmente disponibles para generar bibliotecas de expresión en fagos (p. ej., el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nº de cat. 27-9400-01; y el kit de expresión en fagos Stratagene SurfZAp^{TM} kit de expresión en fagos, nº de cat. 240612). También hay otros procedimientos y reactivos que pueden usarse en la generación y detección selectiva de bibliotecas de expresión de anticuerpos (véase, por ejemplo, Ladner y col., la patente de EE.UU. 5.223.409; Kang y col. La publicación PCT Nº WO 92/18619; Dower y col. La publicación PCT Nº WO 91/17271; Winter y col. La publicación PCT Nº WO 92/20791; Markland y col. La publicación PCT Nº WO 92/15679; Breitling y col. La publicación PCT Nº WO 93/01288; McCafferty y col. La publicación PCT Nº WO 92/01047; Garrard y col. La publicación PCT Nº WO 92/09690; Fuchs y col. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y col. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse y col. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths y col. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins y col. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson y col. (1991) Nature 352:624-628; Gram y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad, y col. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y col. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.
En una forma de realización preferida, para aislar anticuerpos anti-IGF-IR humanos con las características deseadas, primero se usa un anticuerpo anti-IGF-R humano tal como se ha descrito en la presente memoria descriptiva para seleccionar secuencias de cadenas pesada y ligera humanas que tengan una actividad de unión al IGF-IR similar, usando los procedimientos de huella del epítopo descritos en Hoogenboom y col., publicación PCT nº WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este procedimiento son, preferentemente, bibliotecas de scFv preparadas y seleccionadas tal como se describe en McCafferty y col., publicación PCT nº WO 92/01047, McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554; y Griffiths y col., (1993) EMBO J 12:725-734. Preferentemente, las bibliotecas de anticuerpos scFv se seleccionan usando IGF-IR humano como antígeno.
Una vez que se han seleccionado segmentos iniciales de VL y VH humanos, se realizan experimentos de "mezclar y aparear", en los que se seleccionan los segmentos VL y VH seleccionados inicialmente según la unión a IGF-IR, para seleccionar las combinaciones de pares VL/VH preferidas. Adicionalmente, pare mejorar más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH de el(los) pares VL/VH preferidos se pueden mutar aleatoriamente, preferentemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un procedimiento análogo al procedimiento de mutación somática in vivo responsable de la maduración de la afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmunitaria natural. Esta maduración de la afinidad in vitro se puede conseguir mediante la amplificación de las regiones VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la CDR3 de VH o a la CDR3 de VL, respectivamente, en los que los cebadores se han "contaminado" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en ciertas posiciones de modo que los productos resultantes de la PCR codifican los segmentos VH y VL en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de VH y/o de VL. Estos segmentos VH y VL mutados de forma aleatoria se pueden volver a seleccionar según la unión a IGF-IR.
Tras la selección y el aislamiento de un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención de una biblioteca de expresión de inmunoglobulinas recombinantes, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado se puede recuperar del paquete de expresión (p. ej., del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresión mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Si se desea, el ácido nucleico puede además manipularse para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe más adelante. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante selección en una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula huésped de mamífero, tal como se ha descrito en lo que antecede.
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Cambio de clase
Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un mecanismo mediante el cual la clase de un anticuerpo anti-IGF-IR se puede cambiar con otro. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se aísla usando procedimientos bien conocidos en la técnica de modo que no incluya ninguna secuencia de ácido nucleico que codifique CL o CH. Después, la molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o CH de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto se puede realizar usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, tal como se ha descrito en lo que antecede. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-IR que inicialmente era IgM puede cambiarse de clase a una IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo de IgG1 a IgG2. Un procedimiento preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprende un isotipo deseado comprende las etapas de aislar un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-IGF-IR, obtener la región variable de la cadena pesada, ligar la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar en una célula la cadena ligera y la cadena pesada ligadas y recoger el anticuerpo anti-IGF-IR con el isotipo deseado.
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Derivados de anticuerpos
Se pueden usar las moléculas de ácido nucleico descritas en lo que antecede para generar derivados de anticuerpos usando técnicas y procedimientos conocidos para el experto en la técnica.
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Anticuerpos humanizados
Como se ha tratado en lo que antecede en relación con la generación de anticuerpos humanos, existen ventajas de la producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Esto se puede conseguir en cierta medida usando técnicas de humanización y técnicas de expresión usando bibliotecas adecuadas. Se apreciará que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden humanizarse o privatizarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright y col. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede someterse a ingeniería mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir las regiones CH1, CH2, CH3, los dominios bisagra y/o el dominio marco estructural con la correspondiente secuencia humana (véase el documento WO 92102190 y las patentes de EE.UU. Nº 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). En una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IGF-RI se puede humanizar mediante la sustitución de las regiones CH1, CH2, CH3, los dominios bisagra y/o el dominio marco estructural con la correspondiente secuencia humana manteniendo todas las CDR de la cadena pesada, la cadena ligera o tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera.
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Anticuerpos mutados
En otra forma de realización, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y las células huésped pueden usarse para producir anticuerpos mutados anti-IGF-IR. Los anticuerpos pueden estar mutados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar la propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede realizar una mutación en una o más de las regiones CDR para incrementar o disminuir la K_{d} del anticuerpo por IGF-IR, para incrementar o disminuir la K_{off} o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. En la técnica se conocen bien las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. y Ausubel y col., ant. En una forma de realización preferida, las mutaciones se efectúan en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-IGF-IR. En una forma de realización más preferida, se efectúan una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable o región CDR de uno de los anticuerpos anti-IGF-IR 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización, se realizan una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe que está cambiado en comparación con la línea germinal en una región variable o región CDR cuya secuencia de aminoácidos se presenta en las SEC ID Nº 6, 8, 14, ó16 o cuya secuencia de ácido nucleico se presenta en las SEC ID Nº 5, 7, 13 ó 15.
En otra forma de realización, las moléculas de ácido nucleico están mutadas en una o más de las regiones marco estructural. Se puede realizar una mutación en una región marco estructural o dominio constante para incrementar la semivida del anticuerpo anti-IGF-R. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/09560, publicado el 24 de 2000. En una forma de realización puede haber una, tres o cinco mutaciones puntuales y no más de diez mutaciones puntuales. También puede realizarse una mutación en una región marco estructural o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula o para alterar propiedades tales como la fijación del complemento. Las mutaciones pueden realizarse en cada una de las regiones marco estructural, el dominio constante y las regiones variables en un anticuerpo sencillo mutado. Como alternativa, las mutaciones pueden realizarse en sólo una de las regiones marco estructural, las regiones variables o el dominio constante y en un anticuerpo sencillo mutado.
En una forma de realización, no hay más de diez cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF-IR mutado en comparación con el anticuerpo anti-IGF-IR antes de la mutación. En una forma de realización más preferida no hay más de cinco cambios de aminoácidos en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF-IR mutado, más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En otra forma de realización, no hay más de quince cambios de aminoácidos en los dominios constantes, más preferentemente no más de diez cambios de aminoácidos, incluso más preferentemente no más de cinco cambios de aminoácidos.
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Anticuerpos modificados
En otra forma de realización, se puede producir un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo anti-IGF-IR unido a otro polipéptido. En una forma de realización preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo anti-IGF-IR están unidas al polipéptido. En otra forma de realización preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-IR está unido a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-IGF-IR está unido a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de un modo tal que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí para formar un sitio de unión al anticuerpo. En otra forma de realización preferida, el dominio VH está separado por el dominio VL por un ligador tal que tal que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sí (véase más adelante en Anticuerpos de una cadena). El anticuerpo VH-ligador-VL se une después al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que expresan IGF-IR. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente diagnóstico, tal como una enzima que se pueda visualizar fácilmente, tal como la peroxidasa de rábano. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos de una cadena están unidos entre sí. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en un polipéptido de una cadena o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.
Para crear un anticuerpo de una cadena (scFv), los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están operativamente unidos a otro fragmento que codifica un ligador flexible, por ejemplo que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly_{4}-Ser)_{3} (SEC ID Nº 60) de modo que las secuencias VH y VL se puedan expresar en forma de una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el ligador flexible (véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554). El anticuerpo de una cadena puede ser monovalente si se usan sólo una VH y VL, bivalente si se usan dos VH y VL, o polivalente si se usan más de dos VH y VL.
En otra forma de realización se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican anti-IGF-IR. Por ejemplo, "Cuerpos Kappa" (III y col., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin y col., EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger y col., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), "Janusins" (Traunecker y col., EMBO J 10: 3655-3659 (1991); y Traunecker y col. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)) pueden prepararse usando técnicas de biología molecular estándar siguiendo las indicaciones de la especificación.
En otro aspecto se pueden generar anticuerpos quiméricos y biespecíficos. Se puede fabricar un anticuerpo quimérico que comprende CDR y regiones marco estructural de diferentes anticuerpos. En una forma de realización preferida, los CDR del anticuerpo quimérico comprenden todos los CDR de la región variable de una cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR, mientras que las regiones marco estructural derivan de uno o más anticuerpos diferentes. En una forma de realización más preferida, las CDR del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-IR. Las regiones marco estructural pueden ser de otra especie y pueden, en una forma de realización preferida, humanizarse. Como alternativa, las regiones marco estructural puede proceder de otro anticuerpo humano.
Se puede generar un anticuerpo biespecífico que se una específicamente al IGF-IR a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo biespecífico se puede producir a través de técnicas de biología molecular recombinantes o pueden conjugarse físicamente juntos. Además, se puede generar un anticuerpo de una cadena que contiene más de una VH y VL que se una específicamente al IGF-IR y a otra molécula. Dichos anticuerpos biespecíficos se pueden generar usando técnicas que son bien conocidas por ejemplo, en relación con (i) y (ii), véase, por ejemplo, Fanger y col. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, ant. y en relación con (iii) véase, por ejemplo., Traunecker y col. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). En una forma de realización preferida, el anticuerpo biespecífico se une al IGF-IR y a otra molécula expresada a niveles elevados en las células cancerosas o tumorales. En una forma de realización preferida, la otra molécula es el receptor erbB2, VEGF, CD20 o EGF-R.
En una forma de realización, los anticuerpos modificados descritos en lo que antecede se preparan usando una o más de las regiones variables de las regiones CDR del anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2. En otra forma de realización, los anticuerpos modificados se preparan usando una o más regiones variables o las regiones CDR cuya secuencia de aminoácidos se presenta en la SEC ID Nº 6, 8, 14 ó 16, o cuya secuencia de ácido nucleico se presenta en las SEC ID Nº 5, 7, 13 ó 15.
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Anticuerpos derivados y marcados
Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención pueden derivarse o unirse a otra molécula (p. ej., otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o su porción se derivan de modo tal que la unión a IGF-IR no se ve afectada de forma adversa por la derivación o el marcaje. De acuerdo con esto, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención están destinados a incluir formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos humanos anti-IGF-IR descritos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención pueden unirse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tal como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una cola de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivado se produce mediante reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo para crear anticuerpos biespecíficos). Reticuladores adecuados incluye los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador adecuado (p. ej., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (p. ej. suberato de disuccinimidilo). Dichos ligadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Otro tipo de anticuerpo derivado es un anticuerpo marcado. Agentes de detección útiles con los que se puede derivar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluidos fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos lantánidos y similares. Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que son útiles para la detección, tal como peroxidasa de rábano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se marca con una enzima detectable, se detecta mediante la adición de reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que se pueda distinguir. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano, la adición de peróxido de hidrógeno y de diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado que es detectable. También se puede marcar un anticuerpo con biotina y detectarse a través de medición indirecta de la unión de avidina o de estreptavidina. Un anticuerpo se puede marcar con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede marcarse con un epítopo polipeptídico predeterminado reconocido por un indicador secundario (p. ej., secuencias de pares en cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, colas de epítopos). En algunas formas de realización, las marcas están unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir la potencial hidrancia estérica.
Un anticuerpo anti-IGF-IR también se puede marcar con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse para fines diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar tumores que expresan IGF-IR mediante rayos x u otras técnicas diagnósticas. Además, el radiomarcador puede usarse terapéuticamente como una toxina para tumores o células cancerosas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes radioisótopos o radionúclidos - ^{3}H, ^{14}C, ^{15}N, ^{35}S, ^{90}Y, ^{99}Tc, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I.
