RS51373B - Antitela za insulinu sličan faktor rasta i receptor - Google Patents

Antitela za insulinu sličan faktor rasta i receptor

Info

Publication number
RS51373B
RS51373B YUP-542/03A YUP54203A RS51373B RS 51373 B RS51373 B RS 51373B YU P54203 A YUP54203 A YU P54203A RS 51373 B RS51373 B RS 51373B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
YUP-542/03A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Amgen Fremont Inc.
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS51373(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Fremont Inc., Pfizer Inc. filed Critical Amgen Fremont Inc.
Publication of YU54203A publication Critical patent/YU54203A/sr
Publication of RS51373B publication Critical patent/RS51373B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Ova prijava je nastavak SAD privremene prijave 60/259.027, podnete 5. januara 2001.
POZNATO STANJE TEHNIKE
Insulinu sličan faktor rasta (IGF-I) jeste jedan polipeptid, molekulske mase 7,5 kD, koji cirkuliše u plazmi u velikim količinama i može se otkriti u većini tkiva. IGF-I stimuliše diferencijaciju i razmnožavanje ćelija i potreban je većini sisarskih vrsta ćelija za podržano razmnožavanje. Ove vrste ćelija obuhvataju, između ostalih, čovečije dipioidne fibroblaste, epitelne ćelije, ćelije glatkih mišića, T limfocite, nervne ćelije, mijeloidne ćelije, hondrocite, osteoblaste i matične ćelije koštane srži. Za pregled veoma raznovrsnih tipova ćelija videti Goldring et al., Eukar. Gene Express., 1:31-326 (1991).
Prvi korak na pututransdukcije, koji vodi do razmnožavanja ili diferencijacija ćelija, stimulisanog od IGF-I, jeste vezivanje IGF-I ili IGF-II (ili insulin u suprafiziološkim koncentracijama) na IGF-I receptor. IGF-I receptor sastoji se od dve vrste podjedinica: jedna alfa podjedinica (protein molekulske mase 130-135 kD koji je potpuno vanćelijski i deluje u vezivanju liganada) i jedna beta podjedinica (jedan transmembranski protein, molekulske mase 95-kD, sa transmembranskim i citoplazmičkimđomenima). IGF-IR pripada porodici receptora faktora rasta tirosinske kinaze (Ullrich et al, Cell 61: 203-212, 1990), i strukturno je sličan insulinskom receptom (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR prvobitno je sintetizovan kao proreceptorski polipeptid, jednočlani, koji je obrađivan glikosilacijom. proteolitskim cepanjem i kovalentnim vezivanjem da bi se sklopio u zreo heterotetramer, molekulske mase 460 kD, koji sadrži dve alfa podjedinice i dve beta jedinice. Beta podjedinica ima Ugandom aktiviranu aktivnost tirosinske kinaze. Taje aktivnost uključena u ligandno delovanje posredovano signalnim putanjama koje obuhvata autofosforilisanje beta-podjedinice i fosforilisanje IGF-IRsupstrata.
In vivo,nivoi IGF-I u serumu zavise od prisutnosti hormona rasta (GH) hipofize. Mada je jetra jedno glavno mesto za sintezu IGF-I zavisnu od GH, poslednji rad ukazuje da većina normalnih tkiva takođe proizvodi IGF-I. Mnoga neoplastična tkiva takođe mogu proizvoditi IGF-I. Na taj način, IGF-I može delovati kao regulator normalnog i nenormalnog razmnožavanja putem autokrinskog ili parakrinskog kao i endokrinskog mehanizma. IGF-I i IGF-II vezuju se za IGF vezujuće proteine (IGFBPs)in vivo.Dostupnost slobodnog IGF za interakciju sa IGF-IR moduliše se pomoću IGFBPs. Za pregled IGFBPs i IGF-1, videti Grimberg et al., J. Cell. Phvsiol. 183: 1-9, 2000.
Postoji znatna evidencija o ulozi IGF-I i/ili IGF-IR u održavanju ćelija tumora in vitro i in vivo. Nivoi IGF-IR povišeni su kod tumora pluća (Kaiser et al., J. Cancer Res.Clin. Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), tumora dojke (Pollak et al, Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga et al., J. Clin. Ivest. 84: 1418-1423,1989), tumora prostate i debelog creva (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo el al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Poremećeno eksprimiranje IGF-I u epitelu prostate dovodi do neoplazije kod transgenih miševa (DiGiovanni et al, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Pored toga, izgleda da je IGF-I autokrini stimulator čovečijih tumora nervnih ćelija (Sandberg-Nordquist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), dok je IGF-I stimulisao rast malignog tumora vezivnih ćelija koji je preterano eksprimirao IGF-IR (Butler et al., Canver Res. 58: 3021-27, 1998). Dalje, pojedinci sa "visoko normalnim" nivoima IGF-I imaju povećan rizik od uobičajenih vrsta kancera u poređenju sa pojedicima koji imaju nivoe IGF-I u "nisko normalnom" opsegu (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Mnogi od tih tipova tumorskih ćelija reaguju na IGF-I sa proliferativnim signalom u kulturi (Nakanishi et al., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol. Endocnml. 3 509-514, 1989), a pretpostavljene su autokrinske ili parakrinske petlje za razmnožavanje in vivo (LeRoith et al. Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee et al., Mol. Endocinol. 3: 509-514, 1989). Za pregled uloge koju međusobno delovanje IGF-I/IGF-I receptora igra u rastu niza čovečijih tumora, videti Macaulav, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
Povećani nivoi IGF-I povezani su sa nekoliko nekanceroznih patoloških stanja, uključujući agromegaliju i gigantizam (Barkan, Clevelanmd Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), dok je nenormalno funkcionisanje IGF-I/IGF-I receptora povezano sa psorijazom (Wraight et al, Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), aterosklerozom i restenozom krvnih sudova glatkih mišića posle angioplastike (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Povišeni nivoi IGF-I takođe mogi biti problem kod dijabetesa ili njegovih komplikacija kao stoje mikrovaskularno proliferacija (Smith et al, Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Sniženi nivoi IGF-I, koji se javljaju, između ostalog, u slučaju kada su nivoi GH u serumu sniženi ili kada postoji neosetljivost ili rezistencija na GH, povezani su sa poremećajima kao što je nizak rast (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), oboljenje nervnog sistema, smanjenje mišićne mase i osteoporoza (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141,1999) .
Koristeći antisens vektore ekspresije ili antisens oligonukleotide na IGF-IR RNK, pokazalo se da interferencija sa IGF-IR dovodi do inhibiranja rasta ćelija izazvanog posredstvom IFG-I ili IFG-II (videti, npr. Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). Antisens strategija bila je uspešna kod inhibiranja proliferacije ćelija kod nekoliko vrsta normalnih ćelija i kod linija ćelija čovečijeg tumora. Rašćenje se takođe može inhibirati koristeći peptidne analoge od IGF-I (Pietrzkowski et al., Cell Grovvth & Diff. 3: 199-205, 1992; i Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992), ili jedan vektor koji eksprimira jednu antisens RNK na IGF-I RNK (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Pored tog, antitela za IGF-IR (Arteaga et al, Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992; i Kalebic et al., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994), i dominantni negativni mutanti od IGF-IR (Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 91: 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 i Jiang et al., Oncogene 18: 6071-77, 1999), mogu da preokrenu transformisan fenotip, inhibiraju karcinogen i izazovu gubitak metastatičkog fenotipa.
IGF-I takođe je važan za regulisanje apoptoze. Apoptoza, koja je programirana smrt ćelije, javlja se u širokom spektru razvojnih procesa, uključujući sazrevanje imunskog i nervnog sistema. Pored njene uloge u razvoju, apoptoza je takođe naznačena kao važna ćelijska zaštita protiv obrazovanja tumora (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786-787, 1993). Inhibiranje apoptotičkog programa, putem raznih genetskih lezija, može doprineti razvoju i širenju malignosti.
IGF-I štiti od apoptoze izazvane izvlačenjem citokina iz ćelija koje stvaraju krv a zavisne su od IL-3 (Rodriguez-Tarduchv, G. et al, Immunolog. 149: 535-540, 1992) i od izvlačenja seruma iz l/mycER ćelija pacova (Harrington, E., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Antiapoptotičko delovanje IGF-I važno je u stadijumu ćelijskog ciklusa posle smeštaja u neku ustanovu a takođe i kod ćelija blokiranih u razvoju ćelijskog ciklusa etopozidom ili timidinom. Prikaz da su čovečiji diploidni fibroblasti, pokretani od c-myc, zavisni od IGF-I za svoje preživljavanje sugeriše da IGF-IR ima važnu ulogu za održavanje tumorskih ćelija specifičnim inhibiranjem apostoze, ulogu koja se razlikuje od proliferativnih delovanja IGF-I ili IGF-IR. To bi bilo slično ulozi za koju se smatra da igraju drugi anti-apoptotički geni kao stoje bcl-2 kod potpomaganja preživljavanja tumora (McDonnel et al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et al., Nature 348: 334-336, 1990).
Zaštitna delovanja IGF-I na apoptozu zavise od postojanja IGF-IR na ćelijama koji bi reagovao sa IGF-I (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Podrška za anti-apoptotičku funkciju IGF-IR pri održavanju ćelija tumora dobijena je od studije koja je koristila antisens oligonukleotide na IGF-IR koji su iđentifikovali kvantitativnu vezu između nivoa IGF-IR, obima apoptoze karcenogenog potencijala jednog singeneičnog tumora pacova (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Utvrđeno je da jedan prekomerno eksprimiran IGF-IR štiti ćelije tumorain vitrood apoptoze izazvane etoposiđom (Seli et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995) i, još dramatičnije, da je smanjenje nivoa IGF-IR ispod prirodnih nivoa izazvalo masovnu apoptozu tumorskih ćelijain vivo(Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potencijalne strategije za izazivanje apoptoze ili za sprečavanje proliferacije ćelija povezanog sa povišenim nivoima IGF-I, IGF-1I i/ili IGF-IR receptora obuhvataju inhibiranje IGF-I ili IGF-II nivoa ili sprečavanje vezivanja IGF-I sa IGF-IR. Tako je, na primer, oktrotid, analog somatostatina sa dugotrajnim delovanjem, korišćen za smanjenje sinteze i/ili lučenja IGF. Rastvorljiv IGF-IR korišćen je da izazove apoptozu u ćelijama tumorain vivoi da spreči obrazovanje tumora kod opitnih životinja (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Pored toga, IGF-IR antisens oligonukleotidi, peptidni analozi od IGF-I, i antitela za IGF-IR korišćeni su da smanje eksprimiranje IGF-I ili IGF-IR (videti napred). Međutim, ni jedno od tih jedinjenja nije bilo pogodno za dugotrajno davanje humanim pacijentima. Pored toga, mada je IGF-I davan pacijentima za lečenje niskog rasta, osteoporoze, smanjenja mišićne mase, oboljenja nervnog sistema ili dijabetesa, vezivanje IGF-I na IGFBPs često činilo lečenje sa IGF-I teškim ili neefikasnim.
Prema tome, imajući u vidu uloge koje imaju IGF-I i IGF-IR u takvim poremećajima kao što je rak i drugi poremećaji razmnožavanja kada su IGF-I i/ili IGF-IR preteranoeksprimirani, a uloge koje IGF-IR imaju kod poremećaja kao što se nizak rast i slabost kada su i IGF-I i/ili IGF-IR premaloeksprimiri, bilo bi poželjno da se generišu antitela za IGF-IR koja se mogu koristit bilo da inhibiraju bilo da stimulišu IGF-IR. Mada je zabeleženo da su anti-IGF-IR antitela nađena kod izvesnih pacijenata sa autoimunskim oboljenjeima, ni jedno od tih antitela nije bilo prečišćeno i ni jedno se nije pokazalo pogodnim za inhibiranje IGF-I delatnosti za dijagnostičke ili kliničke procedure. Videti, na primer, Thompson et al., Pedfiat. Res. 32: 455-459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; VVeightman et al., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. Prema tome, bilo bi poželjno da se dobiju visoko afinitetna humana anti-IGF-IR antitela koja se mogu korstiti za lečenje oboljenja kod ljudi.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slike 1A-1C prikazuju poređenja nukleotidnih sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca iz šest humanih anti-IGF-IR antitela jedne sa drugom i sa embrionskim sekvencama. Slika 1A prikazuje poređenje nukleotidnih sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (VL) antitela 2.12.1 (SEQ TD NO: 1), 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9), i 4.9.2 (SEQ ID NO: 13), jedne sa drugom i sa embrionskom sekvencom VkA30 (SEQ ID NO: 39). Slika 1B prikazuje poređenje nukleotidne sekvence od VL antitela 4.17.3 (SEQ ID NO: 17) sa embrionskom sekvencom Vk012 (SEQ ID NO: 41) . Slika 1C prikazuje poređenje nukleotidne sekvence od VL antitela 6.1.1 (SEQ ID NO: 21) sa embrionskom sekvencom VkA27 (SEQ ID NO: 37). Poređenja takođe pokazuju CDR regione za VL od svakog antitela. Konsenzusne sekvence za slike 1A-1C prikazane su u SEQ ID NOS: 53-55, respektivno.
Slike 2A-2D prikazuju poređenja nukleotidnih sekvenci varijablnih regiona teškog lanca od šest humanih anti-IGF-IR antitela jednog u odnosu na drugo i prema embrionskim sekvencama. Slika 2A prikazuje poređenje nukleotidne sekvence od VH antitela 2.12.1 (SEQ ID NO: 3) sa embrionskom sekvencom VH DP-35 (SEQ ID NO: 29). Slika 2B prikazuje poređenje nukleotidne sekvence od VH antitela 2.14.3 (SEQ ID NO: 11) sa embrionskom sekvencom VIV-4/4.35 (SEQ ID NO: 43). Slike 2C-1 i 2C-2 prikazuju poređenja nukleotidnih sekvenci VH antitela 2.13.2 (SEQ ID NO: 7), 4.9.2 (SEQ ID NO: 15) 6.1.1 (SEQ ED NO: 23) jedne sa drugom i sa embrionskom sekvencom VH DP-47 (SEQ ID NO: 31). Slika 2D prikazuje poređenje nukleotidne sekvence od VH antitela 4.17.3 (SEQ ID NO: 19) sa sekvencom (SEQ ID NO: 35) embrionske linije VH DP-71. Poređenja takođe pokazuju CDR regione svakog antitela. Konsenzusne sekvence za slike 2A-2D prikazane su u SEQ ID
NOS: 56-59, respektivno.
Slika 3 prikazuje da anti-IGF-IR antitela 2.13.2, 4.9.2 u 2.12.1 inhibiraju vezivanje IGF-I za 3T3-IGF-IR ćelije.
Slika 4 prikazuje da anti-IGF-IR antitelo 4.9.2 inhibira fosforilaciju tirozina receptora izazvanu od IGF-I (gornje polje) i izaziva regulisanje IGF-IR na nižu vrednost na površini ćelije (donje polje).
Slika 5 prikazuje da anti-IGF-IR antitela 2.13.2 i 4.9.2 snižavaju IGF-IR fosfotirozinski signal u 3T3-IGF-IR tumorima.
Slika 6 prikazuje da anti-IGF-IR antitela 2.13.2 i 4.9.2 snižavaju IGF-IR u 3T3-IGF-IR tumorima.
Slika 7 prikazuje da anti-IGF-IR antitelo 2.13.2 inhibira rast 3T3-IGF-IR tumorain vivosamo (levo polje) ili u kombinaciji sa adriamicinom (desno polje).
Slika 8 prikazuje vezu između nivoa anti-IGF-IR antitela 2.13.2 u serumu i regulacije na nižu vrednost IGF-IR u 3T3-IGF-IR tumorima.
Slika 9 prikazuje da višestruke doze anti-IGF-IR antitela 2.13.2 inhibiraju rast 3T3-IGF-IR tumorain vivosame ili u kombinaciji sa adriamicinom.
Slika 10 prikazuje da anti-IGF-IR antitelo 2.13.2 inhibira rast velikog tumorain vivou kombinaciji sa adriamicinom.
Slika 11 prikazuje da anti-IGF-IR antitelo 2.13.2 inhibira rast Colo 205 tumorain vivosamo ili u kombinaciji sa 5-deoksiuridinom (5-FU).
Slika 12 prikazuje da višestruke doze anti-IGF-IR antitela 2.13.2 inhibiraju rast Colo 205 tumorain vivosamo ili u kombinaciji sa 5-FU.
Slika 13 prikazuje da višestruke doze anti-IGF-FR antitela 2.13.2 inhibiraju rast MCF-7 tumorain vivosame ili u kombinaciji sa taksolom.
Slika 14 prikazuje da anti-IGF-IR antitelo 2.13.2 inhibira rast MCF-7 tumorain vivosamo (levo polje) ili u kombinaciji sa adriamicinom (desno polje).
Slika 15 prikazuje da višestruke doze anti-IGF-IR antitela 2.13.2 inhibiru rast MCF-7 tumorain vivosame ili u kombinaciji sa tamoksifenom.
Slika 16 prikazuje da višestruke doze anti-IGF-IR antitela 2.13.2 inhibiraju rast A431 tumorain vivosame ili u kombinaciji sa inhibitorom CP-358,774 receptor pokožnog faktora rasta (EGF-R) tirozinske kinaze.
Slika 17 prikazuje farmakokinetičku procenu jedne jedine intravenske injekcije anti-IGF-IR antitela 2.13.2 Cvnomologus majmunima.
Slika 18 pokazuje da kombinacija anti-IGF-IR antitela 2.13.2 i adriamicina povećava regulisanje IGF-IR na nižu vrednost na 3T3-IFG-IR tumorimain vivo.
Slika 19A prikazuje broj mutacija u raznim regionima teških i lakih lanaca antitela 2.13.2 i 2.12.1 u poređenju sa embrionskim sekvencama.
Slike 19A-D prikazuju poređenja sekvenci amino kiselina iz teških i lakih lanaca antitela 2.13.2 i 2.12.1 sa embrionskim sekvencama iz kojih su izvedene. Slika 19B prikazuje poređenje sekvence amino kiselina teškog lanca antitela 2.13.2 (SEQ ID NO: 45) sa embrionskom sekvencom DP-47-(3-23)/D6-19/JH6 (SEQ ID NO: 46). Slika 19C prikazuje poređenje sekvence amino kiselina lakog lanca antitela 2.13.2 (SEQ ID NO: 47) sa embrionskom sekvencom A30/Jk2 (SEQ ID NO: 48). Slika 19D prikazuje poređenje sekvenca amino kiselina teškog lanca antitela 2.12.1 (SEQ ID NO: 49) sa embrionskom sekvencom DP-35(3-l 1VD3-3/JH6 (SEQ ID NO: 50). Slika 19E prikazuje poređenje sekvence aminokiselina lakog lanca antitela 2.12.1 (SEQ ID NO: 51) sa embrionskom sekvencom A30/Jkl (SEQ ID NO: 52). Za slike 19B-E signalne su sekvence pisane kosim slovima, CDR su podvučeni, konstantni domeni su pisani masnim slovima, okvirne (FR) mutacije označene plus znakom ("+") iznad ostatka amino kiseline a CDR mutacije označene su zvezdicom iznad ostatka amino kiseline.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje jedno izdvojeno antitelo ili njegov deo koji se vezuje na antigen, koje vezuje IGF-IR, poželjno koje vezuje IGF-IR primata i ljudi, još poželjnije jedno koje je humano antitelo. Pronalaskom se dobija jedno anti-IGF-IR antitelo koje inhibira vezivanje IGF-I ili IGF-II na IGF-IR, a takođe obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje aktivira IGF-IR.
Pronalazak obezbeđuje jednu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo i jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija može sadržati jedno drugu komponentu, kao stoje neki protivtumorski agens ili neko sredstvo za snimanje.
Pronalaskom su obuhvaćeni i dijagnostički i terapeutski postupci. Dijagnostički postupci obuhvataju jedan postupak dijagnoziranje prisustva ili položaja tkiva koje eksprimira IGF-IR koristeći jedno anti-IGF-IR antitelo. Jedan terapeutski postupak obuhvata davanje antitela subjektu kome je to potrebno, poželjno zajedno sa davanjem nekog drugog terapeutskog sredstva.
Pronalazak obezbeđuje jednu izdvojenu liniju ćelija, kao što je neki hibridom, koji proizvodi jedno anti-IGF-IR antitelo.
Pronalazak takođe daje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju težak i/ili laki lanac ili delove za vezivanje antigena jednog anti-IGF-IR antitela. Pronalazak obezbeđuje vektore i ćelije domaćine koji sadrže molekule nukleinskih kiselina, kao i postupke za rekombinantnu proizvodnju polipeptida kodiranih molekulima nukleinskih kiselina.
Takođe su obezbeđene ne-humane transgene životinje koje eksprimiraju težak i/ili lak lanac ili delove za vezivanje antigena jednog anti-IGF-IR antitela. Pronalazak takođe daje postupak za lečenje nekog subjekta kome je to potrebno jednom delotvornom količinom molekula jedne nukleinske kiseline koja kodira težak i/ili lak lanac ili delove za vezivanje antigena jednog anti-IGF-IR antitela.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije i opšte tehnike
Ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u ovoj prijavi treba da imaju značenja koja prosečni stručnjaci normalno shvataju. Dalje, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, izrazi u jednini treba da obuhvataju množine a izrazi u množini treba da obuhvataju i jednine. Opšte uzev, nazivi i tehnike koje se odnose na kulturu ćelija i tkiva, molekularnu biologiju, imunologiju, mikrobiologiju, genetiku i herniju proteina i nukleinskih kiselina i hibridizaciju i koji su ovde opisani, poznati su i obično se koriste u struci. Postupci i tehnike prema ovom pronalasku uglavnom se izvode prema konvencionalnim postupcima poznatim u struci i kako su opisani raznim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i detaljno rasmotrene u ovoj specifikaciji, sem ukoliko nije drugačije naznačeno. Videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory manual,2d ed., Cold spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and LaneAntibodies: A Laboratory manualCold Spring Harbor Laboratotv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), koji su ovde uvršteni kao literatura. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se prema specifikacijama proizvođača, kao što se to obično radi u struci ili kako je ovde opisano. Primenjena terminologija i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hernije, sintetičke organske hernije i medicinske i fatmaceutske hernije koje su ove opisane, poznate su i normalno se koriste u struci. Standardne se tehnike koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije i davanje lekova i za lečenje pacijenata.
Za sledeće izraze, ukoliko nije drugačije rečeno, podrazumeva se da imaju sledeća značenja.
Izraz "polipeptid" obuhvata prirodne ili sintetičke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge jedne proteinske sekvence. Polipeptid može biti monomerni ili polimerni.
Izraz "izdvojen peptid" ili "izdvojen polipeptid" označava neki protein ili polipeptid koji je zahvaljujući svom poreklu ili izvoru iz koga je izveden (1) nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom prirodnom stanju, (2) bez drugih je proteina iste vrste, (3) eksprimiran je od strane ćelije neke druge vrste, ili (4) ne javlja su u prirodi. Na taj način, polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili sintetizovan u nekom ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje proističe, biće "izdvojen" od svojih prirodno pripadajućih komponenata. Protein se može u suđtini osloboditi od prirodno pripadajućih komponenata izdvajanjem, koristeći poznate tehnike prečišćavanja proteina.
Neki je protein ili polipeptid "u suštini čist", "u suštini homogen" ili "u suštini prečišćen" kada najmanje od oko 60 do 75% uzorka predstavlja jednu vrstu polipeptida. Polipeptid ili protein može biti monomerni ili multimerni. Jedan u suštini čist polipeptid ili protein tipično će sadržati oko 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% mas. jednog proteinskog uzorka, češće oko 95%, a poželjno će biti preko 99% čist. Proteinska čistoća ili homogenost mogu se označiti na nekoliko načina poznatih u struci, kao što je elektroforeza poliakrilnim gelom jednog proteinskog uzorka, posle čega se vrši vizuelizacija jedne jedine polipeptidne trake nakon bojenja gela nekom bojom poznatom u struci. Za izvesne svrhe može se obezbediti veća rezolucija korišćenjem HPLC ili drugih poznatih sredstava za prečišćavanje.
Izraz "polipeptidni fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan polipeptid koji ima brisanje na amino-završetku i/ili na karboksi završetku, ali kod koga je preostala sekvenca amino kiselina identična sa odgovarajućim položajima u prirodnoj sekvenci. Fragmenti obično imaju dužinu od najmanje 5, 6, 8 ili 10 amino kiselina, poželjno dužine od najmanje 14 amino kiselina, bolje dužine od najmanje 20 amino kiselina, obično dužine od najmane 50 amino kiselins, a najbolje dužine od najmanje 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 amino kiselina.
Izraz "polipeptidni analog", kako se ove koristi, odnosi se na jedan polipeptid koji obuhvata jedan segment od najmanje 25 amino kiselina, koji je u suštini identičan jednom delu jedne sekvence amino kiseline i koji ima najmanje jedno od sledećih svojstava: (1) specifično vezivanje za IGF-IR pod pogodnim uslovima vezivanja, (2) sposobnost da blokira vezivanje IGF-I ili IGF-II za IGF-IR, ili sposobnost da redukuje ekspresiju površine ćelije IGF-IR ili fosforilovanje tirosina in vitro ili in vivo. Obično polipeptidni analozi obuhvataju jednu konzervativnu supstituciju amino kiseline (ili umetanje ili brisanje) u odnosu na priro-dnu sekvencu. Analozi su obično dužine od najmane 20 amino kiselina, poželjno dužine najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 amino kiselina ili veće, a često mogu imati dužinu kao prirodni polipeptid pune dužine.
Poželjne supstitucije amino kiselina se one koje: (1) redukuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidisanju, (3) menjaju afinitet vezivanja radi obrazovanja proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i (4) prenose ili modikuju druga fizičkohemijska ili funkcionalna svojstva takvih analoga. Analozi mogu sadržati razne muteine (mutirane proteine) umesto prirodnih peptidnih sekvenci. Tako, na primer, jednostruke ili višestruke supstitucije amino kiselina (poželjno konzervativne supstitucije amino kiselina) mogu biti izvršene u prirodnoj sekvenci (poželjno u delo polipeptida van domena koji obrazuje međumolekulske kontakte. Konzervativna supstitucija amino kiseline ne bi trebalo da značajnije menja strukturne karakteristike polazne sekvence (na primer, jedna amino kiselina za zamenu ne treba da teži da prekine spiralu koja se javlja u polaznoj sekvenci, ili da prekine druge vrste sekundarne strukture koje karakterišu polaznu sekvencu). Primeri sekundarnih tercijarnih polipeptidnih struktura poznati u struci opisani su uProteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W.H. Freeman and Companv, New York (1984);Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nevv York, N.Y. (1991); i Thornton et al.Nature354:105 (1991), koje su ovde uključene kao literatura.
Nepeptidni analozi koriste se u farmaceutskoj industriji kao lekovi sa svojstvima analognim onima od standardnih peptida. Ove vrste nepeptidnih jedinjenja nazivaju se "podražavaoci peptida" ili "peptidni podražavaoci". Fauchere,J. Adv. Drug Res.15: 29
(1986) ; Veber and FreidingerTINSp.392 (1985); i Evans et al.,J. Med. Chem.30: 1229
(1987) , koji su ovde uključeni kao literatura. Ovakva se jedinjenja često razvijaju pomoću kompjuterizovanog molekulskog modelovanja. Peptidni podražavaoci koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se koristiti da proizvedu ekvivalentno terapeutsko ili profilaktično dejstvo. Opšte uzev, peptidni podražavaoci su strukturno slični jednom paradigmatskom polipeptidu (tj. polipeptidu koji ima neko željeno biohemijsko svojstvo ili farmakološko dejstvo), kao što je neko humano antitelo, ali ima jednu ili više peptidnih veza eventualno zamenjenu nekom vezom iz grupe koja obuhvata: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH?-, -CH=CH- (cis i trans), COCH2-, -CH(OH)CH2i -CH2SO-, a prema poznatim postupcima. Može se koristiti i sistematska supstitucija jedne ili višekoncenzusnih sekvenca nekom D-amino kiselinom istog tipa (napr. D-lizin umesto L-lizina) da bi se generisali stabilniji peptidi. Pored toga, neprirodni, ili ograničeni, peptidi koji sadrže jednu konsenzusnu sekvecu ili varijantu jedne u suštini identične konsenzusne sekvence, mogu se generisati poznatim postupcima (Rizo and Gierash^4««. Rev. Biochem.61: 387 (1992), ovde uključeno kao literatura), na primer dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih da obrazuju unutarmolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptide. Jedan "imunoglobulin" je jedan tetramerni molekul. Kod prirodnog imunoglobulina svaki je tetramer obrazovan od dva identična para polipeptidnih lanaca, a svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" (oko 50-70 kDa) lanac. Amino-završni deo svakog lanca obuhvata jedan varijabilni region od oko 100 ili 110 ili više amino kiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi terminalni deo svakog od lanaca defmiše jedno konstantnan region odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su klasi-rani kaokiXlaki lanci. Teški lanci su klasirani kao u., A, y, a ili s, i definišu izotope antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. I kod lakih i kod teških lancaca, varijabilni i konstantni regioni su spojeni jednim "J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe obuhvata jedan "D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Videti uopšteno,Fundamenta! ImmunologyCh. 7 (Paul, W., ed. 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (uključeno u celini kao literatura za sve svrhe). Verijabilni regioni svakog para lakog/ teškog lanca obrazuju mesto vezivanja tako da jedan nedirnut imunoglobin ima dva mesta vezivanja. Imunoglobulinski lanci imaju istu opštu strukturu relativno održanih okvirnih regiona (framework regions - FR) spojenih sa tri hiperpromenljiva regiona, nazvana i regioni utvrđivanja koplementarnosti ili CDRs. CDRs od dva lanca od svakog para poravnana su okvirnim regionima, omogućujući vezivanje na jedan specifičan epitop. Od N-završetka do C-završetka, i laki i teški lanci sadrže oblasti FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Doznaka amino kiselina svakom od regiona u skladu je sa definicijama koje su dali KabatSeguences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 i 1991), ili Chothia & LeskJ. Mol. Biol.196: 901-917 (1987); Chothia et al.,Nature342: 878-883 (1989). Izraz "antitelo" odnosi se na jedan nedirnut imuniglobulin ili na njegov deo za vezivanje antigena koji se takmiči sa netaknutim antitelom za specifično vezivanje. Delovi koji vezuju antigen mogu se proizvesti tehnikom rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem nedirnutih antitela. Delovi koji vezuju antigen obuhvataju, između ostalih, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb i fragmente regiona utvrđivanja komplementarnosti (CDR), antitela jednog lanca (scFv), himerna antitela, biantitela i polipeptide koji sadrže bar deo jednog imunoglobulina koji je dovoljan da prenese specifično vezivanje antigena na polipeptide. Kako se ovde koristi, jedno se antitelo koje je označeno sa, na primer, 2.12.1. 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1, jeste antitelo izvedeno od hibridoma istog imena. Tako je, na primer, antitelo 2.12.1 izvedeno od hibridoma 2.12.1. Fab fragment je jedan jednovalentni fragment koji se sastoji VL, VH, CL i CH I domena; F(ab')2fragment je jedan dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana jednim disulfidnim mostom u zglobnom regionu; Fd fragment se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment se sastoji od VL i VH domena jedinog kraka jednog antitela; a dAb fragment (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) sastoji se od jednog VH domena. Jednolačnano antitelo (scFv) jeste antitelo u kome su VL i VH regioni upareni da bi obrazovali monovalentne molekule preko jednog sintetičkog linkera koji im omogućuje da budu izvedeni kao jednostruki proteinski lanac (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 i Huston et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Biantitela su bivalentna, bispecifićna antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći linker koji je suviše kratak da bi omogućio sparivanje između dva domena istog lanca, tako da prisiljava domene da se pare sa komplementarnim domcnima drugog lanca i da stvaraju dva mesta za vezivanje antigena (videti, npr., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, i Pollak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). Jedan ili više CDRs mogu biti ugrađeni ujedan molekul bilo kovalentno ili nekovalentno da bi od njega načinili jedan imunoadhezin. Imunoadhezin može da uključuje CDR(s) kao deo jednog većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno vezati CDR(s) na drugi polipeptidni lanac, ili može da nekovalentno uključuje CDR(s). SDRs omogućuje imunoadhezinu da se specifično veže na jedan određeni antigen koji je od interesa. Jedno antitelo može imati jedno ili više mesta za vezivanje. Ako postoji više nego jedno mesto za vezivanje, mesta za vezivanje mogu biti međusobno identična ili mogu biti različita. Tako, na primer, jedan prirodni imunoglobulin ima dva identična mesta za vezivanje, jednolančano antitelo ili Fab fragment ima jedno vezno mesto, dok jedno "bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo ima dva različita područja vezivanja. Jedno "izdvojeno antitelo" jeste jedno antitelo koje (1) nije povezano sa prirodno povezanim komponentama, uključujući druga prirodno povezana antitela koja ga prate u njegovom prirodnom stanju, (2) nema drugih proteina od iste vrste (biološke), (3) eksprimirano je od strane ćelije neke druge vrste, ili (4) ne javlja se u prirodi. Primeri izdvojenih antitela obuhvataju jedno anti-IGF-IR antitelo koje je afinitetno prečišćeno koristeći IGF-IR pa je postalo izdvojeno antitelo, jedno anti-IGF-IR antitelo koje je sintetizovano jednim hibridomom ili drugom linijom ćelija in vitro, ijedno humano anti-IGF-IR antitelo izvedeno od jednog transgenog miša. Izraz "humano antitelo" obuhvata sva antitela koja imaju jedno ili više promenljivih i konstantnih regiona izvedenih od humanih imunoglobulinskih sekvenci. Kod jednog preporučljivog izvođenja svi varijabilni i konstantni domeni su izvedeni od humanih imunoglobulinskih sekvenci (potpuno humano antitelo). Ta se antitela mogu pripremati na razne načine, što će biti kasnije opisano. Humanizovano antitelo jeste jedno antitelo koje je izvedeno od nehumanih vrsta, kod kojih su izvesne amino kiseline u okviru i konstantnim domenima teških i lakih lanaca bile imitirane kako bi se izbeglo ili poništilo neko imunsko reagovanje u ljudima. Alternativno, jedno humanizovano antitelo može se proizvesti fuzionisanjem konstantnih domena jednog humanog antitela na varijabilne domene jedne od nehumanih vrsta. Primeri kako da se načine humanizovana antitela mogu se naći u američkim patentima br. 6,054,297, 5,886,152 i 5,877,293. Izraz "himerno antitelo" odnosi se na jedno antitelo koje sadrži jedan ili više regiona od jednog antitela i jedno ili više regiona od jednog ili više antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja, jedan ili više CDRs izvedeno je iz jednog humanog anti-IGF-IR antitela. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, svi su CDRs izvedeni od jednog humanog anti-IFG-IR antitela. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, CDRs od više nego jednog humanog anti-IGF-IR antitela pomešani su i poređeni u jednom himernom antitelu. Tako, na primer, jedno himerno antitelo može sadržati jedan CDR1 iz lakog lanca prvog humanog anti-IGF-IR antitela koji se može kombinovati sa CDR2 i CDR3 iz lakog lanca drugog humanog anti-IGF-IR antitela, CDRs iz teškog lanca može se izvesti iz trećeg anti-IGF-IR antitela. Dalje se mogu okvirni regioni izvesti iz jednog od istih anti-IGF-IR antitela, od jednog ili od više različitih antitela,
kao što je jedno humano antitelo, ili od nekog humanizovanog antitela.