Un anticuerpo anti-IGF-IR también se puede derivar con un grupo químico, tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo para incrementar la semivida sérica o incrementar la unión en el tejido.
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Composiciones farmacéuticas y kit
La invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de cáncer, tal como, cáncer de cerebro, de células escamosas, de vejiga urinaria, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, de cuello, renal, de riñón, de ovarios, de próstata, colorrectal, esofágico, ginecológico o de tiroides. En otra forma de realización, dicha composición farmacéutica está relacionada con trastornos hiperproliferativos no cancerosos, tales como, sin limitaciones, reestenosis tras angioplastia y psoriasis.
Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administrar a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades minoritarias de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida de almacenamiento o la eficacia del anticuerpo o de la porción del
anticuerpo.
Las composiciones de la presente invención pueden estar en diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica previstos. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (p. ej., vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una forma de realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular en forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la elevada concentración del fármaco. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del anticuerpo anti-IGF-IR en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo que antecede, según se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados en lo que antecede. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización, que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente filtrada para esterilizar. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede efectuar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar mediante varios procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferida es intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o infusión. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variará en función de los resultados deseados. En una forma de realización, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar en forma de una dosis única o se pueden administrar en forma de múltiples
dosis.
En ciertas formas de realización, el compuesto activo se puede preparar con un transportador que proteja al compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
En ciertas formas de realización, el anti-IGF-IR de la invención se puede administrar por vía oral, por ejemplo con un diluyente inerte o un transportador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes si se desea) puede también incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para el fin de la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante una vía distinta a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto, o coadministrar el compuesto, con un material para prevenir su inactivación.
En las composiciones también pueden incorporarse compuestos activos suplementarios. En ciertas formas de realización, un anti-IGF-IR de la invención se formula junto con y/o coadministra con uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico o un agente antitumoral. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede formular conjuntamente y/o coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitaciones, anticuerpos que se unen a otras dianas (p. ej. anticuerpos que se unen a uno o más factores de crecimiento o citoquinas, sus receptores sobre la superficie celular o IGF-1), proteínas de unión a IGF-1, agentes antineoplásicos, agentes quimioterapéuticos, agentes antitumorales, oligonucleótidos antisentido contra IGF-IR o IGF-I, análogos peptídicos que bloquean la activación del IGF-IR, IGF-IR soluble y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o la actividad del IGF-1, que son conocidos en la técnica, por ejemplo
octreotida.
Dichas terapias de combinación pueden requerir dosificaciones menores del anticuerpo anti-IGF-IR, así como los agentes coadministrados, evitando de este modo las posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una con la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo se supera por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes, o en una etapa prematura de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, varias dosis divididas se pueden administrar en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente tal como indican las exigencias de la situación terapéutica. La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o que comprende una terapia de combinación que comprende el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden formular para dosis únicas o múltiples. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a unidades físicamente pequeñas adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se debe conseguir y (b) de las limitaciones inherentes en la técnica de formar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Una formulación particularmente útil es 5 mg/ml de anticuerpo anti-IGF-IR en un tampón de citrato sódico 20 mM, a pH 5,5, NaCl 140 mM y 0,2 mg/ml de polisorbato 80.
Un ejemplo de intervalo no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,1-100 mg/kg, más preferentemente 0,5-50 mg/kg, más preferentemente 1-20 mg/kg e incluso más preferentemente 1-10 mg/kg. Debe entenderse que los valores de la dosis pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se ha de aliviar. Debe entenderse además que, para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y los intervalos de dosificación indicados en la presente memoria descriptiva son únicamente ejemplos y no están destinados a limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. En una forma de realización, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se administra junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
En otro aspecto, la invención se refiere a la administración de un anticuerpo anti-IGF-IR para el tratamiento del cáncer en una dosis inferior a 300 mg al mes.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona kit que comprende los anticuerpos anti-IGF-IR y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o la composición farmacéutica, agentes diagnósticos o terapéuticos. Un kit puede también incluir instrucciones para usar en un procedimiento diagnóstico o terapéutico. En una forma de realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente diagnóstico que se pueden usar en un procedimiento que se describe más adelante. En otra forma de realización preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico, un agente antitumoral o un agente quimioterapéutico adicional, que se puede usar en un procedimiento que se describe más adelante.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para inhibir el crecimiento celular anormal en un mamífero, que comprenden una cantidad de un compuesto de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en la que las cantidades del compuesto, la sal, el solvato o el profármaco, y del agente quimioterapéutico son, juntas, eficaces en la inhibición del crecimiento celular anormal. Actualmente, en la técnica también se conocen muchos agentes quimioterapéuticos. En una forma de realización, los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo constituido por inhibidores de la mitosis, agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas, por ejemplo anti-andrógenos y agentes anti-angiogénesis.
Los agentes anti-angiogénesis, tales como los inhibidores de la MMP-2 (matrizmetaloproteinasa 2), inhibidores de la MMP-9 (matrizmetaloproteinasa 9) e inhibidores de la COX-II (ciclooxigenasa II), se pueden usar junto con un compuesto de la invención. Ejemplos de inhibidores útiles de la COX-11 incluyen CELEBREX^{TM} (alecoxib), valdecoxib, y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores útiles de la matrizmetaloproteinasa se describen en el documento WO 96/33172 (publicado el 24 de octubre de,1996), el documento WO 96/27583 (publicado el 7 de marzo de1996), la solicitud de patente europea nº 97304971.1 (presentada el 8 de julio de1997), la solicitud de patente europea nº 99308617.2 (presentada el 29 de octubre de1999), el documento WO 98/07697 (publicado el 26 de febrero de 1998), el documento WO 98/03516 (publicado el 29 de enero de 1998), el documento WO 98/34918 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento WO 98/34915 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento WO 98/33768 (publicado el 6 de agosto de 1998), el documento WO 98/30566 (publicado el 16 de julio de 1998), la solicitud de patente europea 606.046 (publicada el 13 de julio de 1994), la solicitud de patente europea 931.788 (publicada el 28 de julio de 1999), el documento WO 90/05719 (publicado el 31 de mayo de 1990), el documento WO 99/52910 (publicado el 21 de octubre de 1999), el documento WO 99/52889 (publicado el 21 de octubre de 1999), el documento WO 99/29667 (publicado el 17 de junio de 1999), la solicitud PCT internacional Nº PCT/IB98/01113 (presentada el 21 de julio de 1998), la solicitud de patente europea Nº 99302232.1 (presentada el 25 de marzo de 1999), solicitud de patente de Gran Bretaña número 9912961.1 (presentada el 3 de junio de 1999), la patente de EE.UU. 5.863.949 (expedida el 26 de enero de 1999), la patente de EE.UU. 5.861.510 (expedida el 19 de enero de 1999) y la publicación de patente europea 780.386 (publicada el 25 de junio de 1997), todos los cuales se incorporan en la presente memoria descriptiva en su totalidad por referencia. Inhibidores preferidos de las MMP son los que no demuestran artralgia. Más preferidos son aquéllos que inhiben de forma selectiva la MMP-2 y/o la MMP-9 respecto a las otras matriz-metaloproteinasas (es decir, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-1 0, MMP-11, MMP-12, y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de la MMP útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, y los compuestos citados en la lista siguiente: ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4fluoro-fenoxi)-bencenesulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1 ]octano-3-carboxílico hidroxiamida; ácido (2R, 3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico hidroxiamida; ácido 4-[4-(4- fluoro-fenoxi)-bencenesulfonilamino]-tetrahidropiran-4-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)- bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiónico; ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenesulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico hidroxiamida; ácido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenesulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxílico hidroxiamida; ácido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metil-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-[[4-(4-fluorofenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-amino]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(4-hidroxicarbamoil-tetrahidropiran-4-il)-amino]-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico hidroxiamida; y ácido (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxílico hidroxiamida; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.
Un compuesto de la invención también se puede usar con inhibidores de la transducción de señal, tales como agentes que pueden inhibir las respuestas del EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos frente a EGF-R, anticuerpos frente a EGF y moléculas que son inhibidores del EGF-R; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores de VEGF y moléculas que pueden inhibir el VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se unen al receptor de erbB2, por ejemplo HERCEPTIN^{TM} (Genentech, Inc.). Los inhibidores del EGF-R se describen en, por ejemplo, el documento WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), el documento WO 98/14451 (publicado el 9 de abril de 1998), el documento WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998) y la patente de Estados Unidos 5.747.498 (emitida el 5 de mayo de 1998) y dichas sustancias se pueden usar en la presente invención tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Entre los agentes que inhiben el EGFR se incluye los anticuerpos monoclonales C225 y anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (AbgenixiCell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA), y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-11 (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck &Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxima de fusión de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y vacuna de EGF-R (York Medical/Centro de Immunología
Molecular (CIM)). En la presente invención se pueden usar estos y otros agentes inhibidores del EGF-R.
Los inhibidores del VEGF, por ejemplo SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering), y NX-1838 (NeXstar), también se pueden combinar con el compuesto de la presente invención. Los inhibidores del VEGF se describen en, por ejemplo, el documento WO 99/24440 (publicado el 20 de mayo de 1999), la solicitud de PCR internacional PCR/IB99/40797 (presentada el 3 se mayo de 1999), el documento WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), el documento WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), la patente de Estados Unidos 5.834.504 (emitida el 10 de noviembre de 1998), el documento WO 98/50356 (publicado el 12 de noviembre de 1998), la patente de Estados Unidos 5.883.113 (presentada el 16 de marzo de 1999), la patente de Estados Unidos 5.886.020 (emitida el 23 de marzo de 1999), la patente de Estados Unidos 5.792.783 (emitida el 11 de agosto de 1998), el documento WO 99/10349 (publicado el 4 de marzo de1999), el documento WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de1997), el documento WO 97/22596 (publicado el 26 de junio de1997), el documento WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), el documento WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de1998), el documento WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999) y el documento WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998).
Otros ejemplos de algunos inhibidores específicos del VEGF útiles en la presente invención son EM862 (Cytran Inc.); anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc.; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme and Chiron. Estos y otros inhibidores del VEGF se pueden usar en la presente invención tal como se describe en la presente memoria descriptiva.
Los inhibidores del receptor ErbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceutical Inc.) y 2B-1 (Chiron), pueden combinarse adicionalmente con el compuesto de la invención, por ejemplo los indicados en el documento WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 99/35146 (publicado el 15 de Julio de 1999), el documento WO 99/35132 (publicado el 15 de Julio de 1999), el documento WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 97/13760 (publicado el 17 de abril 1997), el documento WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), la patente de EE.UU. 5,587,458 (emitida el 24 de diciembre de 1996) y la patente de EE.UU. 5.877.305 (emitida el 2 de marzo de 1999).
Los compuestos y sustancias inhibidores del receptor de erbB2 descritos en las solicitudes PCT, patentes de EE.UU. mencionadas en lo que antecede, así como otros compuestos y sustancias que inhiben el receptor erbB2, se pueden usar con el compuesto de la presente invención de acuerdo con la presente invención.
Los agentes anti-supervivencia incluyen anticuerpos anti-IGF-IR y agentes anti-integrina, tales como anticuerpos anti-integrina.
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Procedimientos diagnósticos de uso
Los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden usar para detectar IGF-IR en una muestra biológica in vitro o in vivo. Los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden usar en in inmunoensayo convencional, incluidos, sin limitaciones, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica tisular, transferencia de tipo western o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención pueden usarse para detectar IGF-IR de seres humanos. En otra forma de realización, los anticuerpos anti-IGF-IR pueden usarse para detectar IGF-IR de primates del viejo mundo, tales como de monos cynomologous y rhesus, chimpancés y simios. La invención proporciona un procedimiento para detectar anti-IGF-IR en una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención y detectar el anticuerpo unido a un anti-IGF-IR, para detectar el IGF-IR en la muestra biológica. En una forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR está directamente marcado con un marcador detectable. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR (el primer anticuerpo) no está marcado y se marca un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede unir al anticuerpo anti-IGF-IR. Como es bien conocido para un experto en la técnica, se escoge un segundo anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a la especie y clase específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-IGF-IR es una IgG humana, el anticuerpo secundario puede ser una IgG anti-humana. Otras moléculas que se pueden unir a anticuerpos incluyen, entre otros, proteína A y proteína G, ambas disponibles comercialmente en, por ejemplo, Pierce Chemical Co.
Marcadores adecuados para el anticuerpo o secundario se han divulgado ant. e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, -galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
En una forma de realización alternativa, el IGF-IR se puede analizar en una muestra biológica mediante un inmunoensayo competitivo utilizando patrones de IGF-IR marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IGF-IR no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones de IGF-IR marcados y el anticuerpo anti-IGF-IR se combinan y se determina la cantidad del patrón de IGF-IR marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de IGF-IR en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de IGF-IR marcado unido al anticuerpo anti-IGF-IR.
Se pueden usar los inmunoensayos divulgados en lo que antecede para una serie de propósitos. En una forma de realización, los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden usar para detectar IGF-IR en células en cultivo celular. En una forma de realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden usar para determinar el nivel de fosforilación de tirosina, autofosforilación de tirosina de IGF-IR y/o la cantidad de IGF-IR sobre la superficie celular tras el tratamiento de las células con varios compuestos. Este procedimiento se puede usar para analizar compuestos que se pueden usar para activar o inhibir IGF-IR. En este procedimiento, una muestra de células se trata con un compuesto de prueba durante un periodo de tiempo mientras que otra muestra se deja sin tratar. Si se debe medir la autofosforilación de tirosina, las células se lisan y la fosforilación de tirosina del IGF-IR se mide usando un inmunoensayo descrito en lo que antecede o como se describe en el ejemplo III, que usa un ELISA. Si el nivel total de IGF-IR se debe medir, las células se lisan y el nivel total de IGF-IR se mide usando uno de los inmunoensayos descritos en lo que antecede.
Un inmunoensayo preferido para determinar la fosforilación de tirosina del IGF-IR o para medir los niveles totales de IGF-IR es un ELISA o una transferencia de tipo western. Si sólo se debe medir el nivel total de IGF-IR en la superficie celular, las células no se lisan y los niveles en la superficie celular del IGF-IR se miden usando uno de los inmunoensayos descritos en lo que antecede. Un inmunoensayo preferido para determinar los niveles de IGF-IR en la superficie celular incluye las etapas de marcar las proteínas de la superficie celular con un marcador detectable, tal como biotina o ^{125}I, inmunoprecipitar el IGF-IR con un anticuerpo anti-IGF-IR y, después, detector el IGF-IR marcado. Otro inmunoensayo preferido para determinar la localización del IGF-IR, por ejemplo los niveles en la superficie celular, es mediante el uso de inmunohistoquímica. Procedimientos tales como ELISA, RIA, transferencia de tipo western, inmunohistoquímica, marcaje en la superficie celular de proteínas integrales de membrana e inmunoprecipitación son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, ant. Además, los inmunoensayos se pueden aumentar para detección selectiva de alto rendimiento con el fin de investigar un gran número de compuestos según activación o inhibición del IGF-IR.
Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención también se pueden usar para determinar los niveles de IGF-IR en un tejido o en células derivadas del tejido. En una forma de realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una forma de realización más preferida, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En una forma de realización preferida del procedimiento, se realiza una escisión de un tejido o biopsia del mismo de un paciente. El tejido o la biopsia se usan después en in inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles de IGF-IR, los niveles de IGF-IR en la superficie celular, los niveles de fosforilación de tirosina del IGF-IR o la localización del IGF-IR mediante los procedimientos tratados en lo que antecede. El procedimiento se puede usar para determinar si un tumor expresa IGF-IR a un nivel elevado.
El procedimiento diagnóstico descrito en lo que antecede se puede usar para determinar si un tumor expresa niveles elevados de IGF-IR, que pueden ser indicativos de que el tumor responderá bien al tratamiento con anticuerpo anti-IGF-IR. El procedimiento diagnóstico también se puede usar para determinar si un tumor es potencialmente canceroso, si expresa niveles elevados de IGF-IR, o benigno, si expresa niveles bajos de IGF-IR. Además, el procedimiento diagnóstico también se puede usar para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-IGF-IR (véase más adelante) está causando que un tumor exprese niveles menores de IGF-IR y/o exprese niveles menores de autofosforilación de tirosina y, por tanto, se puede usar para determinar si el tratamiento tiene éxito. En general, un procedimiento para determinar si un anticuerpo anti-IGF-IR disminuye la fosforilación de tirosina comprende las etapas de medir el nivel de fosforilación de tirosina en una célula o tejido de interés, incubar la célula o tejido con un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción de unión a antígeno del mismo, después, volver a medir el nivel de fosforilación de tirosina en la célula o tejido. La fosforilación de tirosina del IGF-IR o de otra(s) proteína(s) puede medirse. El procedimiento diagnóstico también se puede usar para determinar si un tejido o célula no está expresando niveles suficientemente elevados de IGF-IR o niveles suficientemente elevados de IGF-IR activado, que puede ser el caso para individuos con enanismo, osteoporosis o diabetes. Un diagnóstico de que los niveles de IGF-IR o IGF-IR activo son demasiado bajos podría usarse para el tratamiento con anticuerpos anti-IGF-IR de activación, IGF-I y otros agentes terapéuticos para incrementar los niveles de IGF-IR o su actividad.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse in vivo para localizar tejidos y órganos que expresan IGF-IR. En una forma de realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden usar para localizar tumores que expresan IGF-IR. La ventaja de los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención es que no generarán una respuesta inmunitaria tras su administración. El procedimiento comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-IGF-IR o una composición farmacéutica del mismo a un paciente que necesite dicha prueba diagnóstica y someter al paciente e análisis de imagen para determinar la localización de los tejidos que expresan IGF-IR. El análisis de imagen es bien conocido en la técnica médica e incluye, sin limitaciones, análisis con rayos x, obtención de imágenes por resonancia magnética (RM) o tomografía computerizada (TC). En otra forma de realización del procedimiento se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa IGF-IR en lugar de someter al paciente a análisis de imagen. En una forma de realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden marcar con un agente detectable que se puede ver en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un agente de contraste, tal como bario, que se puede usar para análisis de rayos x, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, que se puede usar para RM o TC. Otros agentes de marcaje incluyen, sin limitaciones, radioisótopos, tales como ^{99}Tc. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-IGF-IR no estará marcado y se visualizará mediante la administración
de un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que se pueda unir al anticuerpo anti-IGF-IR.
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Procedimientos terapéuticos de uso
El anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede usar para inhibir la actividad del IGF-IR mediante la administración de dicho anticuerpo a un paciente que lo necesite. Cualquiera de los tipos de anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva puede usarse terapéuticamente.
En otra forma de realización preferida, el IGF-IR es humano y el paciente es un paciente humano. Como alternativa, el paciente puede ser un mamífero que expresa un IGF-IR con el que el anticuerpo anti-IGF-IR sufre una reacción cruzada. El anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un GF-IR con el que el anticuerpo anti-IGF-IR sufre una reacción cruzada (es decir, un primate o un mono cynomologous o rhesus) para fines veterinarios o como modelo animal de enfermedad humana. Dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la presente invención.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, con la expresión "un trastorno en el que la actividad de IGF-IR es perjudicial" se pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que se ha demostrado o se sospecha que la presencia de niveles elevados de IGF-IR en un sujeto que sufre el trastorno es responsable de la fisiopatología del trastorno o es un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. De acuerdo con esto, un trastorno en el que niveles elevados de actividad de IGF-IR son perjudiciales es un trastorno en el que cabe esperar que la inhibición de la actividad de IGF-IR alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Dichos trastornos se pueden poner de manifiesto mediante, por ejemplo, un incremento en los niveles de IGF-IR sobre la superficie celular o un incremento en la autofosforilación de tirosina de IGF-IR en las células o tejidos afectados de un sujeto que sufre el trastorno. El incremento de los niveles de IGF-IR se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IGF-IR tal como se ha descrito en lo que antecede.
En una forma de realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que tiene un tumor que expresa IGF-IR. Un tumor puede ser un tumor sólido o puede ser un tumor no sólido, tal como un linfoma. En una forma de realización más preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que tiene un tumor que expresa IGF-IR que es canceroso. En una forma de realización todavía más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR se administra a un paciente que tiene un tumor de pulmón, de mama, de próstata o de colon. En una forma de realización altamente preferida, el procedimiento hace que el tumor no aumente de tamaño o de volumen o que disminuya de peso o de volumen. En otra forma de realización, el procedimiento hace que se internalice el IGF-IR del tumor. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.
En otra forma de realización preferida, un anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar a un paciente que expresa niveles inadecuadamente altos de IGF-1. En la técnica se sabe que una expresión de niveles elevados de IGF-I puede conducir a una variedad de cánceres frecuentes. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR se administra a un paciente con cáncer de próstata, glioma o fibrosarcoma. En una forma de realización todavía más preferida, el procedimiento hace que el cáncer deje de proliferar de forma anormal o que no aumente de tamaño o de volumen o que disminuya de peso o de volumen.
En una forma de realización, el anticuerpo se usa para el tratamiento de cáncer, tal como, cáncer de cerebro, de células escamosas, de vejiga urinaria, gástrico, pancreático, de mama, de cabeza, de cuello, esofágico, de próstata, colorrectal, de pulmón, renal, de riñón, de ovarios, ginecológico o de tiroides. Pacientes que se pueden tratar con un compuesto de la invención de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, pacientes a los que se ha diagnosticado cáncer de pulmón, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, tumores ginecológicos (p. ej., sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (p. ej., cáncer de las glándulas tiroides, paratiroides o suprarrenal), sarcomas de los tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos de la infancia, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer del riñón o del uréter (p. ej., carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal) o neoplasias del sistema nervioso central (p. ej., linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, gliomas del tallo encefálico o adenomas hipofisarios).
El anticuerpo puede administrarse una vez pero, más preferentemente, se administra múltiples veces. El anticuerpo puede administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede realizarse según un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo puede administrarse mediante vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo se puede administrar en un punto distante del lugar del tumor. El anticuerpo también se puede administrar de forma continua mediante una minibomba. El anticuerpo se puede administrar una vez, al menos dos veces o durante al menos el periodo de tiempo hasta que la afección se trata, palia o cura. Generalmente, el anticuerpo se administrará durante todo el tiempo que el tumor esté presente siempre que el anticuerpo haga que el tumor o cáncer deje de crecer o que disminuya de peso o de volumen. Generalmente, el anticuerpo se administrará como parte de una composición farmacéutica como se ha descrito ant. Generalmente, la dosificación del anticuerpo estará en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, más preferentemente de 0,5-50 mg/kg, más preferentemente 1-20 mg/kg e incluso más preferentemente 1-10 mg/kg. La concentración sérica del anticuerpo se puede medir por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, el ejemplo XVII más adelante. El anticuerpo también se puede administrar profilácticamente con el fin de prevenir la aparición de un cáncer o tumor. Esto puede ser especialmente útiles en pacientes que tienen un nivel "normal elevado" de IGF-I porque se ha demostrado que estos pacientes tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres habituales. Véase Rosen y col., ant.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR puede co-administrarse con otros agentes terapéuticos, tales como fármacos o moléculas antineoplásicas, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor. En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención en combinación con un agente antitumoral seleccionado del grupo constituido por, entre otros, inhibidores de la mitosis, agentes alquilantes, anti-metabolitos, agentes intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas, inhibidores de la quinasa, inhibidores de la matriz metaloproteinasa, terapéuticas genéticas y anti-andrógenos. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo puede administrarse con un agente antineoplásico, tal como adriamicina o taxol. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo o terapia de combinación se administra junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia. En todavía otra forma de realización preferida, el anticuerpo se administrará con otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede administrar con un anticuerpo u otro agente que se sabe que inhibe la proliferación de células tumorales o cancerosas, por ejemplo un anticuerpo o agente que inhibe el receptor de erbB2, el EGF-R, CD20 o VEGF.
La coadministración del anticuerpo con un agente terapéutico adicional (terapia de combinación) abarca administrar una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-IGF-IR y el agente terapéutico adicional y administrar dos o más composiciones farmacéuticas, una comprende el anticuerpo anti-IGF-IR y la(s) otra(s) comprende(n)
el(los) agente(s) terapéutico(s) adicional(es). Además, aunque la co-administración o la terapia de combinación generalmente significa que el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran al mismo tiempo uno que otro, también abarca casos en los que el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran a tiempos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar una vez cada tres días, mientras que el agente terapéutico adicional se administra una vez al día. Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar antes o después del tratamiento del trastorno con el agente terapéutico adicional. De un modo similar, la administración del anticuerpo anti-IGF-IR se puede realizar antes o después de la otra terapia, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia.
El anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales (la terapia de combinación) se puede administrar una vez, dos veces o durante al menos el periodo de tiempo hasta que la afección se trata, palia o cura. Preferentemente, la terapia de combinación se administra múltiples veces. La terapia de combinación puede administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede realizarse según un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses., o puede administrarse de forma continua a través de una minibomba. La terapia de combinación puede administrarse mediante vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La terapia de combinación puede administrarse un punto distante del lugar del tumor. Generalmente, la terapia de combinación se administrará durante todo el tiempo que el tumor esté presente siempre que el anticuerpo haga que el tumor o cáncer deje de crecer o que disminuya de peso o de volumen.
En otra forma de realización más, el anticuerpo anti-IGF-IR se marca con un radiomarcador, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico. El anticuerpo anti-IGF-IR o una proteína de fusión de anticuerpo anti-IGF-IR dirigen el radiomarcaje, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico a la célula cancerosa o tumoral que expresa IGF-IR. En una forma de realización preferida, el radiomarcaje, la inmunotoxina, la toxina o el péptido tóxico se internalizan después de que el anticuerpo anti-IGF-IR se une al IGF-IR sobre la superficie de la célula tumoral o cancerosa.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede usar terapéuticamente para inducir apoptosis de células específicas en un paciente que lo necesite. En muchos casos, las células dirigidas para apoptosis son células cancerosas o tumorales. Por tanto, en una forma de realización preferida, el anticuerpo de la invención puede usarse en un procedimiento de inducir apoptosis mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IGF-IR a un paciente que lo necesite. En una forma de realización preferida, el anticuerpo es 2.13.2 o 4.9.2, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-IGF-IR se puede usar para tratar estados no cancerosos en los que niveles elevados de IGF-I y/o IGF-IR se han asociado con el estado o enfermedad no cancerosa. En una forma de realización, esto comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-IGF a un paciente que tiene un estado patológico no canceroso causado o exacerbado por niveles elevados de IGF-I y/o niveles o actividad de IGF-IR. En una forma de realización preferida, el estado patológico no canceroso es acromegalia, gigantismo, psoriasis, aterosclerosis, reestenosis del músculo liso de los vasos sanguíneos o proliferación microvascular inadecuada, tal como el que se encuentra como complicación de la diabetes, especialmente del ojo. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR ralentiza el progreso del estado patológico no canceroso. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR detiene o invierte, al menos en parte, el estado patológico no canceroso.
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Terapia génica
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden administrar a un paciente que lo necesite mediante terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En una forma de realización preferida, se administran a un paciente moléculas de ácido nucleico que codifican una cadena pesada y una cadena ligera. En una forma de realización más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de un modo tal que se integran de forma estable en el cromosoma de las células B porque estas células están especializadas en producir anticuerpos. En una forma de realización preferida, las células B precursoras se transfeccionan o infectan ex vivo y se retransplantan a un paciente que lo necesite. En otra forma de realización preferida, las células B precursoras u otras células se infectan in vivo usando un virus que se sabe que infecta el tipo celular de interés. Vectores típicos usados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos o vectores virales, tal como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Tras la infección in vivo o ex vivo, los niveles de expresión de anticuerpos se pueden monitorizar tomando una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica y tratado en la presente memoria
descriptiva.
En una forma de realización preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o la porción de unión al antígeno de la misma del anticuerpo humano o su porción y expresar la molécula de ácido nucleico. En otra forma de realización preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o la porción de unión al antígeno de la misma del anticuerpo humano o su porción y expresar la molécula de ácido nucleico. En una forma de realización más preferida, el procedimiento de terapia génica comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o la porción de unión al antígeno de la misma del anticuerpo humano o su porción y una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o la porción de unión al antígeno de la misma del anticuerpo humano o su porción y expresar las moléculas de ácido nucleico. El procedimiento de terapia génica puede también comprender la etapa de administrar otro agente anticanceroso, tal como taxol, tamoxifeno, 5-FU, adriamicina o CP-358,774.
Con el fin de que esta invención se entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ningún modo.
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Ejemplo I Generación de hibridomas productores de anti-IGF-IR
Los anticuerpos de la invención se prepararon, seleccionaron y analizaron del siguiente modo:
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Inmunización y generación de hibridoma
XENOMICE^{TM} de ocho a diez semanas de edad se inmunizaron intraperitonealmente o en sus patas traseras con el dominio extracelular de IGF-IR humano (10 \mug/dosis/ratón) o con 3T3-IGF-IR o células 300.19-IGF-IR, que son dos líneas células transfeccionadas que expresan IGF-IR humano en sus membranas plasmáticas (10 x 10^{6} células/dosis/ratón). Esta dosis se repitió de cinco a siete veces durante un periodo de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final del dominio extracelular del IGF-IR humano en PBS. Los linfocitos de bazo y de ganglios linfáticos de ratones inmunizados se condensaron con la línea celular de mieloma no secretor P3-X63-Ag8.653 y se sometieron a selección HAT como se ha descrito anteriormente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Se recuperó un panel de hibridomas, todos secretores de anticuerpos IgG2\kappa humanos específicos de IGF-IR. Siete hibridomas productores de anticuerpos monoclonales específicos de IGF-IR se seleccionaron para un estudio adicional y se denominaron 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 y 6.1.1.
Los hibridomas 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3 se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 21 0-2209, el 1-2 de diciembre de 2000, con los siguientes números de depósito
1 
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Ejemplo II Determinación de las constantes de afinidad (K_{d}) de los anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR completamente humanos mediante BIAcore
Los inventores realizaron medidas de la afinidad de anticuerpos purificados mediante resonancia de plasmón superficial usando el instrumento BIAcore 3000 siguiendo los protocolos del fabricante.
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Protocolo 1
Para realizar análisis cinéticos, la proteína A se inmovilizó sobre las superficies sensorchip del BIAcore. A continuación, el sensorchip se usó para capturar los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención. Diferentes concentraciones del dominio extracelular del IGF-IR se inyectaron en el sensorchip y se analizaron la cinética de unión y de disociación de las interacciones entre los anticuerpos anti-IGF-IR y el dominio extracelular del IGF-IR. Los datos se evaluaron con global fit Langmuir 1:1, usando modelos de deriva basal disponibles en el software BIAevaluation proporcionado por BIAcore.
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Protocolo 2
Las mediciones en BIAcore se realizaron esencialmente con describen Fagerstam y col. "Detection of antigen antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping". J. Mol. Recog. 3: 208-214. (1990).
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La tabla I enumera las mediciones de la afinidad para anticuerpos anti-IGF-IR representativos de la presente invención:
TABLA I
2
El análisis cinético indica que los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención poseen afinidades elevadas y fuertes constantes de unión para el dominio extracelular del IGF-IR.
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Ejemplo III Inhibición mediada por anticuerpos de la fosforilación de IGF-IR inducida por IGF-I
Los inventores realzaron experimentos de ELISA con el fin de determinar si los anticuerpos de la presente invención podían bloquear la activación mediada por IGF-I del IGF-IR. La activación de IGF-IR mediada por IGF-I se detectó mediante el incremento de la fosforilación de tirosina asociada con el receptor.
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Preparación de placas de ELISA
Los inventores prepararon placas de captura para ELIS mediante la adición de 100 \mul de tampón de bloqueo (3% de seroalbúmina bovina [BSA] en solución salina tamponada con Tris [TBS]) a cada pocillo de una placa ReactiBind de 96 pocillos revestidas con la proteína G (Pierce) y las placas se incubaron en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los autores diluyeron el anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 específico de conejo (Santa Cruz) en tampón de bloqueo hasta una concentración de 5 \mug/ml y se añadieron 100 \mul del anticuerpo diluido a cada pocillo. Los autores incubaron las placas con agitación durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Después, los autores lavaron las placas cinco veces con tampón de lavado (TBS + 0,1% Tween 20) y suavemente se transfirió el tampón restante a toallas de papel. Estas placas no se dejaron secar antes de la adición del lisado.
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Preparación de lisado a partir de células que expresan IGF-IR
Los inventores colocaron células NIH-3T3 transfeccionadas con IGF-IR (5x10^{4}/ml) en 100 \mul de medio de crecimiento (medio DMEM rico en glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivador con calor y 500 \mug/ml cada uno de geneticina, penicilina y estreptomicina) en placas de 96 pocillos de fondo en U. Los inventores incubaron las placas a 37ºC, 5% de CO_{2} durante la noche para dejar que las células se fijen. Se decantó el medio de las placas y se sustituyó con 100 \mul de medio de crecimiento fresco por pocillo. Para el análisis, los inventores diluyeron los potenciales anticuerpos anti-IGF-IR hasta cinco veces la concentración final deseada en medio de crecimiento y se añadieron 25 \mul por pocillo. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Después, las placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Los inventores estimularon las células con 25 \mul/pocillo de IGF-1 600 ng/ml (preparados en medio de crecimiento) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después, los inventores decantaron los medios mediante inversión de las placas y transferencia suave a toallas de papel y las células adheridas se lisaron mediante la adición de 50 \mul de tampón de lisis (HEPES 50 Mm, pH 7,4, EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, NaVO_{4} 1,6 mM. 1% Triton X-100, 1% de glicerol suplementado inmediatamente antes de usar con un comprimido de inhibidor de la proteasa sin EDTA [Roche Molecular Sciences] por 50 ml) y agitación durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los inventores añadieron 200 \mul de tampón de dilución (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaVO_{4} 1,6 mM) a cada pocillo y se mezclaron mediante pipeteo ascendente y descendente. Se transfirieron 100 \mul de lisado de cada pocillo a cada pocillo de la placa de captura de ELISA preparada como se ha descrito en lo que antecede y se incubaron con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente.
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ELISA con anticuerpos anti-tirosina fosfato (pTYR)
Los inventores eliminaron el lisado celular mediante la inversión de las placas, se lavaron las placas cinco veces con tampón de lavado y se transfirieron a toallas de papel. Los inventores añadieron 100 \mul por pocillo de anticuerpo específico de pTYR (H RP-PY54) diluidos en tampón de bloqueo hasta una concentración de 0,2 \mug/ml y se incubaron las placas con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, los inventores lavaron estas placas cinco veces con tampón de lavado y se transfirieron a toallas de papel.
Los inventores decantaron la unión del anticuerpo HRP-PY54 mediante la adición de 100 \mul por pocillo de solución sustrato de TMB peroxidasa (Kirkegaard & Perry) y se incubó con agitación hasta que se desarrolló color (aproximadamente 2-10 minutos). Los inventores detuvieron la reacción de desarrollo de color mediante la adición de 100 \mul por pocillo de solución de detención de TMB (Kirkegaard & Perry). Después, los inventores agitaron las placas durante 10 segundos a temperatura ambiente para mezclar la solución y se cuantificó mediante medición a DO_{450 \ nm}.
La tabla II y la figura 4 muestran los resultados de este experimento realizado con varios anticuerpos de la invención. Los resultados de este experimento demuestran la capacidad de los anticuerpos de la presente invención para bloquear la activación mediada por IGF-1 del IGF-IR como muestra el incremento de la fosforilación de tirosina asociada con el receptor. Además, estos resultados se pueden usar para cuantificar la potencia relativa de los anticuerpos de la presente invención.
TABLA II
3
Ejemplo IV Bloqueo mediado por anticuerpos de la unión IGF-I/IGF-IR
Los inventores realizaron experimentos ELISA para cuantificar la capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la unión de IGF-I a IGF-IR en un ensayo basado en células. Los inventores sembraron células NIH-3T3 transfeccionadas con IGF-IR (5x10^{4}/ml) en 100 \mul de medio de crecimiento (medio DMEM rico en glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivador con calor y 500 \mug/ml cada uno de geneticina, penicilina y estreptomicina) en placas de 96 pocillos de fondo en U. Después, los inventores incubaron las placas a 37ºC, 5% de CO_{2} durante la noche para dejar que las células se fijen. Después, los inventores decantaron el medio de las placas y se sustituyó con 100 \mul de medio fresco por pocillo. Para el análisis, los anticuerpos se diluyeron en medio de ensayo (medio DMEM rico en glucosa suplementado con L-glutamina, 10% de FBS inactivado con calor, 200 \mug/ml de BSEA y 500 \mug/ml cada uno de geniticina, penicilina y estreptomicina) hasta una concentración final deseada y se añadieron 50 \mul por pocillo. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Después, las placas se incubaron a 37ºC durante diez minutos. El [^{125}]-IGF-I se diluyó hasta una concentración de 1 \muCi/ml en medio de ensayo y se añadieron 50 \mul por pocillo de la placa. Como control de la radioactividad básica, se añadió IGF-I frío hasta una concentración final de 100 ng/ml. Las placas se incubaron durante 10 minutos a 37ºC, el medio se decantó mediante transferencia suavemente sobre toallas de papel y se lavaron dos veces con medio de ensayo. Después, los inventores lisaron las células mediante la adición de 50 \mul de NaOH 0,1N, 0,1% de SDS y se agitaron las placas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después, los inventores transfirieron las muestras a una placa de centelleo, se añadieron 150 \mul de OptiPhase Supermix y la señal se leyó en un contador Wallac Micro-Beta.