"Neutrališuće antitelo" ili "inhibitorsko antitelo" jeste jedno antitelo koje inhibira vezivanje IGF-IR za IGF-I kada jedan višak anti-IFR-IR antitela redukuje količinu IGF-I vezanog za IGF-IR bar za oko 20%. Kod jednog poželjnog izvođenja antitelo redukuje količinu IGF-I vezanog za IGF-IR bar za oko 40%, poželjno za 60%, poželjnije za 80%, ili čak za 85%. Redukcija vezivanja može se meriti na bilo koji način poznat prosečnom stručnjaku, na primer u jednomin vitrouporednom ispitivanju vezivanja. Jedan primer merenja redukcije u vezivanju IGF-I sa IGF-IR prikazanje u potonjem Primeru IV.
"Aktivirajuće antitelo" jeste jedno antitelo koje aktivira IGF-IR za najmanje 20% kada se doda nekoj ćeliji, tkivu ili organizmu koji eksprimira IGF-IR. Kod jednog pogodnog izvođenja antitelo podstiče delovanje IGF-IR najmanje za 40%, poželjno 60%, poželjnije 80%, ili čak za 85%. Kod jednog najpreporučljivijeg izvođenja, aktivirajuće se antitelo dodaje u prisustvu IGF-I ili IGF-II. Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja delovanje aktivirajućeg antitela meri se određivanjem količine tirozinskog autofosforilovanja IGF-IR.
Fragmente ili analoge antitela mogu prosečni stručnjaci lako pripremiti prateći uputstva iz ove specifikacije. Pogodni amino i karboksi završeci fragmenata ili analoga javljaju se blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu se identifikovati poređenjem podataka nukleotidne sekvence i/ili sekvence amino kiselina sa javnim ili privatnim bazama podataka za sekvence. Pogodno je da se koriste postupci kompjuteirzovanog poređenja kako bi se identifikovla šema sekvence ili područja uobličavanja predskazanih proteina koja se javljaju kod drugih proteina poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikovanje proteinskih sekvenci koje se savijaju u neku poznatu trodimenzionalnu strukturu poznati su. Bovvie et al.,Science253: 164 (1991).
Izraz "površinska plazmonska rezonansa", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan optički fenomen koji omogućuje analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu otkrivanjem promena u proteinskim koncentracijama unutar jedne biosenzorske matrice, na primer korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska i Piscataway, N.J., SAD). Za dalje opise videti Jonsson, U., et al, (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al, (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; i Johnsson, B., etal., (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Izraz "Koff" odnosi se na konstantu izlazne brzine kod razdvajanja jednog antitela iz kompleksa antitelo/antigen.
Izraz "Kd" odnosi se na konstantu razdvajanja jedne određene interakcije antitelo-
antigen.
Izraz "epitopa" obuhvata svaku proteinsku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za neki imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopičke se determinante obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su amino kiseline ili bočni nizovi šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja. Za jedno antitelo se kaže da se specifično vezuje za neki antigen kada je konstanta razdvajanja <1 uM, poželjno < 100 nM a najbolje <10 nM.
Kako se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih amino kiselina i njihove skraćenice u skladu su sa konvencionalnim korišćenjem. VidetiImmunology -A Svnthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderlan, Mass, SAD (1991)) što je ovde uključeno kao literatura. Steroizomeri (na primer D-amino kiseline) dvadeset konvencionalnih amino kiselina, neprirodne kiseline kao što su a-amino kiseline, oc-disupstituisane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne amino kiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide prema ovom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih amino kiselina obuhvataju: 4-hidroksiprolin, y-karbo-ksiglutamat, z-N,N,N-trimetillizin,£-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, s-N-metilarginin, i druge slične amino kiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U polipeptidnom označavanju koje se ovde koristi, levi je smer smer amino završetka, dok je desni smer smer karboksi završetka, u skladu sa standardnim korišćenjem i konvencijom.
Izraz "polinukleotid", kako se ovde naziva, podrazumeva jedan polimerni oblik nukleotida dužine od najmanje 10 baza, bilo ribonukleotida ili deoksinukleotida ili nekog modifikovanog oblika od obe vrste nukleotida. Izraz obuhvata jednolančane i dvolančane obike DNK.
Izraz "izdvojen polinukleotid", kako se ovde koristi, podrazuneva jedan polinukleotid genomskog porekla, porekla od cDNK, ili sintetičkog porekla, ili neke njihove kombinacije, pri čemu, zbog svog porekla, "izdvojen polinukleotid" (1) nije povezan sa celim polinukleotidom u kome se "izdvojen polinukleotid" nalazi u prirodi, niti sa nekim njegovim delom, (2) operativno je vezan za jedan polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo neke veće sekvence.
Izraz "oligonukleotid", kako se ovde pominje, obuhvata prirodne i modifikovane nukleotide međusibno povezane prirodnim i veštačkim oligonukleotidnim vezama. Oligonukleotidi su jedna podgrupa polinukleotida koja ima dužinu od 200 baza ili manju. Poželjno je da oligonukleotidi imaju dužinu od 10 do 60 baza, a najbolje 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 baza. Olikonukleotidi su obično jednolančani, na primer za uzorke; mada oligonukleotidi mogu biiti dvolančani, na primer za primenu kod obrazovanja nekog genskog mutanta. Oligonukleotidi prema pronalasku mogu biti smisleni ili nesmisleni oligonukleotidi.
Izraz "prirodni nukleotidi" koji se ovde pominje, obuhvata deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Izraz "modifikovani nukleotidi", koji se ovde pominje, obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slične. Izraz "oligonukleotidne veze", kako se ovde pominje, obuhvata oligonukleotidne veze kao što su fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforaniltioat, fosforaniladat, fosforamidat, i slične. Videti, na primer, LaPlanche et al.,Nucl. Acids Res.14: 9081 (1986); Stec et al.,J. Am. Chem. Soc.106: 6077 (1984); Stein et al.,Nuc. Acids Res.16: 3209 (1988): Zon et al.,Anti- Cancer Drug Design6: 539 (1991); Zon et al.,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach,pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and PeymanChemical Reviews90: 543 (1990), čiji su sadržaji ovde uključeni kao literatura. Jedan nukleotid može obuhvatati jednu oznaku za otkrivanje, ukoliko se to želi.
"Operativno vezane" sekvence obuhvataju i sekvence za kontrolu ekspresije koje su bliske sa genom od interesa i sekvence za kontrolu ekspresije koje deluju utransili na nekom rastojanju da kontrolišu gen od interesa. Izraz "sekvenca za kontrolu ekspresije", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da ostvare ekspresiju i obradu sekvenci za kodiranje sa kojima su povezane. Sekvence za kontrolu ekspresije obuhvataju odgovarajuće sekvence za iniciranje, završavanje, promovisanje, i podsticanje transkripcije; efikasne RNK signale obrade kao što su signali spajanja i signali poliadenilacije; sekvence koje stabilišu citoplazmičnu mRNK; sekvence koje podstiču efikasnost translacije (tj. Kozakova konsenzusna sekvenca); sekvence koje podstiču proteinsku stabilnost; a kada je to poželjno, sekvence koje postiču proteinsko lučenje. Priroda ovih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, te kontrolne sekvence obično obuhvataju promoterske sekvence, sekvence ribozomnih mesta vezivanja i sekvence završavanja transkripcije; kod eukariota, u opštem slučaju, te kontrolne sekvence obuhvataju promoterske sekvence i sekvence završavanja transkripcije. Izraz "kontrolne sekcije" predviđen je da obuhvati, najmanje, sve komponente čije je prisustvo bitno za
ekspresiju i obradu, a može da obuhvati i dodatne komponente čije je prisustvo korisno, na primer vodeće sekvence i sekvence fuzionog partnera.
Izraz "vektor", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul jedne nukleinske kiseline koji je u stanju da prenese drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedna vrsta vektora je "plazmid", a odnosi se na jednu kružnu petlju dvolančane DNK u kojoj se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Druga je vrsta vektora virusni vektor, kod koga se dodatni segmenti DNK mogu vezati u virusni genom. Neki su vektori sposobni za autonomno razmnožavanje u ćeliji domaćinu u koju su umetnuti (na primer bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo razmnožavanja i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori (na primer neepizonalni sisarski vektori) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina posle unošenja u ćeliju domaćina i tako reprodukovati zajedno sa genomom domaćina. Sem toga, izvesni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena sa kojima su operativno vezani. Ti se vektori ovde označavaju kao "rekombinantni vektori ekspresije" (ili, jednostavno, "vektori ekspresije"). Opšte uzev, vektori ekspresije koji se koriste u tehnici rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu se koristiti međusobno zamenljivo postoje plazmid najčešće korišćen oblik vektora. Međutim, nameraje da pronalazak obuhvati i te druge oblike vektora ekspresije, kao što su virusni vektori (na primer retrovirusi koji se ne mogu reprodukovati, adenovirusi i adeno-povezani virusi) koji vrše ekvivalentne funkcije.
Izraz "rekombinantna ćelija domaćin" (ili samo ćelija domaćin"), kako se ovde koristi, odnosi se na jednu ćeliju u koju je unet jedan rekombinantan vektor ekspresije. Podrazumeva se da se ovaj izraz ne odnosi na jednu određenu obrađenu ćeliju, već i na potomstvo te ćelije. Pošto se izvesne modifikacije mogu pojaviti u sledećim generacijama bilo zbog mutacije, bilo zbog uticaja okolne sredine, takvo potomstvo, u stvari, ne može biti identično osnovnoj ćeliji, ali je ipak uključeno u opseg izraza "ćelija domaćin" kako se ovde koristi.
Izraz "selektivno hibridizovati", kako se ovde pominje, znači primetljivo i specifično vezati. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti prema pronalasku selektivno se hibridizuju na lance nukleinskih kiselina pod uslovima hibridizovanja i ispiranja koji svode na minimum znatne količine primetljivog vezivanja na nespecifične nukleinske kiseline. Uslovi "velike strogosti" ili "veoma strogi" uslovi mogu se koristiti da se ostvare uslovi selektivne hibridizacije kao što su poznati u struci i ovde diskutovani. Primer uslova "velike strogosti" ili "veoma strogih" uslova jeste postupak inkubacije jednog polinukleotida sa drugim polinukleotidom, po kome se jedan polinukleotid može pričvrstiti na neku čvrstu površinu kao što je neka membrana, u hibridizacijskom puferu od 6X SSPE ili SSC, 50% formamida, 5X Denhardt-ovog reagensa, 0.5% SDS, 100 ug/ml DNK od denaturisane, fragmentovane lososove sperme, na temperaturi hibridizovanja od 42°C u trajanju od 12-16 časova, posle čega se dva puta ispira na 55°C koristeći pufer za ispiranje sastava IX SSC, 0,5% SDS. Videti i Sambrook et al.,napred,str. 9.50-9.55.
Izraz "procentna identičnost sekvenci" u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina odnosi se na ostatke dveju sekvenci koji su isti kada se porede u pogledu maksimalnog poklapanja. Dužina poređenja identičnosti sekvenci može biti na dužini od najmanje devet nukleotida, obično od najmanje 18 nukleotida, češće od najmanje 24 nukleotida, tipično najmanje oko 28 nukleotida, najtipičnije najmanje oko 32 nukleotida, a preporučljivo bar 36, 48 ili više nukleotida. Postoji više različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotidnih sekvenci. Tako se, na primer, polinukleotidne sekvence mogu porediti korišćenjem programa FASTA, Gap ili Bestfit, koji su programi sadržani u programskom paketu Wisconsin Package Version 10.0, firme Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA koji obuhvata, npr., programe FASTA2 i FASTA3, obezbeđuje poređenje i procentualnu identičnost sekvenci regiona najboljeg preklapanja između upitne sekvence i sekvence pretraživanja (Pearson,Methods Enzymol.183: 63-98
(1990); Pearson,Methods Mol. Biol.132: 185-219 (2000); Pearson,Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson,J. Mol. Biol.276: 71-84 (1998), ovde uključeni kao literatura). Ukoliko nije drugačije naznačeno, koriste se usvojeni, standardni parametri za neki posebni program ili algoritam. Tako, na primer, procentualna identičnost sekvenci između sekvenci nukleinskih kiselina može se odrediti koristeći FASTA sa njegovim standardnim parametrima (veličina reči 6 i NOPAM faktor za matricu za izradu rezultata) ili koristeći Gap sa njegovim standardnim parametrima kako su dati u GCG Version 6.1, ovde uključenim kao literatura.
Pozivanje na sekvencu jedne nukleinske kiseline obuhvata i njenu dopunu, ukoliko nije drugačije naznačeno. Tako se kod pozivanja na jedan molekul nukleinske kiseline koji ima jednu posebnu sekvencu podrazumeva da obuhvata i njegov komplementarni lanac, zajedno sa njegovom komplementarnom sekvencom.
U molekularnoj biologiji istraživači koriste izraze "procentualna identičnost sekvenci", "procentualna sličnost sekvenci" i "procentna homolognost sekvenci" međusobno zamenljivo. U ovoj će prijavi ovi izrazi imati isto značenje samo kod sekvenci nukleinskih kiselina.
Izraz "značajna sličnost" ili "značajna sličnost sekvenci", kada se odnosi na neku nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada se optimalno uporedi, sa odgovarajućim nukleotidnim umecima ili brisanjima, sa nekom drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidnih sekvenci od najmanje oko 85%, poželjno od najmanje oko 90%, a najbolje od oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim poznatim algoritmom za identičnost sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kako su napred rasmotreni.
Kada se primeni na polipeptide, izraz "značajna identičnost" znači da dve peptidne sekvence, kada se optimalno porede, kao kod programa GAP ili BESTFIT koristeći standardna značenja razmaka, dele bar 75% ili 80% identičnosti sekvenci, poželjno bar 90% ili 95% identičnosti sekvenci, ili najbolje 98% ili 99% identičnosti sekvenci. Poželjno je da se položaji ostataka koji nisu identični razlikuju po konzervativnim supstitucijama amino kiselina. "Konzervativna supstitucija amino kiseline" je ona kod koje se jedan ostatak amino kiseline supstitiše ostatkom druge amino kiseline koja ima jedan bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (na primer nabojem ili hidrofobičnošću). Opšte uzev, konzervativna supstitucija amino kiselina neće značajnije promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci amino kiselina međusobno razlikuju za konzervativne supstitucije, procentualna identičnost sekvenci ili stepen sličnosti mogu se podesiti na veću vrednost da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Postupci za ovo podešavanje poznati su stručnjacima. Videti, na primer, Pearson, Methods Mol. Biolog. 24: 307-31 (1994), ovde uključeno kao literatura. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sličnih hemijskih svojstava obuhvataju 1) alifatične bočnelance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) amide koji sadrže bočne lance: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočnelance: lizin, arginin i histidin; i 6) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Preporučljive su konzervativne supstitucione grupe amino kiselina: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin. alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin.
Alternativno, konzervativna je zamena svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće koju su prikazali Gorrnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), ovde uključeno kao literatura. "Umereno konzervativna" zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće.
Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe naziva i identičnost sekvenci, obično se meri koristeći softver za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina poredi slične sekvence koristeći merenja sličnosti naznačena za razne supstitucije, brisanja i druge modifikacije, uključujući konzervativne supstitucije amino kiselina. Tako, na primer, GCG sadrži programe kao što su "Gap" i "Bestfit" koji se mogu koristiti sa standardnim parametrima da odrede homologiju sekvenci ili identičnost sekkvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi organizama različitih vrsta ili između prirodnog proteina i njegovog mutanta. Videti, na primer, GCG Version 6.1. Polipeptidne se sekvence takođe mogu porediti koristeći program FASTA koji koristi standarne ili preporučene parametre, a koji je u sklopu GCG Version 6.1. FASTA (na primer FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poređenje i procentualnu identičnost sekvenci regiona najboljeg preklapanja između upitne sekvence i sekvence pretraživanja (Pearson (1990); Pearson (2000)). Jedan drugi preporučljiv algoritam koji se koristi kod poređenja neke sekvence prema pronalasku sa nekom bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci od različitih organizama, jeste računarski program BLAST, naročito blastp ili blastn, koji koristi standardne parametre. Videti, na primer, Altschul et al, J. Mol, Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); ovde uključene kao literatura.
Dužina polipeptidnih sekvenci poređenih homologičnosti biće, uopšteno, bar oko 16 ostataka amino kielina, obično bar oko 20 ostataka, češće bar oko 24 ostatka, tipično bar oko 28 ostataka, a najbolje više nego oko 35 ostataka. Kada se pretražuje neka baza podataka koja sadrži sekvence većeg broja različitih organizama, poželjno je da se porede sekvence amino kiselina.
Kako se ovde koriste, izrazi "oznaka" ili "označen" odnose se na ugradnju jednog drugog molekula u antitelo. Kod jednog je izvođenja oznaka jedan primetljiv marker, na primer ugradnja jedne radioaktivno označene amino kiseline ili vezivanje na jedan polipeptid iz biotinilskih grupa koja se može detektovati označenim avidinom (na primerm streptavidin koji sadrži neki fluorescentni marker ili enzimatsko delovanje koje se može otkriti optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). Kod jednog drugog izvođenja, oznaka ili marker može biti neko terapeutsko sredstvo, na primer dodatak nekog leka ili toksin. U struci su poznati razni postupci za označavanje polipeptida i glikoproteina i mogu se koristiti. Primeri oznaka za polipeptide obuhvataju, ali nisu na njih ograničeni, sledeće: radioizotope ili radionukleide (na primer,<3>H,<1>4C,15N,3<5>S, "V,<99>Tc, '"in,<12S>I,l3lI), fluorescentne oznake (na primer, FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimatske oznake (na primer, ren peroksidazu, 8-galaktozidazu, luciferazu, alkalnu fosfatazu), hemiluminescentne markere, biotinilske grupe, unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje jedan sekundarni informator (na primer sekvence poteznog para leucina, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopske etikete), magnetska sredstva kao što su gadolinijum helati, toksini kao što je toksin velikog kašlja, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, I-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, kao i njihovi analozi ili homolozi. Kod nekih su izvođenja oznake priključne preko odstojnika raznih dužina kako bi se smanjile eventualne prostorne smetnje.
Izraz "agens" ovde se koristi da označi neko hemijsko jedinjenje, mešavinu hemijskih jedinjenja, neki biološki makromolekul ili neki ekstrakt načinjen od bioloških materijala. Izraz "farmaceutski agens ili lek" koristi se ovde za neko hemijsko jedinjenje ili kompoziciju sposobnu da izazove željeno terapeutsko dejstvo kada se pravilno da nekom pacijentu. Ostali hemijski termini ovde se koriste prema uobičajenoj praksi u struci, kako je navedeno u The McGrow-Hill Dictionarv of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco
(1985)), ovde uključen kao literatura).
Izraz " sredstvo protiv tumora" koristi se za sredstva koja imaju funkcionalno svojstvo inhibiranja pojave ili razvoja nekog neoplazma kod nekog čoveka, posebno neke maligne (kancerozne) lezije, kao što je karcinom, sarkom, limfom ili leukemija. Inhibiranje metastaza često je svojstvo sredstava protiv tumora.
Izraz pacijent obuhvata humane i veterinarske subjekte.
Humana anti-IGF-IR antitela
i njihovo obeležavanje
Humana antitela izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima koja imaju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih sekvenci izvedenih od miševa ili pacova mode dovesti do naglog uklanjanja antitela ili može dovesti do generisanja imunskog reagovanja pacijenta protiv antitela. Zbog toga, kod jednog izvođenja, pronalazak obezbeđuje humanizovana anti-IGF-IR antitela. Kod jednog preporučljivog izvođenja pronalazak obezbeđuje potpuno humana anti-IGF-IR antitela unošenjem humanih imunoglobulinskih gena u nekog glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela. Poželjnija su potpuno humana anti-humana IGF-IR antitela. Očekuje se da potpuno humana anti-IGF-IR antitela svedu na minimum imunogenska i alergijska reagovanja svojstvena mišjim ili od miša izvedenim monoklonalnim antitelima (Mabs) i da tako povećaju efikasnost i berzbednost pacijentu datih antitela. Može se očekivati da će primena potpuno humanih antitela obezbediti znatnu prednost kod lečenja hroničnih i povratnih humanih oboljenja, kao što su zapaljenja i rak, koja mogu zahtevati ponovljivo davanje antitela. Kod jednog izvođenja pronalazak daje jedno anti-IGF-IR antitelo koje ne vezuje dopune.
Kod jednog poželjnog izvođenja anti-IGR-IR antitelo je 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo obuhvata jedan laki lanac koji sadrži jednu sekvencu amino kiselina biranu od SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22 ili jedan ili više CDRa iz tih sekvenci amino kiselina. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo obuhvata jedan teški lanac koji sadrži jednu sekvencu amino kiselina biranu od SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24 ili jedan ili više CDRa iz tih sekvenci amino kiselina.
Klasa ipotklasa anti- IGF- IR antitela.
Antitelo može biti jedan IgG, jedan IgM, jedan IgE, jedan IgA ili jedan IgD molekul. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo je IgG a podtip je IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. Kod jednog poželjnijeg izvođenja anti-IGF-IR antitelo je iz potklase IgG2. Kod jednog poželjnog izvođenja anti-IGF-IR antitelo iz iste je klase i potklase kao antitelo 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1, a koja je IgG2.
Klase i potklase anti-IGF-IR antitela mogu se odrediti bilo kojim poznatim postupkom. Opšte uzev, klasa i potklasa jednog antitela može se utvrditi koristeći antitela specifična za neku određenu klasu ili potklasi antitela. Takva se antitela mogu nabaviti komercijalno. Klasa i potklasa mogu se odrediti pomoću programa ELISA, pomoću Western analize bojenjem kao i drugim tehnikama. Alternativno, klasa i potklasa mogu se odrediti sekvenciranjem svih ili dela konstantnih domena teških i/ili lakih lanaca antitela, poredeći njihove sekvence amino kiselina sa poznatim sekvencama amino kiselina raznih klasa i potklasa imunoglobulina i odredivši klasu i potklasu antitela.
Selektivnost vrsta i molekulska selektivnost
Prema jednom drugom vidu pronalaska, anti-IGF-IR antitelo pokazuje i selektivnost vrsta i molekulsku selektivnost. Kod jednog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo vezuje se za humani, pavijanski IGF-IR ili IGF-IR rezus majmuna. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo ne vezuje se za IGF-ER. miša, pacova, zamorca, psa ili zeca. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo ne vezuje se za američke vrste majmuna kao što je marmoset. Prema principima iz ove prijave, može se odrediti selektivnost (životinjskih) vrsta za anti-IGF-IR antitelo koristeći poznate postupke. Tako, na primer, može se utvrditi selekti-vnost vrsta koristeći Western postupak, i programe FACS, ELISA ili RIA. Kod jednog poželjnog izvođenja može se odrediti selektivnost vrsta koristeći Western analizu bojenjem.
Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo ima selektivnost za IGF-IR koja je bar 50 puta veća od njegove selektivnosti za insulinski receptor. Kod jednog poželjnog izvođenja, selektivnost anti-IGF-IR antitela veća je više od 100 puta od njegove selektivnosti za insulinski receptor. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo ne pokazuje nikakvo iole značajno specifično vezivanje za bilo koji protein sem za IGF-IR. Može se odrediti selektivnost anti-IGF-IR antitela za IGF-IR koristeći poznate postupke, a prema principima iz ove prijave. Tako, na primer, može se utvrditi selektivnost koristeći Western postupak, i programe FACS, ELISA ili RIA. Kod jednog poželjnog izvođenja može se odrediti molekulska selektivnost koristeći VVestern analizu bojenjem.
Afinitet za vezivanje anti- IGF- IR antitela za IGF- IR
Kod jednog drugog vida ovog pronalaska, anti-IGF-IR antitela vezuju se sa velikim afinitetom za IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo vezuje se za IGF-IR sa Kdod 1 x 10"<8>M ili manjim. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa Kdod 1 x IO"<9>M ili manjim. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa Kdod 5 x IO"<10>M ili manjim. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa Kjod 1 x IO"<10>M ili manjim. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Kdkao neko antitelo birano od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Kdkao neko antitelo koje sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela biranog od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod još jednog preporučljivog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Kdkao i jedno antitelo koje sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ili 24. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Kdkao jedno antitelo koje sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela koje sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10. 12, 14, 16, 18,20, 22 ili 24.
Prema jednom drugom vidu pronalaska anti-IGF-IR antitelo ima malu brzinu razdvajanja. Kod jednog izvođenja anti-IGF-IR antitelo ima KotT od 1 x IO"<4>s"<1>ili manje. Kod ednog poželjnog izvođenja Koffje 5 x IO"<5>s"<1>ili manje. Kod jednog drugog poželjnog zvođenja Koff je u suštini isto kao i zajedno antitelo birano od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Koffkao neko antitelo koje sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela biranog od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod još jednog preporučljivog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Koff kao i jedno antitelo koje sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ili 24. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo se vezuje za IGF-IR sa u suštini istim Koff kao jedno antitelo koje sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela koje sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 .
Afinitet vezivanja i brzina razdvajanja jednog anti-IGF-IR antitela sa IGF-IR može se odrediti bilo kojim od poznatih postupaka. Kod jednog se izvođenja afinitet vezivanja može meriti pomoću uporedne ELISA-e, RIA ili površinskom plazmon rezonancom, kao što je BIAcore. Brzina razdvajanja takođe može meriti površinskom plazmon rezonancom. Kod jednog poželjnijeg izvođenja se afinitet vezivanja i brzina razdvajanja mere površinskom plazmon rezonancom. Kod jednog najpovoljnijeg izvođenja, afinitet vezivanja i brzina razdvajanja mere se koristeći BIAcore. Primer određivanja afiniteta vezivanja i brzine razdvajanja opisan je u Primeru II.
Poluživot anti- IGF- IR antitela
Prema jednom drugom predmetu ovog pronalaska, anti-IGF-IR antitelo ima poluživot od najmanje jednog dana in vitro ili in vivo. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo ili njegov deo ima poluživot od najmanje tri dana. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo ili njegov deo ima poluživot od četiri dana ili duži. Kod jednog drugog izvođenja, antitelo ili njegov deo ima poluživot od osam dana ili duži. Kod jednog drugog izvođenja, antitelo ili njegov deo za vezivanje antigen derivatizuje se ili modifikuje tako da ima duži poluživot, što će kasnije biti rasmotreno. Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja, antitelo može sadržati tačkaste mutacije da produži poluživot u serumu, kako je opisano u WO 00/09560, objavljenom 24. februara 2000.
Poluživot antitela može se meriti na bilo koji način poznat prosečnom stručnjaku. Tako, na primer, poluživot antitela može se meriti Westem postupkom, programima ELISA ili RIA, tokom nekog određenog perioda vremena. Poluživot antitela može se meriti u bilo kojoj odgovarajućoj životinji, na primer majmunu kao što je pavijan, nekom primatu ili čoveku.
Identifikacija IGF- IR epitopa
koje je prepoznalo anti- IGF- IR antitelo
Pronalazak takođe obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje vezuje isti antigen ili epitopu kao i jedno humano anti-IGF-IR antitelo. Dalje, pronalazak obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje je zamenljivo sa humanim anti-IGF-IR antitelom. Kod jednog poželjnog izvođenja, humano je anti-IGF-IR antitelo 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja humano anti-IGF-IR antitelo sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela biranog od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod još jednog preporučljivog izvođenja, humano anti-IGF-IR antitelo sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ili 24. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, humano anti-IGF-IR antitelo sadrži jedno ili više CDRs od jednog antitela koje sadrži jednu od sekvenci amino kiselina biranih biranih od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ili 24. Kod jednog veoma preporučljivog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo je jedno drugo humano antitelo.