La tabla II y la figura 3 muestran los resultados de este experimento realizado con tres anticuerpos representativos de la invención. Este experimento demostró que los anticuerpos de la invención inhiben específicamente la unión de [^{125}I]-IGF-I a células que sobreexpresan IGF-IR.
TABLA III
4
Ejemplo V Estudios de mapeo de epítopos
Habiendo demostrado que los anticuerpos de la invención reconocen el IGF-IR, se realizaron estudios de mapeo del epítopo con varios anticuerpos de la invención. Los autores centraron estos experimentos particularmente en anticuerpos 2.12.1,2.13.2,2.14.3, y 4.9.2.
Se realizaron estudios competitivos BIAcore para determinar si los anticuerpos de la presente invención se unen al mismo sitio o a uno distinto en la molécula de IGF-IR. Se unió el dominio extracelular (EDC) del IGF-IR a un sensorchip de BIAcore como se ha descrito en lo que antecede en el Ejemplo II. Los autores unieron un primer anticuerpo de la invención a este IGF-IR unido al sensorchip en condiciones saturantes. Después se midió la capacidad de los posteriores anticuerpos secundarios de la invención para competir con el anticuerpo primario por la unión a IGF-IR. Esta técnica ha permitido a los autores asignar los anticuerpos de la presente invención a diferentes grupos de
unión.
Este experimento se realizó con los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, and 4.9.2. Se observó que 2.13.2 y 4.9.2 compiten por el mismo sitio en el dominio extracelular del IGF-IR. Los otros anticuerpos .12.1 y 2.14.3, se unen a los sitios en el IGF-IR que son diferentes entre sí y del sitio al que se unieron 2.13.2 y 4.9.2.
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Ejemplo VI Reactividad cruzada en especies de los anticuerpos de la invención
Con el fin de determinar la reactividad cruzada de especie de los anticuerpos de la invención se realizaron varios experimentos, incluidos inmunoprecipitación, bloqueo mediado por anticuerpos de la fosforilación del receptor inducida por IGF-I y análisis FACS.
Para realizar los experimentos de inmunoprecipitación, se sembraron células en medio DMEM rico en glucosa suplementado con L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado por calor y 500 \mug/ml cada uno de geneticina, penicilina y estreptomicina hasta 50% de confluencia en matraces T25. Después, se añadieron 100 \mul de un anticuerpo de la invención en solución salina tamponada de HanK (HBSS; Gibco BRL) a una concentración de 1 \mug/ml. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en un incubador y, después, se estimularon las células con IGF-1 a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lisaron en tampón RIPA (Harlow y Lane, ant.) y el IGF-IR se inmunoprecipitó con 2 \mug de anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 panespecífico (SANTA Cruz) más perlas de agarosa con proteína A durante 1 hora a 4ºC. Se precipitaron las perlas y se lavaron tres veces con PBS/T (PBS + 0,1 Tween-20) y después las perlas se cocieron en 40 \mul de tampón de Laemli que contiene 5% de \betaME.
Las muestras preparadas como se ha descrito en lo que antecede se analizaron mediante transferencia de tipo western. Se cargaron 12 \mul de cada muestra por calle sobre geles Novex^{TM} en un gradiente de 4-10% con 1X tampón MES (Novex^{TM}). Los geles se sometieron a 150V durante 1 hora o a 200V durante aproximadamente 30 minutos. Se transfirió el gel se a una membrana en tampón de transferencia Novex^{TM} con 105 de metanol durante la noche a 100 mA o durante 1-1,5 horas a 250 mA. Después, se dejó que la membrana se secara completamente y se bloqueó a temperatura ambiente con TBS (solución salina tamponada con Tris, a pH 8,0) que contiene Superblock (Pierce Chemical Co.). Se añadió en anticuerpo de transferencia del IGF-IR SC713 (Santa Cruz) para detectar el IGF-IR inmunoprecipitado.
Este experimento se realizó con anticuerpos de la invención, particularmente con 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 y 4.9.2, sobre células de varios animales. Los autores encontraron que los anticuerpos 2.12.1, 2.13.2 y 4.9.2 eran capaces de unirse al IGF-IR humano, pero no canino, de cobayas, de conejo. Además, estos anticuerpos podían unirse al IGF-IR de COS7 y de Rhesus, ambos derivados de monos del Viejo mundo, pero no al IGF-IR de tití, que es un mono del Nuevo mundo. Estos experimentos indican que los anticuerpos son altamente específicos.
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Bloqueo mediado por anticuerpos de la unión IGF-I/IGF-IR en primates no humanos
Tras la observación de los autores de que los anticuerpos de la invención reconocen el IGF-IR de monos del viejo mundo, también se investigó su capacidad para bloquear la unión IGF-I/IGF-IR en células derivadas de estos monos del viejo mundo. Se sembraron células en medio DMEM rico en glucosa suplementado con L-glutamina, 10% de FBS inactivado por calor y 500 \mug/ml cada uno de geneticina, penicilina y estreptomicina hasta 50% de confluencia en matraces T25. Después se añadió un anticuerpo de la invención, o medio sin anticuerpo como control, y las células se estimularon con IGF-1 a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras la estimulación, se lisaron las células y el IGF-IR se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 panespecífico como se ha descrito en lo que antecede. Después, se realizó análisis de transferencia tipo western tal como se ha descrito en lo que antecede usando el anticuerpo HRP-PY54 para detector la tirosina fosforilada en el IGF-IR activado.
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Los autores observaron que los anticuerpos de la presente invención, en particular 2.13.2 y 4.9.2, podían bloquear la fosforilación inducida por IGF-I del IGF-IR en células de COS7 y de Rhesus, La CI_{50} para la inhibición observada fue 0,02 \mug/ml y 0,005 \mug/ml para IGF-IR de COS7 y Rhesus, respectivamente.
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Determinación de la afinidad de especies cruzadas de los anticuerpos de la invención
Se realizó un análisis FACS para determinar la afinidad de los anticuerpos de la invención por IGF-IR de otros animales, en particular de los monos del viejo mundo descritos en lo que antecede. Se incubaron alícuotas de células humanas y de mono (5x105) durante 1 hora en hielo con concentraciones crecientes de anticuerpos anti-IGF-IR biotinilados de la invención o con un anticuerpo biotinilado anti-hemocianina de lapa californiana (KLH) (Abgenix) como control negativo. Después, se incubaron las muestras durante 30 minutos en hielo con RPE (ficoeritrina) conjugada con estreptavidina. Se midió la unión mediante citometría de flujo y se analizaron los histogramas de la intensidad de la fluorescencia (F12.H) frente al número de células (Recuentos) usando el software CeliQuest. Se calculó la unión (K_{d}) para cada anticuerpo a partir de los gráficos de la intensidad de la fluorescencia media frente a la concentración del anticuerpo. En la mayoría de los experimentos, se midió la unión en células MCF-7 humanas cultivadas y células de cultivo tisular de rhesus o de cynomologous. Se controló la depleción del anticuerpo midiendo la unión en un intervalo de concentraciones celulares.
El análisis FACS mencionado en lo que antecede se realizó para analizar la capacidad de los anticuerpos de la invención, particularmente de .13.2 y 4.9.2, para unirse a células humanas, de rhesus y de cynomologous. Se observó una unión semimáxima (Kd) de 0,1 \mug/ml para todas las líneas celulares analizadas.
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Ejemplo VII Regulación por disminución del receptor de IGF-I
Los experimentos de bloqueo se realizaron esencialmente como se ha descrito en lo que antecede en el Ejemplo IV hasta la adición de IGF-1 marcado con [^{125}I]. En este punto, las células se cocieron en 40 \mul de tampón de Laemli que contiene 50% me. Después, las muestras se analizaron mediante análisis de transferencia de tipo western como se ha descrito en lo que antecede en el Ejemplo VI y las transferencias se sondaron con anticuerpo de IGF-IR panespecífico SC713 para cuantificar los niveles de IGF-IR y del anticuerpo HRP-PY54 para monitorizar los niveles de tirosina fosforilada en el IGF-IR activado.
Como se ha observado anteriormente (Ejemplo III), se observó bloqueo de la fosforilación inducida por IGF-I tras el tratamiento de las células con un anticuerpo de la presente invención (Figura 4). Además, se observó que a este bloqueo de la fosforilación inducida por IGF-I le siguió regulación por disminución del IGF-R en estas células. Véase, por ejemplo, la figura 4. Los niveles de IGF-IR se redujeron al máximo 16 horas tras la estimulación con IGF-1 en presencia de un anticuerpo de la invención.
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Ejemplo VIII Efectos de los anticuerpos de la invención sobre el IGF-IR in vivo
Se determinó si los efectos de los anticuerpos de la invención sobre IGF-IR tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores se producirían in vivo. Se indujeron tumores en ratones atímicos de acuerdo con los procedimientos publicados (VA Pollack y col., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice", J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999). Brevemente, se inyectaron células NIH-3T3 (5x10^{6}) transfeccionadas con IGF-IR por vía subcutánea en ratones atímicos (nu/nu)de 3-4 semanas de edad con 0,2 ml de preparación de Matrigel. Después se inyectó a los ratones un anticuerpo de la invención por vía intraperitoneal después del establecimiento (es decir, de aproximadamente 40 mm^{3}) de los tumores formados.
Tras 24 horas, se extrajeron los tumores, se homogeneizaron y se determinó el nivel de IGF-IR. Para determinar los niveles de IGF-IR, se diluyó el anticuerpo SC713 en tampón de bloqueo hasta una concentración final de \mug/ml y se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una placa recubierta (Pierce) con ReactiBind anti-conejo de cabra (GAR). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación y después las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado. Después, se pesaron las muestras de tumor preparadas como se ha descrito en lo que antecede y se homogeneizaron en tampón de lisis (1 ml/100 mg). Se diluyeron 12,5 \mul de extracto tumoral con tampón de lisis hasta un volumen final de 100 \mul y se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 horas con agitación y después las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado. Después se añadieron a cada pocillo 100 \mul de HRP-PY54 o anticuerpo biotinilado anti-IGF en tampón de bloqueo y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Después, las placas se lavaron cinco veces con tampón de lavado y se desarrollaron las placas. Las placas sondadas con HRP-PY54 se desarrollaron mediante la adición de 100 \mul del sustrato de micropocillos TMB por pocillo y se detuvo el desarrollo de color con la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 0,9M. Después, se cuantificó la señal agitando durante 10 segundos y midiendo la DO_{450 \ nm}. La señal se normaliza hasta la proteína total. Las placas sondadas con anticuerpo anti-IGF-IR se desarrollaron mediante la adición a cada pocillo de 100 \mul de estreptavidina-HRP diluida en tampón de bloqueo, incubando a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos y, después, se continuó como se describe en HRP-PY54.
Se observó que la inyección intraperitoneal de un anticuerpo de la presente invención, particularmente 2.13.2 and 4.9.2, tenía como resultado la inhibición de la actividad de IGF-IR medida mediante una disminución de la fosforotirosina de IGF-R (IGF-IR fosforilado) y la proteína total de IGF-IR (Figura 6). Además, también se observó una disminución de la IGF-IR fosforotirosina (IGF-IR fosforilado) (figura 5). Sin desear quedar anclado a teoría alguna, la disminución de los niveles de fosfotirosina de IGF-IR puede deberse a una disminución de los niveles de la proteína IGF-IR in vivo tras le tratamiento con el anticuerpo y puede deberse a una combinación de los menores niveles de la proteína IGF-IR y una disminución de la fosforilación de tirosina en el IGF-IR que está presente debido al bloqueo de la activación por ligando (p. ej., ING-I o IGF-II). Además, esta inhibición respondió a la dosis de anticuerpo inyectada (figura 6). Estos datos demuestran que los anticuerpos de la invención pueden dirigirse al IGF-IR in vivo de un modo análogo a lo que se ha observado in vitro.
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Ejemplo IX Inhibición del crecimiento (TGI) de tumores de células 3T3/IGF-IR
Se investigó si los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención funcionarían inhibiendo el crecimiento tumoral. Se indujeron tumores tal como se ha descrito en lo que antecede (Ejemplo VIII) y, una vez formados tumores establecidos y palpables (es decir, 250 mm^{3} en 6-9 días), se trató a los ratones con una única dosis de 0,,20 ml de anticuerpo mediante inyección intraperitoneal. Se midió el tamaño del tumor mediante compás de Vernier el dos diámetros cada tres días y se calculó el volumen usando la fórmula (longitud x[anchura]^{2})/2 usando los procedimientos establecidos por Geran, y col., "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems", Cancer Chemother. Rep. 3:1-104.
Cuando este análisis se realizó con un anticuerpo de la invención, los autores encontraron que un único tratamiento con el anticuerpo 2.13.2 solo inhibía el crecimiento de tumores inducidos de células NIH-3TE transfeccionadas con IGF-IR (figura 7, panel izquierdo). Además, en los estudios de combinación con una dosis única de 7,5 mg/kg de adriamicina administrada por vía intravenosa se observó que la administración de una dosis única de 2.13.2 potenciaba la eficacia de adriamicina, un inhibidor conocido del crecimiento tumoral. La combinación de adriamicina con un anticuerpo de la invención, 2.13.2, demostró un retraso del crecimiento de 7 días frente al tratamiento con el anticuerpo o con adriamicina solos (figura 7, panel derecho).
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Ejemplo X Relación entre los niveles de anticuerpo y la regulación por disminución del IGF-IR
Se indujeron tumores en ratones desnudos tal como se ha descrito en el ejemplo VIII. Después, se trató a los ratones con 125 \mug de 2.13.2 mediante inyección intraperitoneal, tal como se describe en el ejemplo VIII. Se extrajeron los tumores y se midieron los niveles de IGF-IR mediante ELISA, tal como se describe en el ejemplo VIII. La figura 8 muestra los niveles séricos del anticuerpo 2.13.2 y los niveles del receptor IGF-IR en el tiempo. El experimento demuestra que el IGF-IR está regulado por disminución por parte del anticuerpo y que el grado de inhibición de IGF-IR es proporcional a la dosis con respecto a la concentración en suero del antibiótico.
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Ejemplo XI Inhibición del crecimiento de tumores 3T3/IGF-IR con múltiples dosis de anticuerpos en combinación con adriamicina
Se indujeron tumores en ratones desnudos tal como se ha descrito en el ejemplo IX. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm^{3} los días 1, 8, 15 y 22 con varias cantidades del anticuerpo 2.13.2 (i.p) o 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), bien como agentes únicos o en combinación, tal como se describe en el ejemplo IX. La figura 9 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una vez cada siete días inhibe el crecimiento de las células tumorales y potencia la inhibición del crecimiento de células tumorales en combinación con adriamicina, un inhibidor tumoral conocido.
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Ejemplo XII Inhibición del crecimiento de tumores grandes
Se indujeron tumores en ratones desnudos tal como se ha descrito en el ejemplo IX. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos grandes ligeramente inferiores a 2000 mm^{3} los días 1 y 8 con varias cantidades del anticuerpo 2.13.2 (i.p) o 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), bien como agentes únicos o en combinación, tal como se describe en el ejemplo IX. La figura 10 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El control, los grupos de animales tratados con anticuerpo solo y con adriamicina solo, terminaron el día 5, cuando el tamaño de tumor superó los 2000 mm^{3}. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con adriamicina es altamente eficaz contra tumores grandes cuando se administran múltiples dosis.
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Ejemplo XIII Inhibición del crecimiento de tumores celulares colorrectales
Se indujeron tumores en ratones desnudos tal como se ha descrito en el ejemplo IX, a excepción de que se usaron células Colo 205 (ATCC CCL 222). Las células Colo 205 son células de adenocarcinoma colorrectal humano. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm^{3} con varias cantidades del anticuerpo 2.13.2 (i.p) o con 100 mg/kg de 5-fluorodesoxiuridina (5-FU, i.v.), bien como agentes únicos o en combinación, tal como se describe en el ejemplo IX. La figura 11 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una vez inhibe el crecimiento de células cancerosas colorrectales humanas cuando se proporciona como un único agentes y potencia la eficacia de 5-FU, un inhibidor tumoral conocido.
Se trató a los ratones con tumores Colo 205 establecidos los días 1, 8, 15 y 22 con 500 \mug de 2.13.2 (i.p), 100 mg/kg de 5-FU (i.v.) o una combinación de los mismos. La figura 12 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una vez cada siete días inhibe el crecimiento de células cancerosas colorrectales humanas y potencia la eficacia de 5-FU.
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Ejemplo XIV Inhibición del crecimiento de tumores celulares de mama
En ratones desnudos tal como se describe en el Ejemplo VIII se implantaron pastillas biodegradables de estrógenos (0,72 mg de 17-\beta-estradiol/pastilla, liberación a 60 días, Innovative Research of America). Trans 48 horas, se indujeron los tumores en ratones desnudos esencialmente como se ha descrito en el ejemplo IX, a excepción de que se usaron células MCF-7 (ATCC HTB -22). Las células MCF-7 son células de carcinoma de mama humano dependiente de estrógenos. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm^{3} con 50 \mug del anticuerpo 2.13.2 (i.p) los días 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 y 22 (c3dx7) o con 6,25 mg/kg de taxol (i.p.) los días 1, 2, 3, 4, 5 (cdx5), bien como agents únicos o en combinación, esencialmente como se ha descrito en el ejemplo IX. La figura 13 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR por sí mismo inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama humano cuando se administra una vez cada tres días y también potencia la eficacia de taxol, un inhibidor conocido del cáncer de mama, cuando se administra en combinación.
Se trató a los ratones con tumores establecidos de células MCF-7 tal como se ha descrito justo antes el día 1 con varias cantidades de anticuerpo 2.13.2 (i.p.) solo o con 3,75 mg/kg de adriamicina (i.v.), esencialmente como se ha descrito en el ejemplo IX. La figura 14 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que un tratamiento único con un anticuerpo anti-IGF-IR por sí mismo inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama humano y potencia la eficacia de adriamicina, un inhibidor tumoral conocido.
Se trató a los ratones con tumores establecidos de células MCF-7 tal como se ha descrito justo antes con 250 \mug del anticuerpo 2.13.2 (i.p.) los días 1, 8, 15 y 23 o con una pastilla biodegradable de tamoxifeno (25 mg/pastilla, base libre, liberación a 60 días, Innovative Research of America), bien como agents únicos o en combinación, esencialmente como se ha descrito en el ejemplo IX. La pastilla de tamoxifeno se implantó el día 1 después del establecimiento del tumor. La figura 15 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento único con un anticuerpo anti-IGF-IR administrado una vez cada siete días inhibe el crecimiento de células de cáncer de mama humano y potencia la eficacia de tamoxifeno, un inhibidor tumoral conocido.
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Ejemplo XVI Inhibición del crecimiento de tumores celulares de carcinoma epidermoide
Se indujeron tumores en ratones desnudos esencialmente como se ha descrito en el ejemplo IX, a excepción de que se usaron células A431 (ATCC CRI 1555). Las células A431 son células de carcinoma epidermoide humano que sobreexpresan EGFR. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 250 mm^{3} los días 1, 8, 15, 22 y 29 con 500 \mug del anticuerpo 2.13.2 (i.p) o fueron tratados una vez al día durante 27 días con 10 mg/kg de CP-358,774 administrado por vía oral (p.o.), bien como agentes únicos o en combinación, tal como se describe en el ejemplo IX. CP-358,774 se ha descrito en la patente de EE.UU. 5.747.498 y Moyer y col. Cancer Research 57: 4838-4848 (1997).
La figura 16 muestra el tamaño del tumor en relación con los diversos tratamientos en el tiempo. El experimento demuestra que el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR potencia la eficacia de CP-358,774, un inhibidor conocido de la tirosina quinasa de EGF-R, para inhibir el crecimiento de células de cáncer epidermoide humano.
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Ejemplo XVII Farmacocinética de los anticuerpos anti-IGF-IR in vivo
Para evaluar la farmacocinética de los anticuerpos anti-IGF-IR, en monos cynomolgous se inyectó por vía intravenosa 3,30 o 100 mg/kg del anticuerpo 2.13.2 en un tampón acetato. Se recogió el suero de los monos en varios puntos de tiempo y se determinaron las concentraciones del anticuerpo anti-IGF-IR en los monos durante un periodo de hasta diez semanas. Para cuantificar los niveles séricos funcionales del anticuerpo, el dominio extracelular del IGF-IR humano (IGF-I-sR, R&D Systems, nº de cat. 391 GR) se unió a placas de 96 pocillos. A las placas de ensayo se añadió suero de mono (diluido entre 1:100 y 1:15.000) de modo que cada muestra estuviera dentro del intervalo lineal de la curva estándar y se incubó en condiciones en las que cualquier anticuerpo anti-IGF-IR se uniría al IGF-IRs. Después de lavar las placas, a las placas se añadió un anticuerpo IgG anti-humano marcado y se incubaron en condiciones en las que el anticuerpo IgG anti-humano se uniría al anticuerpo anti-IGF-IR. Después, las placas se lavaron y desarrollaron y se usó una curva estándar control y ajustes de regresión lineal para cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-IGF-IR. La figura 17 muestra la concentración de 2.13.2 en suero en el tiempo. El experimento demuestra que la semivida del anticuerpo anti-IGF-IR es de 4,6 a 7,7 días y tiene una distribución del volumen de 74-105 ml/kg. Además, el experimento demuestra que las cantidades administrada son proporcionales a la dosis en el mono, lo que indica que el anticuerpo anti-IGF-IR tiene saturados todos los sitios de unión al IGF-IR disponibles en el cuerpo, incluso a la dosis menor de 3 mg/kg.
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Ejemplo XVIII Terapia de combinación del anticuerpo anti-IGF-IR y adriamicina regula por disminución el IGF-IR in vivo
Se indujeron tumores en ratones desnudos tal como se ha descrito en el ejemplo IX. Se trató a los ratones con tumores subcutáneos establecidos de aproximadamente 400 mm^{3} con una única inyección de 250 \mug del anticuerpo 2.13.2 (i.p) o con 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.), bien como agentes únicos o en combinación, tal como se describe en el ejemplo IX. 72 horas después de la administración de los agentes se extrajeron los tumores tal como se ha descrito en el ejemplo VIII y cantidades iguales de los extractos tumorales se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida (SDS PAGE) y análisis de transferencia de tipo western usando el anticuerpo anti-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz). La figura 18 muestra las cantidades del IGF-IR en células tumorales en los animales control (primeras tres calles de cada panel), en animales tratados con el anticuerpo solo (panel superior), en animales tratados con adriamicina sola (panel central) y en animales tratados con anticuerpo y adriamicina (panel inferior). Cada calle representa cantidades iguales de proteína de tumores individuales de ratones individuales. El experimento demuestra que el tratamiento con adriamicina sola tiene poco efecto sobre los niveles de IGF-IR y que el tratamiento con el anticuerpo solo muestra alguna disminución de los niveles de IGF-IR. Sorprendentemente, el tratamiento con adriamicina y el anticuerpo juntos muestra una espectacular disminución de los niveles de IGF-IR, lo que demuestra que la adriamicina y el anticuerpo regulan por disminución considerablemente los niveles de IGF-IR.
<110> ABGENIX, INC.
\hskip1cm
PFIZER, INC. 