Može se utvrditi da li se jedno anti-IGF-IR antitelo vezuje za isti antigen koristeći razne postupke poznate u struci. Tako, na primer, može se utvrditi da li se jedno opitno anti-IGF-IR antitelo vezuje za isti antigen koristeći jedno anti-IGF-IR antitelo za hvatanje jednog antigena za koji se zna da se vezuje za anti-IGF-IR antitelo, kao što je IGF-IR, isprati antigen sa antitela, pa potom utvrditi da li će se opitno antitelo vezati za ispran antigen. Može se utvrditi da li se neko antitelo vezuje za istu apitopu kao i anti-IGF-IR antitelo vezujući anti-IGF-IR antitelo za IGF-IR u uslovima zasićenja, posle čega se meri sposobnost opitnog antitela da se veže za IGF-IR. Ako se opitno telo može vezati za IGF-IR u isto vreme kao i anti-IGF-IR antitelo, tada se opitno antitelo vezuje za jednu različitu epitopu kao anti-IGF-IR antitelo. Međutim, ako se opitno antitelo ne može istovremeno vezati za IGF-IR, tada se opitno antitelo vezuje za istu epitopu kao humano anti-IGF-IR antitelo. Taj se eksperiment može izvesti koristeći programe ELISA, RIA ili površinsku plazmonsku rezonancu. Kod jednog poželjnog izvođenja eksperiment se izvodi koristeći površinsku plazmonsku rezonancu. Kod jednog preporučljivijeg izvođenja koristi se BIAcore. Takođe se može utvrditi da li se jedno anti-IGF-IR antitelo sukobljava sa drugim anti-IGF-IR antitelom. Kod jednog preporučljivog izvođenja može se odrediti da li se jedno anti-IGF-IR antitelo sukobljava sa drugim koristeći isti postupak koji je korišćen da se izmeri da li je anti-IGF-IR antitelo sposobno da se veže za istu epitopu kao i drugo anti-IGF-IR antitelo.
Korištenje lakog i teškog lanca
Pronalazak isto tako obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje sadrži promenljive sekvence kodirane humanimkgenom. Kod jednog preporučljivog izvođenja, promenljive su sekvence kodirane jednom od VkA27, A30 ili 012 familija gena. Kod jednog poželjnog izvođenja, promenljive su sekvence kodirane humanom VkA30 familijom gena. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, laki lanac sadrži ne više od deset supstitucija amino kiselina embrionske linije VkA27, A30 ili 012, poželjno ne više od šest aminokiselinskih supstitucija, a najbolje ne više od tri aminokiselinske supstitucije. Kod jednog preporučljivog izvođenja aminokiselinske supsticuje jesu konzervativne supstitucije.
SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 i 22 obezbeđuju sekvence varijabilnih regiona šest anti-IGF-IRklakih lanaca. SEQ ID NOS: 38, 40 i 42 obezbeđuju sekvence triklaka lanca embrionskih linija od kojih je izvedeno šest anti-IGF-IRklakih lanaca. Slike 1A-1C prikazuju međusobno poređenje nukleotidnih sekvenci varijabilnih regiona lakih lanaca za šest anti-IGF-IR antitela kao i sa embrionskim sekvencama od kojih su izvedene. Postupajući prema principima iz ove specifikacije, prosečan stručnjak će moći da odredi kodirane sekvence amino kiselina za šest anti-IGF-IRklakih lanaca i embrionskeklake lance i da utvrdi razlike između embrionskih sekvenci i sekvenci antitela.
Kod jednog preporučljivog izvođenja, VL anti-IGF-IR antitela sadrži iste supstitucije amino kiselina u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu kao jedan ili više VL od antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Tako, na primer, VL anti-IGF-IR antitela može sadržati jednu ili više supstitucija amino kiselina koje su iste kao one koje postoje u antitelu 2.13.2, drugu supstituciju amino kiselina koja je ista kao ona koja postoji u antitelu 2.14.3, ijednu drugu supstituciju amino kiselina koja je ista kao u antitelu 4.9.2. Na taj se način mogu mešati i uklapati razna svojstva vezivanja antitela da bi se menjao, na primer, afinitet vezivanja antitela za IGF-IR ili njegova brzina razdvajanja od antigena. Kod jednog drugog izvođenja, supstitucije amino kiselina načinjene su u istom položaju kao one u jednom ili više VL antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1, ali se vrše konzervativne supstitucije amino kiselina umesto da se koriste iste amino kiseline. Tako, na primer, ako je supstitucija amino kiseline, poređena sa embrionskom linijom, u jednom od VL antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1 glutamat, može se konzervativno supstituisati aspartat. Slično tome, ako je supstitucija amino kiseline serin, može se
konzervativno supstituisati treonin.
Kod drugog jednog poželjnog izvođenja, laki lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina koja je ista kao sekvenca amino kiselina od VL od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog veoma poželjnog izvođenja, laki lanac obuhvata sekvence amino kiselina koje su iste kao i CDR regiona lakog lanca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, laki lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina od bar jednog CDR regiona lakih lanaca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, laki lanac sadrži sekvence amino kiselina iz CDRs iz različitih lakihlanaca. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, CDRs iz raznih lakih lanaca dobijaju se iz 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja laki lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina biranu od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22. Kod drugog jednog izvođenja, laki lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina kodiranu sekvencom nukleinskih kiselina biranom iz SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21, ili jednu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira jednu sekvencu amino kiselina koja ima 1-10 umetanja, brisanja ili supstitucija amino kiselina. Poželjno je da supstitucije amino kiselina budu konzervativne supstitucije amino kiselina. Kod drugih izvo-đenja, antitela ili njihovi delovi sadrže jedan lamda laki lanac.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo, ili njegov deo, koje sadrži jedan humani teški lanac ili jednu sekvencu izvedeno iz jednog humanog teškog lanca. Kod jednog izvođenja je sekvenca amino kiselina jednog teškog lanca izvedena iz familije humanih VHDP-35, DP-47, DP-70, DP-71 ili VIV-4/4.35 gena. Kod jednog poželjnog izvođenja, sekvenca amino kiselina teškog lanca izvedena je iz familije humanih VHDP-47 gena. Kod jednog preporučljivog izvođenja, teški lanac sadrži ne više od osam promena amino kiselina od embrionske linije VHDP-35, DP-47, DP-70, DP-71 ili VIV-4/4.35, poželjnije ne više od šest promena amino kiselina, najbolje ne više od tri zamene amino kiselina.
SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 i 24 daju sekvence amino kiselina varijabilnih regiona za šest anti-IGF-IR teških lanaca. SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 36 i 44 obezbeđuju sekvence amino kiselina a sekvence SEQ ID NOS: 29, 31, 33, 35 i 43 obezbeđuju nukleotidne sekvence za teške lance embrionskih linija DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 i VIV-4 . Slike 2A-2D prikazuju poređenje sekvenci amino kiselina varijabilnih regiona šest anti-IGF-IR antitela sa njihovim odgovarajućim embrionskim sekvencama. Sledeći principe ove specifikacije, prosečan stručnjak može da utvrdi sekvence kodiranih amino kiselina za šest teških lanaca anti-IGF-IR antitela i teških lanaca embrionske linije i da odredi razlike između embrionskih sekvenci i sekvenci antitela.
Kod jednog preporučljivog izvođenja, VH anti-IGF-IR antitela sadrži iste supstitucije amino kiselina u odnosu na embrionsku aminokiselinsku sekvencu kao jedan ili više VH od antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Slično onome što je napred rasmatrano, VH anti-IGF-IR antitela može sadržati jednu ili više supstitucija amino kiselina koje su iste kao one koje postoje u antitelu 2.13.2, drugu supstituciju amino kiselina koja je ista kao ona koja postoji u antitelu 2.14.3, i jednu dnigu supstituciju amino kiselina koja je ista kao u antitelu 4.9.2. Na taj se način mogu mešati i uklapati razna svojstva vezivanja antitela da bi se menjao, na primer, afinitet vezivanja antitela za IGF-IR ili njegova brzina razdvajanja od antigena. Kod jednog drugog izvođenja, supstitucije amino kiselina načinjene su u istom položaju kao one u jednom ili više VH antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1, ali se vrše konzervativne supstitucije amino kiselina umesto da se koriste iste amino kiseline.
Kod drugog jednog poželjnog izvođenja, teški lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina koja je istakao sekvenca amino kiselina od VH od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod drugog jednog poželjnog izvođenja, teški lanac obuhvata sekvence amino kiselina koje su iste kao CDR regiona teških lanaca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, teški lanac sadrži sekvencu amino kiselina bar iz jednog CDR regiona teških lanaca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja teški lanac sadrži sekvence amido kiselina iz CDRs iz raznih teških lanaca. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, CDRs iz raznih teških lanaca dobij aju se iz 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja teški lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina biranu od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24. Kod drugog jednog izvođenja, teški lanac obuhvata jednu sekvencu amino kiselina kodiranu sekvencom nukleinskih kiselina biranom iz SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23, ili jednu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira jednu sekvencu amino kiselina koja ima 1-10 umetanja, brisanja ili supstitucija amino kiselina. Kod jednog drugog izvođenja, supstitucije su konzervativne supstitucije amino kiselina.
Inhibiranje delovanja IGF - IR pomoću anti - IGF - IR antitela
Inhibiranje vezivanja IGF- I za IGF- IR
Kod jednog drugog izvođenja, pronalazak obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje sprečava vezivanje IGF-I za IGF-IR ili vezivanje IGF-II za IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, IGF-IR je humani. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo je humano antitelo. Kod jednog drugog izvođenja, antitelo ili jedan njegov deo inhibira vezivanje između IFH-IR i IGF-I sa jednim IC50ne većim od 100 nM. Kod jednog preporučljivog izvođenja, IC50 je ne veće od 10 nM. Kod jednog poželjnijetg izvođenja, IC50nije veće od 5 nM. IC50može se meriti bilo kojim poznatim postupkom. Obično se IC50može meriti ELISA ili RIA programom. Kod jednog poželjnog izvođenja IC50meri se sa RIA.
Kod jednog drugog izvođenja, pronalazak obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje sprečava aktiviranje IGF-IR u prisustvu IGF-I. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo sprečava fosforilovanje tirozina koje izaziva IGF-IR a koje se javlja posle zauzimanja receptora. Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo inhibira pojavu sledećih ćelijskih događaja. Tako, na primer, anti-IGF-IR može inhibirati fosforilovanje tirozina Shc i supstrata insulinskog receptora (IRS) 1 i 2, koji se svi normalno fosforiluju kada se ćelije obrade sa IGF-I (Kim et al., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998). Može se utvrditi da li neko anti-IGF-IR antitelo može sprečiti aktivisanje IGF-IR u prisustvu IGF-I određivanjem nivoa autofosforilovanja za IGF-IR, Shc, IRS-1 ili IRS-2 pomoću Western postupka ili imunoprecipitacije. Kod jednog izvođenja, nivoi autofosforilovanja IGF-IR određuju se pomoću Western postupka. Vidi Primer VII.
Kod jednog drugog vida pronalaska, antitelo izaziva regulisanje na nižu vrednost IGF-IR obrađenog antitelom. Kod jednog izvođenja, IGF-IR se unosi u citoplazmu ćelije. Nakon što se anti-IGF-IR antitelo veže za IGF-IR, antitelo ostaje unutar ćelije, što se pokazuje konfokalnom mikroskopijom. Bez želje da se veže za neku teoriju, veruje se daje kompleks antitelo-IGF-IR smešten unutar jednog lizozoma i degradisan. Regulisanje IGF-IR može se meriti bilo kojim poznatim postupkom uključujući imunoprecipitaciju, konfokalnu mikroskopiju ili Western postupak. Vidi Primer VII. Kod jednog preporučljivog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, ili 6.1.1, ili sadrži teški lanac, laki lanac ili njihov deo za vezivanje antigena.
Aktiviranje IGF- IR anti- IGF- IR antitelom
Sledeći vid ovog pronalaska obuhvata aktiviranje anti-IGF-IR antitela. Jedno aktivirajuće antitelo razlikuje se od inhibitornog antitela jer pojačava ili zamenjuje delovanje
IFG-I na IGF-IR. Kod jednog izvođenja, aktivirajuće antitelo može da se veže za IGF-IR i uzrokuje njegovo aktiviranje u odsustvu IGF-I. Ova vrsta aktivirajućih antitela u suštini je imitacija IGF-I. Kod jednog drugog izvođenja, aktivirajuće antitelo pojačava dejstvo IGF-I na IGF-IR. Ova vrsta antitela sama po sebi ne aktivira IGF-IR, već povećava aktiviranje IGF-IR u prisustvu IGF-I. Imitacija anti-IGF-IR antitela može se lako raspoznati od jednog pojačavačkog anti-IGF-IR antitela obradom ćelijain vitrojednim antitelom u prisustvu ili odsustvu nižih nivoa IGF-I. Ako je antitelo u stanju da izazove aktiviranje IGF-IR u odsustvu IGF-I, na primer, povećava IGF-IR tirozinsko fosforilovanje, tada je antitelo jedna imitacija antitela. Ako antitelo nije u stanju da izazove aktiviranje IGF-IR u odsustvu IGF-I ali je u stanju da pojača količinu aktiviranja IGF-IR, tada je antitelo jedno pojačavačko antitelo. U jednom poželjnom izvođenju, aktivirajuće antitelo je 4.17.3. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo obuhvata jedan ili više CDRs od 4.17.3. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo je izvedeno od bilo koje ili od obe embrionske sekvence 012 (laki lanac) i/ili D71 (teški lanac).
Inhibiranje IGF- IR tirozinske fosforilacije, IGF- IR nivoa i rasta tumorskih
ćelijain vivoanti- IGF- IR antitelima
Jedno drugo izvođenje pronalaska obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje inhibira IGF-IR tirozinsku fosforilaciju i nivoe receptora in vivo. Kod jednog izvođenja, davanje anti-IGF-IR antitela nekoj životinji izaziva smanjenje IGF-IR fosfotirozinskog signala kod IGF-IR ekspresivnih tumora. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo izaziva smanjenje fosfotirozinskog signala najmanje za 20%. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo izaziva smanjenje fosfotirozinskog signala najmanje za 60%, poželjnije 50%. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, antitelo izaziva smanjenje fosfotirozinskog signala od najmanje 40%, poželjnije 30%, još poželjnije 20%. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se daje otprilike 24 časa pre merenja nivoa tirozinske fosforilacije. Nivoi tirozinske fosforilacije mogu se meriti bilo kojim poznatim postupkom, kao što su neki koji će biti kasnije opisani. Videti, na primer, Primer III i sliku 5. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, ili 6.1.1, ili sadrži teški lanac, laki lanac ili njihov dao za vezivanje antigena.
Kod jednog drugog izvođenja, davanje anti-IGF-IR antitela jednoj životinji izaziva snižavanje IGF-IR nivoa kod IGF-IR ekspresivnih tumora. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo izaziva snižavanje nivoa receptora za najmanje 20% u porcđenju sa nelečenom životinjom. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo izaziva snižavanje nivoa receptora do najmanje 60%, poželjnije 50% od nivoa receptora u nelečenoj životinji. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo izaziva snižavanje nivoa receptora do najmanje 40%, poželjnije 30%. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se daje približno 24 časa pre no što se mere nivoi IGF-IR. Nivoi IGF-IR mogu se meriti bilo kojim poznatim postupkom, kao što su neki koji će biti kasnije opisani. Videti, na primer, Primer VIII i sliku 6. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, ili 6.1.1, ili sadrži teški lanac, laki lanac ili njihov deo za vezivanje antigena.
Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo inhibira rast tumorskih ćelija in vivo. Tumorske ćelije mogu biti izvedene od bilo koje vrste ćelija, uključujući, bez ograničavanja, epidermne ćelije, epitelne ćelije, endotelialne ćelije, ćelije leukemije, sarkoma, višestrukog mijeloma ili mezodermalne ćelije. Primeri tumorskih ćelija obuhvataju A549
ćelije (karcinoma nemalih ćelija pluća), MCF-7 ćelije, Colo 205 ćelije, 3T3/IGF-IR ćelije i A431 ćelije. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo inhibira rašćenje tumorskih ćelija u poređenju sa rastom tumora kod nelečene životinje. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo inhibira rast tumorskih ćelija do 50%. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo inhibira rast tumorskih ćelija za 60%, 65%, 70% ili 75%. Kod jednog se izvođenja inhibiranje rasta tumorskih ćelija meri najmanje 7 dana po početku lečenja životinje antitelom. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, inhibiranje rasta tumorskih ćelija meri se najmanje 14 dana posle početka lečenja životinja antitelom. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, neko drugo sredstvo protiv tumora daje se životinji zajedno sa anti-IGF-IR antitelom. Kod jednog poželjnog izvođenja sredstvo protiv tumora sposobno je da dodatno inhibira rast tumorskih ćelija. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, sredstvo protiv tumora je adriamicin, taksol, tamoksifen, 5-fluoro-deoksiuridin (5-FU) ili CP-358,774. Kod jednog poželjnog izvođenja, istovremeno davanje sredstva protiv tumora i anti-IGF-IR antitela inhibira rast tumorskih ćelija najmanje za 50%, poželjnije za 60%, 65%, 70% ili 75%, a još poželjnije 80%, 85% ili 90% posle perioda od 22-24 dana. Videti, na primer, sliku 7 i Primer IX. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, ili 6.1.1, ili sadrži teški lanac, laki lanac ili njihov deo za vezivanje antigena.
Izazivanje apoptoze anti- IGF- IR antitelima
Drugi vid pronalaska obezbeđuje jedno anti-IGF-IR antitelo koje izaziva smrt ćelija. Kod jednog izvođenja, antitelo izaziva apoptozu. Antitelo može izazvati apoptozu bilo in vivo bilo in vitro. Opšte uzev, tumorske su ćelije više osetljive na apoptozu od normalnih ćelija, tako da davanje anti-IGF-IR antitela izaziva apoptozu jedne tumorske ćelije pre nego jedne normalne ćelije. Kod jednog drugog izvođenja, davanje jednog anti-IGF-IR antitela smanjuje nivoe jednog enzima,akt,koji je umešan u putanju fosfatidil inozitol (PI) kinaze. Putanja PI kinaze, sa svoje strane, umešana je u razmožavanje ćelija i na sprečavanje apoptoze. Na taj način, inhibiranje akt može izazvati apoptozu. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo se daje in vivo da izazove apoptozu jedne ćelije koja eksprimira IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, ili 6.1.1, ili sadrži teški lanac, laki lanac ili njihov deo za vezivanje antigena.
Postupci za proizvodnju antitela i ćelijs kih linij a koje proizvode antitela
Imunizacija
Kod jednog izvođenja ovog pronalaska, humana antitela proizvode se imunizacijom jedne ne-humane životinje koja ima deo ili celokupno imunoglobulinsko mesto sa jednim IGF-IR antigenom. Kod jednog poželjnog izvođenja, ne-humana životinja je jedan XENOMOUSE™, koji jedan projektovan mišji soj koji sadrži velike fragmente humanih imunoglobulinskih mesta a ne proizvodi mišja antitela. Videti, na primer, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) i američke patente 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 i 6,130,364. Videti, takođe, \VO 91/10741, objavljena 25. jula 1991, WO 94/02602, objavljena 3. februara 1994, WO 96/ 34096 i WO 96/33735, obe objavljene 31. oktobra 1996, WO 98/16654, objavljena 23. aprila 1998, WO 98/24893, objavljena 11. juna, WO 98/50433, objavljena 12. novembra 1988, WO 99/45031, objavljena 10. septembra 1999, WO 99/53049, objavljena 21. oktobra 1999, WO 00/09560, objavljena 24. februara 2000 i WO 00/037504, objavljena 29. juna 2000. XENOMOUSE™ proizvodi repertoar, slično kao kod odraslih ljudi, potpuno humanih antitela i generiše antigen-specifična humana molekulska antitela. Druga generacija XENOMOUSE™ sadrži otprilike 80% repertoara humanih antitela uvođenjem YAC fragmenata, veličine megabaza, konfiguracije embrionske linije, mesta humanih teških lanaca i kapa mesta lakihlanaca. Videti Mendez et al.,Nature Genetics15: 146- 156 (1997); Green and JakobovitsJ. Exp. Med.
188:483-495 (1998), čiji je sadržaj ovde uključen kao literatura.
Pronalazak isto tako obezbeđuje postupak za izradu anti-IGF-IR antitela od ne-humanih i ne-mišijih životinja imunizacijom ne-humanih transgenih životinja koje sadrže humana imunoglobulinska mesta. Ove se životinje mogu proizvesti koristeći neposredno napred opisane postupke. Postupci opisani u pomenutim patentima mogu se modi likovati kako je to opisano u američkom patentu 5,994,619. Kod jednog preporučljivog izvođenja, ne-ljudske životinje mogu biti pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji.
Kod jednog drugog izviđenja, ne-humana životinja koja sadrži mesta humanih imunoglobulinskih gena jeste životinja koja ima jedno "mini mesto" humanih imunoglobulina. Kod pristupa sa mini mestom, jedno spoljne Tg mesto imitira se uključivanjem pojedinačnih gena iz Ig mesta. Na taj sc način oblikuju jedan ili više VHgena, jedan ili više Dhgena, jedan ili više JHgena, jedan u konstantni region i jedan dragi konstantni region (poželjno jedan gamakonstantni region) ujedan sastav za unošenje u jednu životinju. Takav pristup opisan je, između ostalih, i u američkim patentima br. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 i 5,643,763, ovde uključenim kao literatura.
Jedna je prednost pristupa sa mini mestom brzina sa kojom se sastav koji sadrži Ig mesto može generisati i uneti u životinje. Međutim, mogući je nedostatak pristupa sa mini mestom da se može desiti da ne bude dovoljne razlike imunoglibulina koja bi podržala pun razvoj B-ćelija, tako da može doći do manje proizvodnje antitela.
Da bi se proizvelo humano anti-IGF-IR antitelo, jedna ne-humana životinja koja sadrži neka ili sva mesta humanog imunoglobulina imunizuje se jednim IGF-IR antigenom pa se antitelo ili ćelija koja proizvodi antitelo izdvoji iz životinje. IGF-IR antigen može biti jedan izdvojen i/ili prečišćen IGF-IR a poželjno je jedan humani IGF-IR. Kod jednog drugog izvođenja, IGF-IR antigen je jedan fragment IGF-IR, poželjno vanćelijski domen IGF-IR. Kod jednog drugog izvođenja, IGF-IR antigen je jedan fragment koji obuhvata jednu epitopu IGF-IR. Kod jednog drugog izvođenja, IGF-IR antigen je jedna ćelija koja eksprimira IGF-IR na njegovoj površini ćelije, poželjno ćelija koja prekomerno eksprimira IGF-IR na njegovoj površini ćelije.
Imunizacija životinja može se izvršiti bilo kojim poznatim postupkom. Videti, na primer, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Postupci imunizacije ne-humanih životinja kao što su miševi, pacovi, ovce, koze, svinje, goveda i konji, poznati su u struci. Videti, na primer, Harlovv i Lane i američki patent 5.994,619. Kod jednog preporučljivog izvođenja, IGF-IR antigen se daje sa nekim adjuvansom da bi se stimulisano imunsko reagovanje. Takvi adjuvansi sadrže kompletan ili nekompletan Freund-ov adjuvans (muramil dipeptidi) ili ISCOM (imunostimulacioni komple-ksi). Takvi adjuvansi mogu zaštiti polipeptide od naglog rasprostiranja izdvajanjem u neki lokalni spremnik ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina da luči faktore koji su hemotaktički za makrofage i druge komponente imunskog sistema. Poželjno će, ako se polipeptidi daju kao lek, program imunizacije obuhvatiti dva ili više davanja polipeptida, raspoređenih tokom nekoliko nedelja.
Primer I daje protokol za imunizaciju jednog XENOMOUSE ™ miša humanim IGF-IR pune dužine u fosfatazom pufiranom slanom rastvoru.
Proizvodnja antitela i ćelijskih linija koje proizvode antitela
Posle imunizovanja neke životinje sa jednim IGF-IR antigenom, mogu se od životinje dobiti antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela. Serum koji sadrži jedno anti-IGF-IR antitelo dobija se od životinje krvarenjem ili ubijanjem životinje. Serum se može koristiti onakav kako je dobijen od životinje, iz seruma se može dobiti imunoglobulinska frakcija, ili se mogu anti-IGF-IR antitela dobiti prečišćavanjem iz seruma. Serum ili imunoglobulini dobijeni na ovaj način poliklonski su, što je nedostatak pošto je količina antitela koja se mogu dobiti ograni-čena a poliklonalno antitelo ima heterogen skup svojstava.
Kod jednog drugog izvođenja, obesmrćeni hibridomi koji proizvode antitela mogu se pripremati od imunizovanih životinja. Posle imunizovanja, životinja se usmrti i B ćelije slezine fuzionišu se na obesmrćene čelije mijeloma, što je poznato u struci. Videti, na primer, Harlow and Lane,napred.Kod jednog poželjnog izvođenja, ćelije mijeloma ne luče imunoglobulinske polipeptide (linija ćelija koje ne luče). Posle fuzije i antibiotičke selekcije hibridomi se pretražuju koristeći IGF-IR, neki njegov deo, ili neku ćeliju koja eksprimira IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, početno pretraživanje se vrši koristeći jedno imunsko ispitivanje povezano sa enzimima (ELISA) ili radioimunsko ispitivanje (RIA), poželjno ELISA. Primer pretraživanja sa ELISA nalazi se u WO 00/37504, koji je ovde uključen kao literatura.
Kod jednog drugog izvođenja, ćelije koje proizode antitelo mogu se pripremiti od jednog čoveka koji ima neki autoimunski poremećaj i koji eksprimira anti-IGF-IR antitela. Ćelije koje eksprimiraju anti-IGF-IR antitela mogu se izdvojiti izdvajanjem belih krvnih zrnaca i potom njihovim izlaganjem fluorescencijom aktivisanom sortiranju ćelija (FACS) ili ispiranjem na pločama obloženim sa TGF-IR ili nekim njegovim delom. Te ćelije mogu biti fuzionisane sa humanim mijelomima koji ne luče da bi se proizveli humani hibridomi koji eksprimiraju humana anti-IGF-IR antitela. Opšte uzev, to je jedno manje poželjno izvođenje, pošto je verovatno da će anti-IGF-IR antitela imati slab afinitet za IGF-IR.
Hibridomi koji proizvode anti-IGF-IR antitelo biraju se, kloniraju i dalje pretražuju na poželjne karakteristike, uključujući rast robustnih hibridoma, veliku proizvodnju antitela i poželjne karakteristike antitela, što će biti rasmotreno kasnije. Hibridomi se mogu gajiti i razmnožavatiin vivou singeneičnim životinjama, u životinjama koje nemaju imunski sistem, na primer golim miševima, ili u ćelijskim kulturamain vitro.Postupci za selekciju, kloniranje i razmnožavanje hibridoma poznati su prosečnim stručnjacima.
Poželjno je daje imunizovana životinja jedna ne-humana životinja koja eksprimira humane imunoglobulinske gene a B ćelije slezine su fuzionisane na jedan mijelom izveden od iste vrste kao i ne-humana životinja. Poželjnije je da je imunizovana životinja jedan XENOMOUSE™ miš, a linija ćelija mijeloma je jedan mišji mijelom koji se ne luči, kao što je NSO-bcl2 linija ćelija mijeloma. Videti, npr., Primer I.
U jednom svom vidu, pronalazak obezbeđuje hibridome koji su proizvedeni da bi proizvodili humana anti-IGF-IR antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja, hibridomi su mišji hibridomi, kako je napred opisano. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, hibridomi su proizvedeni u jednoj ne-humanoj, ne-mišjoj vrsti kao što su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. Kod jednog drugog izvođenja, hibridomi su humani hibridomi u kojima se humani mijelom koji se ne luči fuzioniše sa jednom humanom ćelijom koja eksprimira jedno anti-IGF-IR antitelo.
Nukleinske kiseline, vektori, ćelije domaćini i
rekombinantni postupci za izradu antitela
Nukleinske kiseline
Obezbeđene su nukleinske kiseline koje kodiraju anti-IGF-IR antitela prema pronalasku. Kod jednog izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira jedan teški i/ili laki lanac jednog anti-IGF-IR imunoglobulina. Kod jednog poželjnog izvođenja, jedan jedini molekul nukleinske kiseline kodira jedan teški lanac jednog anti-IGF-IR imunoglobulina, dok jedan drugi molekul nukleinske kiseline kodira jedan laki lanac jednog anti-IGF-IR imunoglobulina. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, kodiranje imunoglobulin jedan humani imunoglobulin, najbolje jedan humani IgG. Kodiran laki lanac može biti jedan X. lanac ili jedanklanac, poželjno jedanklanac.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanca može se izvesti od A30, A27 ili 012 Vkgena. Kod jednog poželjnog izvođenja, laki lanac je izveden od A30 Vkgena. Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac obuhvata region srastanja izvedeno od JkI, Jk2 ili Jk4. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac sadrži ne više od deset promena amino kiselina iz embrionskog A30 Vkgena, poželjno ne više od šest promena amino kiselina, a najbolje ne više od tri promena amino kiselina.
Pronalazak obezbeđuje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanac (VL) koji sadrži najmanje tri aminokiselinske promene u poređenju sa sekvencom embrionske linije, pri čemu su aminokiselinske promene identične aminokiselinskim promenama iz embrionske sekvence iz VL jednog od antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Pronalazak takođe obezbeđuje jedan molekul nukleinske kiseline koji sadrži jednu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1.Pronalazak takođe obezbeđuje jedan molekul nukleinskih kiselina koji sadrži jednu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira aminosikelinsku sekvencu jednog ili više CDRs bilo kog od lakih lanaca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.23 ili 6.1.1. Kod jednog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu za sve CDRs bilo kog od lakih lanaca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.23 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22 ili sadrži sekvencu nukleinske kiseline jedne od SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu jednog ili više CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22 ili sadrži sekvencu nukleinske kiseline jednog ili više CDRs bilo od koje od SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu aminokiselinsku sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu svih CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22 ili sadrži sekvencu nukleinske kiseline svih CDRs bilo od koje od SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21.
Pronalazak takođe obezbeđuje jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira jednu aminokiselinsku sekvencu jednog VL koji ima jednu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% jednaka ranije opisanom VL, naročito VL koji ima jednu aminokiselinsku sekvencu jedne od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22. Pronalazak takođe obezbeđuje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% jednaka sekvenci nukleinske kiseline jedne od SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21. Kod jednog drugog izvođenja, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan VL koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima na jedan molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan VL kako je napred opisano, naročito jedan molekul nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu sekvencu amino kiseline od SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22. Pronalazak takođe obezbeđuje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VL koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima na molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline jedne od SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 ili 21.
Pronalazak takođe obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni domen teškog lanca (VH) izvedeno od DP-35, DP-47, DP-71 ili VIV-4.4.35 VH gena, poželjno DP-35 VH gena. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira VH obuhvata region spajanja izvedeno od JH6 ili JH5, poželjnije od JH6. Kod jednog preporučljivog izvođenja, D segment je izveden od 3-3, 6-19 ili 4-17. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira VH sadrži ne više od deset promena amino kiselina embrionskog gena D-47, poželjno ne više od šest promena amino kiseline, a još bolje ne više od tri promene amino kiselina. Kod jednog veoma poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira VH sadrži najmanje jednu promenu amino kiselina u poređenju sa embrionskom sekvencom, pri čemu je promena amino kiseline jednaka promeni amino kiseline iz embrionske sekvence teškog lanca jednog od antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog još više poželjnog izvođenja. VH sadrži najmanje tri promene amino kiselina, poređeno sa embrionskim sekvencama, pri čemu su promene jednake tim promenama embrionske sekvence od VH jednog od antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1.
Kod jednog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleidne kiseline koja kodira sekvence amino kiselina za VH od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline obuhvata jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu amino kiseline jednog ili više CDRs teškog lanca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira amino sekvence svih CDRs teškog lanca od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvence amino kiselina jedne od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24 ili koja sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline jedne od SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu amino kiseline jednog ili više od CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24 ili koja sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline jednog ili više od CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23. Kod jednog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvence amino kiselina svih CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24 ili koja sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline svih CDRs bilo koje od SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23.
Kod jednog drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira jednu sekvencu amino kiselina jednog VH koja je bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% jednaka jednoj od sekveci amino kiseline koja kodira jedan VH kako je opisano neposredno napred, naročito jedan VH koji ima jednu sekvencu amino kiselina jedne od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24. Pronalazak takođe obezbeđuje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% jednaka jednoj sekvenci nukleinske kiseline jedne od SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23. Kod jednog drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan VH jeste jedan koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima na jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jedan VH kako je napred opisano, naročito jedan VH koji obuhvata jednu sekvencu amino kiseline jedne od SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24. Pronalazak takođe obezbeđuje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jedan VH koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima na jedan molekul nukleinske kiseline koji sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline jedne od SEQ TD NOS: 3, 7, 11, 15, 19 ili 23.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira svaki ili oba potpunalanca, teški i laki, jednog anti-IGF-IR antitela ili njegove varijabilne regione, može se dobaviti iz bilo kog od izvora koji proizvodi anti-IGF-IR antitelo. Postupci za izdvajanje mRNK koja kodira jedno antitelo poznati su u struci. Videti, na primer, Sambrook et al. mRNK može se koristiti da se proizvede cDNK za primenu u polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) ili kod cDNK kloniranja gena antitela. Kod jednog izvođenja pronalaska, molekuli nukleinske kiseline mogu se dobiti od jednog hibridoma koji eksprimira jedno anti-IGF-IR antitelo, kako je napred opisano, poželjno jedan hibridom koji ima kao jednog fuzionog partnera ćeliju jedne transgene životinje koja eksprimira humane imunoglobulinske gene, kao što je jedan XENOMOUSE™ miš, ne-humana transgena životinja - miš, ili jedna ne-humana, ne-mišja transgena životinja. Kod jednog drugog izvođenja, hibridom je izveden od jedne ne-humane, ne-transgene životinje a može se koristiti, na primer za humanizovana antitela.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira ceo teški lanac jednog anti-IGF-IR antitela može se načiniti fuzionisanjem jednog molekula nukleinske kiseline koji kodira varijabilni domen teškog lanca ili njegov deo za vezivanje antigena sa konstantnim domenom teškoglanca. Slično tome, molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac jednog anti-IGF-IR antitela može se načiniti fuzionisanjem jednog molekula nukleinske kiseline koji kodira verijabilni domen lakog lanca ili njegov deo za vezivanje antigena sa konstantnim domenom lakog lanca. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH i VL lance mogu se prevesti u gene antitela pune dužine njihovim umetanjem u vektore ekspresije koji već kodiraju konstantne regione teških lanaca i konstantne regione lakihlanaca, tako da je VH segment operativno vezan za konstantan region (CH) segmen(a)ta teškog lanca unutar vektora, dok je VL segment operativno vezan za konstantan region (CL) segmenta lakog lanca unutar vektora. Alternativno, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH ili VL lance prevode se u gene pune dužine antitela vezivanjem, npr., spajanjem molekula nukleinske kiseline koji kodira jedan VH lanac sa jednim molekulom nukleinske kiseline koji kodira jedan CH lanac koristeći standarne tehnike nuklearne biologije. Isto se može postići koristeći molekule nukleinske kiseline koji kodiraju VL i CL lance. U struci su poznate sekvence humanih gena konstantnih regiona teških i lakih lanaca. Videti Kabat et al.,Secjuences of Proteins of Immunological Interests,5th Ed., Publ. No. 91-3242, 1991. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju teške i/ili lake lance pune dužine mogu se tada eksprimirati iz ćelije u koju su uneti a anti-IGF-IR antitelo može se izdvojiti.
Kod jednog poželjnog izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region teškog lanca kodira sekvencu amino kiselina iz SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20 ili 24, a molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanca kodira sekvencu amino kiselina iz SEQ JD NOS: 2, 6, 10, 14, 18 ili 22. SEQ ID NO: 28 prikazuje sekvencu amino kiselina, a SEQ ID NO: 27 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline, koje kodiraju konstantan region teškog lanca anti-IGF-IR antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. SEQ ID NO: 26 prikazuje sekvencu amino kiselina, a SEQ ID NO: 25 prikazuje sekvencu nukleinske kiseline, koje kodiraju konstantan region lakog lanca anti-IGF-IR antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Na taj način, kod jednog poželjnog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira konstantan domen teškog lanca kodira SEQ ID NO: 28, a molekul nukleinske kiseline koji kodira konstantan domen lakog lanca kodira SEQ ID NO: 26. Kod jednog poželjnijeg izviđenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira konstantan domen teškog lanca ima sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 27, dok molekul nukleinske kiseline koji kodira konstantan domen ima sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 25.
Kod jednog drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji kodira bilo teški lanac anti-IGF-IR antitela ili njegov deo za vezivanje antigena, bilo laki lanac jednog anti-IGF-IR antitela ili njegov deo za vezivanje antigena, može se izdvojiti iz jedne ne-humane, ne-mišje životinje koja eksprimira humane imunoglobulinske gene a imunizovana je jednim IGF-IR antigenom. Kod drugog izvođenja, molekul nukleinske kiseline može se izdvojiti iz jedne ćelije koja proizvodi anti-IGF-IR antitelo, izvedene iz jedne ne-transgene životinje ili iz jednog humanog pacijenta koji proizvodi anti-IGF-IR antitela. Postupci izdvajanja mRNK iz ćelija koje proizvode anti-IGF-IR antitelo, obuhvataju izdvajanje standardnim tehnikama, kloniranje i/ili pojačavanje koristeći PCR i tehnike konstruisanja biblioteka, i probiranje koristeći standardne protokole za dobijanje molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance anti-IGF-IR antitela.
Molekuli nukleinske kiseline mogu se koristiti da rekombinantno izraze velike količine anti-IGF-IR antitela, kako je niže opisano. Molekuli nukleinske kiseline mogu se takođe koristiti da proizvedu himerna antitela, ///jednolančana /// antitela, imunoadhezine, dvojna antitela, mutirana antitela i derivate antitela, što će biti kasnije opisano. Ako su molekuli nukleinske kiseline izvedeni iz jedne ne-humane, ne-transgene životinje, molekuli nukleinske kiseline mogu se koristiti za humaniziranje antitela, što će kasnije biti opisano.
Kod jednog drugog izvođenja, molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti kao sonde ili PCS prajmeri za specifične sekvence antitela. Tako, na primer, jedna sonda od molekula nukleinske kiseline može se koristiti u dijagnostičkim postupcima, ili jedan PCR primer od molekula nukleinske kiseline može se uzeti da pojača regione DNK koji se mogu koristiti, između ostalog, za izdvajanje sekvenci nukleinske kiseline koje se koriste kod proizvodnje varijabilnih domena anti-IGF-IR antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja, molekuli nukleinske kiseline su oligonukleotidi. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, oligonukleotidi su iz veoma varijabilnih regiona teških i lakih lanaca antitela od interesa. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, oligonukleotidi kodiraju sve ili deo jednog ili više CDRs.
Vektori
Pronalazak daje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline prema pronalasku koji kodiraju teški lanac ili njegov deo za vezivanje antigena. Pronalazak takođe daje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline ovog pronalaska koji kodiraju laki lanac i ili njegov deo za vezivanje antigena. Pronalazak takođe daje vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju fuzionisanje proteina, modifikovana antitela, fragmente antitela i njihove sonde.
Da bi se izrazila antitela, ili delovi antitela prema ovom pronalasku, DNK koje kodiraju parcijalne ili punodužinske lake i teškelance, dobijene kako je napred opisano, umeću se u vektore ekspresije tako da su geni operativno povezani sa sekvencama za kontrolu transkripcije i translacije. Vektori ekspresije obuhvataju plazmide, retroviruse, kozmide, YAC-ove, EBV izvedene epizome, i slično. Gen antitela vezan je u jedan vektor tako da sekvence za kontrolu transkripcije i translacije unutar vektora vrše svoju namenjenu funkciju regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Vektor ekspresije i sekvence za kontrolu ekspresije biraju se tako da budu kompatibilne sa primenjenom ćelijom domaćinom za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se uneti u odvojene vektora. Kod jednog preporučljivog izvođenja, oba su gena umetnuta u isti vektor ekspresije. Geni antitela umetnuti su u vektor ekspresije standardnim pistupcima (na primer spajanjem komplementarnih mesta ograničavanja na fragmentu gena antitela i na vektoru, ili vezivanjem na oslabljenom kraju ako nema mesta ograničavanja).
Pogodan je vektor koji kodira jednu kompletnu čovečiju CH ili Cl imunoglobulinsku sekvencu, sa odgovarajućim mestima ograničavanja projektovanim tako da se bilo koja VH ili VL sekvenca može lako umetnuti ieksprimirati, kako je napred opisano. Kod ovakvih vektora se povezivanje obično odvija između mesta davaoca veze u umetnutom J regionu i mesta primaoca veze ispred humanog C regiona, a takođe na mestims vezivanja koja se javljaju unutar humanih CH egzona. Poliadenilacija i završetak transkripcije odvijaju se na prirodnim hromozomalnim mestima iza regiona kodiranja. Rekombinantni vektor ekspresije takođe može kodirati jedan signalni peptid koji podstiče lučenje lanca antitela iz neke ćelije domaćina. Gen niza antitela može se klonirati u vektoru tako da je signalni peptid vezan u okviru na amino završetak niza antitela. Signalni peptid može biti neki imunoglobulinski signalni peptid ili neki heterologni signalni peptid (tj, signalni peptid iz nekog neimunoglobulinskog proteina).
Pored gena lanca antitela, rekombinantni vektori ekspresije prema pronalasku nose regulacione sekvence koje kontrolišu eksprimiranje gena lanca antitela u nekoj ćeliji domaćinu. Stručnjaci će shvatiti da projektovanje vektora ekspresije, uključujući izbor regulacionih sekvenci može zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja treba da se transformiše, željeni nivo ekspresije proteina, itd. Poželjno je da regulacione sekvence za ekspresije sisarske ćelije domaćina obuhvataju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promoteri i/ili pojačavači izvedeni iz retrovirusnog LTRs, citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promoter/ pojačavač), majmunski virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter/pojačavač), adenovirus
(napr., adenovirusni veći kasniji promoter - adenovirus major late promoter - AdMLP), poliom i jaki sisarski promoteri kao što su prirodni imunoglobulinski i aktinski promoteri. Za dalje opise virusnih regulacionih elemenata, kao i njihovih sekvenci, videti, na primer, američke patente br. 5,168,062, Stinski, br.4,510,245, Bell et al., i br. 4,968,615, Schaffner et al.
Pored gena lanca antitela i regulacionih sekvenci, rekombinantni vektori ekspresije prema pronalasku mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu razmnožavanje vektora u ćelijama domaćinima (na primer začeci razmnožavanja) i birljivi markerski geni. Birljivi markerski geni olakšavaju izbor ćelija domaćina u koje će se vektor uneti (videti američke patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel-a et al.). Tako je, na primer, tipično da birljivi markerski gen prenese otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliju domaćina u koju je vektor unet. Preporučljivi markerski geni obuhvataju gen dihidrofolatne reduktaze (DHFR) (za primenu u dhfr-ćelijama domaćinima sa metotreksatnom selekcijom/ pojačavanjem) i neo gen (za selekciju G418).
Nehibridomske ćelije domaćini i postupci
za rekombinantnu proizvodnju proteina
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju težak lanac ili jedan njegov deo za vezivanje antigena i/ili laki lanac ili jedan njegov za vezivanje antigena jednog anti-IGF-IR antitela, i vektori koji sadrže te molekule nukleinske kiseline, mogu se koristiti za transformaciju jedne pogodne sisarske ćelije domaćina. Transformacija se može izvesti bilo kojim poznatim postupkom za unošenje polinukleotida u neku ćeliju domaćina. Postupci za unošenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara poznati su stručnjacima i obuhvataju dekstranom posredovanu transfekciju, taloženje kalcijumfosfata, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, hermetičko zatvaranje polinukleotida u lipozome, biolističko ubrizgavanje i neposredo mikroubrizgavanje DNK u jedro. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu se unositi u ćelije sisara virusnim vektorima. Postupci transformisanja poznati su u struci. Videti, na primer, američke patente br. 4,399,216. 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455 (koji su patenti ovde uneti kao literatura).
Ćelije sisara raspoložive kao domaćini za ekspresiju, poznate su u struci i obuhvataju brojne obesmrćene linije ćelija koje se mogu pribaviti iz Američkog zavoda za deponovanje uzoraka ćelija (American Type Culture Collection - ATCC). One obuhvataju, između ostalih, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, FleLa ćelije, ćelije bubrega mladunčeta
(BHK) hrčka, ćelije bubrega majmuna (COS), humane hepatocelularne ćelije raka (npr., Hep G2), A549 ćelije, 3T3 ćelije i veći broj drugih ćelijskih linija. Ćelije domaćini sisara obuhvataju ćelije ljudi, miševa, pacova, pasa, majmuna, svinje, koze, goveda, konja i hrčka. Posebno pogodne ćelijske linije biraju se utvrđivanjem koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije. Druge ćelijske linije koje se mogu koristiti jesu ćelijske linije insekata, kao što su Sf9 ćelije, ćelije vodozemaca, bakterijske ćelije, ćelije biljaka i ćelije gljivica. Kada se rekombinantni vektori ekspresije, koji kodiraju težak lanac ili jedan njegov deo za vezivanje antigena i/ili laki lanac ili jedan njegov za vezivanje antigena unesu u ćeliju domaćina sisara, proizvode se antitela gajenjem ćelija domaćina u vremenskom trajanju dovoljnom da se omogući eksprimiranje antitela ili, što je poželjnije, da se omogući izlučivanje antitela u međijum za razvoj kultura u kome se gaje ćelije domaćini. Antitela se mogu izdvojiti iz medijuma za kulture koristeći standardne postupke za prečišćavanje proteina.
Dalje se može ekspresija antitela prema pronalasku (ili drugih grupa) iz linije proizvedenih ćelija podstaći korišćenjem niza poznatih tehnika. Tako je, na primer, sistem ekspresije gena glutaminske sintetaze (GS sistem) jedan uobičajen pristup za podsticanje ekspresije pod izvesnim uslovima. GS sistem se rasmatra u celini ili delom u vezi sa evropskim patentima br. 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 i evropskom patentnom prijavom br. 89303964.4.
Verovatno je da će antitela eksprimirana različitim linijama ćelija ili u transgenim životinjama imati međusobno različite glikosilacije. Međutim, sva antitela ovde datim molekulima nukleinskih kiselina, ili koja obuhvataju ovde date sekvence amino kiselina predstavljaju deo ovog pronalaska, bez obzira na glikosilaciju antitela.
Transgene životinje
Pronalazak takođe obezbeđuje transgene ne-humane životinje koje sadrže jedan ili više molekula nukleinskih kiselina prema pronalasku koje se mogu koristiti da proizvedu antitela prema pronalasku. Antitela se mogu proizvesti u tkivima ili u telesnim sokovima kao što su mleko, krv ili urin, koza, krava, konja, svinja, pacova, miševa, kunića, hrčaka ili drugih sisara, i iz njih izdvojiti. Videti, na primer, američke patente br. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 i 5,741,957. Kao što je napred opisano, ne-humane transgene životinje koje obuhvataju mesta humanog imunoglobulina mogu se proizvesti imunizovanjem sa IGF-IR ili nekim njegovim delom.
Kod jednog drugog izvođenja, ne-humane transgene životinje proizvode se unošenjem jednog ili više molekula nukleinskih kiselina prema pronalasku u životinju standardnom transgenskom tehnikom. Videti Hogan, napred. Transgenske ćelije koje se koriste za dobijanje transgenih životinja mogu biti embrionske osnovne ćelije ili somatske ćelije. Transgeni ne-humani organizmi mogu biti himemi, nehimerni heterozigoti, i nehimcmi homozigoti. Videti, na primer, Hogan et al., Mampulating the Mouse Embrvo: A Laboratorv Manual, 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mose Genetics and Trans genetics: A Practical Approach, Oxford Universitv Press (2000); and Pinkert, Transgenic Animal Technologv: A Laboratorv Handbook, Academic Press (1999). Kod jednog drugog izvođenja, transgeni ne-humani organizam može imati jedno usmereno raskidanje i zamenu koja kodira jedan teški lanac i/ili jedan laki lanac od interesa. Kod jednog preporučljivog izvođenja, transgene životinje obuhvataju i eksprimiraju molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju teške i lake lance koji se specifično vezuju za IGF-IR. poželjno za humani IGF-IR. Kod jednog drugog izvođenja, transgene životinje sadrže molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju jedno modifikovano antitelo kao što je neko jednolančano antitelo, himerno antitelo ili jedno humanizirano antitelo. Anti-IGF-IR antitela mogu se načiniti u bilo kojoj transgenoj životinji. Kod jednog preporučljivog izvođenja, ne-humane životinje su miševi, pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. Ne-humana transgena životinja eksprimira pomenute kodirane polipeptide u krvi, mleku, urinu, pljuvački, suzama, sluzi i drugim telesnim fluidima.
Biblioteke za prikazivanje fagova
Pronalazak obezbeđuje postupak za obrazovanje jednog anti-IGF-IR protivtela ili njegovog dela za vezivanje antigena, koji postupak sadrži korake sintetizovanja jedne biblioteke humanih antitela na fagu, pretraživanja biblioteke jednim IGF-IR-om ili jednim njegovim delom, izolovanja faga koji vezuje IGF-IR, i dobijanja antitela sa faga. Jedan postupak za pripremanje biblioteke antitela obuhvata korake imunizovanja jedne ne-humane životinje domaćina koja sadrži jedno humano imunoglobulinsko mesto, sa IGF-IR ili sa njegovim antigenskim delom da bi se ostvarilo imunsko reagovanje, ekstrahovanje ćelija iz životinje domaćina, koje su ćelije odgovorne za proizvodnju antitela; izdvajanja RNK iz ekstrahovanih ćelija, reveznog transkribovanja RNK da bi se dobila cDNK, pojačavanja cDNK korišćenjem jednog prajmera, i umetanja cDNK u vektor prikazivanja faga tako da su antitela eksprimirana na fagu. Rekombinantna anti-IGF-IR antitela prema pronalasku mogu se
dobiti na ovaj način.
Rekombinantna anti-IGF-IR antitela prema pronalasku mogu se, pored ovde opisanih anti-IGF-IR antitela, izdvojiti pretraživanjem jedne rekombinantne kombinatorne biblioteke antitela, poželjno jedne biblioteke za prikazivanje scFv fagova, pripremljene korišćenjem humanih VL i VH cDNK pripremljenih od mRNK izvedene iz humanih limfocita. Metodologije za pripremanje i pretraživanje takvih biblioteka poznate su u struci. Postoje komercijalno dostupni kompleti za generisanje biblioteka za prikazivanje fagova (na primer, Pharmacia Recombinant Phage Antibodv Svstem, kataloški br. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAP™ komplet za prikazivanje fagova, kataloški br. 240612). Postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti za generisanje i pretraživanje biblioteka za prikazivanje antitela (videti, na primer. Ladner et al., U.S. Pat. No. 5,223,409; Kang et al., PCT Publication No. WO 92/18619; Dovver et al., PCT Publication No. WO 91/17271; Winter et al., PCT Publication No. WO 92/20791; Markland et al., PCT Publication No. WO 92/15679; Breitling et al., PCT Publicatiom No. WO 93/01288; McCafferty et al., PCT Publication No. WO 92/01047; Garrard et al., PCT Publication No. WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bi/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hvbridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al., (1993) EMBOJ 12:725-734; Havvkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.
Kod jednog preporučljivog izvođenja, da bi se izdvojila humana anti-IGF-IR antitela željenih karakteristika, humano anti-IGF-IR antitelo, kako je ovde opisano, prvo je korišćeno da bi se izabrale humane sekvence teškog i lakog lanca koje imaju sličnu aktivnost vezivanja prema IGF-IR, koristeći postupke utiskivanja cpitopa opisane u Hoogenboom et al., PCT Publication No. WO 93/ 06213. Biblioteke antitela koje se koriste u ovom postupku poželjno su scFv biblioteke pripremljene i pretražene kako su opisali McCaffertv et al., PCT Publication No. WO 92/01047; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al.,
(1993) EMBOJ 12:725-734. Ove scFv biblioteke antitela poželjno se pretražuju koristeći humani IGF-IR kao antigen.
Kada se izaberu početni humani VL i VH segmenti, vrše se eksperimenti tipa "pomešaj i uporedi", u kojima se različiti parovi početno izabranih VL i VH segmenata pretražuju na IGF-IR vezivanje, da bi se izabrale preporučljive kombinacije VL/VH parova. Pored toga, da bi se još više poboljšao kvalitet antitela, VL i VH segmenti preporučljiog VL/VH para (ili parova) mogu se proizvoljno mutirati, poželjno unutar CDR3 regiona VH i/ili VL, u procesu analognom in vivo procesu somatske mutacije odgovornom za afinitetno sazrevanje antitela tokom prirodnog imunskog reagovanja. To in vitro afinitetno sazrevanje može se ostvariiti pojačavanjem VH i VL regiona korišćenjem PCR prajmera komplementarnih sa VH CDR3, odnosno VL CDR3, koji su prajmeri bili "obeleženi" jednom proizvoljnom mešavinom četiri nukleotidne baze na određenim mestima tako da dobijeni PCR proizvodi kodiraju VH i VL segmente u koje su proizvoljne mutacije uvedene u VH i/ili VL CDR3 regiona. Ti proizvoljno mutirani VH i VL segmenti mogu se ponovo pretražiti za vezivanje na IGF-IR.
Posle pretraživanja i izdvajanja jednog anti-IGF-IR antitela prema pronalasku iz jedne biblioteke za prikazivanje imunoglobulina, nukleinska kiselina koja kodira izabrano antitelo može se dobiti iz paketa za prikazivanje (na primer iz fagnog genoma) i potklonirati u drugi vektor ekspresije standardnom tehnikom rekombinantne DNA. Ako se želi, nukleinska se kiselina može dalje obrađivati da bi obrazovala druge oblike antitela prema pronalasku, što će biti opisano u nastavku. Da bi se izrazilo jedno humano antitelo izdvojeno pretraživanjem jedne kombinatorne biblioteke, DNK koja kodira antitelo klonira se ujedan rekombinantni vektor ekspresije i unosi u ćeliju domaćina sisara, kako je napred opisano.
Promena klase
Drugi vid ovog pronalaska jeste obezbeđivanje mehanizma kojim se klasa jednog anti-IGF-IR antitela može zameniti nekom drugom. Prema jednom vidu ovog pronalaska, jedan se molekul nukleinske kiseline koji kodira VL ili VH izdvaja koristeći postupke poznate u struci, tako da ne obuhvata bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CL ili CH. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VL ili VH tada se operativno povezuju sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CL ili CH od jedne različite klase imunoglobulinskih molekula. To se može ostvariti koristeći neki vektor ili molekul nukleinske kiseline koji obuhvata jedan CL ili CH lanac, kako je napred opisano. Tako, na primer, jedno anti-IGF-IR antitelo koje je prvobito bilo IgM može se prebaciti u jedan IgG. Dalje se promenom klase može konvertovati jedna IgG potklasa u drugu potklasu, na primer, od IgGl u IgG2. Preporučljiv postupak za dobijanje jednog antitela prema pronalasku koje sadrži jedan željeni izotip, obuhvata korake izdvajanja jedne nukleinske kiseline koja kodira teški lanac jednog anti-IGF-IR antitela i jedne nukleinske kiseline koja kodira laki lanac jednog anti-IGF-IR antitela, dobijanja varijabilnog domena teškoglanca, vezivanje varijabilnog domena teškog lanca sa konstantnim domenom teškog lanca željenog izotipa, eksprimiranje lakog lanca i vezanog teškog lanca u nekoj ćeliji, i sakupljanje anti-IGF-IR antitela sa željenim izotopom.
Derivati antitela
Mogu se koristiti napred opisani molekuli nukleinske kiseline za generisanje derivata antitela korišćenjem tehnika i postupaka poznatih prosečnom stručnjaku.
Humanizirana antitela
Kao što je ranije rasmatrano u vezi sa generisanjem humanih antitela, postoje prednosti kada se proizvode antitela smanjene imunogeničnosti. To se u izvesnoj meri može ostvariri koristeći tehnike humaniziranja i tehnike prikazivanja uz koriščenje odgovarajućih biblioteka. Podrazumeva se da se mišja antitela ili antitela drugih vrsta mogu humanizirati ili primatizovati koristeći tehnike poznate u struci. Videti, na primer, Winter and HarrisImmunol Today14:43-46 (1993) i Wright et al,Crit. Reviews in Immunol.12125-168 (1992). Antitela od interesa mogu se projektovati tehnikom rekombinantne DNK da bi se supstituisali CH1, CH2, CH3, spojni domeni i/ili okvirni domen sa odgovarajućom humanom sekvencom (videti WO 92/02190 i američke patente br. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, i 5,777,085). Kod jednog poželjnog izvođenja anti-IGF-IR antitelo može se ohumanizirati supstituisanjem CH1, CH2, CH3, spojnih domena i/ili okvirnog domena odgovarajućom humanom sekvencom uz održanje svih CDRS teškog lanca, lakog lanca ili i teškog i lakog lanca.
Mutantna antitela
Kod jednog drugog izvođenja, molekuli nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćini mogu se koristiti da se načine mutantna anti-IGF-IR antitela. Antitela se mogu podvrgnuti mutaciji u varijabilnim domenima teških i/ili lakih lanaca da bi se promenilo neko svojstvo vezivanja antitela. Tako, na primer, jedna se mutacija može izvesti u jednom ili više od CDR regiona da bi se povećalo ili smanjilo Kdantitela za IGF-IR, da se poveća ili smanji K0,f, ili da se promeni specifičnost vezivanja antitela. Tehnike lokalno usmerene mutageneze poznate su u struci. Videti napred, Sambrook et al. i Ausubel et al. Kod jednog poželjnog izvođenja mutacije su načinjene najednom radikalu jedne amino kiseline za koji se zna daje izmenjen u poređenju sa embrionskom linijom u jednom varijabilnom regionu jednog anti-IGF-IR antitela. Kod jednog preporučljivog izvođenja, jedna ili više mutacija se izvode na radikalu jedne amino kiseline za koji se zna da je izmenjen u poređenju sa embrionskom linijom u jednom varijabilnom regionu ili CDR regionu jednog od anti-IGF-IR antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja, jedna ili više mutacija izvode se na radikalu jedne amino kiseline za koju se zna da je promenjena u poređenju sa embrionskom linijom u jednom varijabilnom regionu ili CDR regionu čija je sekvenca amino kiselina prikazana u SEQ ID NOS: 2. 4, 6, 8, 10. 12, 14, 16. 18, 20. 22 ili 24, ili čija je sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21 ili 23. Kod jednog drugog izvođenja, molekuli nukleinske kiseline mutirani su u jednom ili više okvirnih regiona. Jedna mutacija može biti načinjena u okvirnom regionu ili u konstantnom domenu da se poveća poluživot anti-IGF-IR antitela. Videti, na primer, WO 00/09560, objavljenu 24. februara 2000, ovde uključenu kao literatura. Kod jednog izvođenja može postojati jedna, tri ili pet tačkastih mutacija, i ne više od deset tačkastih mutacija. Mutacija u okvirnom regionu ili konstantnom domenu može biti načinjena da se promeni imunogeničnost antitela, da se obezbedi mesto za kovalentno ili nekovalentno vezivanje za drugi molekul ili da se promene svojstva kao što je dodatno učvršćivanje. Mutacije se mogu vršiti u svakom od okvirnih regiona , konstantnog domena i varijabilnih regiona u jednom jedinom mutantnom antitelu. Aternativno, mutacije se mogu izvesti u samo jednom od okvirnih regiona, varijabilnih regiona ili konstantnog domena u jednom jedinom mutantnom antitelu.
Kod jednog izvođenja, nema više od deset izmena amino kiselineni u VH ni u VL regionu mutantnog anti-IGF-IR anti tela u poređenju sa anti-IGF-IR antitelom pre mutacije. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, nema više od od pet izmena amino kiselina bilo u VH bilo u VL regionu mutantnog anti-IHF-IR antitela, najbolje ne viđe od tri promene amino kiseline. Kod jednog drugog izvođenja, nema više od petnaest izmena amino kiseline u konstantnim domenima, poželjnije ne više od deset promena amino kiselina, najbolje ne više od pet promena amino kiseline.
Modifikovana antitela
Kod jednog izvođenja, može se načiniti jedno fuzionisano antitelo ili imunoadhezin koje sadrži celo anti-IGF-IR antitelo, ili jedan njegov deo, vezano za drugi polipeptid. Kod jednog su preporučljivog izvođenja samo promenljiva područja anti-IGF-IR antitela vezana za polipeptid. Kod jednog poželjnog izvođenja, VH domen anti-IGF-IR antitela je vezana za prvi polipeptid, dok je VL domen anti-IGF-IR antitela vezan za drugi polipeptid tako da VH i VL domeni mogu međusobno delovati tako da obrazuju jedno mesto za vezivanje antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja VH domen je razdvojen od VL domena jednim linkerom tako da VH i VL domeni mogu međusobno sadejstvovati (videti u nastavku pod Jednolačnana Antitela). VH-linker-VL antitela potom se vezuje na polipeptid od interesa. Fuzionisano antitelo pogodno je za usmeravanje jednog polipeptida na ćeliju ili tkivo koje eksprimira IGF-IR. Polipeptid može biti jedan terapeutski agens, kao što je neki toksin, faktor rasta ili drugi regulacioni protein, ili može biti neko dijagnostičko sredstvo, kao što je neki enzim koji se može lako vizualizovati, kao što je ren peroksidaza. Pored toga, mogu se obrazovati fuzionisana antitela u kojima su dva (ili više) antitela sa jednim jedinim lancem povezana jedno za drugo. To je pogodno ako neko želi da stvori jedno dvovalentno ili viševalentno telo na jednom jedinom polipeptidnom lancu, ili ako neko hoće da stvori jedno dvospecifično antitelo.