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<120> ANTICUERPOS FRENTE AL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA I
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<130> ABX-PF2
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<140>
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<141>
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
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<400> 50
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58
59 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
60 
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<210> 52
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<211> 236
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
61 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, c, t, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
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<211> 322
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<400> 54
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63 
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<210> 55
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<211> 325
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (291)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, c, t, g, otra o desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
64 
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<210> 56
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<211> 376
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<400> 56
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65 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
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<211> 358
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (337)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, c, t, g, otra o desconocida
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<400> 57
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66 
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<210> 58
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<211> 418
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<400> 58
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67 
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<210> 59
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<211> 364
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia consenso
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<400> 59
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68 
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<210> 60
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Ligador Gly-Ser
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<400> 60
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\hskip1cm
69

Claims (34)

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o una porción del mismo de unión al antígeno que se une específicamente al receptor del factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR), en el que dicho anticuerpo o porción inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR e inhibe el crecimiento tumoral in vivo; y en el que dicho anticuerpo o porción del mismo de unión al antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena pesada y las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de una cadena ligera, en el que dicha cadena pesada y cadena ligera son:
a)
la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 2.13.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2788);
b)
la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 4.9.2 (nº de depósito en la ATCC PTA-2789);
c)
una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6; o
d)
una cadena pesada que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 16 y una cadena ligera que comprende la región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14; o
e)
una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 45 sin la secuencia señal y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 47 sin la secuencia señal.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el IGF-IR es humano.
3. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo constituido por:
a)
no se une al IGF-IR de perro o de conejo;
b)
se une al IGF-IR de monos cynomologous o rhesus pero no al IGF-IR de tití;
c)
tiene una selectividad por IGF-IR que es al menos 50 veces mayor que su selectividad por el receptor de la insulina,
d)
produce la desaparición del IGF-IR de la superficie celular cuando se expresa con una célula que expresa IGF-IR;
e)
inhibe la fosforilación de tirosina inducida por IGF-IR;
f)
se une al IGF-IR con una K_{d} de 8 x 10^{-9} M o menor; y
g)
tiene una tasa off del IGF-IR de Kott de 10^{-4} s^{-1} o menor.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo tiene todas las propiedades citadas.
5. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo constituido por:
a)
compite con cruzamiento por la unión a IGF-IR con loas anticuerpos 2.13.2 o 4.9.2;
b)
Se une al mismo epítopo de IGF-R que el anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2;
c)
se une al mismo antígeno al que se une el anticuerpo 2.13.2 o 4.9.2;
d)
se une al IGF-IR con sustancialmente la misma K_{d} que los anticuerpos 2.13.2 o 4.9.2; y
e)
se une al IGF-IR con sustancialmente la misma tasa off que los anticuerpos 2.13.2 o 4.9.2; y
\vskip1.000000\baselineskip
6. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende todas las propiedades citadas.
7. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo inhibe la unión entre IGF-IR e IGF-I o IFG-II con una CI_{50} inferior a 100 nM.
8. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de una cadena ligera \kappa, en la que la secuencia de dicha región variable de dicha cadena ligera \kappa comprende no más de diez cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un V\kappaA30 de la línea germinal.
9. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la región variable de una cadena ligera \kappa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 o SEC ID Nº: 14 o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos.
10. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de una cadena pesada, en el que la secuencia de dicha región variable comprende no más de ocho cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por un gen VH DP47 de la línea germinal.
11. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la región variable de una cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene 1-10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos.
12. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que es
a)
una molécula de inmunoglobulina G (IgG), IgM, IgE, IgA o IgD, o derivada de las mismas; o
b)
un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un anticuerpo de una cadena, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico.
\vskip1.000000\baselineskip
13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789).
14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en el que las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera son:
a)
la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789); o
b)
la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788); o
c)
la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 45 sin la secuencia señal, y la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 47 sin la secuencia señal.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, que además comprende un agente antineoplásico, quimioterapéutico, antiangiogénico o antitumoral.
17. Un procedimiento para fabricar el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende las etapas de:
a)
inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende IGF-IR, en el que el mamífero es capaz de expresar anticuerpos humanos en las células B del animal;
b)
aislar las células B del mamífero;
c)
seleccionar dichas células B, o líneas celulares derivadas de las mismas, para identificar una línea celular que produce anticuerpos que se unen al IGF-IR;
\newpage
d)
cultivar la línea celular que expresa anticuerpos que se unen al IGF-IR; y
e)
aislar los anticuerpos que se unen al IGF-IR de la línea celular.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Una línea celular aislada que produce el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
19. La línea celular de acuerdo con la reivindicación 18 que produce el anticuerpo 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789), o un anticuerpo que tiene las mismas secuencias de aminoácidos que 2.13.2 o 4.9.2.
20. Uso del anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para diagnosticar la presencia o localización de un tumor que expresa IGF-IR en un sujeto que lo necesite.
21. Uso del anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un ser humano.
22. Uso del anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que lo necesite.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho medicamento comprende además un agente antineoplásico, antitumoral, antiangiogénico o quimioterapéutico.
24. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada, o una porción de unión a antígeno de la misma, y una cadena ligera, o una porción de unión a antígeno de la misma, de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
25. La molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 24, en la que la molécula de ácido nucleico comprende:
a)
una secuencia de ácido nucleico que codifica las tres secuencias de CDR de la cadena pesada del anticuerpo 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789); o
b)
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, o una porción de unión a antígeno de la misma, del anticuerpo 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789), o
c)
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 ó 16; o
d)
la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 ó 15, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 28.
\vskip1.000000\baselineskip
26. La molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 24, en la que la molécula de ácido nucleico comprende:
a)
una secuencia de ácido nucleico que codifica las tres secuencias de CDR de la cadena ligera del anticuerpo 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789); o
b)
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, o la porción de unión a antígeno de la misma, del anticuerpo 2.13.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2788) o 4.9.2 (ATCC, Nº de depósito PTA-2789);o
c)
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 6 ó 14; o
d)
la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 5 o 13;
en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de la expresión ligada operablemente a la molécula de ácido nucleico.
28. Una célula huésped que comprende secuencias de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, y la cadena ligera, o una porción de unión a antígeno de la misma, de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
29. Un procedimiento para fabricar un anticuerpo anti-IGF-IR o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 28 o la línea celular de acuerdo con la reivindicación 18 en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno.
30. Un animal transgénico no humano que comprende secuencias de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, y la cadena ligera, o una porción de unión a antígeno de la misma, de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el animal transgénico no humano expresa dichas secuencias de ácido nucleico.
31. Uso de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de la misma, y una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de la misma, o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica tanto una cadena ligera como una cadena pesada o sus porciones de unión a antígeno, de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto con cáncer.
32. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de SEC ID Nº 8 o dicha secuencia con hasta cinco sustituciones conservadoras de aminoácidos y la secuencia de aminoácidos de la cadena comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de SEC ID Nº 6 o dicha secuencia con hasta cinco sustituciones de aminoácidos.
33. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de SEC ID Nº 8 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de SEC ID Nº 6.
34. Un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente al IGF-IR en el que dicha cadena pesada de dicho anticuerpo consta de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 45 sin la secuencia señal y la cadena ligera de dicho anticuerpo consta de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 47 sin la secuencia señal.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ME00502B (me) 2001-01-05 2011-10-10 Amgen Fremont Inc Antitjela za insulinu sličan receptor faktora i rasta
EP2295081B1 (en) 2001-06-26 2018-10-31 Amgen Inc. Antibodies to OPGL
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
SI1461359T1 (sl) * 2002-01-18 2007-06-30 Pf Medicament Nova anti IGF-IR protitelesa in njihova uporaba
US6936427B2 (en) 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
US8658773B2 (en) 2011-05-02 2014-02-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
WO2003097805A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
EP1506286B1 (en) 2002-05-24 2014-03-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-igfr antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
AU2003275240A1 (en) * 2002-09-24 2004-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
PL378812A1 (pl) * 2003-02-13 2006-05-29 Pfizer Products Inc. Zastosowania przeciwciał przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostowego I
JP2007528201A (ja) * 2003-03-14 2007-10-11 ファルマシア・コーポレーション 癌治療のためのｉｇｆ−ｉ受容体に対する抗体
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
ES2383014T3 (es) * 2003-04-02 2012-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos contra el factor I de crecimiento similar a insulina y usos de los mismos
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
CA2524305C (en) 2003-05-01 2015-12-08 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
ATE458006T1 (de) * 2003-05-14 2010-03-15 Kenta Biotech Ag Humaner monoklonaler antikörper spezifisch für lipopolysacchariden (lps) des serotyps iats o6 von pseudomonas aeruginosa
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DE602004029581D1 (de) * 2003-08-13 2010-11-25 Pfizer Prod Inc Modifizierte humane igf-1r antikörper
ATE492562T1 (de) * 2003-09-24 2011-01-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Rekombinanter antikörper gegen humanen insulin- like growth factor
WO2005032476A2 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cpg15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
TW200526684A (en) * 2003-11-21 2005-08-16 Schering Corp Anti-IGFR1 antibody therapeutic combinations
CN1886424A (zh) * 2003-12-08 2006-12-27 伊缪诺金公司 抗igf－i受体抗体
BRPI0510716A (pt) * 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
KR20080019733A (ko) * 2004-07-16 2008-03-04 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 항-아이지에프-1알 항체를 사용하는 비-혈액학적악성종양에 대한 조합 치료
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
PT1828249E (pt) 2004-12-03 2011-02-25 Schering Corp Biomarcadores para a pré-selecção de pacientes para terapêutica anti-igf1r
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
RU2413735C2 (ru) 2005-03-31 2011-03-10 Эдженсис, Инк. Антитела и родственные молекулы, связывающиеся с белками 161p2f10b
JP4875064B2 (ja) * 2005-04-15 2012-02-15 シェーリング コーポレイション 癌を処置または予防するための方法および組成物
CA2763671A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
BRPI0611901A2 (pt) * 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
NZ564098A (en) * 2005-06-15 2010-04-30 Schering Corp Anti-IGF1R antibody formulations
CA2612449A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Imclone Systems Incorporated Receptor antagonists for treatment of metastatic bone cancer
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
NZ566774A (en) 2005-09-07 2011-11-25 Pfizer Human monoclonal antibodies to activin receptor-like kinase-1
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
EP1957541A2 (en) 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
DK1979001T3 (da) 2005-12-13 2012-07-16 Medimmune Ltd Bindingsproteiner, der er specifikke for insulinlignende vækstfaktorer og anvendelser deraf
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
WO2007084631A2 (en) 2006-01-20 2007-07-26 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
AP2008004569A0 (en) 2006-02-03 2008-08-31 Imclone Systems Inc IGR-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostrate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
JP2009531371A (ja) * 2006-03-28 2009-09-03 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｉｇｆ−１ｒヒト・モノクローナル抗体製剤
AU2007245164A1 (en) 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
PT2450437T (pt) 2006-04-14 2017-08-25 Cell Signaling Technology Inc Defeitos de genes e cinase alk mutante em tumores sólidos humanos
EP2258700A1 (en) 2006-05-09 2010-12-08 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
WO2008005469A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
EP2104501B1 (en) 2006-12-13 2014-03-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods of cancer treatment with igf1r inhibitors
AR064464A1 (es) * 2006-12-22 2009-04-01 Genentech Inc Anticuerpos anti - receptor del factor de crecimiento insulinico
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
JP2010518140A (ja) * 2007-02-14 2010-05-27 グラクソ グループ リミテッド Ｉｇｆ−１ｒに対する新規抗体
ATE530907T1 (de) * 2007-02-27 2011-11-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur beurteilung der hemmungsaktivität von antikörpern gegen insulinartigen wachstumsfaktor-1-rezeptor
AU2008223541B2 (en) * 2007-03-02 2012-04-05 Amgen Inc. Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
EP2559771A3 (en) 2007-05-17 2013-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
KR20100052545A (ko) * 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
CA2697612A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
EP2205280B1 (en) * 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
JP5769968B2 (ja) 2007-10-18 2015-08-26 セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド ヒト非小細胞肺癌における転座および変異ｒｏｓキナーゼ
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
PT2594590E (pt) 2007-12-14 2015-01-14 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
ES2388017T3 (es) 2007-12-21 2012-10-05 Roche Glycart Ag Ensayo de estabilidad de anticuerpos
US20110104256A1 (en) * 2008-03-25 2011-05-05 Yaolin Wang Methods for treating or preventing colorectal cancer
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201006485A (en) 2008-06-03 2010-02-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102149825B (zh) 2008-07-08 2015-07-22 Abbvie公司 前列腺素e2双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
JP5576370B2 (ja) 2008-08-06 2014-08-20 ファイザー・インク Ｃｈｋ−１阻害剤としての６置換２−ヘテロシクリルアミノピラジン化合物
NZ597692A (en) 2008-12-12 2013-08-30 Boehringer Ingelheim Int Anti-IGF antibodies
EP3266795A1 (en) 2009-02-12 2018-01-10 Cell Signaling Technology, Inc. Method for detecting a fig-ros fusion polynucleotide
US20160095939A1 (en) 2014-10-07 2016-04-07 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
ES3000111T3 (en) 2009-02-13 2025-02-27 Immunomedics Inc Intermediates for preparing conjugates with an intracellularly-cleavable linkage
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
WO2010120599A2 (en) 2009-04-16 2010-10-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions and methods for treating cancer
PE20120532A1 (es) * 2009-04-27 2012-05-18 Novartis Ag ANTICUERPOS ANTI-ActRIIB
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
BR112012008833A2 (pt) 2009-10-15 2015-09-08 Abbott Lab imunoglobulinas de dominio variavel duplo e usos das mesmas
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
SI2493922T1 (sl) 2009-10-26 2017-06-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za proizvodnjo glikoziliranega imunoglobulina
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
EP2571992B1 (en) 2010-05-21 2018-04-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
SG186094A1 (en) 2010-06-07 2013-01-30 Amgen Inc Drug delivery device
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
RU2012157167A (ru) 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
MX337040B (es) 2010-09-09 2016-02-09 Pfizer Moleculas de union a 4-1bb.
RU2607033C2 (ru) * 2010-09-28 2017-01-10 Ноно Инк. Пептиды nd2 и способы лечения неврологического заболевания
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
EP2643694B1 (en) 2010-11-24 2018-01-03 Litron Laboratories Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
MX2013008833A (es) 2011-02-02 2013-12-06 Amgen Inc Metodos y composiciones relacionadas con la inhibicion de receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (igf-1r).
KR20130118941A (ko) 2011-02-10 2013-10-30 로슈 글리카트 아게 면역치료법
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
AU2012236573B2 (en) 2011-03-31 2016-06-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US8476409B2 (en) * 2011-04-19 2013-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-IGF-1R and anti-ErbB3 antibodies
DK2699598T3 (en) 2011-04-19 2019-04-23 Pfizer COMBINATIONS OF ANTI-4-1BB ANTIBODIES AND ADCC-INducing ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER
HUE042822T2 (hu) 2011-04-20 2019-07-29 Amgen Inc Automata befecskendezõ szerkezet
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
CA2843158A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
EP2766497A1 (en) 2011-10-13 2014-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
PL3045187T3 (pl) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
WO2013071056A2 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
KR101470700B1 (ko) * 2011-11-25 2014-12-12 서울대학교산학협력단 표적 항암제의 내성 극복 방법
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
PL2838998T3 (pl) 2012-04-18 2018-04-30 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR i ROS1 w nowotworze
RU2737765C2 (ru) 2012-05-04 2020-12-02 Пфайзер Инк. Простатоассоциированные антигены и иммунотерапевтические схемы на основе вакцин
CA2875543A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
EP3539563A1 (en) 2012-07-19 2019-09-18 Redwood Bioscience, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
MY175687A (en) 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
CN104379169A (zh) 2012-08-14 2015-02-25 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体
RU2661083C2 (ru) 2012-10-04 2018-07-11 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
TW202037609A (zh) 2012-11-01 2020-10-16 美商艾伯維有限公司 抗-vegf/dll4雙重可變區域免疫球蛋白及其用途
ES2860954T3 (es) 2012-11-21 2021-10-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
MX359651B (es) 2012-11-29 2018-10-05 Chemocentryx Inc Antagonistas de cxcr7.
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
CN107753954A (zh) 2012-12-13 2018-03-06 免疫医疗公司 功效改进且毒性降低的抗体与sn‑38的免疫缀合物的剂量
HK1220465A1 (zh) 2013-03-06 2017-05-05 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. 抗c-met串联fc双特异性抗体
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
TWI614041B (zh) 2013-03-15 2018-02-11 安美基公司 用於注射器之匣盒
US10646664B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 Amgen Inc. Body contour adaptable autoinjector device
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
BR112015027313A2 (pt) 2013-04-29 2017-09-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd anticorpos anti-cd38 e fusões ao interferon alfa-2b atenuado
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
JP6869720B2 (ja) * 2013-06-13 2021-05-12 アンチセンス セラピューティクス リミテッド 併用療法
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
CA2936675C (en) 2014-01-12 2023-06-27 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
JP6447933B2 (ja) 2014-02-21 2019-01-09 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ−２発現細胞に対する免疫応答を誘発することによる疾患治療
CA2935748A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Immunomedics, Inc. Humanized rfb4 anti-cd22 antibody
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
CN111840696B (zh) 2014-06-03 2022-12-20 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
EP3160504B1 (en) 2014-06-24 2020-09-16 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US10544199B2 (en) 2014-10-29 2020-01-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha 2B variants
US10413615B2 (en) 2014-11-19 2019-09-17 Immunogen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
KR20180016972A (ko) * 2015-02-22 2018-02-20 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 Cd137에 결합하는 항체 치료제
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
AU2016252771B2 (en) 2015-04-22 2021-12-16 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating Trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
JP6980980B2 (ja) 2015-06-25 2021-12-15 イミューノメディクス、インコーポレイテッドImmunomedics, Inc. 抗ｈｌａ‐ｄｒまたは抗ｔｒｏｐ‐２抗体と微小管阻害剤、ｐａｒｐ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはホスホイノシチド３‐キナーゼ阻害剤との併用は癌の治療効果を有意に改善する
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CN108367048B (zh) 2015-10-02 2022-08-12 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
EP3373937B1 (en) 2015-11-09 2021-12-22 R.P. Scherer Technologies, LLC Anti-cd22 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
TW201731532A (zh) 2016-02-05 2017-09-16 伊繆諾金公司 用於製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之有效方法
CN116284392A (zh) 2016-03-10 2023-06-23 艾科赛扬制药股份有限公司 活化素2型受体结合蛋白及其用途
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
PT3528787T (pt) 2016-10-21 2026-03-11 Amgen Inc Formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
BR112019013953A2 (pt) 2017-01-06 2020-02-11 Abl Bio Inc. Anticorpo anti-a-syn e uso do mesmo
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3056011A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
ES3023742T3 (en) 2017-03-28 2025-06-03 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system
CN117442747A (zh) 2017-05-21 2024-01-26 Igf肿瘤公司 胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
CN111885914B (zh) * 2017-10-27 2022-05-13 投资健康有限责任公司 使用芴衍生物制造扩增的造血干细胞的组合物和方法
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
EP3725806A4 (en) 2017-12-14 2022-03-30 ABL Bio Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST A-SYN/IGF1R AND ASSOCIATED USE
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
US12325737B2 (en) 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202541859A (zh) 2018-10-15 2025-11-01 美商安進公司 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
BR112021010479A2 (pt) * 2018-12-03 2021-11-16 Teijin Pharma Ltd Anticorpo humanizado anti-receptor de igf-i ou fragmento ou derivado do mesmo, molécula de ácido nucleico, vetor de clonagem ou vetor de expressão, célula recombinante, processo para produção de um anticorpo humanizado anti-receptor de igf-i ou fragmento ou derivado do mesmo, e, composição farmacêutica
MX2021006915A (es) 2018-12-12 2021-08-24 Chemocentryx Inc Inhibidores de cxcr7 para el tratamiento de cancer.
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
AU2020275413A1 (en) 2019-05-14 2021-12-23 Cedars-Sinai Medical Center TL1A patient selection methods, systems, and devices
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
AU2020337958A1 (en) 2019-08-28 2022-03-17 Horizon Therapeutics Ireland Dac Methods for the treatment of thyroid eye disease
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
EP4559477A3 (en) 2020-05-13 2025-08-13 Adagene AG Compositions and methods for treating cancer
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
US20220267450A1 (en) 2020-10-14 2022-08-25 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of thyroid eye disease
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
JP2024503933A (ja) 2021-01-27 2024-01-29 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド Ｃｄ１６ａに対する単一ドメイン抗体およびその使用
US20240166760A1 (en) * 2021-03-08 2024-05-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
WO2022239720A1 (ja) 2021-05-10 2022-11-17 公益財団法人川崎市産業振興財団 抗原への結合親和性を低減させた抗体
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
EP4384219A4 (en) 2021-08-10 2025-06-18 Viridian Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS, DOSAGES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF THYROID EYE DISEASE
US20250076309A1 (en) 2021-10-05 2025-03-06 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
KR20240135670A (ko) * 2022-01-29 2024-09-11 밍훼이 파마슈티컬 (항저우) 리미티드 항원 결합 단백질 및 이의 용도
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024244149A1 (en) * 2023-04-04 2025-08-28 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-igf1r antibodies and uses thereof
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
AU2024287547A1 (en) 2023-07-07 2026-01-22 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating chronic thyroid eye disease
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) * 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP1820858B1 (en) 1991-03-01 2009-08-12 Dyax Corporation Chimeric protein comprising micro-protein having two or more disulfide bonds and embodiments thereof
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CZ283601B6 (cs) 1991-04-19 1998-05-13 Subburaman Mohan Inzulinu podobný růstový faktor vázající protein odvozený z lidské kosti
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
WO1994019935A1 (en) 1993-03-09 1994-09-15 Genzyme Corporation Isolation of components of interest from milk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
ES2153031T4 (es) 1995-04-20 2001-05-16 Pfizer Derivados del acido arilsulfonil hidroxamico como inhibidores de mmp y tnf.
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6084085A (en) * 1995-11-14 2000-07-04 Thomas Jefferson University Inducing resistance to tumor growth with soluble IGF-1 receptor
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
NZ331191A (en) 1996-03-05 2000-03-27 Zeneca Ltd 4-anilinoquinazoline derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
AR007857A1 (es) 1996-07-13 1999-11-24 Glaxo Group Ltd Compuestos heterociclicos fusionados como inhibidores de proteina tirosina quinasa, sus metodos de preparacion, intermediarios uso en medicina ycomposiciones farmaceuticas que los contienen.
EA199900021A1 (ru) 1996-07-13 1999-08-26 Глаксо, Груп Лимитед Бициклические гетероароматические соединения в качестве ингибиторов протеинтирозинкиназы
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
KR20000067904A (ko) 1996-07-18 2000-11-25 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 매트릭스 메탈로프로테아제의 포스피네이트계 억제제
KR20000068248A (ko) 1996-08-23 2000-11-25 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 아릴설포닐아미노 하이드록삼산 유도체
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
JP3338064B2 (ja) 1997-01-06 2002-10-28 ファイザー・インク 環状スルホン誘導体
NZ336840A (en) 1997-02-03 2001-01-26 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives useful in the treatment of tumor necrosis factor and matrix metalloproteinase mediated diseases
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
EP0960098A1 (en) 1997-02-11 1999-12-01 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002511852A (ja) 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
JP2002501532A (ja) 1997-05-30 2002-01-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 新規血管形成阻害薬
CA2299355C (en) 1997-08-08 2005-09-27 Pfizer Products Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ES2289791T3 (es) 1997-08-22 2008-02-01 Astrazeneca Ab Derivados de oxindolilquinazolina como inhibidores de la angiogenesis.
AU744939B2 (en) 1997-09-26 2002-03-07 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
EP1028964A1 (en) 1997-11-11 2000-08-23 Pfizer Products Inc. Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
SK287132B6 (sk) 1998-05-29 2009-12-07 Sugen, Inc. Farmaceutická kompozícia obsahujúca pyrolom substituovaný 2-indolinón, súprava obsahujúca uvedenú kompozíciu a použitie pyrolom substituovaného 2-indolinónu
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
EP1004578B1 (en) 1998-11-05 2004-02-25 Pfizer Products Inc. 5-oxo-pyrrolidine-2-carboxylic acid hydroxamide derivatives
CZ302706B6 (cs) 1998-12-23 2011-09-14 Pfizer Inc. Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, bunecná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelská bunka obsahující tuto izolovanou molek
WO2000050067A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Saltech I Göteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic production of insulin-like growth factor-1
HUP0200575A3 (en) 1999-03-25 2004-11-29 Abbott Gmbh & Co Kg Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
ME00502B (me) 2001-01-05 2011-10-10 Amgen Fremont Inc Antitjela za insulinu sličan receptor faktora i rasta
EP2295081B1 (en) 2001-06-26 2018-10-31 Amgen Inc. Antibodies to OPGL
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
CA2524305C (en) 2003-05-01 2015-12-08 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
DE602004029581D1 (de) * 2003-08-13 2010-11-25 Pfizer Prod Inc Modifizierte humane igf-1r antikörper
MX370489B (es) 2004-01-09 2019-12-16 Pfizer Anticuerpos contra madcam.
US20130246300A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and Methods for Tailoring Marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

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