Da bi se obrazovalo jedno jednolančano antitelo, (scFv) DNK fragmenti koji kodiraju VH i VL radno su povezani sa drugim fragmentom koji kodira jedan savitljiv linker, na primer kodira jednu sekvencu amino kiseline (Gly4-Ser)3(SEQ ID NO: 60), tako da se VH i VL sekvence mogu izraziti kao jedan pripojen jednolančani protein, sa VL i VH regionima povezanim savitljivim linkerom (videti, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Fluston et al.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). Jednolančano antitelo može biti jednovalentno, ako se koriste samo po jedan VH i VL, dvovalentno ako se koriste po dva VH i VL, ili polivalentno ako se koriste više od dva VH i
VL.
Kod jednog drugog izvođenja, druga se modifikovana antitela mogu pripremati koristeći molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-IGF-IR. Tako se, na primer, mogu pripremati "Kappa Bodies" (Kapa tela) (111 et al., Protein Eng 10:949-57 (1997); "Minibodies"
(Minitela) (Martin et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994); "Diabodies" (Dvojna antitela) (Holliger et al, PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), ili "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) i Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J
Cancer Suppl 7:51-52 (1992)) koristeći standardne tehnike molekularne biologije prateći uputstva iz ove specifikacije.
Prema jednom drugom vidu pronalaska, mogu se generisati himerna i bispecifična antitela. Može biti načinjeno himerno antitelo koje sadrži CDRs i okvirni regioni od različitih antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja, CDRs himernog antitela obuhvata sve CDRs varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca jednog anti-IGF-IR antitela, dok su okvirni regioni izvedeni od jednog ili više različitih antitela. Kod jednog preporučljivog izvođenja. CDRs himernog antitela sadrže sve CDRs varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca jednog anti-IGF-IR antitela. Okvirni regioni mogu biti od drugih vrsta i mogu, kod jednog preporučljivog izvođenja, biti ohumanizirana. Alternativno, okvirni regioni mogu biti od nekog drugog humanog antitela.
Može se generisati jedno bispecifično antitelo koje se specifično veže na jedan IGF-IR preko jednog domena vezivanja i na jedan drugi molekul preko drugog domena vezivanja. Bispecifično antitelo može se proizvesti rekombinantnom tehnikom molekularne biologije, ili se može fizički sastaviti. Pored toga, može se generisati jednolančano antitelo koje sadrži više od jednog VH i VL, a koje se specifično vezuje za IGF-IR i za drugi molekul.Takva se dvospecifična antitela mogu generisati koristeći poznate tehnike, na primer, u vezi sa (i) i (ii) videti, npr., Fanger et al., Immuno Methods 4: 72-81 (1994) i VVright and Harris, videti napred, a u vezi sa (iii) videti, napr., Traunecker et al. Inter. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52
(1992). Kod jednog preporučljivog izvođenja, dvospecifično antitelo vezuje se za IGF-IR i na drugi molekul eksprimiran na visokom nivou na ćelijama raka ili tumora. Kod jednog preporučljivog izvođenja, drugi je molekul erbB2 receptor, VEGF, CD20 ili EGF-R.
Kod jednog izvođenja, napred opisana antitela pripremaju se koristeći jedno ili više varijabilnih regiona ili jedno ili više CDR regiona jednog od antitela biranih od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 ili 6.1.1. Kod jednog drugog izvođenja, modifikovana antitela pripremaju se koristeći jedno ili više varijabilnih regiona ili jedno ili više CDR regiona čija je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ili 24, ili čija je sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21 ili 23.
Derivatizovana i obeležena antitela
Jedno antitelo ili deo antitela prema pronalasku može se derivatizovati ili vezati na neki drugi molekul (npr., drugi peptid ili protein). U opštem slučaju, antitela ili njihovi delove derivatizuju se tako da vezivanje sa IGF-IR nije ugroženo derivatizovanjem ili obeležavanjem. Prema tome, predviđeno je da antitela i delovi antitela prema pronalasku obuhvataju i nedirnute i modifikovane oblike ovde opisanih humanih anti-IGF-ITR antitela. Tako, na primer, jedno antitelo ili deo antitela prema pronalasku može biti funkcionalno povezan (hemijskim spajanjem, genetskim fuzionisanjem, nekovalentnim povezivanjem ili drugačije) sa jednom ili više molekulskih celina. kao što je neko drugo antitelo (npr., jedno dvospecifično antitelo ili neko dvostruko antitelo), neko sredstvo za detektovanje, neki citotoksični agens, neko farmaceutsko sredstvo, i/ili neki protein ili peptide koji može posredovati kod povezivana antitela ili dela antitela sa nekim drugim molekulom (kao što je region jezgra streptavidina ili neko polihistidinsko obeležje).
Jedna vrsta derivatizovanih antitela dobija se ukrštanjem dva ili više antitela (iste vrste ili različitih vrsti, npr., da se kreiraju dvospecifična antitela). Pogodna sredstva za ukršteno povezivanje obuhvataju ona koja su heterobifunkcionalna, koja imaju dve izrazito reaktivne grupe razdvojene jednim odgovarajućim odstojnikom (na primer estar m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimida) ili homobifunkcionalna (na primer disukcinimidil suberat). Takvi se linkeri mogu pribaviti od Pierce Chemical Companv, Rockford, 111., SAD.
Jedna druga vrsta derivatizovanog antitela jeste obeleženo antitelo. Pogodna sredstva za detektovanje kojima se neko antitelo ili deo antitela prema pronalasku može derivatizovati obuhvataju fluorescentna jedinjenja, kao što su fluorescein, florescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-l-naftalinsulfonil hlorid, fikoeritrin, lantanidne fosfore i slično. Jedno se antitelo isto tako može obeležiti enzimima koji su upotrebljivi za detektovanje, kao stoje hren peroksidaza, J3-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, glukozna oksidaza i slično. Kada se jedno antitelo obeleži nekim enzimom koji se može detektovati, on se može detektovati dodavanjem dodatnih reagensa koje enzim koristi da proizvede jedan proizvod reakcije koji se može otkriti. Tako, na pimer, ako je prisutna hren peroksidaza kao sredstvo za obeležavanje, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog proizvoda reakcije koji se može detektovati. Antitelo se isto tako može obeležiti biotinom i detektovati posrednim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina. Jedno se antitelo može obeležiti nekim magnetskim sredstvom kao što je gadolinijum. Jedno antitelo može biti obeleženo unapred određenim polipeptidnim epitopama koje prepoznaje neki sekundarni izveštač (na primer sekvence poteznog para leucina, mesta za vezivanje sekundarnih antitela, domeni vezivanja metala, epitopne oznake). Kod nekih izvođenja, oznake su pričvršćene odstojnim krakovima različitih dužina da bi se smanjilo eventualno prostorno ometanje.
Jedno anti-IGF-IR antitelo može se obeležiti nekom radioaktivno obeleženom amino kiselinom. Radioaktivna oznaka može se koristiti za detektovanje tumora koji eksprimirajuGF-IR pomoću rendgenskih zrakova ili drugim dijagnostičnim tehnikama. Pored toga, radioaktivne se oznake mogu koristiti terapeutski kao otrov za kancerozne ćelije ili tumore. Primer radiokativnih oznaka za peptide obuhvataju, ali nisu na njih ograničeni, sledeće radioizotope ili radionukleide: 3H, 14C, 15N,<35>S, 9<0>Y, 99Tc, "'in, 125P131J.
Jedno anti-IGF-IR antitelo isto tako može biti derivatizovano nekom hemijskom grupom kao što je polietilen glikol (PEG), neka metil ili etil grupa, ili neka ugljovodonična grupa. Te grupe mogu biti korisne za poboljšanje bioloških karakteristika antitela, napr., da povećaju poluživot seruma ili da povećaju vezivanje tkiva.
Farmaceutske kompozicije i kompleti
Pronalazak se isto tako odnosi na jednu farmaceutsku kompoziciju za lečenje jednog poremećaja usled preteranog razmnožavanja ćelija kod nekog sisara, koje obuhvata davanje jedne terapeutski delotvorne količine jedinjenja prema pronalasku i nekog farmaceutski prihvatljivog nosača. Kod jednog je izvođenja pomenuta farmaceutska kompozicija predviđena za lečenje raka na mozgu, na plućima, raka ćelija skvamusa, bešike, raka želuca, pankreasa, dojke, glave, vrata, bubrega, jetre, jajnika, prostate, kolorektalni rak, rak jednjaka, ginekološki ili tiroidni kancer. Kod jednog drugog izvođenja, ova se farmaceutska kompozicija odnosi na nekancerozne poremećaje usled preteranog razmnožavanja ćelija, kao što je, bez ograničavanja, restenoza posle angioplastike i psorijaze. Kod jednog drugog izvođenja, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju za lečenje nekog sisara koji zahteva aktiviranje IGF-IR, pri čemu farmaceutska kompozicija obuhvata jednu terapeutski delotvornu količinu jednog antitela za aktiviranje prema pronalasku i jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela za aktivisanje mogu se koristiti za lečenje životinja koje nemaju dovoljno IGF-I ili IGF-II, ili se mogu koristiti za lečenje osteoporoze, slabosti ili poremećaja kod kojih životinja luči suviše malo aktivnog hormona rasta ili nije u stanju da reaguje na hormon rasta.
Anti-IGF-IR antitela prema pronalasku mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za davanje nekom subjektu. Tipično, farmaceutska kompozicija sadrži jedno antitelo prema pronalasku ijedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata sve rastvarače, sredstva za dispergovanje, obloge, sredstva protiv bakterija i protiv gljivica, izotonička sredstva i sredstva za usporavanje apsorpcije, i slična sredstva koja su fiziološki kompatibilna. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača obuhvataju, jedan ili više njih, kao što su voda, slani rastvor, fosfatom puferovan slani rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slični, kao i njihove kombinacije. U mnogim će slučajevima biti pogodno da se u kompoziciju uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polivalentni alkoholi kao manitol, sorbitol ili natrijumhlorid. Farmaceutski prihvatljive supstance kao što su okvašivači ili male količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje ili za emulgiranje, konzervansi ili puferi, koji poboljšavaju trajnost kod skladištenja ili povećavaju efikasnost antitela ili dela antitela.
Kompozicije prema ovom pronalasku mogu imati najrazličitije oblike. Oni obuhvataju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr., rastvori za injekcije i za infuziju), disperzije ili nsuspenzije, tablete, pilule, praškove, lipozome i supozitorije. Preporučljivi oblik zavisi od namenjenog oblika davanja i od terapeutske primene. Tipične preporučljive kompozicije su u obliku rastvora za injekcije ili za infuzije, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi sa drugim antitelima. Preporučljiv način davanja je parenteralno (npr., intravensko, potkožno, intraperitonalno, intramuskularno). Kod jednog preporučljivog izvođenja, antitelo se daje intravenskom infuzijom ili injekcijama. Kod jednog se drugog izvođenja antitelo daje intramuskularnim ili potkožnim injekcijama.
Terapeutske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za veliku koncentraciju leka. Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu se pripremati uključivanjem anti-IGF-IR antitela u traženoj količini u nekom pogodnom rastvaraču sa jednim ili sa kombinacijom napred navedenih sastojaka, već po potrebi, posle čega se vrši sterilisanje filtriranjem. U opštem slučaju, disperzije se pripremaju unošenjem aktivnog jedinjenja u neki sterilni nosač koji sadrži jedan osnovni medijum za dispergovanje i druge potrebne sastojke od napred nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih rastvora za injekcije, preporučljivi postupci priprema jesu sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak od nekog njegovog rastvora prethodno sterilisanog filtriranja. Odgovarajuća tečljivost jednog rastvora može se održavati, na primer, korišćenjem neke obloge kao što je leticin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju dispezije i primenom površinski aktivnih materijala. Produženo apsorbovanje kompozicija za ubrizgavanje može se ostvariti uključivanjem u kompoziciju nekog sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer soli monostearata i želatin.
Antitela prema ovom pronalaskumogu se davati raznim postucima poznatim u struci, mada su za mnoge terapeutske primene pogodnije putanje/režimi davanja intraperitonalni, potkožni, intramuskularni, intravenski ili infuzija. Kao što će stručnjak shvatiti, putanja i/ili našin davanja menjaće se u zavisnosti od željenih rezultata. Kod jednog izvođenja, antitela prema ovom pronalasku mogu se davati kao jednokratna doza ili se mogu davati u više doza.
Kod izvesnih izvođenja, aktivno se jedinjenje može pripremati sa nosačem koji će štititi jedinjenje od brzog ispuštanja, kao što je formulacija sa regulisanim ispuštenjem, uključujući implantate, flastere za delovanje kroz kožu i formulacija sistema davanja u vidu mikrokapsula. Mogu se koristiti biloški razloživi, biološki kompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnogi su postupci za pripremanje takvih formulacija patentirani ili su opšte poznati stručnjacima. Videti, na primer, Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Kod izvesnih izvođenja, anti-IGF-IR prema pronalasku može se davati oralno, na primer sa nekim inertnim razređivačem ili nekim nosačem koji se može jesti i asimilovati. Jedinjenje (i drugi sastojci, ako se želi) može biti zatvoreno u tvrdu ili meku želatinsku kapsulu, komprimovano u tabletu, ili uključeno neposrednu u hranu subjekta. Za oralno terapeutsko davanje, jedinjenje može biti pomešano sa neutralnim dodacima i korišćeno u vidu jestivih tableta, tableta za sisanje, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafii i sličnog. Da bi se dalo jedinjenje prema pronalaska na neki drugi način umesto parenteralno, može biti potrebno da se jedinjenje obloži nekim materijalom, ili da se istovremeno daje sa njim, kako bi se sprečilo njegovo dezaktiviranje.
Dodatna aktivna jedinjenja takođe mogu biti ugrađena u kompozicije. Kod izvesnih izvođenja, jedan anti-IGF-IR prema pronalasku formuliše se zajedno i/ili se daje zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava, kao što je neko hemoterapeutsko sredstvo, neko antineoplastično sredstvo ili neko protivtumorsko sredstvo. Tako, na primer, jedno anti-IGF-IR antitelo može biti istovremeno formulisano i/ili istovremeno davano sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava. Ta sredstva obuhvataju, bez ograničavanja, antitela koja vezuju druge ciljeve (npr., antitela koja se vezuju za jedan ili više faktora rasta ili citokine, njihove receptore na površini ćelija ili IGF-I), proteini koji se vezuju za IGF-I, anti-neoplastične agense, hemoterapeutska sredstva, protivtumorska sredstva, antisens oligonukleotide protiv IGF-IR ili IGF-I, peptidne analoge koji blokiraju aktiviranje IGF-IR, rastvorljiv IGF-IR, i/ili jedan ili više hemijskih agenasa koji inhibiraju proizvodnju IGF-I ili njegovo delovanje, a koji su poznati u struci, npr., oktreotid. Za farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno antitelo za aktivisanje, anti-IGF-IR antitelo mora biti formulisano sa nekim faktorom koji povećava proizvodnju ćelija ili sprečava apoptozu. Takvi faktori obuhvataju faktore rasta kao što je IGF-I, i/ili analoge IGF-I koji aktiviraju IGF-IR. Takve kombinovane terapije mogu zahtevati manje doziranje anti-IGF-IR antitela kao i istovremeno davanih sredstava, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa raznim monoterapijama. Kod jednog izvođenja to je antitelo i jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa.
Terapeutske kompozicije prema pronalasku mogu sadržati jednu "terapeutski delotvornu količinu" ili jednu "profilaktički delotvornu količinu" jednog antitela, ili dela antitela, prema pronalasku. Jedna "terapeutski delotvorna količina" odnosi se na jednu količinu u stanju da, pri potrebnim dozama i u potrebnom vremenskom trajanju, ostvari željeni terapeutski rezultat. Terapeutski delotvorna količina antitela, ili dela antitela, može se menjati u zavisnosti od činilaca kao što je stanje oboljenja, starost, pol i telesna masa pojedinca, kao i od sposobnosti antitela, ili dela antitela, da ostvari željeno reagovanje u pojedincu. Terapeutski delotvorna količina je takođe i ona količina pri kojoj su bilo koja toksična ili štetna delovanja antitela, ili dela antitela, znatno manja od terapeutski korisnih delovanja. "Profilaktički delotvorna količina" odnosi se na jednu količinu u stanju da, pri potrebnim dozama i u potrebnom vremenskom trajanju, ostvari željeni profilaktički rezultat. Pošto se jedna profilaktička doza daje subjektu pre oboljenja, ili u nekoj ranoj fazi oboljenja, jasno je da će profilaktički delotvorna količina biti manja od terapeutski delotvorne količine.
Režimi doziranja mogu se podešavati kako bi se obezbedilo optimalno željeno reagovanje (na primer terapeutsko ili profilaktičko reagovanje). Tako, na primer, može se davati jedna jedina veća doza, nekoliko manjih doza može se davati tokom nekog vremena, ili se doze mogu proporcionalno smanjivati ili povećavati prema potrebama terapeutske situacije. Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo, ili koje sadrže jednu kombinovanu terapiju koja obuhvata antitelo i jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, mogu se formulisati za jednokratne ili za višekratne doze. Posebno je pogodno da se parenteralne kompozicije formulišu u vidu doznih jedinica radi lakšeg davanja i ujednačenosti doziranja. Jedinični dozni oblici, kako se ovde koriste, odnose se fizički pojedinačne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za sisarske subjekte koje treba lečiti, pri čemu svaka jedinica sadrži jednu unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja, proračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa zahtevanim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike prema pronalasku diktirane su i neposredno zavisne od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapeutskog ili profilaktičkog delovanja koje treba ostvariti, i (b) od ograničenja neizbežnih kod obrazovanja takvog jednog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca. Jedna posebno korisna formulacija je 5 mg/ml anti-IGF-IR antitela u jednom puferu od 20 mM natrijumcitrata, pH 5,5, 140 mM NaCl, i 0,2 mg/ml polisorbata 80.
Kao primer, koji ne ograničuje, opseg za terapeutsku ili profilaktičku delotvornu količinu jednog antitela, ili dela antitela, prema pronalasku jeste 0,1- 100 mg</>kg, bolje 0,5-50 mg/kg, još bolje 1-20 mg/kg, a najbolje 1-10 mg/kg. Treba napomenuti da veličina doze može varirati sa vrstom i ozbiljnošću stanja koje treba ublažiti. Dalje treba podrazumevati da će se kod svakog pojedinačnog subjekta specifični dozni režimi podešavati tokom vremena u skladu sa individualnim potrebama i stručnoj proceni osobe koja daje ili nadgleda davanje kompozicija, i da su napred navedeni opsezi doziranja samo primer i nisu namenjeni za ograničavanje opsega ili praktične primene jedinjenja za koja se traži zaštita. Kod jednog izvođenja, terapeutski ili profilaktički delotvorna količina jednog antitela, ili dela antitela, daje se zajedno sa jednim ili više terapeutskih sredstava.
U svom drugom vidu, pronalazak se odnosi na davanje jednog anti-IGF-IR antitela za lečenje raka u dozi manjoj od 300 mg mesečno.
U svom drugom vidu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplete koji sadrže anti-IGF-IR antitela i farmaceutske kompozicije koje sadrže ta antitela. Jedan komplet može sadržati pored antitela ili farmaceutske kompozicije, dijagnostička ili terapeutska sredstva. Komplet takođe može sadržati uputstva za korišćenje u nekom dijagnostičkom ili terapeutskom postupku. Kod jednog poželjnog izvođenja, komplet obuhvata antitelo ili njegovu farmaceutsku kompoziciju i jedno dijagnostičko sredstvo koje se može koristiti u jednom postupku u nastavku opisa. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, komplet obuhvata antitelo ili njegovu farmaceutsku kompoziciju i jedno ili više terapeutskih sredstava, kao što je neko dodatno antineoplastično sredstvo, protivtumorsko sredstvo ili neko hemoterapeutsko sredstvo, koja se mogu koristiti u jednom postupku u nastavku opisa.
Ovaj se pronalazak isto tako odnosi na farmaceutske kompozicije za inhibiranje nenormalnog rasta ćelija kod nekog sisara a koje sadrže neku količinu jednog jedinjenja prema pronalasku u kombinaciji sa nekom količinom jednog hemoterapeutskog sredstva, pri čemu su količine jedinjenja, soli, solvata ili proleka, i količina hemoterapeutskig sredstva zajedno dovoljne za inhibiraju nenormalno rastenje ćelija. U struci su poznata mnoga hemoterapeutska sredstva. Kod jednog se izvođenja hemoterapijsko sredstvo bira iz grupe koju čine inhibitori mitoze (deobe ćelija), sredstva za alkilovanje, antimetaboliti, antibiotici za umetanje, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, sredstva protiv preživljavanja, modifikatori biološkog reagovanja, anti hormoni, npr., sredstva protiv androgena i sredstva protiv angiogeneze.
Sredstva protiv angiogeneze, kao što su inhibitori MMP-2 (matrična metaloproteinaza 2), inhibitori MMP-9 (matrična metaloproteinaza 9) i inhibitori COX-II (ciklooksigenaza II), mogu se koristi u sklopu sa jednim jedinjenjem prema pronalasku. Primeri korisnih COX-II inhibitora su CELEBREX™ (alekoksib), valdekoksib i rofekoksib. Primeri pogodnih inhibitora matričnih metaloproteinaza opisani su u WO 96/33172 (objavljeno 24. oktobra 1996), WO 96/27583 (objavljeno 7. marta 1996), evropska patentna prijava br. 97304971.1 (podneta 8. jula 1997), evropska patentna prijava br. 97304971.1 (podneta 8. jula 1997), evropska patentna prijava br. 99308617.2 (podneta 29. oktobra 1999), WO 98/07697 (objavljeno 26. februara 1998), WO 98/03516 (objavljeno 29. januara 1998), WO 98/34918 (objavljeno 13. avgusta 1998), WO 98/34915 (objavljeno 13. avgusta 1998), WO 98/33768 (objavljeno 6. avgusta 1998), WO 98/30566 (objavljeno 16 jula 1998), evropska patentna publikacija 606,046 (objavljena 13. jula 1994), evropska patentna publikacija 931,788 (objavljena 28. jula 1999), WO 90/ 05719 (objavljeno 31, maja 1990), WO 99/52910 (objavljeno 21. oktobra 1999), WO 99/52889 (objavljeno 21. oktobra 1999), WO 99/29667 (objavljeno 17. juna 1999), PCT međunarodna prijava PCT/IB98/01113 (podneta 21. jula 1998), evropska patentna prijava br. 99302232.1 (podneta 25. marta 1999), britanska patentna prijava br. 9912961.1 (podneta 3. juna 1999), američka privremena prijava br. 60/148,464 (podneta 12. avgusta 1999), američki patent 5,863,949 (izdat 26. januara 1999), američki patent 5,861,510 (izdat 19. januara 1999) i evropska patentna publikacija 780,386 (objavljena
25. juna 1997), svi u celini ovde uključeni kao literatura. Preporučljivi MMP inhibitori su oni koji ne izazivaju bolove u zglobovima. Preporučljiviji su oni koji selektivno inhibiraju MMP-2 i/ili MMP-9 u odnosu na druge matrične metaloproteinaze (tj. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13. Neki od specifičnih primera MMP inhibitora koji se mogu koristiti u ovom pronalasku jesu AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i jedinjenja navedena u sledećem spisku: 3-[[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonil]-(l-hidroksikarbamoil-ciklopentil)-amino]-propionska kiselina;
hidroksiamid 3-ekso-3-[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3,2,l]oktan-3-karbonske kiseline;
hidroksiamid (2R, 3R) l-[4-(2-hlor-4-fluor-benziloksi)-benzensulfonil]-3-hidroksi-3-metil-piperidin-2-karbonske kiseline;
hidroksiamid 4-[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonilammo]-tetrahidro-piran-4-karbonske kiseline;
3-[[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonil]-(l-hidroksikarbamoil-ciklobutil)-amino]-propionska kiselina;
hidroksiamid 4-[4-(4-hlor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-karbonske kiseline;
hidroksiamid (R) 3-[4-(4-hlor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-karbonske kiseline;
hidroksiamid (2R, 3R) l-[4-(4-fluor-2-metil-benziloksi)-benzensulfonil]-3-hidroksi-3-metil-piperidin-2-karbonske kiseline;
3-[[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonil]-(l-hidroksikarbamoil-l-metil-etil)-amino]-propionska kiselina;
3-[[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonil]-(4-hidroksikarbamoil-tetrahidro-piran-4-il)-aminoj-propionska kiselina;
hidroksiamid 3-ekso-3-[4-(4-hlor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3.2.l]oktan-3-karbonske kiseline;
hidroksiamid 3-endo-3-[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-8-oksa-biciklo[3.2.1]oktan-3-karbonske kiseline; i
hidroksiamid (R) 3-[4-(4-fluor-fenoksi)-benzensulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-karbonske kiseline; i
farmaceutski prihvatljive soli i solvati ovih jedinjenja.
Jedinjenje prema pronalasku može se koristiti i sa inhibitorima signala transdukcije, kao što su sredstva koja mogu inhibirati reagovanja EGF-R (receptor faktora rasta epiderma), kao što su EGF-R antitela, EGF antitela i molekuli koji su EGF inhibitori; VEGF (vaskularni endotelni faktor rasta) inhibitori, kao što su VEGF receptori i molekuli koji mogu inhibirati VEGF; i inhibitori erbB2 receptora, kao što su organski molekuli ili antitela koja se vezuju na erbB2 receptor, na primer HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). EGF-R inhibitori opisani su, na primer, u WO 95/19970 (objavljen 27. jula 1995), WO 98/14451 (objavljen 9. aprila 1998), WO 98/02434 (objavljen 22. januara 1998) i u američkom patentu 5,747,498 (izdat 5. maja 1998), i te se supstance mogu koristiti u ovom pronalasku kako je ovde opisano. IGFR sredstva za inhibiranje obuhvataju, ali niša na njih ograničena, monoklonska antitela C225 i anti-EGFR 22Mab (ImClone Svstems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesvs), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA), i jedinjenja ZD-1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomide (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (VVarner Lambert Parke Daviš), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis),CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CEVI)) Ova i druga sredstva za inhibiranje EGF-R mogu se koristiti u ovom pronalasku.
VEGF inhibitori, na primer SU-5416 i SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering), i NX-1838 (NeXstar) takođe se mogu kombinovati sa jedinjenjima iz ovog pronalaska. VEGF inhibitori opisani su, na primer, u WO 99/24440 (objavljen 20. maja 1999), PCT međunarodnoj prijavi PCT/IB99/00797 (podneta 3. maja 1999), WO 95/21613 (objavljeno 17. avgusta 1995), WO 99/61422 (objavljeno 2. decembra 1999), SAD patent 5,834,504 (izdat 10. novembra 1998), WO 98/50356 (objavljeno 12 novembra 1998), SAD patent 5,883,113 (izdat 16. marta 1999), SAD patent 5,886,020 (izdat 23. marta 1999), SAD patent 5,792,783 (izdat 11. avgusta 1998), WO 99/10349 (objavljeno 4. marta 1999), WO 97/32856 (objavljeno 12. septembra 1997), WO 97/22596 (objavljeno 26. juna 1997), WO 98/ 54093
(objavljeno 3. decembra 1998), WO 98/02438 (objavljeno 22. januara 1998), VVO 99/16755 (objavljeno 8, aprila 1999) i WO 98/02437 (objavljeno 22. januara 1998), sve uključeno u celini kao literatura. Drugi primeri nekih specifičnih VEGF inhibitora korisnih u ovom pronalasku jesu IM862 (Cvtran Inc.); anti-VEGF monoklonalno antitelo firme Genentech, Inc.; i angiozim, jedan sintetički ribozim firme Ribozvme and Chiron. Ovi i drugi VGF inhibitori mogu se koristiti u ovom zahtevu kako je opisano.
Inhibitori ErbB2 receptora, kao što su GW-282974 (Glaxo VVellcome plc), i monoklonska antitela AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) i 2B-1 (Chiron), mogu se kombinovati sa jedinjenjima prema pronalasku, na primer ona pomenuta u WO 98/02434 (objavljeno 22. januara 1998), WO 99/35146 (objavljeno 15. jula 1999), WO 99/35132 (objavljeno 15. jula 1999), WO 99/02437 (objavljeno 22. januara 1998), WO 97/13760 (objavljeno 17. aprila 1997), VVO 95/19970 (objavljeno 27. jula 1995), SAD patentu 5,587,458 (izdat 24. decembra 1996) i SAD patent 5,877,305 (izdat 2. marta 1999), sve uključeno u celini kao literatura. Inhibitori ErbB2 receptora korisni u ovom pronalasku takođe su opisani u američkoj privremenoj prijavi br. 60/117,341, podnetoj 27. januara 1999, i u američkoj privremenoj prijavi br. 60/117,346, podnetoj 27. januara 1999, obe uključene u celini kao literatura. Jedinjenja i supstance inhibitora erbB2 receptora, opisani u napred pomenutim PCT prijavama, SAD patentima i u američkim privremenim prijavama, kao i druga jedinjenja i supstance koje inhibiraju erbB2 receptor, mogu se koristiti sa ovim pronalaskom a u skladu sa tim pronalaskom.
Sredstva protiv preživljavanja uključuju anti-IGF-IR antitela i anti-integrinska sredstva kao što su anti-integrinska antitela.
Primena kod dijagnostičkih postupaka
Anti-IGF-IR antitela nogu se koristiti za detektovanje IGF-IR u jednom biološkom uzorkuin vitroili invivo.Anti-IGF-IR antitela mogu se koristiti u konvencionalnim imuno-ispitivanjima, uključujući, bez ograničavanja, ELISA, RIA, FACS testove, imunohistohemiju tkiva, "VVester blot" ili imunoprecipitaciju. Anti-IGF-IR antitela prema pronalasku mogu se koristiti za detektovanje IGF-IR od ljudi. Kod jednog drugog izvođenja. anti-IGF-IR antitela mogu se koristiti za detektovanje IGF-IR od afro-azijskih primata kao što su pavijani rezus-majmuni, šimpanze i bezrepi majmuni. Pronalazak daje postupak za detektovanje anti-IGF-ER u jednom biološkom uzorku, koji obuhvata dodir jednog biološkog uzorka sa jednim anti-IGF-IR antitelom prema pronalasku i detektovanje vezanog antitela vezanog za anti-IGF-IR, da bi se detektovao IGF-IR u biološkom uzorku. Kod jednog izvođenja anti-IGF-IR antitelo neposredno je obeleženo jednom primetljivom oznakom. Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo (prvo antitelo) nije označeno dok je jedno drugo antitelo ili molekul, koji se može vezati za anti-IGF-IR antitelo, označen. Kao što je poznato stručnjaku, bira se jedno drugo antitelo koje je u stanju da vezuje specifične vrste i klase prvog antitela. Tako, na primer, ako je anti-IGF-IR antitelo jedan humani IgG, tada sekundarno antitelo može biti jedan protiv-humani-IgG. Drugi molekuli koji se mogu vezati za antitela obuhvataju, bez ograničavanja, Protein A i Protein G, oba komercijalno dostupna, npr. od Pierce Chemical Co.
Pogodne oznake za antitela ili sekundarne bile su opisane ranije, a obuhvataju razne enzime, protezinske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, magnetska sredstva i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima obuhvataju hren peroksidazu, alkalne fosfataze, B-galaktozidaze, ili acetilholinesteraze; primeri pogodnih protezinskih grupa uključuju streptavidin/ biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala obuhvataju umeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlortriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; jedna primer jednog luminescentnog materijala obuhvata luminol; primer jednog magnetskog sredstva obuhvata gadolinijum; a primeri pogodnih radioaktivnih materijala obuhvataju<123>J,<131>J,<33>S ili<3H.>
Kod jednog alternativnog izvođenja, IGF-IR može biti ispitivan u jednom biološkom uzorku jednim uporednim imunoispitivanjem koristeći IGF-IR standarde označene nekom primetljivom supstancom i neoznačena anti-IGF-IR antitela. Kod tog ispitivanja, biološki uzorak, označeni IGF-IR standardi i anti-IGF-IR antitelo kombinuju se a određuje se količina označenih IGF-IR standarda vezanih za neoznačeno antitelo. Količina IGF-IR u biološkom uzorku obrnuto je proporcionalna količini obeleženih IGF-IR standarda vezanih za anti-IGF-IR antitelo.
Napred opisana imunoispitivanja mogu se koristiti u više svrha. Kod jednog izvođenja, anti-IGF-IR antitela mogu se koristiti za detektovanje IGF-IR u ćelijama u ćelijskoj kulturi. Kod jednog preporučljivog ispitivanja, anti-IGF-IR antitela mogu se koristiti za određivanje nivoa fosforilacije tirozina, autofosforilacije tirozina TGF-IR-a, i/ili količina IGF-IR na površini ćelije posle obrade ćelija raznim jedinjenjima. Ovaj se postupak može koristiti za ispitivanje jedinjenja koja se mogu koristiti za aktiviranje ili inhibiranje IGF-IR. U tom se postupku jedan uzorak ćelija obrađuje nekim ispitnim jedinjenjem u toku nekog vremena dok se drugi uzorak ostavlja neobrađen. Ako se meri autofosforilacija tirozina, ćelije se usmrte a fosforilacija tirozina IGH-IR-a meri se koristeći jedno imunsko ispitivanje kako je opisano napred ili kako je opisano u Primeru III, gde se koristi ELISA. Ako treba da se meri ukupan nivo IGF-IR, ćelije se usmrte a ukupan nivo IGF-IR meri se jednim od napred opisanih imunoispitivanj a.
Preporučljivo imunoispitivanje za određivanje fosforilacije tirozina IGF-IR-a ili za merenje ukupnih nivoa IGF-IR jeste ELISA ili "Western blot". Ako se meri samo nivo IGF-IR na površini ćelije, ćelije se ne usmrćuju, a nivoi IGF-IR na površini ćelije mere se koristeći neko od napred opisanih imunoispitivanj a. Jedno preporučljivo imunoispitivanje za određivanje nivoa IGF-IR na površini ćelija obuhvata korake označavanja proteina na površini ćelije nekom prepoznatljivom oznakom, kao što je biotin ili<I23>J, imunoprecipitiranje IGF-IR sa jednim anti-IGF-IR antitelom i potom detektovanje označenog IGF-IR. Drugo jedno imunoispitivanje za određivanje lokalizovanja IGF-IR, napr., nivoa na površini ćelije, vrši se pomoću imunohistohemije. Postupci kao što su ELISA. RIA, "Western blot". imunohistohemija, označavanje površine ćelija proteina integralnih membrana i imunoprecipitacija poznati su u struci. Videti napred, Harlovv and Lane. Pored toga, imunoispitivanja se mogu srazmerno proširiti radi obimnijeg pretraživanja da bi se ispitao veći broj jedinjenja bilo za aktivisanje, bilo za inhibiranje IGF-IR.
Anti-IGF-IR antitela prema pronalasku mogu se isto tako koristiti za određivanje nivoa IGF-IR u nekom tkivu ili u ćelijama izvedenim iz tkiva. Kod jednog preporučljivog izvođenja, tkivo je jedno obolelo tkivo. Kod jednog preporučljivog izvođenja postupka, tkivo ili njegova biopsija je isečeno iz pacijenta. Tkivo ili biopsija se potom koristi kod imunoispitivanja da bi se odredili, npr., nivoi IGF-IR, nivoi IGF-IR na površinama ćelija, nivoi tirozinske fosforilacije od IGF-IR, ili lokalizovanje IGF-IR prerma napred rasmatranim postupcima. Postupak se može primeniti na utvrđivanje da li neki tumor eksprimira IGF-IR na nekom visokom nivou.
Napred opisan dijagnostički postupak može se koristiti da se odredi da li neki tumor eksprimira visoke nivoe IGF-IR što bi moglo ukazati da će tumor dobro reagovati na lečenje jednim anti-IGF-antitelom. Dijagnostički se postupak takođe može koristiti da se odredi da li je tumor eventualno kancerozan, ako eksprimira visoke nivoa IGF-IR, ili je benigni. ako eksprimira niske nivoe IGF-IR. Dalje se dijagnostički postupak takođe može koristiti da se utvrdi da li lečenje sa anti-IGF-IR antitelom (videti u daljem tekstu) čini da neki tumor eksprimira niže nivoe IGF-IR i/ili eksprimira niže nivoe autofosforilacije tirozina, pa se tako može koristiti za utvrđivanje da lije lečenje uspešno. Opšte uzev, postupak za određivanje da li neko anti-IGF-IR antitelo smanjuje fosforilaciju tirozina, obuhvata korake merenja nivoa fosforilacije tirozina u nekoj ćeliji ili tkivu od interesa, inkubacije ćelije ili tkiva jednim anti-IGF-IR antitelom, ili njegovim delom za vezivanje antigena, ponovnog merenja nivoa fosforilacije tirozina u ćeliji ili tkivu. Fosforilacija tirozina od IGF-IR ili od nekog drugog (ili drugih) proteina može se meriti. Dijagnostički se postupak može primeni da bi se utvrdilo da li ćelija ne eksprimira dovoljno visoke nivoe IGF-IR ili dovoljno visoke nivoe aktivisanog IGF-IR, što bi mogao biti slučaj kod pojedinaca sa patuljastim rastom, osteoporozom ili dijabetesom. Dijagnoza da su nivoi IGF-IR ili aktivisanog IGF-IR suviše niski može se koristiti za lečenje aktivisanjem anti-IGF-antitela, IGF-I ili drugih terapeutskih sredstava za povećanje nivoa ili aktivnosti IGF-IR.
Antitela prema ovom pronalasku takođe se mogu koristiti in vivo da lokalizuju tkiva i organe koji eksprimiraju IGF-IR. Kod jednog pogodnog izvođenja, anti-IGF-IR antitela mogu se koristiti za lokalizovanje tumora koji eksprimiraju IGF-IR. Prednost je anti-IGF-IR antitela prema ovom pronalasku to što ona neće generisati imunsko reagovanje posle davanja. Postupak obuhvata korake davanja jednog anti-IGF-IR antitela ili neke njegove farmacijske kompozicije pacijentu kome je potrebno takvo dijagnostičko ispitivanje i podvrgavanja pacijenta analizi snimanjem radi utvrđivanja lokacije tkiva koja eksprimiraju IGF-IR. Analiza snimanjem je dobro poznata i obuhvata, bez ograničavanja, analizu rendgenskim zracima, snimanje magnetnom rezonancom (MRI) ili računarskim rendgenskim snimanjem (CE). Kod jednog drugog izvođenja, uzima se biopsija od pacijenta da bi se utvrdilo da li tkivo od interesa eksprimira IGF-IR umesto da se pacijent podvrgava analizi snimanjem. Kod jednog poželjnog izvođenja, anti-IGF-IR antitela mogu se označiti nekim preoznatljivim sredstvom koje se može snimati u pacijentu. Tako se, na primer, antitelo može označiti nekim kontrastnim sredstvom, kao što je barijum, koje se može koristiti za analizu rendgenskim zracima, ili nekim magnetskim kontrastnim sredstvom kao što je gadolinijum helat, koji se može koristiti za MRI ili CE. Druga sredstva za obeležavanje obuhvataju, bez ograničavanja, radioizotope kao što je<99>Tc. Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo biće neoznačeno i biće snimljeno davanjem jednog drugog antitela ili drugog molekula koji je prepoznatljiv i koji se može vezati za anti-IGF-IR antitelo.
Primena kod terapeutskih postupaka
Kod jednog drugog izvođenja, pronalazak daje postupak ua inhibiranje delovanja IGF-
IR davanjem jednog anti-IGF-IR antitela nekom pacijentu kome je to potrebno. Bilo koja vrsta antitela koja su ovde opisana može se koristiri u terapeutske svrhe. Kod jednog preporučljivog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo je jednohumano, himerno ili ohumanizirano antitelo. Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja, IGF-IR je humani a pacijent je čovek. Alternativno, pacijent može biti neki sisar koji eksprimira jedan IGF-IR sa kojim anti-IGF-IR antitelo uzajamno reaguje. Antitelo se može dati nekom ne-humanom sisani koji eksprimira jedan IGF-IR koji reaguje sa antitelom (tj. nekom primatu, pavijanu ili rezus majmunu) u veterinarske svrhe ili kao opitnoj životinji za humane bolesti. Te životinje mogu biti korisne za procenu terapeutske efikasnosti antitela prema ovom pronalasku.
Kako se ovde koristi, izraz "poremećaj kod koga je delovanje IGF-IR štetno" treba da obuhvati oboljenja i druge poremećaje kod koji se pokazalo da je prisustvo visokih nivoa IGF-IR kod nekog subjekta koji pati od poremećaja odgovorno, ili se sumnja daje odgovorno za patofiziologiju poremećaja, ili je činilac koji doprinosi pogoršanju poremećaja. Prema tome, poremećaj kod koga su delovanja visokih nivoa štetna, jeste poremećaj kod koga se očekuje da će inhibiranje IGF-IR delovanja ublažiti simptome i/ili usporiti razvijanje poremećaja. Takvi se poremećaji mogu zapaziti, na primer, povećanjem nivoa IGF-IR na površini ćelija ili u povećanju auto fosforilacije tirozina od IGF-IR u obolelim ćelijama ili tkivima subjekta koji pati od poremećaja. Povećanje nivoa IGF-IR može se otkriti, na primer, koristeći jedno anti-IGF-IR antitelo kako je napred opisano.
Kod jednog preporučljivog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo može se davati nekom pacijentu koji ima neki tumor koji eksprimira IGF-IR. Tumor može biti čvrst tumor ili može biti mek tumor, na primer limfom. Kod jednog preporučljivijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo može se davati pacijentu kod koga je tumor koji eksprimira IGF-IR kancerozan. Kod jednog još preporučljivijeg izvođenja, anti-IGF-IR jedinjenje daje se pacijentu koji ima tumor pluća, dojke, prostate ili debelog creva. Kod najpreporučljivijeg izvođenja, postupak čini da se tumor ne povećava ni po masi ni po zapremini, ili da se smanjuje po masi i/ili zapremini. Kod jednog drugog izvođenja, postupak dovodi do intemalizovanja IGF-IR na tumoru. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 i 6.1.1, ili sadrži jedan njihov teški lanac, jedan laki lanac ili deo za vezivanje antigena.
Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja, jedno anti-IGF-IR antitelo može se dati pacijentu koji eksprimira neodgovarajuće visoke nivoe IGF-I. U struci je poznato da visok nivo ekspresije IFG-I može dovesti do neke grupe uobičajenih kancera. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo daje se pacijentu sa rakom prostate, gliomom ili fibrosarkomom. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, postupak dovodi do toga da rak prestane da se nenormalno razmnožava, ili da mu ne raste masa ili zapremina, ili da mu se smanjuje masa ili zapremina.
Kod jednog izvođenja, taj se postupak odnosi na lečenje raka kao što je rak mozga, ćelija skvamusa, bešike, želuca, pankreasa, dojke, glave, vrata, grkljana, prostate, kolorektalni rak, rak pluća, bubrega, jetre, jajnika, ginekološki ili tiroidni rak. Pacijenti koji se mogu lečiti jedinjenjima prema ovom pronalasku a prema postupcima iz ovog pronalaska obuhvataju, na primer, pacijente kod kojih je dijagnosticiran rak pluća, rak kostiju, rak pankreasa, rak kože, rak glave i vrata, kožni ili intraokularni melanom, rak materice, rak jajnika, rak rektuma, rak analnog područja, rak želuca, rak debelog creva, rak dojke, ginekološki tumori (npr., sarkomi materice, rak jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine ili karcinom vulve), Hočkinsonova bolest, rak jednjaka, rak tankog creva, rak endokrinskog sistema (npr., rak tiroidne, paratiroidne ili adrenalne žlezde), sarkom mekog tkiva, rak mokraćnog kanala, rak penisa, rak prostate, hronična ili akutna leukemija, čvrsti tumori iz detinjstva, limfocitni limfomi, rak bešike, rak bubrega ili uretre (npr., karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice), ili izraštaji centralnog nervnog sistema (npr., primarni limfom CNS, tumori kičme, gliom moždanog stabla ili adenomi hipofize).
Antitelo se može dati odjednom, ali je poželjnije da se daje iz više puta. Antitelo se može davati od tri puta dnevno do jedanput u šest meseci. Davanje leka može biti po rasporedu kao što je triput dnevno, dvaput dnevno, jednom dnevno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca i jednom na svakih šest meseci. Antitelo se može davati oralno, kroz sluzokožu, kroz usnu duplju, kroz nos, udisanjem, intravenski, potkožno, intramuskularno, parenteralno, u tumor ili lokalno. Antitelo se može davati na mestu udaljenom od mesta gde je tumor. Antitelo se može davati kontinualno jednom mini-pumpom. Antitelo se može davati jednom, najmanje dvaput, ili najmanje tokom jednog perioda dok se stanje leči, ublaži ili dok se ne izleči. Antitelo će se uglavnom davati sve dok tumor postoji, pod uslovom da antitelo čini da tumor ili rak prestane da raste ili da se smanjuje po masi ili po zapremini. Antitelo će se uglavnom davati kao deo jedne farmaceutske kompozicije, kako je napred opisano. Doziranje će antitela uglavnom biti u opsegu od 0,1-100 mg/kg, bolje 0,5-50 mg/kg, još bolje 1-20 mg/kg, a najbolje 1-10 mg/kg. Koncentracija antitela u serumu može se meriti bilo kojim postupkom poznatim u struci. Videti, na primer, sledeći Primer XVII. Antitelo se takođe može davati i profilaktički kako bi se sprečilo nastajanje nekog raka ili tumora. Ovo može biti posebno korisno kod pacijenata koji imaju "normalno visok" nivo IGF-I jer se za te pacijente pokazalo da kod njih postoji veći rizik cd obrazovanja uobičajenih vrsta raka. Videti napred. Rosen et al.
U jednom svom drugom vidu, anti-IGF-IR antitelo može se davati zajedno sa drugim terapeutskim sredstvima, kao što su lekovi ili molekuli protiv tumora, pacijenu koji ima jedan poremećaj usled preteranog razmnožavanja ćelija, kao što je neki rak ili neki tumor. U jednom svom vidu, pronalazak se odnosi na postupak lečenja poremećaja usled preteranog razmnožavanja ćelija kod nekog sisara. koji postupak obuhvata davanje tom sisani jedne terapeutski delotvornne količine količine jednog jedinjenja prema pronalasku u kombinaciji sa nekim sredstvom protiv tumora izabranom iz grupe koju čine, ali na koje nisu ograničeni, inhibitori mitoze (deobe ćelija), sredstva za alkilovanje, anti-metaboliti, sredstva za umetanje, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze. modifikatori biološkog reagovanja, anti-hormoni, inhibitori kinaze. inhibitori matrične metaloproteaze, genetička terapeutska sredstva i sredstva protiv muškog hormona (antiandrogeni). Kod jednog poželjnijeg izvođenja, antitelo se može davati sa nekim sredstvom protiv tumora kao što je adriamicin ili taksol. Kod drugog poželjnog izvođenja, antitelo ili kombinovana terapija daje se zajedno sa radioterapijom, hemoterapijom, fotodinamičkom terapijom, operativnom ili drugom imunoterapijom. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, antitelo če biti dato sa jednim drugim antitelom. Tako, na primer. anti-IGF-IR antitelo može biti dato sa nekim antitelom ili drugim agensom za koji se zna da inhibira rast ćelija tumora ili raka, npr., neko antitelo ili sredstvo koje inhibira erbB2 receptor, EGF-R, CD20 ili VEGF.
Istovremeno davanje antitela sa nekim dodatnim terapeutskim sredstvom (kombinovana terapija) obuhvata davanje jedne farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-IGF-IR antitelo i dodatno terapeutsko sredstvo i davanje dve ili više posebnih farmaceutskih kompozicija, od kojih jedna sadrži anti-IGF-IR antitelo a druga (ili druge) sadrži dodatno terapeutsko sredstvo (ili sredstva). Dalje, mada istovremeno davanje ili kombinovana terapija obično podrazumeva da se antitelo i dodatno terapeutsko terapeutsko sredstvo daju istovremeno jedno s drugim, ono takođe obuhvata i slučajeve kada se antitelo i dodatna terapeutska sredstva daju u različito vreme. Tako. na primer, antitelo se može davati jednom u tri dana dok se terapeutsko sredstvo daje jednom dnevno. Alternativno, antitelo se može davati pre ili posle obrade poremećaja dodatnim terapeutskim sredstvom. Slično tome, anti-IGF-IR antitelo može se davati pre ili posle druge terapije, kao što je radioterapija,
hemoterapija, fotodinamička terapija, hirurška intervencija ili druga imunoterapija.
Antitelo i jedno ili više dodatnih terapeutskih sredstava (kombinovana terapija) mogu se davati jednom, dva puta, ili bar tokom perioda dok se stanje ne obradi, ublaži ili ne izleči. Poželjno je da se kombinovana terapija daje više puta. Kombinovana se terapija može davati od tri puta dnevno do jedanput u šest meseci. Davanje može biti po rasporedu kao što je triput dnevno, dvaput dnevno, jednom dnevno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca. jednom na svaka tri meseca i jednom na svakih šest meseci. ili se može davati kontinualno jednom mini-pumpom. Kombinovana se terapija može davati oralno, kroz sluzokožu, kroz usnu duplju, kroz nos, udisanjem, intravenski. potkožno. intramuskularno. parenteralno. u tumor ili lokalno. Kombinovana se terapija može davati na inestu udaljenom od mesta gde je tumor. Kombinovana će se terapija uglavnom davati sve dok tumor postoji, pod uslovom da antitelo čini da tumor ili rak prestane da raste ili da se smanjuje po masi ili po zapremini.
Kod jednog drugog izvođenja, anti-IGF-IR antitelo obeleženo je nekom radioaktivnom oznakom, nekim imunotoksinom ili nekim toksinom, ili je to jedan fuzionisan protein koji sadrži jedan toksički peptid. Anti-IGF-IR antitelo ili fuzionisani protein anti-IGF-IR antitela usmerava radioaktivnu oznaku, imunotoksin, toksin ili toksični peptid na tumorsku ćeliju ili ćeliju raka koja eksprimira IGF-IR. Kod jednog preporučljivog izvođenja, radioaktivna oznaka, imunotoksin, toksin ili toksični peptid internalizuju se nakon što se anti-IGF-IR antitelo veže za IGF-IR na površini ćelije tumora ili raka.
Prema jednom svom drugom vidu, anti-IGF-IR antitelo može se koristiti da izazove apoptozu specifičnih ćelija kod nekog pacijenta kome je to potrebno. U mnogim su slučajevima ćelije određene za apoptozu kancerne ili tumorske ćelije. Tako, kod jednog pogodnog izvođenja, pronalazak daje jedan postupak za iniciranje apoptoze davanjem jedne terapeutski efikasne količine jednog anti-IGF-IR antitela pacijentu kome je to potrebno. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 ili 6.1.1, ili sadrži jedan njihov teški niz, jedan laki niz ili region za vezivanje antigena.
Prema jednom svom drugom vidu, anti-IGF-IR antitelo može se koristiti za lečenje nekanceroznih stanja kod kojih su visoki nivoi IGF-I i/ili IGF-IR povezani sa nekanceroznim stanjem ili oboljenjem. Kod jednog izvođenja, postupak sadrži korak davanja jednog anti-IGF-IR antitela jednom pacijentu koji ima neko nekancerozno patološko stanje izazvano ili pogoršano visokim nivoima IGF-I i/ili IGF-IR ili njihovim pojačanim delovanjem. Kod jednog poželjnog izvođenja, nekancerozno patološko stanje je akromegalija, gigantizam, psorijaza, ateroskleroza, restenoza glatkih mišića krvnih sudova ili neodgovarajuće razmno-žavanje mikrovaskularnih ćelija, što se javlja kao jedna od komplikacija dijabetesa, specijalno oka. Kod jednog poželjnijeg izvođenja. anti-IGF-IT antitelo usporava razvoj nekanceroznog patološkog stanja. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja, anti-IGF-IR antitelo zaustavlja ili otklanja, bar delom, nekancerozno patološko stanje.
Prema jednom svom drugom vidu, pronalazak daje postupak za davanje jednog pokretačkog anti-IGF-IR antitela jednom pacijentu kome je to potrebno. Kod jednog izvođenja, pokretačko antitelo ili farmaceutska kompozicija daje se pacijentu kome je to potrebno u količini potrebnoj da se poveća delovanje IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, pokretačko antitelo je u stanju da uspostavi normalno delovanje IGF-IR. Kod drugog poželjnog izvođenja, pokretačko antitelo može se davati pacijentu koji je malog rasta, ima neuropatiju, smanjenje mišićne mase ili osteoporozu. Kod jednog drugog poželjnog izvođenja, pokretačko se antitelo može dati sa jednim ili više drugih faktora koji povećavaju razmnožavanje ćelija, sprečavaju apoptozu ili pojačavaju delovanje IGF-IR. Ti faktori obuhvataju faktore rasta kao što su IGF-I, i/ili analozi IGF-I koji aktiviraju IGF-IR. Kod jednog poželjnog izvođenja, antitelo se bira od 4.17.3, ili sadrži jedan njegov teški lanac, jedan laki lanac ili region za vezivanje antigena.
Genska terapija
Molekuli nukleinske kiseline prema ovom pronalasku mogu se dati pacijentu kome je to potrebno genskom terapijom. Terapija može biti biloin vivo,biloex vivo.Kod jednog preporučljivog izvođenja, pacijentu se daju molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju i teški lanac i laki lanac. Kod jednog više preporučljivog izvođenja, molekuli nukleinske kiseline daju se tako da budu stabilno integrisani u hromozome B ćelija pošto su te ćelije specijalizovane za obrazovanje antitela. Kod jednog poželjnog izvođenja, prekurzorske B ćelije su transfektovane ili zaraženeex vivoi ponovo usađene u pacijenta kome je to potrebno. Kod jednog drugog izvođenja, prekurzorske B ćelije ili druge ćelije su inficiranein vivokoristeći jedan virus za koji se zna da inficira vrstu ćelija od interesa. Tipični vektori korišćeni za gensku terapiju obuhvataju lipozome, plazmide ili virusne vektore kao što su retrovirusi, adenovirusi i adeno povezani virusi. Posle inficiranja in vivo ili eks vivo, nivoi ekspresije antitela mogu se pratiti uzimanjem jednog uzorka od lečenog pacijenta i primenom bilo kog imunskog ispitivanja, poznatog u struci i ovde raspravljanog.
Kod jednog poželjnog izvođenja, postupak genske terapije obuhvata korake davanja jedne delotvorne količine izdvojenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teškilanac, ili njegov deo za vezivanje antigena, humanog antitela ili njegovog dela i eksprimiranje molekula nukleinske kiseline. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, postupak genske terapije obuhvata korake davanja jedne delotvorne količine izdvojenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju lakilanac, ili njegov deo za vezivanje antigena, humanog antitela ili njegovog dela i eksprimiranje molekula nukleinske kiseline. Kod jednog još poželjnijeg izvođenja postupak genske terapije obuhvata korake davanja jedne delotvorne količine izdvojenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac, ili njegov deo za vezivanje antigena, humanog antitela ili njegovog dela i jedne delotvorne količine izdvojenih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju lakilanac , ili njegov deo za vezivanje antigena, humanog antitela ili njegovog dela i eksprimiranje molekula nukleinske kiseline. Postupak genske terapije može takođe sadržati korak davanja nekog drugog sredstva protiv raka, kao što je taksol, tamofiksen, 5-FU, adriamicin ili CP-538,774.
Da bi se ovaj pronalazak bolje shvatio, prikazani su sledeći primeri. Ovi primeri služe samo kao ilustracija i ne mogu se smatrati kao bilo kakvo ograničavanje opsega pronalaska.
PRIMER I: Generisanje hibridoma koji proizvode anti- IGF- IR. antitelo
Antitela prema pronalasku pripremljena su, izabrana i ispitana na sledeći način:
Imunizovanje i generisanje hibridoma
Osam do deset nedelja stari miševi soja XENOMICE™ bili su imunizovani, ili intraperitonalno ili u stopala zadnjih nogu, bilo sa vanćelijskim opsegom humanog IGF-IR (10 ug/doza/miš), bilo sa 2T3-IGF-IR ili 300.19-IGF-IR ćelijama, koje su dve linije transfektovanih ćelija koje eksprimiraju humani IGF-IR na njihovim plazmenim membranama (10 x IO<6>ćelija/doza/miš). Ova je doza ponovljena pet do sedam puta u periodu od tri do osam nedelja. Četiri dana pre fuzije, miševi su dobili jednu završnu injekciju vanćelijskog domena humanog IGF-IR u PBS. Limfociti slezine i limfnih čvorova iz imunizovanih miševa fuzionisani su sa neizlučenim mielomom P3-X63-Ag8.653 linije ćelija i izloženi HAT selekciji kako je ranije opisano (Galfre and Milstein, Methods Enzvmol. 73:3-46, 1981). Dobijen je skup hibridoma koji su svi lučili IGF-IR specifična humana IgG2k antitela. Sedam hibridoma koji su proizvodili monoklonska antitela specifična za IGF-IR izdvojena su za dalja proučavanja i označena 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1.
Hibridomi 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 i 4.17.3 deponovani su kod American Type Culture Collection - (ATCC) (Američki zavod za deponovanje uzoraka ćelija), 10801 Universitv Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 12, decembra 2000, sa sledećim depozitnim brojevima:
PRIMER II: Određivanje konstante afiniteta ( K< Q potpuno humanih
anti- IGF- IR monoklonskih antitela pomoću BIAcore- a
Vršili smo merenje afiniteta prečišćenih antitela rezonancom površinskih plazmona koristeći instrument BIAcore 3000, a prema protokolima proizvođača.
Protokol 1
Da bi se izvršile kinetičke analize, protein A je imobilisan na površinama senzorskih čipova BIAcore-a. Senzorski su čipovi potom korišćeni za hvatanje anti-IGF-IR antitela prema ovom pronalasku. Različite koncentracije vanćelijskog domena IGF-IR ubrizgane su na senzorski čip pa je analizirano vezivanje i kinetika disocijacije uzajamnih delovanja između anti-IGF-IR antitela i vanćelijskog domena IGF-IR. Podaci su procenjeni sa "global fit Langmuir 1:1" koristeći osnovne modele pomeranja koji se mogu naći na BIAevaluation softveru koji obezbeđuje BIAcore.
Protokol 2
BIAcore merenja su izvođena u suštini kako su opisali Fagerstam et al. "Detection of antigen-antibodv by surface plasmon resonance. Application to epitope mapping", J. Mol.
Recog. 3:208-214 (1990).
Tabela I prikazuje merenja afiniteta za reprezentativna anti-IGF-IR antitela prema nvnm nrnnalflskn ■
Kinetička analiza ukazuje da antitela pripremljena u skladu sa pronalaskom imaju veliki afinitet i jake konstante vezivanja za vanćelijski domen IGF-IR.
PRIMER III: Antitelom posredovano inhibiranje
fosforilacije IGF- IR izazvane od IGF- I
Vršili smo ELISA eksperimente da bi utvrdili da li su antitela prema ovom pronalasku sposobna da blokiraju aktiviranje IGF-IR do koga dolazi posredstvom IGF-I. Aktiviranje IGF-IR posredstvom IGF-I otkriveno je povećanom fosforilacijom tirozina povezanom sa recep torom.
Priprema ELISA ploča
Pripremali smo ELISA prihvatne ploče dodavanjem 100 ul pufera za blokiranje (3% belančevine iz seruma govečeta [BSA] u Tris-puferovanom slanom rastvoru [TBS]) u svaku od čašica jedne RectaBind Protein G-coated ploče sa 96 čašica (Pierce) i inkubiranjem ploča vibriranjem u trajanju od 30 min na sobnoj temperaturi. Razredili smo "rabbit pan" specifično SC-713 Anti-IGF-IR antitelo (Santa Cruz) u puferu za blokiranje do koncentracije od 5 u g/ml i dodali 100 ul razblaženog antitela u svaku od čašica. Inkubirali smo ploče vibriranjem u trajanju od 60 do 90 minuta na sobnoj temperaturi. Isprali smo ploče pet puta puferom za pranje (TBS + 0,1% Tvveen 20) i pažljivo izvukli zaostali pufer na papirnim ubrusima. Ove
ploče nisu puštene da se suše pre dodavanja lizata.
Pripremanje lizata od ćelija koje eksprimiraju IGF- IR
Stavili smo IGF-IR transfektovane NIH-3T3 ćelije (5 x IO<4>/ml) u 100 ul medij uma za rašćenje (DMEM medijum sa velikim sadržajem glukoze dopunjen sa L-glutaminom (0,29 mg/ml), 10% toplotom dezaktiviranog FBS, i po 500 u/ml geneticina, penicilina i streptomicina) u ploče sa 96 čašica zaokrugljenog dna. Inkubirali smo ploče na 37°, u 5% CO2, preko noći da bi se ćelije pričvrstile. Uklonili smo medijum sa ploča i zamenili ga sa 100 ul svežeg medijuma za rašćenje po čašici. Za ispitivanje, razredili smo potencijalna anti-IFG-IR antitela na petostruku željenu krajnju koncentraciju u medij umu za rašćenje i dodali po 25 u.1 u svaku čašicu. Svi su uzorci izvedeni u triplikatu. Potom smo ploče inkubirali jedan čas na 37°C. Stimulisali smo ćelije (25 ul/čašica) sa jednim 600 ng/ml IGF-I (pripremljenim u medijumu za raščenje) i inkubirali ploče 10 min na sobnoj temperaturi. Potom smo uklonili medijum prevrtanjem ploča i laganim upijanjem papirnim ubrusima i usmrtili slepljene ćelije dodavanjem 50 ul pufera za lizovanje (50 nM HEPES, pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCL, 1,6 mM NaV04>1% Triton X-100, 1% glicerol, dopunjen neposredno pre upotrebe jednom tabletom inhibitora proteaze bez EDTA [Roche Molecular Sciences] na 50 ml) i vibriranjem 5 min na sobnoj temperaturi. Dodali smo 200 ul pufera za razređivanje (50 mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaVCv) svakoj od čašica i mešali pipetom. Preneli smo 100 ul lizata iz svake čašice u svaku od čašica ELISA prihvatne ploče pripremljene kako je napred opisano i inkubirali laganim vibriranjem tokom dva časa na sobnoj temperaturi.
ELISA sa anti- tirozin- fosfat ( pTYR) antitelima
Uklonili smo lizate ćelija prevrtanjem ploča, isprali ploče pet puta puferom za pranje i sušili na papirnim ubrusima. Dodali smo po čašici 100 ul pTYR-specifičnog antitela (HRP-PY54) razređenog u puferu za blokiranje do koncentracije od 0,2 p.g/ml i inkubirali ploče vibriranjem u toku 30 min na sobnoj temperaturi. Potom smo isprali te ploče puferom za pranje pet puta i sušili na papirnim ubrusima.
Otkrili smo vezivanje HRP-PY54 antitela dodavanjem 100 ul po čašici rastvora supstrata TMB peroksidaze (Kirkegaard & Perry) i inkubiranjem vibriranjem do pojave boje (oko 2-10 min). Prekinuli smo reakciju razvijanja boje dodavanjem 100 ul po čašici TMB rastvora za prekidanje (Kirkegaard & Perry). Potom smo vibrirali ploče 10 sekundi na sobnoj temperaturi da bi se rastvor promešao i kvantifikovali merenjem pri OD450nm-
Tabela II i slika 4 prikazuju rezultate ovog eksperimenta izvedenog sa nekoliko antitela prema ovom pronalasku. Rezultati ovog eksperimenta pokazuju sposobnost antitela prema ovom pronalasku da blokiraju aktiviranje IGF-IR posredstvom IGF-I, stoje prikazano povećanom fosforilacijom tirozina povezanom sa receptorom. Sem toga, ovi se rezultati mogu koristiti za kvantifikovanje relativne jačine antitela prema ovom pronalasku.
PRIMER IV: Blokiranje IGF-I/IGF-IR
vezivanja posredstvom antitela
Izvršili smo ELISA eksperimmente da bi kvantifikovali sposobnost antitela prema pronalasku da inhibira vezivanje IGF-I na IGF-IR u ispitivanju baziranom na ćelijama. Stavili smo IGF-IR transfektovane NIH-3T3 ćelije (5 x IO<4>/ml) u 100 ul DMEM sa velikim sadržajem glukoze dopunjen sa L-glutaminom (0,29 mg/ml), 10% toplotom dezaktiviranog FBS, i po 500 u g/ml geneticina, penicilina i streptomicina u ploče sa 96 čašica zaokrugljenog dna. Inkubirali smo ploče na 37°, u 5% CO2, preko noći da bi se ćelije pričvrstile. Uklonili smo medijum sa ploča i zamenili ga sa 100 ul svežeg medijuma za rašćenje po čašici. Za ispitivanje, razblažili smo antitela u medijum za ispitivanje (DMEM medijum sa velikim sadržajem glukoze dopunjen sa L-glutaminom, 10% toplotom dezaktiviranog FBS, 200 ug/ml BSA i po 500 ug/ml geneticina, penicilina i streptomicina) na željenu krajnju koncentraciju i dodali po 50 u.1 u svaku čašicu. Svi su uzorci izvedeni u triplikatu. Potom smo ploče inkubirali deset minuta na 37°C. Razblažili smo [<123>J]-IGF-I u medij umu za ispitivanje do koncentracije od 1 u.Ci/ml i dodali 50 ul u svaku čašicu na ploči. Kao kontrolu drugostepene radioaktivnosti, dodali smo hladan IGF-I do konačne koncentracije od 100 ng/ml. Inkubirali smo ploče 10 minuta na 37°C, uklonili medijum laganim upijanjem pomoću papirnih ubrusa i dva puta isprali ispitnim medijumom. Potom smo umrtvili ćelije dodavanjem 50 u.1 0,1 N NaOH, 0,1% SDS i vibriranjem ploča tokom pet minuta na sobnoj temperaturi. Potom smo prebacili uzorke na jednu scintilacionu ploču, dodali 150 ul OptiPhase Supermix-a i očitali signal najednom Wallac Micro-Beta brojaču.
Tabela III i slika 3 prikazuju rezultate ovog eksperimenta izvedenog sa tri reprezentativna antitela prema pronalasku. Ovaj je eksperiment pokazao da antitela prema pronalasku specifično inhibiraju vezivanje [<125>J]-IGF-I na ćelije koje prekomerno eksprimiraju IGF-IR.
PRIMER V: Studije mapiranja epitopa
Pošto je pokazano da antitela prema pronalasku prepoznaju IGF-IR, vršili smo studije mapiranja epitopa sa nekoliko antitela prema pronalasku. Ove smo eksperimente posebno usmerili na antitela 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2.
Izvršili smo BIAcore uporedne studije da utvrdimo da li se antitela prema ovom pronalasku vezuju na isto ili na neko određeno mesto na IGF-IR molekulu. Vezali smo vanćelijski domen (ECD) od IGF-IR na jedan BIAcore senzorski čip kako je opisano u Primeru II. Vezali smo prvo antitelo prema pronalasku na IGF-IR vezan na taj senzorski čip pod uslovima zasićenja. Potom smo merili sposobnost sledećih sekundarnih antitela prema pronalasku da se porede sa primarnim antitelom u pogledu vezivanja za IGF-IR. Ova nam je tehnika omogućila da raspodelimo antitela prema pronalasku u različite grupe vezivanja.
Ovaj smo eksperiment izvodili sa antitelima 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2. Zapazili smo da se 2.13.2 i 4.9.2 nadmeću za isto mesto na vanćelijskom domenu IGF-IR. Druga antitela, 2.12.1 i 2.14.3, vezuju se za mesta na IGF-IR koja se razlikuju međusobno i od mesta za koje se vezuju 2.13.2 i 4.9.2.
PRIMER VI: Unakrsna reaktivnost antitela prema pronalasku na nivou vrste
Da bi utvrdili sposobnost međusobnog reagovanja vrsta za antitela prema pronalasku, izveli smo nekoliko eksperimenata uključujući imunoprecipitaciju, blokiranje posredstvom antitela fosforilacije receptora izazvane od IGF-IR i FACS analizu.
Da bi izveli eksperimente sa imunoprecipitacijom, stavitili smo ćelije u ploče sa čašicama u DMEM medijum sa velikim sadržajem glukoze dopunjen sa L-glutaminom (0,29 mg/ml), 10% toplotom dezaktiviranog FBS, i po 500 ug/ml geneticina, penicilina i streptomicina do 50% popunjenosti u T25 bocama. Potom smo dodali 100 ul jednog antitela prema pronalasku u Hank-ovom puferovanom slanom rastvoru (HBSS; Gibco BRL) pri koncentraciji od 1 ug/ml. Inkubirali smo ploče 30 minuta na 37°C u jednom inkubatoru pa smo stimulisali ćelije sa IGF-I pri 100 ng/ml tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Usmrtili smo ćelije u RIPA puferu (Harlow and Lane, kao napred) i imunoprecipirali IGF-IR sa 2 ug pan-specifičnog SC-713 anti-IGF-IR antitela (Santa Cruz) agarozne granule proteina A tokom 1 časa na 4°C. Tabletirali smo granule i isprali tri puta sa PBS/T (PBS+0,1% Tween 20) a potom isprali granule u 40 ul Laemmli-jevog pufera koji je sadržao 5% BME.
Uzorci pripremljeni kako je napred opisano bili su analizirani postupkom "Westem blot". Stavili srno po 12 ul svakog od uzoraka po traci na Novex™ gelovima, pod nagibom od 4-10%, aktiviranim IX MES puferom (Novex™). Gelovi su bili izloženi naponu od 150 V tokom 1 časa ili 200 V oko 30 minuta. Potom smo prebacili gel na jednu membranu u Novex™ transfernom puferu sa 10% metanola, bilo preko noći pri 100 mA, ili tokom 1-1,5 časa pri 250 mA. Pustili smo da se membrana potpuno osuši i blokira na sobnoj temperaturi sa TBS (Tris-puferovan slani rastvor pH 8.0) koji je sadržao Superblock (Pierce Chemical Co.). Dodali smo antitelo SC713 (Santa Cruz) koje obeležava IGF-IR kako bi otkrili imunoprecipiran IGF-IR.
Ovaj je eksperiment izveden sa antitelima prema pronalasku, posebno sa 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 i 4.9.2, na ćelijama raznih životinja. Utvrdili smo da se antitela 2.12.1, 2.13.2 i 4.9.2 mogu vezati za humani IGF-IR, ali ne ina IGF-IR psa, zamorca, kunića. Dalje je utvrđeno da se ta antitela mogu vezati sa COS7 i Rezus IGF-IR, oba izvedena od majmuna iz starog sveta, ali ne sa IGF-IR marmozeta koji je majmun iz novog sveta. Ovi eksperimenti ukazuju da su antitela veoma specifična.
Antitelom posredovano blokiranje vezivanja
IGF- I/ IGF- IR kod ne- humanih primata
Polazeći od zapažanja da antitela prema pronalasku prepoznaju IGF-IR od majmuna iz starog sveta, mi smo takođe proveravali njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje IGF-I/IGF-IR u ćelijama izvedenim od ovih majmuna iz starog sveta. Stavitili smo ćelije u ploče sa čašicama u DMEM medijum sa velikim sadržajem glukoze dopunjen sa L-glutaminom, 10% toplotom dezaktiviranog FBS, i po 500 u.g/ml geneticina, penicilina i streptomicina do 50% popunjenosti u T25 bocama. Potom smo dodali jedno antitelo prema pronalasku, ili medijum bez antitela kao kontrolu, i stimulisali ćelije sa IGF-I pri 100 ng/ml tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Posle stimulisanja ćelije smo usmrtili i imunoprecipirali IGF-IR da pan-specifičnim IGF-IR antitelom SC713, kako je napred opisano. Potom smo izveli "Western blot" analizu kako je napred opisano, koristeći HRP-PY54 antitelo radi detektovanja fosforilovanog tirozina u aktivisanom IGF-IR.
Zapazili smo da antitela prema ovom pronalasku, naročito 2.13.2 i 4.9.2 mogu blokirati fosforilaciju IGH-IR koju izaziva IGF-I i n COS7 i u Rhesus ćelijama. Za zapaženo inhibiranje, ICsoje bilo 0,02 ug/ml i 0,005 ug/ml zaCOS7, odnosno Rhesus IGF-IR.
Utvrđivanje afiniteta antitela prema pronalasku
prema drugim vrstama
Izvršili smo FACS analizu da odredimo afinitet za IGF-IR od drugih životinja, posebno od majmuna iz starog sveta, kako su napred opisani. Inkubirali smo jednake količine humanih i majmunskih ćelija (5 x IO3) 1 čas na ledu sa povećavanim koncentracijama biotinilovanih anti-IGF-IR antitela prema pronalasku ili sa biotinilovanim anti-hemocijanin prstaca/prilepaka (KLH) antitelom (Abgenix) kao negativnom kontrolom. Potom smo inkubirali uzorke 30 minuta na ledu sa streptavidin-konjugovanim RPE (fikoeritrin). Merili smo vezivanje protočnom citometrijom i analizirali histograme intenziteta fluorescencije (F12-H) u odnosu na broj ćelija (Counts) koristeći CellQuest softver. Izračunali smo vezivanje (Kd) za svako antitelo iz grafikona srednjeg intenziteta fluorescencije u odnosu na koncentraciju antitela. U najvećem delu eksperimenata merili smo vezivanje gajenih humanih MCF-7 ćelija i ćelija iz kulture tkiva rezus majmuna ili pavijana. Kontrolisali smo gubitak antitela merenjem vezivanja u jednom opsegu koncentracija ćelija.
Napred pomenutu FACS analizu vršili smo da bi proverili sposobnost antitela prema pronalasku, naročito 2.13.2 i 4.9.2, da vezuju ćelije čoveka, rezus majmuna i pavijana. Zapazili smo polumaksimalno vezivanje (Kj) od 0,1 ug/ml za sve ispitivane linije ćelija.
PRIMER VII: Regulisanje IGF- I receptora na nižu vrednost
Izvršili smo eksperimente blokiranja u suštini kako su napred opisani u Primeru IV sve do dodavanja IGF-I označenog sa [ J], Tada smo kuvali čelije u 40 ul Laemmli-jevog pufera koji je sadržao 50% me. Potom smo uzorke analizirali "vvestern blot" analizom, kako je opisano napred u Primeru VI, i pretražili mrlje i sa pan-specifičnim IGF-IR antitelom SC713 da bi se kvantifikovali nivoi IGF-IR, i sa HRP-PY54 antitelom da bi se pratili nivoi fosforilovanog tirozina u aktiviranom IFG-IR.
Kao što je i ranije zapaženo (Primer III), zapazili smo blokiranje fosforilovanja IGF-IR izazvanog od IGF-I posle obrade ćelija jednim od antitela prema ovom pronalasku (Slika 4). Dalje smo zapazili da je ovo blokiranje fosforilacije izazvane od IGD-I praćeno regulisanjem IGF-IR u tim ćelijama na nižu vrednost. Videti, npr., sliku 4. Nivoi IGF-IR maksimalno su sniženi 16 časova posle stimulisanja sa IGF-I u prisustvu nekog antutela prema pronalasku.
PRIMER VIII: Uticaji antitela prema pronalasku na IGF- IRin vivo
Utvrdili smo da li će se uticaji antitela prema pronalasku na IGF-IR kako su opisani u prethodnim primerima pojavitiin vivo.Indukovali smo tumore kod atimičnih miševa prema objavljenim postupcima (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tvrosine phosphorvlation in human carcinomas with CP-358,774: Dvnamic of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice", .1. Pbarmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999). Ukratko, ubrizgali smo IGF-IR-transfektovane NIH-3T3 ćelije (5xl0<6>) potkožno u 3-4 nedelje stare atimične (nu/nu) miševe sa 0,2 ml "Matrigel" preparata. Potom smo miševima ubrizgali intraperitonalno antitelo prema pronalasku pošto je utvrđeno da su se obrazovali tumori odgovarajuće veličine (tj. oko 400 mm<3>).
Posle 24 časa izvadili smo tumore, homogenizovali smo ih i odredili nivo IGF-IR. Da bi odredili nivoe IGF-IR, rastvorili smo antitelo SC-713 u puferu za blokiranje do neke krajnje koncentracije u pg/ml i dodali po 100 ul u svaku od čašica jedne ploče obložene sa "Reacti-Bind Goat anti-rabit (GAR)" (Pierce). Inkubirali smo ploče 1 čas na sobnoj temperaturi uz vibriranje pa smo isprali ploče pet puta sa puferom za ispiranje. Potom smo isprali uzorke tumora koji su bili pripremljeni kako je napred opisano i homogenizovali smo ih u puferu za razaranje (1 ml/100 mg). Razblažili smo 12,5 ul tumorskog ekstrakta sa puferom za razaranje do krajnje zapremine od 100 ul i to dodali u svaku čašicu jedne ploče sa 96 čašica. Inkubirali smo ploče na sobnoj temperaturi uz vibriranje, a u trajnju od 1 do 2 časa pa smo potom isprali ploče pet puta sa puferom za ispiranje. Potom smo dodali 100 ul HRP-PY54 ili biotilovanog anti-IGF-IR antitela u puferu za blokiranje u svaku od čašica i inkubirali na sobnoj temperaturi 30 minuta uz vibriranje. Potom smo isprali ploče pet puta sa puferom za ispiranje i razvili ploče. Ploče obrađene sa HRP-PY54 razvili smo dodavanjem 100 pl TBM microvvell supstrata po čašici i zaustavili razvoj boje dodavanjem 100 ul 0,9 M H2SO4. Potom smo kvantifikovali signal vibriranjem u trajanju 10 sekundi i merenjem OD450nm- Signal je normalizovan do ukupnog proteina. Ploče obrađene sa ant-IGF-IR antitelom razvili smo dodavanjem 100 ul streptavidin-HRP razblaženog u puferu za blokiranje u svaku od čašica, inkubirali na sobnoj temperaturi sa 30 minuta vibriranja, a potom nastavili kako je opisano za HRP-PY54.
Zapazili smo da su intraperitonalne injekcije jednog antitela prema ovom pronalasku, posebno 2.13.2 i 4.9.2, dovele do inhibiranja delovanja IGF-IR mereno smanjenjem i IGF-IR fosfotirozina (fosforilovanog IGF-IR) i ukupnog proteina (slika 6). Pored toga, zapazili i smanjenje kod IGF-IR fosfotirozina (fosforilovanog IGF-IR) (slika 5). Bez želje za vezivanje za bilo koju teoriju, smanjeni nivoi IGF-IR fosfotirozina mogu biti posledica smanjenih nivoa IGF-IR proteina in vivo posle obrade antitelom ili može biti posledica kombinovanja smanjenih nivoa IGF-IR proteina i smanjenja u fosforilaciji tirozina na postojećem IGF-IR zbog blokiranja aktivisanja ligandima (npr., IGF-I ili IGF-II). Pored toga, to inhibiranje reaguje na dozu ubrizganog antitela (slika 6). Ovi podaci pokazuju da su antitela prema pronalasku sposobna da se usmere na IGF-IRin vivona analogan način kako je zapaženoin
vitro.
PRIMER IX: Inhibiranje rasta ( TGI) 3T3/ IGF- IR tumorskih ćelija
Ispitivali smo da li će anti-IGF-IR antitela prema pronalasku funkcionisati tako da inhibiraju rast tumora. Izazvali smo tumor kako je napred opisano (Primer VIII) i kada smo ustanovili da su obrazovani opipljivi tumori (tj. 250 mm<3>, u roku od 6 do 9 dana), dali smo miševima jednu jedinu dozu od 0,20 ml antitela intraperitonalnom injekcijom. Veličinu tumora merili smo nonijusom (kljunastim merilom) preko dva prečnika svaki treći dan, a potom proračunavali zapreminu koristeći formulu (dužina x [širina]<2>)/2, koristeći postupke koje su ustanovili Geran, et al, "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological svstems", Cancer Chemother. Rep. 3:1-104.
Kada smo izvršili ovu analizu sa jednim od antitela prema pronalasku, našli smo daje jedno jedino davanje samo antitela 2.13.2 inhibiralo rast tumora izazvanih IGF-IR-transfektovanim NIH-3T-3 ćelijama (slika 7, levi deo). Dalje smo, kod studija kombinacija sa jednom jedinom dozom od 7,5 mg/kg intravenski unetog adriamicina, zapazili daje davanje jedne jedine doze 2.13.2 pojačalo efikasnost adriamicina, poznatog inhibitora rasta tumora. Kombinacija adriamicina sa jednim od antitela prema pronalasku, 2.13.2, pokazala je zadr-žavanje rasta od 7 dana u odnosu na primanje samo antitela ili samo adriamicina (slika 7, desni deo).
PRIMER X: Odnos nivoa antitela prema regulisanju na nižu vrednost IGF- IR
Tumori su izazvani u miševima bez imunskog sistema, kako je opisano u Primeru VIII. Miševi su onda tretirani intraperitonalnom injekcijom od 125 ug 2.13.2, kako je opisano u Primeru VIII. Tumori su izvađeni i nivoi IGF-IR mereni su postupkom ELISA, kako je opisano u Primeru VIII. Slika 8 prikazuje nivoe u serumu antitela 2.13.2 i IGF-IR receptora u funkciji vremena. Eksperimenti su pokazali da se IGF-IR reguliše na nižu vrednost pomoću antitela i daje korak inhibiranja IGF-IR proporcionalan koncentraciji antitela u serumu.
PRIMER XI: Inhibiranje rasta 3T3/ IGF- IR tumora višestrukim dozama antitela
u kombinaciji sa adriamicinom
Tumori su izazvani u miševima bez imunskog sistema, kako je opisano u Primeru IX. Miševi sa utvrđenim potkožnim tumorima od oko 250 mm<3>lečeni su dana 1, 8, 15 i 22 raznim količinama antitela 2.13.2 (i.p.) ili 7,5 mg/kg adriamicina (i.v.), bilo kao pojedinačnim agensima ili u kombinaciji, kako je opisano u Primeru IX. Slika 9 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje jednim anti-IGF-IR antitelom davanim svakih sedam dana inhibira rašćenje tumorskih ćelija i pojačava inhibiranje rasta tumorskih ćelija u kombinaciji sa adriamicinom, poznatim tumorskim inhibitorom.
PRIMER XII: Inhibiranje rasta velikih tumora
Tumori su izazvani u miševima bez imunskog sistema, kako je opisano u Primeru IX. Miševi sa velikim utvrđenim potkožnim tumorima malo manjim od oko 2000 mm<3>lečeni su dana 1 i 8 raznim količinama antitela 2.13.2 (i.p.) ili 7.5 mg/kg adriamicina (i.v.), bilo kao pojedinačnim agensima ili u kombinaciji, kako je opisano u Primeru IX. Slika 10 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Kontrole kod grupa životinja sa davanjem samo antitela i samo adriamicina završene su 5. dana kad je veličina tumora prelazila 2000 mm<3>. Eksperiment pokazuje daje lečenje anti-IGF-IR antitelom u kombinaciji sa adriamicinom visoko efikasno protiv velikih tumora kada se daju višestruke doze.
PRIMER XIII: Sprečavanje rasta kolorektalnih tumorskih ćelija
Tumori su izazvani u miševima bez imunskog sistema, kako je opisano u Primeru IX sem što su primenjenje Colo 205 ćelije (ATCC CCL 222). Colo 205 ćelije su ćelije humanog kolorektalnog adenokarcinoma. Miševi sa utvrđenim potkožnim tumorima od oko 250 mm<3>lečeni su raznim količinama antitela 2.13.2 (i.p.) ili sa 100 mg/kg 5-fluordeoksiuridina (5-FU, i.v.), bilo kao pojedinačnim agensima ili u kombinaciji, kako je opisano u Primeru IX. Slika 11 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje jednim anti-IGF-IR antitelom davanim jednom inhibira rašćenje humanih kolorektalnih kanceroznih ćelija kada deluje kao jedini agens i pojačava efikasnost 5-FU, poznatog tumorskog inhibitora.
Miševi sa utvrđenim Colo 205 tumorima lečeni su dana 1, 8, 15 i 22 sa 500 ug 2.13.2 (i.p), 100 mg/kg 5-FU (i.v.) ili nekom njihovom kombinacijom. Slika 12 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje jednim anti-IGF-IR antitelom davanim svakih sedam dana inhibira rašćenje humanih kolorektalnih kanceroznih ćelija i pojačava efikasnost 5-FU.
PRIMER XIV: Inhibiranje tumorskih ćelija raka dojke
Miševima bez imunskog sistema, opisanim u Primeru VIII, implantirana su biološki razgradljiva zrnca estrogena (zrnca 17-B-estradiola od 0,72 mg, koja se ispuštaju tokom 60 dana; Innovative Research of America). Posle 48 časova, kod miševa bez imunskog sistema izazvani su tumori, u suštini kako je opisano u Primeru IX, sem što su korišćene MCF-7 ćelije (ATCC HTB-22). MCF-7 ćelije su čelije humanog raka dojke zavisne od estrogena. Miševi kod kojih su utvrđeni potkožni tumori od oko 250 mm<3>lečeni su sa 50 ug antitela 2.13.2 (i.p.) u dane 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 i 22 (svakog 3. dana, 7 puta), ili sa 6,25 mg/kg taksola (i.p.) u dane 1, 2, 3, 4, 5 (svakog dana, 5 puta), bilo kao pojedinačni agensi, bilo u kombinaciji, u suštini kao što je opisano u Primeru IX. Slika 13 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje samo jednim anti-IGF-IR antitelom davanim jednom u tri dana inhibira rašćenje humanih ćelija raka dojke, a takođe pojačava efikasnost taksola, poznatog inhibitora raka dojke, kada se daje u kombinaciji.
Miševi kod kojih su utvrđeni tumori od MCF-7 ćelija, kako je neposredno napred opisano, lečeni su dana 1 sa različitim količinama samo antitela 2.13.2 (i.p.), ili sa 3,75 mg/kg adriamicina (i.v.), u suštini kao što je opisano u Primeru IX. Slika 14 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje samo jednim anti-IGF-IR antitelom davanim samo jednom, inhibira rašćenje humanih ćelija raka dojke i pojačava efikasnost adriamicina, poznatog inhibitora tumora.
Miševi kod kojih su utvrđeni tumori od MCF-7 ćelija, kako je neposredno napred opisano, lečeni su sa 250 ug antitela 2.13.2 (i.p.) u dane 1, 8, 15 i 23, ili sa jednom biološki razgradljivom granulom tamoksifena (25 mg/granula, slobodna baza, ispuštanje 60 dans, Inovative Research of America), bilo kao pojedinačni agensi, bilo u kombinaciji, u suštini kao stoje opisano u Primeru IX. Tamoksifen granula je implantirana dana 1 nakon što je utvrđen tumor. Slika 15 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje jednim anti-IGF-IR antitelom davanim samo jednom svakih, sedam dana samo po sebi inhibira rašćenje humanih ćelija raka dojke i pojačava efikasnost tamoksifena, poznatog inhibitora tumora.
PRIMER XVI: Inhibiranje rasta tumorskih ćelija karcinoma epiderma
Tumori su izazvani u miševima bez imunskog sistema, kako je u suštini opisano u Primeru IX sem što su primenjene A431 ćelije (ATCC CRL 1555). A431 ćelije su ćelije humanog karcinoma epiderma koje prekomerno eksprimiraju EGFR. Miševi sa utvrđenim potkožnim tumorima od oko 250 mm<3>lečeni su dana 1,8, 15, 22 i 29 sa 500 u.g antitela 2.13.2 (i.p.) ili su lečeni jednom dnevno tokom 27 dana sa 10 mg/kg CP-358,774 davanim oralno (p.o.), bilo kao pojedinačnim agensima ili u kombinaciji, kako je opisano u Primeru IX. CP-358,774 opisan je u SAD patentu 5,747,498 i kod Moyer et al., Cancer Research 57: 4838-4848 (1997), ovde uključenim kao literatura. Slika 16 prikazuje veličinu tumora u odnosu na različita lečenja u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje da lečenje jednim anti-IGF-IR antitelom pojačava efikasnost CP-358,774, poznatog inhibitora SGF-R tirosinske kinaze, na inhibiranju rasta tumora humanog karcinoma epiderma.
PRIMER XVII: Farmakokinetika anti- IGF- IR antitela in vivo
Da bi se ocenila farmakokinetika anti-IGF-IR antitela, majmunima pavijanima ubrizgano je intravenski 3, 30 ili 100 mg/kg antitela 2.13.2 u jednom acetatnom puferu. Serum je uziman od majmuna u različitim vremenskim intervalima i koncentracije anti-IGF-IR antitela u majmunima određene su za nivoe u periodu do deset nedelja. Da bi se kvantifikovali funkcionalni nivoi antitela u serumu, vanćelijski domen humanog IGF-IR (IGF-I-sR, R&D Svstems, Catalog #391 GR) vezano je na ploče sa 96 čašica. Serum majmuna (razređen iz-među 1:100 i 1:15 000) dodavan je pločama za ispitivanje tako da svaki od uzoraka bude unutar linearnog opsega standardne krive i inkubisan pod uslovima u kojima će bilo koje anti-IGF-IR antitelo vezivati na IGF-I-sR. Posle ispiranja ploča, pločama je dodano jedno obele-ženo anti-humano IgG antitelo i ploče su inkubirane pod uslovima u kojima će se anti-humano IgG antitelo vezati za anti-IGF-IR antitelo. Ploče su potom isprane i razvijene, pa su korišćene jedna kontrolna standardna kriva i elementi linearne regresije da bi se kvantifikovala količina anti-IGF-IR antitela. Slika 17 prikazuje koncentraciju antitela 2.13.2 u serumu u funkciji vremena. Eksperiment pokazuje daje poluživot anti-IGF-IR antitela 4,6 do 7,7 dana i da ima zapreminsku raspodelu od 74-105 mL/kg. Dalje je eksperiment pokazao da su dobijene količine proporcionalne dozama u majmunima, što ukazuje da je anti-IGF-IR antitelo zasitilo sva raspoloživa mesta za vezivanje IGF-IR u telu, čak i pri najnižoj dozi od 3 mg/kg.
PRIMER XVIII: Kombinovana terapija sa anti- IGF- IR antitelom i adriamicinom
reguliše naniže vrednost IGF- IR in vivo
Tumori su izazvani kod miševa bez imunskog sistema kako je opisano u Primeru IX Miševi sa utvrđenim potkožnim tumorima od oko 400 mm<3>lečeni su jednom jedinom inekcijom sa 250 ug antitela 2.13.2 (i.p.) ili 7,5 mg/kg adriamicina (i.vo.), bilo kao pojedinačnim agensima ili u kombinaciji, kako je opisano u Primeru IX. 72 časa posle davanja agensa, tumori su izvađeni kako je opisano u Primeru VIII, pa su jednake količine tumorskoh ekstrata podvrgnute elektroforezi sa natrijum dodecil fosfat poliakrilamidnim gelom (SDS PAGE) i "vvestem blot" analizi koristeći anti-IFG-IR antitelo SC-713 (Santa Cruz). Slika 18 prikazuje količine IGF-IR u tumorskim ćelijama u kontrolnim životinjama (prva tri polja u svakoj traci), kod životinja lečenih samo antitelom (gornja traka), kod životinja lečenih samo adriamicinom (srednja traka), i kod životinja lečenih antitelom i adriamicinom (donja traka). Svaka od traka predstavlja jednake količine proteina iz pojedinačnih tumora pojedinačnih miševa. Eksperiment ukazuje da lečenje samo adriamicinom ima mali uticaj na nivoe IGF-IR a da lečenje samo antitelom ukazuje neko smanjenje nivoa IGF-IR. Iznenađujuće je da lečenje sa adriamicinom i antitelom zajedno ukazuje na dramatično smanjenje nivoa IGF-IR, čime dokazuje da adriamicin i antitelo veoma

Claims (36)

1. Humano monoklonsko antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena koje se specifično vezuje na insulinu sličan faktor rasta I receptor (IGF-IR), gde navedeno antitelo sadrži težak lanac i lak lanac; pri čemu navedeni lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ne više od deset aminokiselinskih izmena u aminokiselinskoj sekvenci koju kodira humani gen germinativne linije Vk A30; i pri čemu se aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog teškog lanca i aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog lakog lanca respektivno biraju iz grupe koja se sastoji od: a) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792); b) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788); c) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela 2.14.3 (ATCC pristupni broj PTA-2790); d) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela 4.9.2 (ATCC pristupni broj PTA-2789); e) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 4 i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 2; f) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 8 i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 6; g) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 12 i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 10; h) aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 16 i aminokiselinskih sekvenci CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 14.
2. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 1, naznačeno time, što laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu biranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 14, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima 1-10 aminokiselinskih insercija, delecija ili supstitucija iz nje.
3. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 1, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca čija sekvenca sadrži ne više od osam aminokiselinskih izmena od aminokiselinske sekvence kodirane genom germinativne linije VHDP47, DP35, ili VTV-4.
4. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 3, naznačeno time, što težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu biranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, i SEQ ID NO: 16, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima 1-10 aminokiselinskih insercija, delecija ili supstitucija iz nje.
5. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 1, naznačeno time, što navedeni težak lanac i navedeni lak lanac sadrže aminokiselinske sekvence respektivno birane iz grupe koja se sastoji od: a) aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca antitela 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792); b) aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca antitela 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788); c) aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca antitela 2.14.3 (ATCC pristupni broj PTA-2790); d) aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca i aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca antitela 4.9.2 (ATCC pristupni broj PTA-2789); e) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 4 i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 2; f) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 8 i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 6; g) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 12 i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 10; h) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 16 i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 14.
6. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što se bira iz grupe koja se sastoji od 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792), 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788), 2.14.3 (ATCC pristupni broj PTA-2790), i 4.9.2 (ATCC pristupni broj PTA-2789).
7. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što sadrži težak lanac i lak lanac, pri čemu su aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca birane iz grupe koja se sastoji od: a) aminokiselinske sekvence teškog lanca i aminokiselinske sekvence lakog lanca od 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792); b) aminokiselinske sekvence teškog lanca i aminokiselinske sekvence lakog lanca od 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788); c) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 45 bez signalne sekvence i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 47 bez signalne sekvence, i d) aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 49 bez signalne sekvence i aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 51 bez signalne sekvence.
8. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što navedeni težak lanac sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 4, i što navedeni lak lanac sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 2.
9. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 8, naznačeno time, što navedeni težak lanac sadrži SEQ ID NO: 4 a navedeni lak lanac sadrži SEQ ID NO: 2.
10. Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje na IGF-IR, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 49 bez signalne sekvence, i što navedeno antitelo dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 51 bez signalne sekvence.
11. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što navedeni težak lanac sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ ID NO: 8, i što navedeni lak lanac sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 iz SEQ DD NO: 6.
12. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 11, naznačeno time, što navedeni težak lanac sadrži SEQ ID NO: 8 a navedeni lak lanac sadrži SEQ ID NO: 6.
13. Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za IGF-IR, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 45 bez signalne sekvence, i što navedeno antitelo dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 47 bez signalne sekvence.
14. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 1, naznačeno time, što antitelo ili njegov deo ima bar jedno od svojstava izabranih iz grupe koju čine sledeća svojstva: a) sukobljava se za vezivanje za IGF-IR sa jednim antitelom biranim iz grupe koja se sastoji od 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792), 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788), 2.14.3 (ATCC pristupni broj PTA-2790), i 4.9.2 (ATCC pristupni broj PTA-2789), b) vezuje se za isti epitop od IGF-IR kao antitelo birano iz grupe koja se sastoji od 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, c) vezuje se za isti antigen kao što je onaj vezan antitelom biranim iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, d) vezuje se za IGF-IR sa u suštini istim K? kao antitelo birano iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, i e) vezuje se za IGF-IR u suštini istom izlaznom brzinom kao antitelo birano iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2.
15. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 14, naznačeno time, što antitelo ili njegov deo sadrži sva od navedenih svojstava.
16. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 1, naznačeno time, što antitelo ili njegov deo ima bar jedno svojstvo izabrano iz sledeće grupe: a) ne vezuje se za IGF-IR miša, pacova, psa ili kunića, m Cl- C\uš b) vezuje se za IGF-IR pavijanp ili rezus majmuna ali ne i za IGF-IR marmozeta, c) inhibira vezivanje IGF-I ili IGF-II za IGF-IR, d) ima selektivnost za IGF-IR koja je bar 50 puta veća od njegove selektivnosti za insulinski receptor, e) inhibira rast tumora in vivo, f) izaziva nestanak IGF-IR sa površine ćelije kada se inkubira sa ćelijom koja eksprimira IGF-IR, g) inhibira tirozinsku fosforilaciju koju izaziva IGF-IR, h) vezuje se za IGF-IR sa Kdod 8 x IO"<9>M ili manjim, i i) ima konstantu izlazne brzine IGF-IR od Koff jednako IO"4 s"1 ili manju.
17. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 16, naznačeno time, što antitelo ili njegov deo ima sva navedena svojstva.
18. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema zahtevu 16, naznačeno time, što antitelo ili njegov deo inhibira vezivanje IGF-I ili IGF-II za IGF-IR i vezuje se za IGF-IR sa Kdod 8 x IO"<9>M ili manjim.
19. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-18, naznačeno time, što navedeno antitelo ili njegov deo inhibira vezivanje između IGF-IR i IGF-I ili IGF-II sa IC50od 100 nM ili manjim.
20. Antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-19, naznačeno time, daje a) imunoglobulin G(IgG), IgM, IgE, IgA ili IgD molekul, ili je iz njih izveden, ili b) Fab fragment, F(ab')2fragment, Fvfragment, jednolančano antitelo, humanizirano antitelo, himerno antitelo ili jedno dvospecifično antitelo.
21. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov deo prema bilo kom od zahteva 1-20 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
22. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21, koja još sadrži anti-neoplastično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, anti-angiogeničko sredstvo ili sredstvo protiv tumora.
23. Postupak za izradu antitela prema bilo kom od zahteva 1-20, koji obuhvata sledeće korake: a) imunizovanje ne-humanog sisara imunogenom koji sadrži IGF-IR, pri čemu je sisar u stanju da ekprimira humana antitela u svojim B ćelijama, b) izdvajanje B ćelija iz sisara, c) pretraživanje navedenih B ćelija ili iz njih izvedenih ćelijskih linija da bi se identifikovala ćelijska linija koja proizvodi antitela koja se vezuju za IGF-IR, d) gajenje ćelijske linije koja eksprimira antitela koja se vezuju za IGF-IR, i e) izdvajanje antitela koja se vezuju za IGF-IR iz ćelijske linije.
24. Izdvojena ćelijska linija koja proizvodi antitela prema bilo kom od zahteva 1-20.
25. Ćelijska linija prema zahtevu 24, naznačena time, što proizvodi antitelo birano iz grupe koja se sastoji od 2.12.1 (ATCC pristupni broj PTA-2792), 2.13.2 (ATCC pristupni broj PTA-2788), 2.14.3 (ATCC pristupni broj PTA-2790), i 4.9.2 (ATCC pristupni broj PTA-2789), ili antitelo sa istim aminokiselinskim sekvencama kao odabrano antitelo.
26. Upotreba antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 20, za proizvodnju leka za dijagnoziranje prisustva ili lokacije jednog IGF-IR koji eksprimira tumor kod subjekta kome je to takvo dijagnoziranje potrebno, pri čemu to dijagnoziranje obuhvata korake a) ubrizgavanja antitela ili njegovog dela subjektu, b) određivanje ekspresije IGF-IR u subjektu određivanjem mesta gde se vezalo antitelo ili njegov deo, c) poređenje ekspresije u delu (b) sa ekspresijom kod nekog normalno referentnog subjekta ili standarda, i d) dijagnoziranje prisustva ili lokacije tumora.
27. Upotreba antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-20 za proizvodnju leka za lečenje kancera u čoveku, pri čemu to lečenje obuhvata korak davanja čoveku jedne količine antitela ili njegovog dela koja je efikasna za lečenje tog kancera.
28. Upotreba antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-20 za proizvodnju leka za lečenje pacijenta kome je potrebno takvo antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena, pri čemu to lečenje obuhvata korak davanja pacijentu jedne delotvorne količine antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena.
29. Upotreba prema zahtevu 27 ili 28, kada to lečenje obuhvata i korak davanja nekog antineoplastičnog sredstva, protivtumorskog sredstva, anti-angiogeničkog sredstva ili hemoterapeutskog sredstva.
30. Izdvojen molekul nukleinske kiseline koji sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira težak lanac ili deo za vezivanje antigena ili kodira lak lanac ili deo za vezivanje antigena, antitela prema bilo kom od zahteva 1-20.
31. Izdvojen molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 30, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiseline biranu iz grupe koja se sastoji od: a) sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca ili dela za vezivanje antigena koja sadrži tri CDR aminokiselinske sekvence teškog lanca antitela biranog iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2, b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca ili dela za vezivanje antigena antitela biranog iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, c) sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca ili dela za vezivanje antigena koja sadrži tri CDR aminokiselinske sekvence lakog lanca antitela biranog iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, d) sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca ili dela za vezivanje antigena antitela biranog iz grupe koja se sastoji od 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, i 4.9.2, e) sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu biranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, i 16, i h) sekvence nukleinske kiseline birane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9,11,13,115, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline opciono sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 26.
32. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 30 ili 31, naznačen time, što taj vektor opciono obuhvata sekvencu za kontrolu ekspresije radno povezanu sa molekulom nukleinske kiseline.
33. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira težak lanac ili deo za vezivanje antigena i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira lak lanac ili deo za vezivanje antigena, antitela prema bilo kom od zahteva 1-20.
34. Postupak za izradu anti-IGF-IR antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena, koji obuhvata gajenje ćelije domaćina prema zahtevu 33 ili ćelijske linije prema zahtevu 24 pod pogodnim uslovima i izdvajanje navedenog antitela ili njegovog dela za vezivanje antigena.
35. Ne-humana transgena životinja koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira težak lanac ili deo za vezivanje antigena i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira lak lanac ili deo za vezivanje antigena, antitela prema bilo kom od zahteva 1-20, naznačena time, što ta ne-humana transgena životinja eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.
36. Upotreba izdvojenog molekula nukleinske kiseline za proizvodnju leka za lečenje subjekta, gde je izdvojeni molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe koja se sastoji od: a) izdvojenog molekula nukleinske kiseline koji kodira težak lanac ili deo za vezivanje antigena antitela prema bilo kom od zahteva 1-20 b) izdvojenog molekula nukleinske kiseline koji kodira lak lanac ili deo za vezivanje antigena antitela prema bilo kom od zahteva 1-20 c) izdvojenog molekula nukleinske kiseline oba a) i b).
YUP-542/03A 2001-01-05 2001-12-20 Antitela za insulinu sličan faktor rasta i receptor RS51373B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU54203A YU54203A (sr) 2006-03-03
RS51373B true RS51373B (sr) 2011-02-28

Family

ID=22987016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-542/03A RS51373B (sr) 2001-01-05 2001-12-20 Antitela za insulinu sličan faktor rasta i receptor

Country Status (52)

Country Link
US (7) US7037498B2 (sr)
EP (4) EP2796468A2 (sr)
JP (4) JP2004531217A (sr)
KR (1) KR100830082B1 (sr)
CN (2) CN1330668C (sr)
AP (1) AP2072A (sr)
AR (1) AR032028A1 (sr)
AT (1) ATE464322T1 (sr)
AU (1) AU2002231368C1 (sr)
BG (3) BG66460B1 (sr)
BR (2) BR0116728A (sr)
CA (1) CA2433800C (sr)
CR (4) CR7045A (sr)
CU (1) CU23447B7 (sr)
CZ (1) CZ301712B6 (sr)
DE (1) DE60141855D1 (sr)
DK (1) DK1399483T3 (sr)
DZ (1) DZ3494A1 (sr)
EA (1) EA012079B3 (sr)
EC (1) ECSP034711A (sr)
EE (2) EE05715B1 (sr)
ES (1) ES2344592T3 (sr)
GE (1) GEP20084484B (sr)
GT (1) GT200100257A (sr)
HK (1) HK1203521A1 (sr)
HN (1) HN2001000283A (sr)
HR (2) HRP20130659A2 (sr)
HU (1) HUP0302525A2 (sr)
IL (2) IL156661A0 (sr)
IS (1) IS2790B (sr)
MA (1) MA26040A1 (sr)
ME (1) ME00502B (sr)
MX (2) MX337162B (sr)
MY (1) MY143465A (sr)
NO (1) NO339789B1 (sr)
NZ (2) NZ527302A (sr)
OA (1) OA12589A (sr)
PA (1) PA8535501A1 (sr)
PE (1) PE20020801A1 (sr)
PL (3) PL224873B1 (sr)
PT (1) PT1399483E (sr)
PY (1) PY0132240A (sr)
RS (1) RS51373B (sr)
SG (1) SG138469A1 (sr)
SK (1) SK287954B6 (sr)
SV (1) SV2007000775A (sr)
TN (1) TNSN01177A1 (sr)
TW (1) TWI324609B (sr)
UA (1) UA87804C2 (sr)
UY (2) UY27087A1 (sr)
WO (1) WO2002053596A2 (sr)
ZA (1) ZA200305995B (sr)

Families Citing this family (307)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2796468A2 (en) 2001-01-05 2014-10-29 Pfizer Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
MY143582A (en) 2001-06-26 2011-05-31 Amgent Fremont Inc Antibodies to opgl
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
EP1806364B1 (fr) * 2002-01-18 2013-07-31 Pierre Fabre Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
AU2003237864B2 (en) * 2002-05-15 2008-12-18 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
NZ571508A (en) 2002-05-24 2010-05-28 Schering Corp Neutralizing human anti-IGFR antibody
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
AU2004303792A1 (en) * 2003-12-08 2005-07-07 Immunogen, Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
AU2003275240A1 (en) * 2002-09-24 2004-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
CA2514231A1 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Pfizer Products Inc. Uses of anti-insulin-like growth factor i receptor antibodies
CA2518980A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-30 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
US7378503B2 (en) 2003-04-02 2008-05-27 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
ES2338105T3 (es) * 2003-05-14 2010-05-04 Kenta Biotech Ag Anticuerpo monoclonal humano especifico para lipopolisacaridos (lps) de serotipo iats 06 pseudomonas aeruginosa.
US7579157B2 (en) 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DE602004029581D1 (de) * 2003-08-13 2010-11-25 Pfizer Prod Inc Modifizierte humane igf-1r antikörper
US7498415B2 (en) * 2003-09-24 2009-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
US20050187175A1 (en) * 2003-09-30 2005-08-25 Elly Nedivi Methods and compositions for CPG15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
TW200526684A (en) * 2003-11-21 2005-08-16 Schering Corp Anti-IGFR1 antibody therapeutic combinations
JP2007536254A (ja) * 2004-05-05 2007-12-13 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 生物活性を調節するための二重特異性結合剤
WO2006008639A1 (en) 2004-07-16 2006-01-26 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-igf-1r antibody
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
MX2007006640A (es) * 2004-12-03 2007-06-19 Schering Corp Biomarcadores para la preseleccion de pacientes para la terapia con anti-receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina.
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
EP3300739A3 (en) 2005-03-31 2018-07-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
AU2006236637B2 (en) * 2005-04-15 2012-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for treating or preventing cancer
KR101203328B1 (ko) 2005-04-26 2012-11-20 화이자 인코포레이티드 Ｐ-카드헤린 항체
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
ES2776657T3 (es) * 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
CN101287761A (zh) * 2005-06-15 2008-10-15 先灵公司 抗-igf1r抗体制剂
PT2100618E (pt) 2005-06-17 2014-04-07 Philadelphia Health & Educatio Um anticorpo anti-pdgfr-alfa para o tratamento de cancro ósseo metastático
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
HN2006031275A (es) 2005-09-07 2010-10-29 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
EP1957541A2 (en) 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
DK1979001T3 (da) 2005-12-13 2012-07-16 Medimmune Ltd Bindingsproteiner, der er specifikke for insulinlignende vækstfaktorer og anvendelser deraf
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP3360965A1 (en) 2006-01-20 2018-08-15 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
AU2007212447B2 (en) 2006-02-03 2013-02-21 Imclone Llc IGF-IR antagonists as adjuvants for treatment of prostate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
AU2007229554A1 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-IGF-1R human monoclonal antibody formulation
EA200802061A1 (ru) 2006-03-28 2009-04-28 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Антитело или его фрагмент, специфично связывающееся с рецептором 1 инсулиноподобного фактора роста (igf-r1) (варианты), композиция на его основе, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область антитела (варианты), содержащие полинуклеотид композиция (варианты) и вектор, содержащая вектор клетка-хозяин (варианты), способ продуцирования антитела или его фрагмента (варианты) и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у животного организма
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
EP3266867A1 (en) 2006-04-14 2018-01-10 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant alk kinase in human solid tumors
EA200802058A1 (ru) 2006-05-09 2009-06-30 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции
JP5399900B2 (ja) 2006-06-30 2014-01-29 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｇｆｂｐ２インヒビター
CN102123712B (zh) 2006-12-13 2014-03-19 默沙东公司 使用igf1r抑制剂治疗癌症的方法
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
KR20090114449A (ko) * 2007-02-14 2009-11-03 글락소 그룹 리미티드 Ｉｇｆ-ⅰｒ에 대한 항체
US20100323373A1 (en) * 2007-02-27 2010-12-23 Stefan Evers Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
WO2008108986A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Amgen Inc. Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
ES2529790T3 (es) 2007-04-13 2015-02-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Métodos de tratamiento de cáncer resistente a agentes terapéuticos de ERBB
US8492328B2 (en) 2007-05-17 2013-07-23 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
WO2009032145A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
US20090130105A1 (en) * 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
EP2197421A1 (en) * 2007-08-31 2010-06-23 Amgen, Inc Solid-state protein formulation
WO2009043049A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2203558B1 (en) 2007-10-18 2016-05-04 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
HUE032735T2 (en) 2007-12-14 2017-10-30 Bristol Myers Squibb Co Binding molecules for the human OX40 receptor
CA2709029A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Bianca Eser Stability testing of antibodies
CA2718918A1 (en) * 2008-03-25 2009-11-26 Schering Corporation Methods for treating or preventing colorectal cancer
JP5646457B2 (ja) 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
AR072000A1 (es) 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Proteinas de union multivalentes con capacidad de unir dos o mas antigenos y usos de la misma
BRPI0915448A2 (pt) 2008-07-08 2015-11-10 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo para prostaglandina e2 e usos das mesmas
ES2378513T3 (es) 2008-08-06 2012-04-13 Pfizer Inc. Compuestos 2-heterociclilamino piracinas sustituidas en posición 6 como inhibidores de CHK-1
AR074726A1 (es) 2008-12-12 2011-02-09 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf (factor de crecimiento insulinico)
DK2881402T3 (en) 2009-02-12 2017-08-28 Cell Signaling Technology Inc Mutant ROS expression in human liver cancer
ES2738700T3 (es) 2009-02-13 2020-01-24 Immunomedics Inc Inmunoconjugados con un enlace escindible intracelularmente
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
CN102481361B (zh) 2009-04-16 2014-10-22 默沙东公司 用于治疗癌症的组合物和方法
EA027071B1 (ru) * 2009-04-27 2017-06-30 Новартис Аг АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
EP4406615A3 (en) 2009-10-26 2024-12-11 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053779A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
JP6200806B2 (ja) 2010-05-21 2017-09-20 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 二重特異的融合タンパク質
HUE026173T2 (en) 2010-06-07 2016-05-30 Amgen Inc pharmaceutical Pump
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
PE20130643A1 (es) 2010-07-12 2013-06-07 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN103221428B (zh) 2010-09-09 2016-02-10 辉瑞公司 4-1bb结合分子
JP6073230B2 (ja) * 2010-09-28 2017-02-01 ノノ インコーポレイテッド Ｎｄ２ペプチドおよび神経疾患の治療方法
EP2640750A1 (en) * 2010-11-16 2013-09-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
EP2643694B1 (en) 2010-11-24 2018-01-03 Litron Laboratories Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
US20140037642A1 (en) 2011-02-02 2014-02-06 Amgen Inc. Methods and compositions relating to inhibition of igf-1r
EP2672999A2 (en) 2011-02-10 2013-12-18 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
US9402916B2 (en) 2011-03-17 2016-08-02 The University Of Birmingham Re-directed immunotherapy
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
AU2012236573B2 (en) 2011-03-31 2016-06-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
KR20140138353A (ko) * 2011-04-19 2014-12-03 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
TR201905991T4 (tr) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Oto enjektör aparatı.
CN103501825B (zh) 2011-05-02 2017-03-15 免疫医疗公司 用于小体积施用的同种异型选择的抗体的超滤浓缩
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
MX2014002289A (es) 2011-08-26 2015-03-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc Anticuerpos fc especificos en tandem.
BR112014006390A2 (pt) * 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
EP3045188B1 (en) 2011-10-14 2020-12-23 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2013060872A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CA2852127C (en) 2011-11-11 2020-10-27 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
KR101470700B1 (ko) * 2011-11-25 2014-12-12 서울대학교산학협력단 표적 항암제의 내성 극복 방법
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
DK2838998T3 (en) 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
CA2871711A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Pfizer Inc. Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
EP2863947B1 (en) 2012-06-21 2018-03-07 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind igf1r
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
CN104662045B (zh) 2012-08-07 2019-04-05 罗切格利卡特公司 包含两种工程化改造成具有降低的和升高的效应器功能的抗体的组合物改进的免疫疗法
EP2885002A4 (en) 2012-08-14 2016-04-20 Ibc Pharmaceuticals Inc BISPECIFIC ANTIBODIES REDIRECTED AGAINST T CELLS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
MY171664A (en) 2012-11-01 2019-10-22 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
EP2922590B1 (en) 2012-11-21 2020-02-05 Amgen Inc. Drug delivery device
KR102196374B1 (ko) 2012-11-29 2020-12-31 케모센트릭스, 인크. Cxcr7 길항제
AU2013360335B2 (en) 2012-12-13 2017-12-07 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
MX2015011712A (es) 2013-03-06 2016-04-04 Merrimack Pharmaceuticals Inc Anticerpos biespecificos fc en fila anti-c-met.
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
US10092703B2 (en) 2013-03-15 2018-10-09 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
SG11201507417RA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Body contour adaptable autoinjector device
TWI614041B (zh) 2013-03-15 2018-02-11 安美基公司 用於注射器之匣盒
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
FI3677591T3 (fi) 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
DK3007704T3 (da) * 2013-06-13 2021-03-29 Antisense Therapeutics Ltd Kombinationsterapi til akromegali
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
ES2993142T3 (en) 2013-10-01 2024-12-23 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
CA2920894C (en) 2013-10-24 2023-03-14 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3957345B1 (en) 2013-10-24 2025-12-10 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3094339B1 (en) 2014-01-12 2019-12-11 IGF Oncology, LLC Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
EP3107577B1 (en) 2014-02-21 2024-03-20 IBC Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
MX388536B (es) 2014-05-07 2025-03-20 Amgen Inc Autoinyector con elementos reductores del shock.
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
CN106470717B (zh) 2014-06-03 2020-09-11 安姆根有限公司 药物递送系统和使用方法
WO2015200260A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
CA2961774C (en) 2014-10-07 2023-05-23 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
EA037749B1 (ru) 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b
RU2711930C2 (ru) 2014-11-19 2020-01-23 Иммуноджен, Инк. Способ получения конъюгатов агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
CA3069716C (en) 2015-02-17 2021-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
TW201632559A (zh) * 2015-02-22 2016-09-16 索倫多醫療公司 結合ｃｄ１３７之抗體治療劑
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
US9797907B2 (en) 2015-04-22 2017-10-24 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating Trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
JP6980980B2 (ja) 2015-06-25 2021-12-15 イミューノメディクス、インコーポレイテッドImmunomedics, Inc. 抗ｈｌａ‐ｄｒまたは抗ｔｒｏｐ‐２抗体と微小管阻害剤、ｐａｒｐ阻害剤、ブルトンキナーゼ阻害剤またはホスホイノシチド３‐キナーゼ阻害剤との併用は癌の治療効果を有意に改善する
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CN115960249A (zh) 2015-10-02 2023-04-14 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
ES2908470T3 (es) 2015-11-09 2022-04-29 Scherer Technologies Llc R P Conjugados de anticuerpo anti-CD22-maitansina y métodos de uso de los mismos
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
AU2017213858A1 (en) 2016-02-05 2018-08-16 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
HRP20241557T1 (hr) 2016-03-10 2025-05-23 Acceleron Pharma Inc. Proteini koji vezuju receptor aktivina tipa 2 i njihova uporaba
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3528787B1 (en) 2016-10-21 2026-01-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
KR102014066B1 (ko) 2017-01-06 2019-10-21 에이비엘바이오 주식회사 항 α-syn 항체 및 그 용도
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
EP3582829A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
CA3052482A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP7672196B2 (ja) 2017-03-14 2025-05-07 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
CN118743804A (zh) 2017-03-28 2024-10-08 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件系统以及方法
AU2018273370B2 (en) 2017-05-21 2025-04-17 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CA3066399A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MA49461A (fr) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc Dispositif électronique d'administration de médicament comprenant un bouchon activé par un ensemble commutateur
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019046600A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Amgen Inc. INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
EP3694578B1 (en) 2017-10-09 2025-09-24 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
JP2021501198A (ja) * 2017-10-27 2021-01-14 トランスフュージョン ヘルス，リミティド ライアビリティ カンパニー フルオレンの誘導体を用いて造血幹細胞を増殖する組成物および方法
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
IL319987A (en) 2017-11-10 2025-06-01 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
SG11202003004RA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
JP7747438B2 (ja) 2017-11-16 2025-10-01 アムジエン・インコーポレーテツド 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ
BR112020011875A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-24 Abl Bio Inc. anticorpo biespecífico ao a-syn/igf1r e uso do mesmo
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
KR20200135781A (ko) 2018-03-26 2020-12-03 암젠 인크 세포 배양에서 생산된 항체의 총 비푸코실화 당형태
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AU2019352616B2 (en) 2018-10-02 2024-10-10 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
JP2022504805A (ja) 2018-10-15 2022-01-13 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスのプラットフォーム式組み立てプロセス
SG11202103800RA (en) 2018-10-15 2021-05-28 Amgen Inc Drug delivery device having damping mechanism
AU2019370159B2 (en) 2018-11-01 2025-05-29 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
AU2019393487A1 (en) * 2018-12-03 2021-06-03 Teijin Pharma Limited Anti-IGF-I receptor humanized antibody
JP7590084B2 (ja) 2018-12-12 2024-11-26 ケモセントリックス，インコーポレイティド 癌治療のためのｃｘｃｒ７阻害剤
CA3120800A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Revitope Limited Twin immune cell engager
JP7510952B2 (ja) 2019-04-24 2024-07-04 アムジエン・インコーポレーテツド シリンジ滅菌確認アセンブリ及び方法
WO2020232125A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Prometheus Biosciences, Inc. Tl1a patient selection methods, systems, and devices
JP7608439B2 (ja) 2019-08-23 2025-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
MX2022003461A (es) 2019-09-26 2022-04-19 Amgen Inc Metodos de produccion de composiciones de anticuerpos.
CA3177717A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CR20230204A (es) 2020-10-14 2023-10-11 Viridian Therapeutics Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de la enfermedad ocular tiroidea
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
CN116745324A (zh) 2021-01-27 2023-09-12 信达生物制药(苏州)有限公司 针对cd16a的单域抗体及其用途
AU2022233150A1 (en) * 2021-03-08 2023-09-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
JPWO2022239720A1 (sr) 2021-05-10 2022-11-17
CA3217207A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
TW202320850A (zh) 2021-08-10 2023-06-01 美商維里迪恩醫療股份有限公司 用於治療甲狀腺眼病之組合物、劑量及方法
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024208244A1 (en) * 2023-04-04 2024-10-10 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-igf1r antibodies and uses thereof
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025014773A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating chronic thyroid eye disease
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
AU658187B2 (en) 1991-04-19 1995-04-06 Boehringer Mannheim Gmbh Human bone derived insulin like growth factor binding protein
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
WO1993016043A1 (en) 1992-02-18 1993-08-19 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha β-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
DK0821671T3 (da) 1995-04-20 2001-04-23 Pfizer Arylsulfonylhydroxamsyrederivater som MMP- og TNF-inhibitorer
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
EP0861267A4 (en) * 1995-11-14 2000-02-02 Univ Jefferson INDUCTION AND RESISTANCE TO TUMOR GROWTH BY MEANS OF SOLUBLE IGF-1
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ES2183905T3 (es) 1995-12-20 2003-04-01 Hoffmann La Roche Inhibidores de metaloproteasa de matriz.
ATE211134T1 (de) 1996-03-05 2002-01-15 4-anilinochinazolin derivate
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
JP4386967B2 (ja) 1996-07-13 2009-12-16 グラクソ、グループ、リミテッド プロテインチロシンキナーゼ阻害剤としての縮合複素環式化合物
ES2191187T3 (es) 1996-07-13 2003-09-01 Glaxo Group Ltd Compuestos heteroaromaticos biciclicos como inhibidores de la proteina tirosin-quinasa.
HUP9903014A3 (en) 1996-07-18 2000-08-28 Pfizer Phosphinate derivatives having matrix metalloprotease inhibitor effect and medicaments containing the same
US6153609A (en) 1996-08-23 2000-11-28 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
AU5131998A (en) 1997-01-06 1998-08-03 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
ES2202796T3 (es) 1997-02-03 2004-04-01 Pfizer Products Inc. Derivados de acidos arilsulfonilaminohidroxamicos.
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
BR9807678A (pt) 1997-02-11 2000-02-15 Pfizer Derivados de ácidos arilsulfonil-hidroxâmicos
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002511852A (ja) 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
AU734009B2 (en) 1997-05-30 2001-05-31 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
ID23668A (id) 1997-08-08 2000-05-11 Pfizer Prod Inc Turunan asam ariloksiarilsulfonilamino hidroksamat
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
NZ520093A (en) 1997-11-11 2004-03-26 Pfizer Prod Inc Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
IL139934A (en) 1998-05-29 2007-10-31 Sugen Inc History 2 - Indulinone converted to pyrrole and pharmaceutical preparations containing them
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
ES2213985T3 (es) 1998-11-05 2004-09-01 Pfizer Products Inc. Derivados de hidroxiamida de acido 5-oxo-pirrolidin-2-carboxilico.
DK2112166T3 (en) 1998-12-23 2019-02-04 Pfizer Human monoclonal antibodies to CTLA-4
WO2000050067A1 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Saltech I Göteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic production of insulin-like growth factor-1
CA2796140A1 (en) 1999-03-25 2000-09-28 Jochen Salfeld Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
EP2796468A2 (en) 2001-01-05 2014-10-29 Pfizer Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
MY143582A (en) 2001-06-26 2011-05-31 Amgent Fremont Inc Antibodies to opgl
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
DE602004029581D1 (de) * 2003-08-13 2010-11-25 Pfizer Prod Inc Modifizierte humane igf-1r antikörper
SI2177537T1 (sl) * 2004-01-09 2012-01-31 Pfizer Protitielesa proti MAdCAM
US9881309B2 (en) 2012-03-13 2018-01-30 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
EE05724B1 (et) 2014-10-15
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
US7037498B2 (en) 2006-05-02
CR10134A (es) 2010-09-14
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
CR20140001A (es) 2014-02-05
GT200100257A (es) 2002-09-02
US7700742B2 (en) 2010-04-20
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
OA12589A (en) 2006-06-08
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
BR0116728A (pt) 2005-04-12
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
PY0132240A (es) 2004-06-01
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
AR032028A1 (es) 2003-10-22
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
NZ569856A (en) 2010-03-26
CR10786A (es) 2009-06-04
CN1854157A (zh) 2006-11-01
CN1854157B (zh) 2013-01-02
BG108037A (bg) 2005-04-30
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
US9234041B2 (en) 2016-01-12
US7982024B2 (en) 2011-07-19
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
EE05715B1 (et) 2014-06-16
IS6866A (is) 2003-07-04
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
AP2072A (en) 2009-12-10
CN1330668C (zh) 2007-08-08
IL156661A0 (en) 2004-01-04
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
SV2007000775A (es) 2007-03-15
CU23447B7 (es) 2009-10-16
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
IL156661A (en) 2008-11-26
MX349009B (es) 2017-07-06
MX337162B (es) 2016-02-15
TWI324609B (en) 2010-05-11
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
CR7045A (es) 2005-09-02
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
PL366340A1 (en) 2005-01-24
ME00502B (me) 2011-10-10
UY27087A1 (es) 2002-06-20
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
MY143465A (en) 2011-05-13
US7815907B2 (en) 2010-10-19
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
GEP20084484B (en) 2008-09-25
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
NO339789B1 (no) 2017-01-30
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
SG138469A1 (en) 2008-01-28
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
CN1564829A (zh) 2005-01-12
ECSP034711A (es) 2003-10-28
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
BG112197A (bg) 2016-05-31
US8642037B2 (en) 2014-02-04
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
PT1399483E (pt) 2010-07-20
EE201300037A (et) 2014-04-15
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
NZ527302A (en) 2006-10-27
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
YU54203A (sr) 2006-03-03
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
EE200300318A (et) 2003-10-15
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
NO20033074L (no) 2003-07-04
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
ZA200305995B (en) 2004-08-04
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6166243B2 (ja) インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体
RS54203B1 (sr) Preparati za primenu gelova za nokte koji se lako mogu ukloniti i postupci njihove upotrebe
AU2002231368A1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor
HK1072059B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor