CZ20032131A3 - Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický přípravek obsahující tuto protilátku - Google Patents

Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický přípravek obsahující tuto protilátku Download PDF

Info

Publication number
CZ20032131A3
CZ20032131A3 CZ20032131A CZ20032131A CZ20032131A3 CZ 20032131 A3 CZ20032131 A3 CZ 20032131A3 CZ 20032131 A CZ20032131 A CZ 20032131A CZ 20032131 A CZ20032131 A CZ 20032131A CZ 20032131 A3 CZ20032131 A3 CZ 20032131A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
seq
antibodies
Prior art date
Application number
CZ20032131A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301712B6 (cs
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20032131(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of CZ20032131A3 publication Critical patent/CZ20032131A3/cs
Publication of CZ301712B6 publication Critical patent/CZ301712B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká protilátky a antigen vázající části protilátky, která se specificky váže na receptor insulinu podobného růstového faktoru I (IGF-IR), výhodně humánní IGF-IR. Vynález se také týká humánní anti-IGF-IR protilátky, včetně chimérické, bispecifické, derivatizované, jednořetězcové protilátky nebo části fúzniho proteinu. Vynález se také týká izolovaného těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinové molekuly odvozené z anti-IGF-IR protilátky a odpovídající kódující molekuly nukleové kyseliny. Vynález se dále týká způsoby přípravy anti-IGF-IR protilátky a farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky. Vynález se týká i použití protilátek a přípravků podle vynálezu při diagnóze a léčení. Vynález se dále týká genové terapie s využitím molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec molekul imunoglobulinů, které zahrnují humánní anti-IGF-IR protilátky. Vynález se také týká transgennich zvířat obsahujících molekuly nukleové kyselinové podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Růstový faktor podobný insulinu (IGF-I) je 7,5-kD
- 2 diploidní svalstva, buňky, chondrocyty, Pro přehled širokého polypeptid, který cirkuluje v plazmě ve vysokých koncentracích a je detekovatelný v většině tkáních. IGF-I stimuluje buněčnou diferenciaci a buněčnou proliferaci a je vyžadován většinou typů savčích buněk pro udržení proliferace. K takovým buněčným typům patří, mezi jinými, humánní fibroblasty, epiteliální buňky, buňky hladkého T lymfocyty, nervové buňky, myeloidní osteoblasty a kmenové buňky kostní dřeně, spektra buněčných typů, u kterých interakce IGF-I/ receptor IGF-I zprostředkuje buněčnou proliferaci, viz např. Goldring et al., Eukar. Gene Express., 1: 31-326, 1991.
První krok v transdukční dráze vedoucí k IGF-I-stimulované buněčné proliferaci nebo diferenciaci je vazba IGF-I nebo IGF-II (nebo inzulínu ve vyšší než fyziologické koncentraci) k receptoru IGF-I. Receptor IGF-I je složen ze dvou typů podjednotek: alfa podjednotky (130-135 kD protein, který je plně extracelulární a jeho funkcí je vazba ligandu) a beta podjednotky (95-kD transmembránový protein, s transmembránovými a cytoplazmatickými doménami). IGF-IR patří k rodině receptorů tyrosinkinázových růstových faktorů (Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990) a je strukturálně podobný receptoru inzulínu (Ullrich et al., EMBO J. 5: 25032512, 1986). IGF-IR je nejdříve syntetizován jako jednořetězcový proreceptorový polypeptid, který je opracován glykosylací, proteolytickým štěpením a kovalentní vazbou, takže vytváří zralý 460-kD heterotetramer, který obsahuje dvě alfa-podjednotky a dvě beta podjednotky. Beta podjednotka vykazuje ligandem aktivovanou tyrosinkinázovou aktivitu. Tato aktivita je zapojena do signální dráhy zprostředkovávající působení ligandu, která zahrnuje autofosforylaci betapodjednotky a fosforylaci IGF-IR substrátů.
- 3 V podmínkách in vivo jsou sérový hladiny IGF-I závislé na přítomnosti růstového hormonu (GH) hypofýzy. Ačkoliv játra jsou hlavním místem GH-závislé syntézy IGF-I, nedávné práce ukazují, že většina normálních tkání také produkuje IGF-I. Celá řada nádorových tkání také produkují IGF-I. Takže IGF-I může působit jako regulátor normální i abnormální buněčné proliferace prostřednictvím autokrinního, parakrinního a také endokrinního mechanismu. IGF-I a IGF-II se vážou in vivo na IGF vazebné proteiny (IGFBP). Dostupnost volného IGF pro interakce s IGF-IR je modulována IGFBP. Přehled IGFBP a IGF-I lze nalézt např. v Grimberg et al., J. Cell. Physiol. 183: 19, 2000.
Existují důkazy pro úlohu IGF-I a/nebo IGF-IR v udržování nádorové buňky in vitro a in vivo. IGF-IR hladiny jsou zvýšeny v plicních nádorech (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993, Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993, Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), prsu (Pollak et al., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987, Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989, Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990, Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), prostaty a tračníku (Remaole Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992, Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Deregulovaná exprese IGF-I v epitelu prostaty vede k neoplázii u transgenních myší (Digiovanni et al., Proč. Nati. ACAD. Sci. USA 97: 3455-60, 2000) . Kromě toho se zdá, že IGF-I je autokrinním stimulátorem humánní gliomů (Sandberg-Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), zatímco IGF-I stimuluje růst fibrosarkomů, které nadměrně exprimují IGF-IR (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Dále, jedinci s vysokou normální hladinou IGF-I mají zvýšené obecné riziko karcinomu ve srovnání s jednotlivci s IGF-I v nízké normální hladině
• · · · « • • • · • · • · · «· • · · · · · · • · · · · · • · · * · ··· • « · · · · ·· ·»♦ ·· • · • · • · • · · e · · *
- 4 -
(Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999).
Mnoho z těchto typů nádorových buněk reaguje na IGF-I
proliferativním signálem v kultuře (Nakanishi et al., J. Clin.
Invest. 82: 354 359, 1988, Freed et al., J. Mol. Endocrinol.
3: 509-514, 1989) a byla proto postulována existence autokrinní nebo parakrinní smyčky pro proliferaci in vivo (LeRoith et al., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995, Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Přehled o úloze interakce IGF-I/IGF-I receptor v růstu u celé řady humánních nádorů - viz Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
Zvýšené hladiny IGF-I také korelují s několika patologickými stavy jinými než je rakovina, jako je např. akromegalie a gigantismus (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), zatímco abnormální funkce IGF-I/IGF-I receptor se zřejmě podílí na psoriáze (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), ateroskleróze a restenóze hladkého svalstva krevních cév po angioplastice (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Zvýšené hladiny IGF-I také mohou být problémem při diabetů nebo jeho komplikacích, jako je například proliferace mikrocév (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Snížení hladiny IGF-I, ke kterému dochází, inter alia, v případech, kdy jsou nízké sérové hladiny GH nebo když existuje necitlivost nebo rezistence k GH, je asociováno s takovými chorobnými stavy jako je zakrslost (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatie, pokles objemu svalové hmoty a osteoporóza (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
S použitím antisense expresních vektorů nebo antisense oligonukleotidů k IGF-IR RNA bylo ukázáno, že interference s IGF-IR vede k inhibici IGF-I-zprostředkovaného nebo IGF-IIzprostředkovaného buněčného růstu (viz např. Wraight et al.,
- 5 Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). Antisense strategie byla úspěšná pro inhibici buněčné proliferace u několika typů normálních buněk a humánních nádorových buněčných linií. Růst může být také inhibován s použitím peptidových analogů IGF-I (Pietrzkowski et al., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992, a Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) nebo vektoru exprimujíciho antisense RNA k IGF-I RNA (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Kromě toho, protilátky k
IGF-IR (Arteaga et al., Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101106, 1992, and Kalebic et al., Cancer Res. 54: 5531-5534,
1994) a dominantní negativní mutanty IGF-IR (Prager et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2181-2185, 1994, Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 a Jiang et al. , Oncogene 18: 6071-77, 1999) moci revertovat (zvrátit) transformovaný fenotyp, inhibovat tumorigenezi a indukovat ztrátu metastázujíciho fenotypů.
IGF-I je také důležitým činitelem v regulaci apoptózy. Apoptóza, programovaná buněčná smrt, je zapojena v celé řadě vývojových procesů, včetně vyzrávání imunitního a nervového systému. Kromě této úlohy ve vývoji, apoptóza také zřejmě působí jako důležitá buněčná zábrana proti tumorigenezi (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991, Lané, Nátuře 362: 786787, 1993). Potlačení apoptotického programu celou řadou genetických lézí může přispět k rozvoji a progesi maligních onemocnění.
IGF-I chrání před apoptózou indukovanou odstraněním cytokinů IL-3 dependentní hemopoetické buňky (RodriguezTarduchy, G. et al., J. Immunol. 149: 535-540, 1992) a odstraněním séra u Rat-l/mycER buněk (Harrington, E., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Anti-apoptotická funkce IGF-I je důležitá klidovém stupni buněčného cyklu a také u buněk, u • ·
- 6 kterých je průběh buněčného cyklu blokován etoposidem nebo thymidinem. Demonstrace toho, že přežívání c-myc řízených fibroblastů je závislé na IGF-I, ukazuje na existenci důležité úlohy IGF-IR při udržování nádorových buněk specifickou inhibici apoptózy, což je úloha zřetelně odlišná od proliferativních účinků IGF-I nebo IGF-IR. To je podobné úloze, kterou zřejmě hrají i jiné anti-apoptotické geny jako například bcl-2 při podpoře přežívání nádorů (McDonnell et al., Cell 57: 79-88, 1989, Hockenberry et al., Nátuře 348: 334-336, 1990).
Protektivní účinky IGF-I na apoptóza jsou závislé na tom, zda jsou na buňkách přítomné IGF-IR pro interakci s IGF-I (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Podpora pro anti-apoptotickou funkci IGF-IR v udržování nádorových buněk byla také poskytnuta ve studii s použitím antisense oligonukleotidů k IGF-IR, která identifikovala kvantitativní vztah mezi hladinou IGF-IR, rozsahem apoptózy a tumorigenním potenciálem u syngenních nádorů laboratorního potkana (Rescinoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Bylo zjištěno, že overexprese IGF-IR chrání nádorové buňky in vitro před etoposidem indukovanou apoptózou (Seli et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995) a, ještě výrazněji, že pokles hladiny IGF-IR pod hladinu odpovídající divokému typu způsobuje masivní apoptózu nádorových buněk in vivo (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potenciální strategie pro indukci apoptózy nebo pro inhibici buněčné proliferace spojené se zvýšením hladiny IGF-I, zvýšením IGF-11 a/nebo zvýšením IGF-IR receptorů zahrnují snížení hladiny IGF-I nebo IGF-II nebo zabránění vazby IGF-I k IGF-IR. Například dlouhodobě působící somatostatinový analog octreotid byl použit k redukci syntézy
a/nebo sekrece IGF. Rozpustný IGF-IR byl použit k indukci apoptózy u nádorových buněk in vivo a inhibici tumorigeneze v experimentálním zvířecím systému (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Kromě toho, IGF-IR antisense oligonukleotidy, peptidové analogy IGF-I a protilátky k IGF-IR byly použity ke snížení exprese IGF-I nebo IGF-IR (viz výše). Nicméně žádná z těchto sloučenin nebyla vhodná k dlouhodobému podáváni (humánním) pacientům. Navíc, ačkoliv IGF-I byl podáván pacientům pro léčení zakrslosti, osteoporózy, snížení objemu svalové hmoty, neuropatie nebo diabetů, vazba IGF-I na
IGFBP často způsobila, zcela neúčinná. že taková léčba byla obtížná nebo byla
Tudíž, s ohledem na úlohy, které IGF-I a IGF-IR maj í
v takových chorobných stavech jako karcinom a jiná
proliferativní onemocnění, když jsou GF-I a/nebo IGF-IR
nadměrně exprimovány, a úlohy příliš malého množství IGF-I a IGF-IR při chorobných stavech, jako například zakrnělost a svalová slabost, když jsou IGF-I a/nebo IGF-IR nedostatečně exprimovány, bylo by potřebné připravit protilátky k IGF-IR, které by mohl být použity buďto k inhibici nebo stimulaci IGF-IR. Přestože bylo publikováno, že anti-IGF-IR protilátky byly zjištěny u některých pacientů trpících autoimunními nemocemi, žádná z těchto protilátek nebyla purifikována a nebylo ukázáno, že by mohla být vhodná k inhibici aktivity IGF-I pro diagnostické nebo terapeutické postupy (Viz např. Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455459, 1988, Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988, Weightman et al., Autoimmunity
16: 251-257, 1993, Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45:
285-293, 1994) . Takže se jeví jako potřebné získat vysokoafinitní humánní anti-IGF-IR protilátky, které mohly být použity při léčení nemocí u lidí.
Popis obrázků
Obr. 1A-1C ukazují vzájemné porovnání nukleotidových sekvencí variabilních úseků lehkého řetězce šesti humánních anti-IGF-IR protilátek a také jejich srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr. IA ukazuje porovnání nukleotidová sekvence variabilních úseků lehkého řetězce (VL) protilátek 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 1)
2.13.2 (SEKV. ID. Č. 5), 2.14.3 (SEKV. ID. Č. 9) a 4.9.2 (SEKV. ID. Č. 13) navzájem a také se sekvencí zárodečné linie Vk A30 (SEKV. ID. Č. 39).
Obr. IB ukazuje porovnání nukleotidová sekvence VL protilátky
4.17.3 (SEKV. ID. Č. 17) a sekvence zárodečné linie Vk 012 (SEKV. ID. Č. 41).
Obr. 1C ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VL protilátky
6.1.1 (SEKV. ID. Č. 21) a sekvence zárodečné linie Vk A27 (SEKV. ID. Č. 37) . Přiřazení sekvencí také ukazuje CDR úseky VL každé protilátky. Kanonické sekvence pro obr. 1 A-l C jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 53 až 55, v daném pořadí.
Obr. 2A-2D ukazují vzájemné porovnání nukleotidových sekvencí variabilních úseků těžkého řetězce šesti humánních anti-IGFIR protilátek a srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr. 2A ukazuje porovnání nukleotidová sekvence VH protilátky
2.12.1 (SEKV. ID. Č. 3) se sekvencí zárodečné linie VH DP-35 (SEKV. ID. Č. 29).
Obr. 2B ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VH protilátky
2.14.3 (SEKV. ID. Č. 11) a sekvence zárodečné linie VIV-4/4,35 (SEKV. ID. Č. 43).
Obr. 2C-1 a 2C-2 ukazují porovnání nukleotidové sekvence VH protilátek 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 7), 4.9.2 (SEKV. ID. Č. 15) a
6.1.1 (SEKV. ID. Č. 23) navzájem a ještě se sekvencí zárodečné linie VH DP-47 (SEKV. ID. Č. 31).
Obr. 2D ukazuje porovnání nukleotidové sekvence VH protilátky
4.17.3 (SEKV. ID. Č. 19) se sekvencí zárodečné linie VH DP-71 (SEKV. ID. Č. 35) . Porovnání také ukazuje CDR úseky protilátek. Kanonické sekvence pro obr. 2A - 2D jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 56-59, v daném pořadí.
Obr. 3 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, 4.9.2 a
2.12.1 inhibují vazbu IGF-I na 3T3-IGF-IR buňky.
Obr. 4 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 4.9.2 inhibuje IGF-I-indukovanou fosforylaci tyrosinu receptoru (horní panel) a indukuje pokles exprese IGF-IR („down-regulace IGF-IR) na buněčném povrchu (spodní panel).
Obr. 5 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukují IGF-IR fosfotyrosinovou signalizaci u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 6 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukují IGF-IR u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 7 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 inhibuje in vivo růst 3T3-IGF-IR nádorů, samotná (levý panel) nebo v kombinaci s adriamycinem (pravý panel).
Obr. 8 ukazuje vztah mezi sérovou hladinou anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a IGF-IR down-regulací u 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 9 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky
2.13.2, samotné nebo v kombinaci s adriamycinem, inhibují in vivo růst 3T3-IGF-IR nádorů.
Obr. 10 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 v kombinaci s adriamycinem inhibuje nádorový růst in vivo.
Obr. 11 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2, samotná nebo v kombinaci s 5-deoxyuridinem (5-FU), inhibuje in vivo růst nádoru Colo 205.
Obr. 12 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky
2.13.2, samotné nebo v kombinaci s 5-FU, inhibují in vivo růst nádorů Colo 205.
Obr. 13 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátka
2.13.2, samotné nebo v kombinaci s taxolem, inhibují in vivo růst nádoru MCF-7.
Obr. 14 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 inhibuje in vivo růst nádoru MCF-7, buďto samotná (levý panel) nebo v kombinaci s adriamycinem (pravý panel).
Obr. 15 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky
2.13.2, samotné nebo v kombinaci s tamoxifenem, inhibují
- 11 • · · ·
in vivo růst nádoru MCF-7.
Obr. 16 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky
2.13.2 inhibují in vivo růst nádoru A431, a to buď samotné nebo v kombinaci s inhibitorem CP-358, 774 tyrosinkinázového receptoru epidermálního růstového faktoru (EGF-R).
Obr. 17 ukazuje farmakokinetické hodnocení jediné intravenózní injekce anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 u makaka.
Obr. 18 ukazuje, že kombinace anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a adriamycinu zesiluje in vivo down-regulaci IGF-IR ve 3T3-IGF-IR nádorech.
Obr. 19A ukazuje počet mutací v různých úsecích těžkého a lehkého řetězce 2.13.2 a 2.12.1 ve srovnání se sekvencí zárodečné linie.
Obr. 19A-D ukazují porovnání aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce protilátek 2.13.2 a 2.12.1 se sekvencí zárodečné linie, ze které pocházející.
Obr. 19B ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence těžkého
řetězce protilátky 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 45) se sekvencí
zárodečné linie DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEKV. ID. Č. 46 ) ·
Obr. 19C ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence lehkého
řetězce protilátky 2.13.2 (SEKV. ID. Č. 47) se sekvencí
zárodečné linie A30/Jk2 (SEKV . ID. Č. 48).
Obr. 19D ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence těžkého
řetězce protilátky 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 49) se sekvencí zárodečné linie DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEKV. ID. Č. 50).
Obr. 19E ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence lehkého řetězce protilátky 2.12.1 (SEKV. ID. Č. 51) se sekvencí zárodečné linie A30/Jkl (SEKV. ID. Č. 52).
Pro obr. 19B-E platí, že signální sekvence jsou uvedeny kurzívou, úseky CDR jsou podtrženy, konstantní domény jsou tučně, mutace kosterních (FR) úseků jsou zvýrazněny znaménkem plus (”+) nad aminokyselinovým zbytkem a mutace úseků CDR jsou zvýrazněny hvězdičkou nad aminokyselinovým zbytkem.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje izolovanou protilátku nebo antigen-vazebnou část (tj. část vázající antigen) protilátky, která se váže na IGF-IR, výhodně na IGF-IR primátů a člověka, nejvýhodněji se jedná o humánní protilátku. Vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která inhibuje vazba IGF-I nebo IGF-II k IGF-IR, a také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která aktivuje IGF-IR.
Vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující protilátku a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutický přípravek může dále obsahovat další složky, jako například anti-nádorová agens nebo zobrazovací činidlo.
Vynález se dále týká i diagnostických a terapeutických metod. Diagnostické metody se týkají způsobu diagnózy přítomnosti nebo lokalizace tkáně exprimující IGF-IR s použitím anti-IGF-IR protilátka. Terapeutický způsob zahrnuje
podávání protilátky pacientovi který potřebuje, výhodně ve spojení s podáváním dalšího terapeutického agens.
Vynález poskytuje izolovanou buněčnou linii, jako například hybridom, která produkuje anti-IGF-IR protilátku.
Vynález také poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky nebo jejich antigen-vazebné části.
Vynález dále poskytuje vektory a hostitelské buňky obsahující molekuly nukleové kyseliny, a také způsoby rekombinantní produkce polypeptidů kódovaných molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
A dále vynález poskytuje transgenní zvířata, organizmy jiného než lidského původu, která exprimují těžký a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část z anti-IGF-IR protilátky.
Vynález se také týká léčení pacienta, který to potřebuje, podáváním účinného množství molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část z anti-IGF-IR protilátky.
Podrobný popis vynálezu
Definice termínů a obecné postupy
Není-li uvedeno jinak, vědecké a technické termíny používané v souvislosti s předkládaným vynálezem mají význam, který je odborníkovi obecně srozumitelný a známý. A dále, pokud kontext nevyžaduje jinak, termíny vyjádřené jednotným číslem zahrnují i množné číslo a termíny vyjádřené množným číslem zahrnují i jednotné číslo. Obecně, nomenklatura v tomto
- 14 textu užívaná ve spojení s metodami buněčných a tkáňových kultur, molekulární biologie, imunologie, mikrobiologie, genetiky a chemie hybridizace proteinů a nukleových kyselin, je obecně v oboru užívána a odborníkovi srozumitelná. Metody a techniky užité v předkládaném vynálezu jsou obecně prováděny podle obvyklých postupů odborníkovi známých, které byly popsány v různých obecných nebo specifických publikacích, které jsou citovány a diskutovány v předkládaném popisu, nenili uvedeno jinak. Jde např. o následující publikace: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992, and Harlow and Lané antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1990, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Enzymatické reakce a purifikačni techniky jsou prováděny podle specifikací výrobců, tak jak se obvykle v oboru užívají, nebo jak je popsáno v tomto textu. Nomenklatura použitá v spojení s laboratorními postupy a technikami analytické chemie, syntetické organické chemie a lékařské a farmaceutické chemie, popisovanými v tomto textu, je obecně známá a používaná v oboru. Pro chemické syntézy, chemické analýzy, formulaci farmaceutických přípravků a jejich aplikaci při léčení pacientů jsou používány standardní techniky.
Následující termíny, neni-li uvedeno ještě jinak, je třeba chápat v následujícím významu:
Termín polypeptid označuje nativní nebo umělý protein, proteinový fragment a polypeptidový analog proteinové sekvence. Polypeptid může být monomerní nebo polymerní.
• · · · · *
- 15 Termín izolovaný protein nebo izolovaný polypeptid označuje protein nebo polypeptid, který v důsledku svého původu nebo zdroje (1) není asociován s přirozeně asociovanými součástmi, se kterými je asociován ve svém nativním stavu, (2) je zbaven jiných proteinů z téhož biologického druhu, (3) je exprimován buňkou jiného biologického druhu nebo (4) nevyskytuje se v přírodě. Takže polypeptid, který byl chemicky syntetizován, nebo byl syntetizován v buněčném systému odlišného od buněk, ve kterých se přirozeně tvoří, je izolovaný od svých přirozeně asociovaných složek. Protein je izolací v podstatě zbaven přirozeně asociovaných složek, a sice s využitím technik purifikace proteinů, které jsou dobře známy v oboru.
Protein nebo polypeptid je v podstatě čistý, v podstatě homogenní nebo v podstatě purifikovaný, když alespoň přibližně 60 až 75% vzorku vykazuje přítomnost jediného druhu polypeptidů. Polypeptid nebo protein může být monomerní nebo multimerní. V podstatě čistý polypeptid nebo protein bude typicky obsahovat přibližně 50 %, 60, 70 %, 80 % nebo 90 % (hmotnost/hmotnost) proteinu, obvykle má čistotu přibližně 95 % a výhodně má dokonce čistotu 99 %. Čistota nebo homogenita proteinu může být demonstrována řadou metod v oboru známých, například elektroforézou proteinového vzorku na polyakrylamidovém gelu, následovanou tím, že se vizualizuje pás odpovídající jednomu polypeptidů obarvením gelu barvivém, které je v oboru známo. Pro některé účely lze dosáhnout vyššího rozlišení s použitím HPLC nebo jiný prostředky purifikace, které jsou v oboru dobře známy.
Termín polypeptidový fragment (zaměnitelný s „fragment polypeptidů), jak se v tomto textu používá, se týká polypeptidů, který má deleci aminokoncového a/nebo karboxykoncového úseku, ale přitom zbývající aminokyselinová sekvence je totožná s odpovídajícími polohami v přirozeně se vyskytující sekvenci. Fragmenty jsou typicky dlouhé alespoň 5, 6, 8 nebo 10 aminokyselin, výhodně jsou dlouhé alespoň 14 aminokyselin, výhodněji jsou dlouhé alespoň 20 aminokyselin, obvykle jsou dlouhé alespoň 50 aminokyselin, dokonce výhodněji jsou alespoň 70, 80, 90, 100, 150 nebo 200 aminokyselin dlouhé.
Termín polypeptidový analog, jak se v tomto textu používá, se týká polypeptidů, který je složen ze segmentu přinejmenším 25 aminokyselin, který je v podstatě identický s částí aminokyselinové sekvence a který má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) specificky se váže k IGF-IR za podmínek vhodných pro vazbu, (2) je schopen blokovat IGF-I nebo IGF-II vazbu na IGF-IR nebo (3) je schopen redukovat expresi IGF-IR na buněčném povrchu nebo fosforylaci tyrosinu in vitro nebo in vivo. Typicky polypeptidový analogy obsahuje konzervativní aminokyselinové substituce (nebo inzerce nebo delece) ve srovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí. Analogy jsou typicky alespoň 20 aminokyseliny dlouhé, výhodně alespoň 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 nebo 200 aminokyselin dlouhé nebo i delší a často jsou stejně dlouhé jako přirozeně se vyskytující polypeptid plné délky.
Výhodné substituce aminokyselin jsou takové, které: (1) redukují citlivost k proteolýze, (2) redukují citlivost k oxidaci, (3) mění proteinového komplexu, vazebnou afinitu pro vytvoření (4) mění vazebné afinity obecně a (5) propůjčují nebo přizpůsobují další fyzikálně chemické nebo funkční vlastnosti takového analogu. Analogy zahrnují různé muteiny dané sekvence kromě přirozeně se vyskytující peptidové sekvence. Například jednoduchá nebo mnohonásobná substituce • · • · · ·
- 17 aminokyselin (výhodně konzervativní substituce aminokyselin) může být vytvořena v přirozeně se vyskytující sekvenci (výhodně v část polypeptidů vně domény (s) vytvářející intermolekulární kontakty). Konzervativní aminokyselinová substituce by neměla v podstatě změnit strukturální vlastnosti základní sekvence (např. nahrazená aminokyselina by neměl inklinovat k narušení spirály, kterou tvoří základní sekvence, nebo k narušení jiného typu sekundární struktury, která je charakteristická pro základní sekvenci). Příklady sekundárních a terciálních struktur polypeptidů, které jsou odborníkům známy, jsou popsány v publikacích Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Vyd., W. H. Freeman and Company, New York, 1984), Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, vyd., Garland Publishing, New York, N. Y. , 1991), a Thornton et al. Nátuře 354: 105, 1991, které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.
Nepeptidové analogy jsou obecně používány ve farmaceutickém průmyslu jako léčiva s vlastnostmi podobnými, jak mají templátové peptidy. Tyto typy nepeptidových sloučenin jsou nazývaný peptidová mimetika nebo peptidomimetika (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29, 1986, Veber a Freidinger TINS p. 392, 1985, a Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229, 1987, který jsou zahrnut formou odkazu v tomto textu). Takový sloučeniny jsou často konstruovány pomocí počítačového modelování molekul. Peptidomimetika, která jsou strukturálně podobná terapeuticky použitelným peptidům, mohou být použita s dosažením rovnocenného terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně, peptidomimetika jsou strukturálně podobný vzorovému polypeptidů (tj. polypeptidů, který má požadovanou biochemickou vlastnost nebo farmakologickou aktivitu), jako je například humánní protilátka, ale mají jednu nebo více peptidových vazeb volitelně nahrazených vazbou vybranou ze skupiny, kterou tvoří -CH2NH2-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis a trans], -COCH2-, -CH(OH)CH2- a -CH2SO-, a sice metodami dobře známými v oboru. Systematická substituce jedné nebo více aminokyselin kanonická sekvence D-aminokyselinou stejného typu (např. D-lysin místo L-lysinu) může také být využita k přípravě peptidů s vyšší stabilitou. Kromě toho, omezené peptidy obsahující kanonickou sekvenci nebo v podstatě totožnou variaci kanonické sekvence mohou být připraveny metodami známými v oboru (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992, zahrnuto formou odkazu v tomto textu), například přidání vnitřního cysteinového zbytku schopného vytvořit intramolekulární disulfidický můstek, kterým se cyklizuje peptid.
Imunoglobulin je tetramerní molekula. V přirozeně se vyskytujícím imunoglobulinu je každý tetramer složen ze dvou totožných párů polypeptidových řetězců, každý pár obsahuje jeden lehký (přibližně 25 kDa) a jeden těžký řetězec (přibližně 50-70 kDa). Aminokoncová část každého řetězce zahrnuje variabilní úsek přibližně 100 až 110 nebo i více aminokyselin, který je primárně zodpovědný za rozpoznávání antigenu. Karboxykoncová část každého řetězec definuje konstantní úsek primárně zodpovědný za efektorové funkce. Humánní lehké řetězce jsou klasifikovaný jako κ a λ lehké řetězce. Těžké řetězce jsou označována jako μ, Δ, γ, a nebo ε, čímž jsou definovány protilátkové izotypy IgM, IgD, IgG, IgA a IgE, v daném pořadí. V lehkém a těžkém řetězci jsou variabilní a konstantní úseky spojeny J úsekem z přibližně 12 nebo více aminokyselin, a těžký řetězec ještě obsahuje D úsek přibližně 10 či více aminokyseliny. Viz Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., vyd., 2. vyd. Raven Press, N. Y. , 1989) (zahrnut formou odkazu). Variabilní úseky z každého páru lehkého/těžkého řetězce vytvářejí vazebné místo pro
- 19 protilátku, takže intaktní imunoglobulin má dvě vazebná místa.
Imunoglobulinové řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu s relativně konzervativními rámcovými úseky (FR) spojenými třemi hypervariabilními úseky, které se označují jako „komplementaritu určující úseky nebo CDR. CDR ze dvou řetězců každého páru jsou spojeny rámcovými úseky, což umožňuje vazbu ke specifickému epitopu. Směrem od N-konce k Ckonci, lehký a těžký řetězec obsahují domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin do každé domény je v souladu s definicí podle Kabat Sequences of Proteins of lmmunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 a 1991)), nebo Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987, Chothia et al. Nátuře 342: 878-883, 1989.
Termín protilátka se týká intaktního imunoglobulinu nebo jeho antigen-vazebné části (tj. části proilátky schopné vázat antigen), která kompetuje s intaktní protilátkou o specifickou vazbu. Antigen-vazebné části mohou být připraveny technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemický štěpením intaktních protilátek. Antigen-vazebné části zahrnují, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2/ Fv, dAb a fragmenty úseků určujících komplementaritu (CDR), jednořetězcové protilátky (scFv), chimérické protilátky, tzv. „diabodies a polypeptidy, které obsahují alespoň část imunoglobulinu, která je dostatečná k tomu, aby jim propůjčila schopnost specifické vazby k antigenu.
Jak se v tomto textu používá, protilátka, která je označena např. 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1, je protilátka, která pochází z hybridom stejného jména. Například protilátka 2.12.1 pochází z hybridomu 2.12.1.
Fab fragment je monovalentní fragment, který tvoří VL, VH, • · « · · a • ·· 9 9 ··
CL a CH1 domény, F(ab’)2 fragment je dvojvalentní fragment sestávající ze dvou Fab fragmentů spojených disulfidovým můstkem v tzv. oblasti kloubu, Fd fragment obsahuje VH a CH1 domény, Fv fragment obsahuje VL a VH domény jednoho ramene protilátky a dAb fragment (Ward et al., Nátuře 341: 544-546,
1989) sestává z VH domény.
Jednořetězcová protilátka (scFv) je protilátka,kde VL a VH úseky jsou párovány a vytvářejí monovalentní molekulu prostřednictvím syntetické spojovací sekvence (linkeru), která umožňuje vytvořit jednoduchý proteinový řetězec (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 and Huston et al., Proč. Nati.
Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Tzv. „diabodies jsou divalentní bispecifické protilátky, kde VH a VL domény jsou exprimovány na jednoduchém polypeptidovém řetězci, ale s použitím linkeru, který je příliš krátký na to, aby se umožnilo párování mezi dvěma doménami na stejném řetězci, a tím jsou domény nuceny k párování s komplementárními doménami dalšího řetězec a vytvářejí se tak dvě vazebná místa pro antigen (viz např. Holliger, P., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993 a Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). Jeden nebo více úseků CDR může být zaveden do molekuly buďto kovalentně nebo nekovalentně, imunoadhesin. Imunoadhesiny mohou cimz se pripravi tzv. obsahovat jeden nebo polypeptidového řetězce,
CDR jako kovalentně část spoj ovát zavést většího
CDR s
CDR do více mohou dalším polypeptidovým řetězcem nebo mohou molekuly nekovalentně. CDR dovolují imunoadhesinům vázat se specificky na požadovaný konkrétní antigen.
Protilátka může mít jedno nebo více vazebných míst. Jestliže existuje více než jedno vazebné místo, pak vazebná místa mohou být navzájem totožná nebo mohou být různá.
• · ···· · · · · · · •· ·· ····· ··
- 21 Například přirozeně se vyskytující ímunoglobulin má dvě totožná vazebná místa, jednořetězcová protilátka nebo Fab fragment mají jedno vazebné místo, zatímco bispecifická nebo bifunkční protilátka má dvě různá vazebná místa.
Izolovaná protilátka je protilátka, která (1) není spojena (asociována) se složkami, se kterými je spojena v přírodním stavu, včetně ostatních přirozeně asociovaných protilátek, které ji doprovázejí v jejím nativním stavu, (2) je bez jiných proteinů stejného druhu, (3) je exprimována buňkou jiného biologického druhu nebo (4) vůbec se nevyskytuje v přírodě. Příklady izolovaných protilátek zahrnují anti-IGFIR protilátku, která byl afinitně purifikována s použitím IGFIR, anti-IGF-IR protilátku, která byla syntetizována hybridomem nebo jinou buněčnou linií in vitro a humánní antiIGF-IR protilátku pocházející z transgenní myši.
Termín humánní protilátka zahrnuje všechny protilátky, které mají jeden nebo více variabilních a konstantních úseků pocházejících z humánní imunoglobulinové sekvence. Ve výhodném provedení všechny variabilní a konstantních domény pocházejí z humánní imunoglobulinové sekvence (plně humánní protilátka). Tyto protilátky mohou být připraveny celou řadou postupů, jak bude popsáno dále.
Humanizovaná protilátka je taková protilátka, která pochází z jiného biologického druhu než člověka, kde určité aminokyseliny v rámcovém úseku a konstantních doménách těžkého a lehkého řetězce byly mutovány tak, aby byla zrušena nebo odstraněna imunitní reakce u lidí. Alternativně, humanizován protilátka může být vytvořena fúzí konstantní domény z humánní protilátky s variabilními doménami jiného než lidského původu. Příklady přípravy humanizovaných protilátek lze najít v patentech Spojených Států č. 6,054,297, 5,886,152 a 5,877,293.
Termín chimérická protilátka se týká protilátky, která obsahuje jeden nebo více úseků z jedné protilátky a jeden nebo více úseků z jedné nebo více jiných protilátek. Ve výhodném provedení jeden nebo více CDR pocházejí z humánní anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodnějším provedení všechny CDR pocházejí z humánní anti-IGF-IR protilátky. V dalším výhodném provedení CDR z více než jedné humánní anti-IGF-IR protilátky jsou smíchány a sestaveny v chimérické protilátce. Například chimérická protilátka může zahrnovat CDRl z lehkého řetězce první humánní anti-IGF-IR protilátky v kombinaci s CDR2 a CDR3 z lehkého řetězce druhé humánní anti-IGF-IR protilátky a CDR těžkého řetězce může pocházet z třetí anti-IGF-IR protilátky. A dále rámcové úseky mohou pocházet z rámce jedné anti-IGF-IR protilátky, z jedné nebo více různých protilátek, jako například humánní protilátky, nebo z humanizované protilátky.
Neutralizační protilátka nebo inhibiční protilátka je protilátka, která inhibuje vazbu IGF-IR k IGF-I, když nadbytek anti-IGF-IR protilátky redukuje množství IGF-I vázaného k IGFIR alespoň přibližně o 20 %. Ve výhodném provedení protilátka redukuje množství IGF-I vázaného k IGF-IR alespoň o 40 %, výhodněji o 60 %, dokonce výhodněji o 80 % nebo dokonce ještě výhodněji o 85 %. Redukce vazby může být měřena kteroukoliv metodou v oboru známou, například v in vitro kompetitivním vazebném testu. Příklad měření redukce vazby IGF-I k IGF-IR je prezentován dále v příkladu 4.
Aktivační protilátka je protilátka, která aktivuje alespoň přibližně 20% IGF-IR, když je přidána k buňce, tkáni nebo organismu, které exprimují IGF-IR. Ve výhodném provedení protilátka aktivuje IGF-IR aktivitu na alespoň 40 %, výhodněji 60 %, dokonce ještě výhodněji 80 % nebo dokonce nejvýhodněji 85 %. Ve výhodnějším provedení aktivační protilátka je přidána • · · · ···· • · · · « • « · · ·
- 23 v přítomnosti IGF-I nebo IGF-II. V dalším výhodném provedení je aktivita aktivační protilátky měřena tím, že se určuje množství autofosforylace tyrosinu IGF-IR.
Fragmenty nebo analogy protilátek mohou být snadno připraveny odborníkem na základě předloženého popisu. Výhodné aminokoncové a karboxykoncové fragmenty nebo analogy se vyskytují v blízkosti hranic funkčních domén. Strukturální a funkční domény mohou být identifikovány srovnáním nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence s daty, která jsou ve veřejných nebo soukromých databází. Výhodně se použijí počítačové srovnávací metody k rozpoznání sekvenčních motivů nebo predikci proteinových konformačních domén, které se vyskytují u jiných proteinů se známou strukturou a/nebo funkcí. Metody identifikace proteinových sekvencí, které se svinují do známých trojrozměrných struktur, jsou známy (Bowie et al. Science 253: 164, 1991).
Termín povrchová plazmonová rezonance, jak se v tomto textu používá, se týká optického jevu, který umožňuje analyzovat biospecifické interakce v reálném čase tím, že se detekují změny v proteinových koncentracích v biosenzorové matici, například s použitím systému BIACORE (Pharmacia Biosenzor AB, Uppsala, Švédsko a Piscataway, N. J.). Pro další popis např. viz Jonsson, U., et al. , 1993, Ann. Biol. Clin.
51: 19-26, Jonsson, U., et al., 1991, Biotechnigues 11: 620627, Johnsson, B., et al., 1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131 a Johnson, B., et al., 1991, Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termín KOff se týká rychlostní konstanty pro oddělení protilátky z komplexu protilátka/antigen.
Termín Kd se týká disociační konstanty konkrétní interakce protilátka-antigen.
Termín epitop označuje jakoukoliv proteinovou «4 « · · « • · · ·
- 24 determinantu schopnou specifické vazby k imunoglobulinu nebo receptoru T lymfocytu. Epitopové determinanty obvykle sestávají z chemicky aktivního povrchového seskupení molekul jako jsou například aminokyseliny nebo sacharidové postranní řetězce a obvykle mají specifické prostorové (trojrozměrné) strukturální vlastnosti, a také specifické vlastnosti pokud jde o náboj. Protilátky specificky váží antigen, když je disociační konstanta < 1 μΜ, výhodně < 100 nM a nejvýhodněji je < 10 nM.
Jak se v tomto textu používá, dvacet obvyklých aminokyselin a jejich zkratky se drží toho, co je v oboru zvykem (viz publikce Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Ed. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 1991, která je zahrnuta formou odkazu v tomto textu). Stereoizomery (např. D-aminokyselina) dvaceti obvyklých „nepřírodní aminokyseliny (v přírodě se jako například α-, α-disubstituované N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná a jiné nekonvenční aminokyseliny mohou také být vhodné složky polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Příklady nekonvenčních aminokyselin zahrnují: 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν, N, N-trimethyllysin, ε-N-acetyllysin, N-acetylserin, N-formylmethionin,
5-hydroxylysin, ε-N-methylarginin a další podobné aminokyseliny a iminokyseliny (např. 4-hydroxyprolin). V zápisu polypeptidů, který je užíván v tomto textu, je směr doleva amino-koncový směr a směr doprava je karboxy-koncový směr, což odpovídá standardu a konvenci.
aminokyselin, nevyskytuj ící) aminokyseliny,
O-fosfoserin, 3-methylhistidin,
Termín polynukleotid, jak je užíván v tomto textu znamená polymerní formu nukleotidů alespoň 10 bází, buďto ribonukleotidů nebo deoxynukleotidů nebo modifikovaných forem • · · ·
- 25 obou z výše uvedených typů nukleotidů. Termín zahrnuje jednoduché a dvojvláknové (dvojřetězcové) formy DNA.
Termín izolovaný polynukleotiď', jak se v tomto textu používá, znamená polynukleotid genomového, cDNA nebo syntetického původu nebo jakékoliv jejich kombinace, který z důvodu svého původu jako izolovaný polynukleotid (1) není asociován ani se všemi ani částí polynukleotidů, se kterými je „izolovaný polynukleotid asociován v přírodě, (2) je operativně spojen k polynukleotidem, se kterým není spojen v přírodě nebo (3) nevyskytuje se v přírodě jako část větší sekvence.
Termín oligonukleotid v tomto textu zahrnuje přirozeně se vyskytující a modifikované nukleotidy spojené přirozeně se vyskytujícími oligonukleotidovými vazbami a oligonukleotidovými vazbami, které se přirozeně nevyskytují. Oligonukleotidy jsou podmnožinou polynukleotidů obecně obsahující 200 bází nebo méně. Výhodně oligonukleotidy jsou dlouhé 10 až 60 bází, a nejvýhodněji 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nebo 20 až 40 bází. Oligonukleotidy jsou obvykle jednoduchá vlákna, např. pro sondy, ačkoliv oligonukleotid může být dvojvláknový, např. oligonukleotid pro použití v konstrukci genových mutant. Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být buď „sense nebo „antisense oligonukleotidy.
Termín přirozeně se vyskytující nukleotidy v tomto textu zahrnuje deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy. Termín modifikované nukleotidy v tomto textu zahrnuje nukleotidy s modifikovanými nebo substituovanými sacharidovými skupinami apod. Termín oligonukleotidové vazby v tomto textu zahrnuje oligonukleotidové vazby jako je například vazba fosforothioátová, fosforodithioátová, fosforoselenoátová, fosforodiselenoátová, fosforoanilothioárová, fosfor• · · ·
- 26 aniladátová, fosforamidátová apod. (viz např. LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081, 1986, Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077, 1984, Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988, Zon et al. anti-Cancer Drug Design 6: 539, 1991, Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87108 (F. Eckstein, Vyd., Oxford University Press, Oxford England, 1991), Stec et al., patent Spojených Států 5,151,510, Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543, 1990).
Oligonukleotid může obsahovat „značku pro detekci, je-li to třeba.
Operativně spojené sekvence zahrnují jak expresní kontrolní sekvence, které jsou bezprostředně sousedící s požadovaným genem, tak i expresní kontrolní sekvence, které působí v trans nebo na dálku kontrolují požadovaný gen. Termín expresní kontrolní sekvence, jak se v tomto textu používá, se týká polynukleotidových sekvencí, které jsou nutné k realizaci exprese a opracování kódující sekvence, ke které jsou ligovány. Expresní kontrolní sekvence zahrnují vhodné sekvence iniciace a ukončení transkripce, promotorové a enhancerové (zesilující) sekvence, účinné sekvence opracování RNA jako například sestřihové a polyadenylační signály, sekvence stabilizující cytoplazmatickou mRNA, sekvence zesilující translační účinnost (tj. Kozáková kanonická sekvence), sekvence zlepšující stabilitu proteinu, sekvence zesilující sekreci proteinu. Povaha takové kontrolní sekvence závisí na hostitelském organismu, u prokaryot takové kontrolní sekvence obecně zahrnují promotor, ribozomální vazebné místo a sekvenci pro terminaci transkripce, u eukaryot obecně takové kontrolní sekvence zahrnují promotor a sekvenci pro terminaci transkripce. Termín kontrolní sekvence zahrnuje přinejmenším všechny složky, jejichž přítomnost je esenciální pro expresi a • ·
- 27 opracování a může také zahrnovat další složky, jejichž přítomnost je výhodná, například vedoucí sekvence a fúzní partnerské sekvence.
Termín vektor, jak je použit v tomto textu, se týká molekuly nukleové kyseliny schopné transportovat další nukleovou kyselinu, se kterou byl spojen. Jeden typ vektoru je plazmid, což je kruhová dvojvláknová DNA klička, do které mohou být ligovány další segmenty DNA. Dalším typem vektoru je virový vektor, kde další DNA segmenty mohou být ligovány do virového genomu. Určité vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou vneseny (např. bakteriální vektory mající bakteriální replikační počátek a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např. neepisomální savčí vektory) mohou být integrovány do genomu hostitelské buňky po vnesení do hostitelské buňky a proto jsou kopírovány společně s hostitelským genomem. Navíc určité vektory jsou schopné řídit expresi genu, ke kterému jsou operativně spojeny. Takové vektory jsou nazývány v tomto textu rekombinantní expresní vektory (nebo prostě expresní vektory). Obecně platí, že expresní vektory použitelné v rekombinantní DNA technikách jsou často ve formě plazmidu. V předkládaném popisu proto termíny plazmid a vektor mohou být použitelné zaměnitelně, jelikož plazmid je nejobvyklejší používaná forma vektoru. Nicméně, vynález zahrnuje i jiné formy expresních vektorů, jako například virové vektory (např. replikačně defektní retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry), které mají ekvivalentní funkce.
Termín rekombinantní hostitelská buňka (nebo prostě hostitelská buňka), jak je použit v tomto textu, se týká buňky, do které byl vnesen rekombinantní expresní vektor. Je třeba rozumět, že tento termín nezahrnuje pouze konkrétní buňku, ale i potomstvo takové buňky. Protože se mohou vyskytovat určité modifikace v následných generacích způsobené buďto mutací nebo environmentálními vlivy, takové potomstvo
nemůže ve skutečnosti být totožné se základní, rodičovskou
buňkou, ale přesto je zahrnuto v rozsahu termínu hostitelská
buňka, jak se v tomto textu používá.
Termín selektivně hybridizovat v tomto textu znamená
specificky a detekovatelně vázat. Polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty podle vynálezu selektivně hybridizuji s vláknem nukleové kyseliny za podmínek hybridizace a promývání, které významně minimalizují detekovatelnou vazbu k nespecifickým nukleový kyselinám. Vysoce stringentni nebo vysoce přísné podmínky se užívají k dosažení selektivní hybridizace jak je v oboru známo a jak je dále ještě diskutováno. Příkladem vysoce stringentnich přísných podmínek je způsob inkubace s dalším polynukleotidem, kdy jeden polynukleotid může být fixován na povrchu pevné látky, jako je například membrána, v hybridizačnim pufru obsahujícím 6X SSPE nebo SSC, 50% formamid, 5X Denhardtovo činidlo, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu, při hybridizačni teplotě 42 °C po dobu 12-16 hodin, po které následuje dvakrát promytí v 55 °C v promývacim pufru s IX SSC, 0,5% SDS (podrobněji viz Sambrook et al., citován výše, pp. 9,50-9,55).
nebo velmi polynukleotidu
Termín procento sekvenční identity v kontextu sekvencí nukleové kyseliny se týká dvou sekvencí, které jsou stejné, když se přiřadí (srovnají) pro dosažení maximální shody. Délka sekvence srovnání identity může být alespoň devět nukleotidů, obvykle alespoň 18 nukleotidů, obvykleji alespoň 24 nukleotidů, typicky alespoň přibližně 28 nukleotidů, typičtěji
alespoň 32 nukleotidů a výhodně alespoň přibližně 36, 48 nebo ještě více nukleotidů. V oboru je známa řada různých algoritmů, které mohou být použity pro určení míry identity nukleotidových sekvencí. Například polynukleotidové sekvence mohou být porovnávány s použitím algortimů FASTA, Gap nebo Bestfit, které jsou součástí programového balíku Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, který zahrnuje, např. programy FASTA2 a FASTA3, poskytuje porovnání sekvencí a určí procento sekvenční identity úseku nejlepšího přiřazení (překrytí) mezi dotazovanou a vyhledanou sekvencí (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98, 1990, Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219, 2000, Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996, Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84, 1998, v tomto textu zahrnuto formou odkazu). Není-li uvedeno jinak, pro konkrétní program nebo algoritmus jsou použity standardní parametry. Například procenta sekvenční identity mezi sekvencemi nukleové kyseliny mohou být určena s použitím programu FASTA s její standardními parametry (velikost slova 6 a faktor pro skórovací matici NOPAM) nebo s použitím programu GAP se standardními parametry, které poskytuje GCG Verze 6,1, které jsou v tomto textu zahrnuty formou odkazu.
Pokud se v textu odkazuje na sekvenci nukleové kyseliny, pak je zahrnut i její komplement (komplementární sekvence), není-li uvedeno jinak. Takže pokud se popis týká molekuly nukleové kyseliny mající konkrétní sekvenci, zahrnuje i její komplementární vlákno, s její komplementární sekvencí.
oboru molekulární biologie se termíny procenta sekvenční procenta identita, identity, sekvenční procenta homoiogie, ,sekvenční podobnost' sekvenční podobnosti a resp. termíny „sekvenční a „sekvenční homoiogie • · • · ·
- 30 užívají zcela zaměnitelně. V této přihlášce mají tyto termíny stejný význam pouze pokud jde o sekvence nukleové kyseliny.
Termín podstatná podobnost nebo podstatná sekvenční podobnost, ve vztahu k nukleovým kyselinám nebo jejich fragmentům, odkazuje na to, že když se sekvence optimálně přiřadí (srovná) za použití vhodné nukleotidové inzerce nebo delece s další nukleovou kyselinou (nebo jejím komplementárním vláknem), dosáhne se nukleotidové sekvenční identity alespoň přibližně 85 %, výhodně alespoň přibližně 90 % a výhodněji alespoň přibližně 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % nukleotidových bází, při měření kterýmkoliv známým algoritmem pro sekvenční identitu, jako je například FASTA, BLAST nebo Gap, jak bylo již diskutováno výše.
Pokud jde o polypeptidy, pak termín podstatná identita znamená, že dvě peptidové sekvence, když jsou optimálně porovnány, jako například pomocí programu GAP nebo BESTFIT s použitím standardní váhy pro mezeru, sdílejí alespoň 75% nebo 80% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90% nebo 95% sekvenční identitu, dokonce výhodněji alespoň 98% nebo 99% sekvenční identitu. Výhodně, pozice zbytků, které nejsou totožné, se liší díky konzervativní substituci aminokyselin. Konzervativní substituce aminokyseliny je taková substituce, kde jeden aminokyselinový zbytek je substituován jiným aminokyselinovým zbytkem majícím postranní řetězec (R skupina) s podobnými chemickými vlastnostmi (jako je např. náboj nebo hydrofobicita). Obecně, konzervativně substituovaná aminokyselina v podstatě nemění funkční vlastnosti proteinu. V případech, kde se dvě nebo více aminokyselinových sekvencí liší konzervativní substitucí, procenta sekvenční identity nebo míry podobnosti mohou být korigovány směrem k vyšším hodnotám vzhledem ke konzervativní povaze substituce.
- 31 Prostředky pro takovou jsou odborníkům známy, viz např. Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31, 1994, v tomto textu zahrnuto formou odkazu. Příklady skupin aminokyselin, které mají postranní řetězce s podobnými chemický vlastnostmi, zahrnují 1) alifatický postranní řetězce: glycin, alanin, valin, leucin a izoleucin, 2) alifatický-hydroxylový postranní řetězce: serin a threonin, 3) amid obsahující postranní řetězec: asparagin a glutamin, 4) aromatický postranní řetězce: fenylalanin, tyrosin a tryptofan, 5) bazický postranní řetězce: lysin, arginin a histidin a obsahující postranní řetězec: cystein a methionin.
6) síru Výhodné konzervativní nálseduj ící: lysin-arginin, glutamin.
aminokyselinové substituční skupiny jsou valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, alanin-valin, glutamát-aspartát a asparaginAlternativně, konzervativní substituce je jakákoliv změna mající pozitivní hodnotu v PAM250 log-pravděpodobnostní matici popsané v Gonnet et al., Science 256: 1443-45, 1992, v tomto textu zahrnuté formou odkazu. Mírně konzervativní substituce je kterákoliv změna mající hodnotu v PAM250 logaritmické pravděpodobnostní matici jinou než negativní.
Sekvenční podobnost polypeptidů, která je také nazývána sekvenční identita, je typicky měřena s použitím softwaru pro analýzy sekvence. Software pro analýzy proteinů přiřazuje podobné sekvence na základě míry podobnosti přiřazené různým substitucím, delecím a jiným modifikacím, včetně konzervativních substitucí aminokyselin. Například programový balík GCG obsahuje programy jako například Gap a Bestfit , které mohou být použity se standardními parametry pro určování sekvenční homologie nebo sekvenční identity mezi blízce příbuznými polypeptidy, jako jsou například homologní
polypeptidy z různých druhů organismů, nebo mezi proteinem divokého typu a jeho muteinem (viz např. GCG Verze 6,1). Polypeptidové sekvence také mohou být porovnávány pomocí programu FASTA s použitím standardních nebo doporučených parametrů, což je také program v GCG Verzi 6,1. FASTA (např. FASTA2 a FASTA3) poskytuje porovnání a procenta sekvenční identity pro úseky nej lepšího překrývání mezi dotazovanou a vyhledávanou sekvencí (Pearson, 1990, Pearson, 2000). Další výhodný algoritmus pro srovnávání sekvence podle vynálezu s databází obsahující velký počet sekvencí z různých organismů je počítačový program BLAST, obzvláště jeho varianty blastp nebo tblastn, s použitím standardních parametrů (viz např. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402, 1997, v tomto textu zahrnuto formou odkazu).
Délka polypeptidové sekvence porovnávané na homologii je obecně alespoň asi 16 aminokyselinových zbytků, obvykle alespoň asi 20 zbytků, obvykleji alespoň přibližně 24 zbytků, typicky alespoň přibližně 28 zbytků a výhodně víc než přibližně 35 zbytků. Když se prohledává databáze obsahující sekvence z velkého počtu různých organismů, je výhodné srovnávat aminokyselinové sekvence.
Jak se v tomto textu používá, termíny značka nebo značený se týkají inkorporace další molekuly do protilátky. V jednom provedení vynálezu je značka detekovatelný markér, např. inkorporace radioaktivně značené aminokyseliny do polyppetidu nebo připojení biotinylových skupin k polypeptidů, které mohou být detekovány značeným avidin (např. streptavidinem obsahujícím fluorescenční markéry nebo enzymatickou aktivitu, které mohou být detekovány optickými nebo kolorimetrickými metodami). V dalším provedení značka • · · ·
nebo markér mohou být terapeutické, např. konjugát s léčivem nebo toxin. Různé metody značení polypeptidů a glykoproteinů jsou známy v oboru a mohou být použity. Příklady značek pro polypeptidy zahrnují, ale bez omezení, následující: radioizotopy nebo radionuklidy (např. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, U1ln, 125I, 131I), f luroescenční značky (např. FITC, rhodamin, lanthanid fosfory), enzymatické značky (např. křenová peroxidáza, p-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminescenční značky, biotinylové skupiny, předeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundárním reportérem (např. sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátky, vazebné domény kovů, epitopové „přívěsky), magnetická činidla jako například cheláty gadolinia, toxiny jako například toxin černého kašle, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxydion anthracinu, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glukokortikoidy, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol a puromycin a jejich analogy nebo homology.
V některých provedeních jsou značky připojeny pomocí oddělovače, spaceru, různých délek, aby se snížila možnost sférických zábran.
Termín agens nebo „činidlo se užívá v tomto textu pro označení chemické sloučeniny, směs chemických sloučenin, biologické makromolekuly nebo extraktu získaného z biologického materiálu. Termín farmaceutické agens nebo léčivo, jak se v tomto textu používá, se týká chemických sloučenin nebo kompozic schopných vyvolat požadovaný terapeutický účinek, když jsou vhodně podávány pacientovi.
• · · ·
Další chemické termíny v tomto textu jsou použity v souladu se zvyklostmi v oboru, jak lze najít např. v publikaci The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Vyd., McGraw-Hill, San Francisco, 1985), zahrnuté formou odkazu v tomto textu.
Termín antineoplazické agens je používán v tomto textu k označení činidel, která mají tu funkční vlastnost, že inhibují rozvoj nebo progresi neoplázie čili novotvaru u člověka, konkrétně maligní (rakovinné) léze, jako je například karcinom, zhoubný nádor, lymfom nebo leukémie. Inhibice metastáz je také častou vlastností antineoplazického agens.
Termín pacient zahrnuje pacienty jak humánní tak i a veterinární, tedy lidi i zvířata.
Humánní anti-IGF-IR protilátky a jejich charakterizace
Humánní protilátky zabraňují určitým problémům, které jsou spojeny s protilátkami, které obsahují variabilní a/nebo konstantní úseky z myši nebo laboratorního potkana Přítomnost sekvence pocházející z myši nebo laboratorního potkana může vést k rychlé clearance protilátek nebo může dokonce vyvolat imunitní reakci pacienta proti podané protilátce.
Proto v jednom provedení vynález poskytuje humanizované anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodném provedení vynález poskytuje plně humánní anti-IGF IR protilátky tak, že humánní imunoglobulinové geny jsou vneseny do hlodavce, takže hlodavec pak vytváří plně humánní protilátky. Výhodnější jsou plně humánní anti-humánní IGF-IR protilátky. Plně humánní anti-IGF-IR protilátky by měly podle očekávání minimalizovat imunogenní a alergickou odpověď, která je vlastní myším nebo z myší odvozených monoklonálních protilátek (Mab), a tím
- 35 zvýšit účinnost a bezpečnost podávání protilátek. Použití plně humánních protilátek by mělo poskytnout podstatné výhody při léčbě chronických a periodických lidských onemocnění, jako je například zánět a karcinom, kdy je vyžadováno opakované podávání protilátky. V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která se neváže na komplement.
Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je protilátka
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka obsahuje lehký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo jeden nebo více úseků CDR z těchto aminokyselinových sekvencí. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka obsahuje těžký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo jeden nebo více úseků CDR z těchto aminokyselinových sekvencí.
Třídy a podtřídy Anti-IGF-IR protilátek
Protilátka může být molekula IgG, IgM, IgE, IgA nebo IgD. Ve výhodném provedení protilátka je IgG protilátka a je podtypu IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4. Ve výhodnější provedení anti-IGF-IR protilátka je protilátka podtřídy IgG2. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je stejné třídy a podtřídy jako protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1, což je IgG2.
Třída a podtřída anti-IGF-IR protilátky mohou být určeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru. Obecně, třída a podtřída protilátky mohou být určeny pomoc protilátek, které jsou specifické pro konkrétní třídu a podtřídu protilátky. Takové protilátky jsou dostupné komerčně. Třída a podtřída mohou být určeny např. testem ELISA, Western blot, a jinými technikami.
• · · ·
- 36 Alternativně třída a podtřída mohou být určeny sekvencováním celých nebo části konstantních domén těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátek, porovnáním jejich aminokyselinové sekvence se známou aminokyselinovou sekvencí různých tříd a podtříd imunoglobulinů a určením třídy a podtřídy protilátky.
Druhová a molekulová selektivita
V dalším aspektu vynálezu anti-IGF-IR protilátka vykazuje jak druhovou tak i molekulovou selektivitu. V jednom provedení se anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-IR člověka nebo makaků (Macaca fascicularis nebo M. rhesus). Ve výhodném provedení se anti-IGF-IR protilátka neváže na IGF-IR myši, laboratorního potkana, morčete, psa nebo králíka. V dalším výhodném provedení se anti-IGF-IR protilátka neváže u druhů opic Nového světa jako je například marmoset. Na základě popisu vynálezu je možné určit druhovou selektivitu anti-IGF-IR protilátky pomocí metod dobře známých v oboru. Například je možné určit druhovou selektivitu s použitím testů Western blot, FACS, ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení může být určena druhová selektivita s použitím Western blotu.
V dalším provedení má anti-IGF-IR protilátka selektivitu pro IGF-IR, která je alespoň 50 krát větší než její selektivita pro inzulínový receptor. Ve výhodném provedení selektivita anti-IGF-IR protilátka je více než 100 krát vyšší než její selektivita pro inzulínový receptor. V ještě výhodnějším provedení anti-IGF-IR protilátka neprojevuje žádnou patrnou specifickou vazbu na jakýkoliv jiný protein kromě IGF-IR. Selektivita anti-IGF-IR protilátky pro IGR-IR může být určena na základě popisu vynálezu s použitím metod dobře známých v oboru. Například selektivita může být určena • · · · •· · ·· ······ • · · · · ·· · • ······ ·· ·· · · · · · ···· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· ··
- 37 pomocí testů Western blot, FACS, ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení může být určena molekulární selektivita s použitím Western blotu.
Vazebná afinita anti-IGF-IR k IGF-IR
V dalším aspektu vynálezu, anti-IGF-IR protilátky se vážou k IGF-IR s vysokou afinitou. V jednom provedení se anti-IGFIR protilátka váže k IGF-IR s Kd 1 x 108 M nebo menší. Ve výhodnějším provedení se protilátka váže k IGF-IR s Kd nebo 1 x 10-9 M nebo menší. V ještě výhodnějším provedení se protilátka váže k IGF-IR s Kd 5 x ΙΟ“10 M nebo menší. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s Kd 1 x ΙΟ-10 M nebo menší. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka vybraná z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky vybrané z protilátek 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V ještě dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6,
8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Kd jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu nebo více aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20, 22 nebo 24.
V dalším aspektu vynálezu, anti-IGF-IR protilátka má nízkou rychlost disociace. V jednom provedení anti-IGF-IR protilátka má Koff hodnotu I x 10“4 s“1 nebo nižší. Ve výhodném
9 · · · 9 · • 99 99 99 99 provedení Koff je 5 x 10“5 s-1 nebo nižší. V dalším výhodném provedení Koff je v podstatě stejná jako Koff protilátky vybrané z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1,1. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGFIR s v podstatě stejnou Koff jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky vybrané z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1,1. V ještě dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Koff jako protilátka, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. V dalším výhodném provedení se protilátka váže k IGF-IR s v podstatě stejnou Koff jako protilátka, která obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí
vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,
22.
Vazebná afinita a rychlost disociace anti-IGF-IR
protilátky a IGF-IR mohou být určeny jakýmkoliv způsobem
známým v oboru. V jednom provedení je vazebná afinita měřena kompetitivní ELISA, RIA nebo povrchovou plazmonovou resonancí, jako je například systém BIACORE. Rychlost disociace může být také měřena povrchovou plazmonovou resonancí. Ve výhodnějším provedení vazebná afinita a rychlost disociace jsou měřeny povrchovou plazmonovou resonancí. V ještě výhodnějším provedení vazebná afinita a rychlost disociace jsou měřeny s použitím systému BIACORE. Příklady stanovení vazebné afinity a rychlosti disociace jsou popsány dále v příkladu 2.
Poločas anti-IGF-IR protilátky
Podle dalšího předmětu vynálezu, anti-IGF-IR protilátka má biologický poločas in vitro nebo in vivo alespoň jeden den. Ve výhodném provedení má protilátka nebo její část poločas alespoň tři dny. Ve výhodnějším provedení má protilátka nebo její část poločas čtyři dny nebo delší. V dalším provedení má protilátka nebo její část poločas osm dnů nebo delší. V dalším provedení je protilátka nebo její antigen-vazebná část derivatizována nebo modifikována tak, že má delší poločas, jak je diskutováno ještě dále. V dalším výhodném provedení protilátka může obsahovat bodové mutace, které zvyšují poločas v séru, jako bylo například popsáno ve WO 00/09560, publikované 24. února 2000.
Poločas protilátky může být měřen kteroukoliv z metod známých v oboru. Například poločas protilátky může být měřen pomocí Western blot, ELISA nebo RIA po vhodný časové období. Poločas protilátka může být měřen na jakýchkoliv vhodných zvířatech, např. opicích, jako například makakové, primáti nebo i člověk.
Identifikace IGF-IR epitopů rozpoznávaných protilátkou anti-IGF-IR
Vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která váže stejný antigen nebo epitop jako humánní anti-IGF-IR protilátka. Dále vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která zkříženě kompetuje s humánní anti-IGF-IR protilátkou. Ve výhodném provedení humánní anti-IGF-IR protilátka je protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jeden nebo více úseků CDR z protilátka vybrané z
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1.
V ještě dalším výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. V dalším • · ·
- 40 výhodném provedení humánní anti-IGF-IR obsahuje jeden nebo více CDR z protilátky, která obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí vybraných ze SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24. Ve vysoce výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je další humánní protilátka.
Zda se anti-IGF-IR protilátka váže ke stejnému antigenu je možné určit použitím celé řady metod známých v oboru. Například se může určovat, zda se testovaná anti-IGF-IR protilátka váže ke stejnému antigenu s použitím anti-IGF-IR protilátky k zachycení antigenu, o kterém je známo, že se váže na anti-IGF-IR protilátku, jako například IGF-IR, pak eluovat antigen z protilátky a nakonec určit, zda se testovaná protilátka váže k eluovanému antigenu. Může se určovat také, zda se protilátka váže ke stejnému epitopu jako anti-IGF-IR protilátka, a sice vazbou anti-IGF-IR protilátky k IGF-IR za saturujících podmínek a pak měřením schopnosti testované protilátky vázat se k IGF-IR. Jestliže je testovaná protilátka schopná vázat se k IGF-IR současně jako anti-IGF-IR protilátka, pak se testovaná protilátka váže k odlišnému epitopu než anti-IGF-IR protilátka. Nicméně, jestliže testovaná protilátka není schopná se vázat k IGF-IR současně, pak se testovaná protilátka váže ke stejnému epitopu jako humánní anti-IGF-IR protilátka. Tento experiment může být prováděn s použitím ELISA, RIA nebo povrchové plazmonové rezonance. Ve výhodném provedení je experiment prováděn s použitím povrchové plazmonové rezonance. V výhodnější provedení je použit systém BIACORE. Může se také určovat, zda anti-IGF-IR protilátka zkříženě kompetuje s anti-IGF-IR protilátkou. Ve výhodném provedení se může určovat, zda antiIGF-IR protilátka zkříženě kompetuje s jinou, a to tak, že se použije stejný způsob, kterým se určuje, zda je anti-IGF-IR protilátka schopná vázat se ke stejnému epitopu jako jiná ··«· ·· · · · · · · · * »
anti-IGF-IR protilátka.
Využití lehkých a těžkých řetězců
Vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která obsahuje variabilní sekvence kódované humánním genem k. Ve výhodném provedení jsou variabilní sekvence kódovány geny rodiny buď Vk A27, A30 nebo 012. Ve výhodném provedení jsou variabilní sekvence kódovány humánní genovou rodinou Vk A30. Ve výhodnějším provedení lehký řetězec obsahuje ne více než deset substituovaných aminokyselin ze zárodečné linie VkA27, A30 nebo 012, výhodně ne více než šest substituovaných aminokyselin a výhodněji ne více než tři substituované aminokyseliny. Ve výhodném provedení jsou aminokyselinové substituce konzervativní substituce.
SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 a 22 poskytovat aminokyselinové sekvence variabilní úseky šesti anti-IGF-IR κ lehkých řetězců. SEKV. ID. Č. 38, 40 a 42 poskytují aminokyselinové sekvence tři zárodečných κ lehkého řetězce, z něhož pochází šest anti-IGF-IR κ lehkých řetězců. Obr. 1A-1C ukazují srovnání nukleotidových sekvencí variabilních úseků lehkého řetězce šesti anti-IGF-IR protilátek a zárodečné sekvence, ze které pocházejí. Na základě popisu vynálezu odborník může určit kódované aminokyselinové sekvence pro těchto šest anti-IGF IR κ lehkých řetězců a zárodečného κ lehkého řetězce a stanovit rozdíly mezi zárodečnou sekvencí a sekvencí protilátky.
Ve výhodném provedení VL z anti-IGF-IR protilátky obsahuje stejné substituce aminokyselin, vzhledem k zárodečné aminokyselinové sekvenci, jako kterýkoliv jeden nebo více VL z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
- 42 6.1.1. Například VL anti-IGF-IR protilátky může obsahovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které jsou stejné jako substituce přítomné v protilátce 2.13.2, další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako substituce přítomná v protilátce 2. 14.3 a další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako substituce v protilátce
4.9.2. Tímto způsobem se mohou mísit a spojovat různé rysy vazby protilátky, aby se např. změnila afinita protilátky pro IGF-IR nebo její rychlost disociace od antigenu. V dalším provedení jsou aminokyselinové substituce vytvořeny ve stejných polohách, ve kterých byly zjištěny v kterékoliv jedné nebo více VL z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2. 4.17.3 nebo 6. 1,1, přičemž jsou tvořeny konzervativní substituce místo použití zcela stejných aminokyselin. Například jestliže je aminokyselinová substituce srovnána se zárodečnou sekvencí v jedné z protilátek 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1 je glutamát, může být konzervativně substituován aspartát. Podobně, jestliže je substituovaná aminokyselina serin, může být konzervativně substituován threonin.
V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je stejná jako aminokyselinová sekvence VL z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším vysoce výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence, které jsou stejné jako CDR úseky lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci z alespoň jednoho CDR úseku lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence z CDR z různých lehkých řetězců. Ve výhodnějším provedení CDR
• · · ·· · · • · · ···· ··
- 43 z různých lehkých řetězců jsou získány z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. V dalším provedení lehký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21 nebo sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí. Výhodně, substituce aminokyselin jsou konzervativní substituce aminokyselin. V dalším provedení vynálezu protilátka nebo její část obsahuje lehký řetězec lambda.
Předkládaný vynález také poskytuje anti-IGF-IR protilátku nebo část protilátky, která obsahuje humánní těžký řetězec nebo sekvenci pocházející z humánního těžkého řetězce. V jednom provedení aminokyselinová sekvence těžkého řetězce pochází z humánní genové rodiny VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 nebo VIV-4/4.35. Ve výhodném provedení aminokyselinová sekvence těžkého řetězce pochází z humánní genové rodiny VH DP47. Ve výhodnějším provedení těžký řetězec obsahuje ne více než osm aminokyselinových substitucí ze zárodečné linie VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 nebo VIV-4/4.35, výhodněji ne více než šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce.
SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 a 24 poskytují aminokyselinové sekvence variabilních úseků z šest anti-IGF-IR těžkých řetězců. SEKV. ID. Č. 30, 32, 34, 36 a 44 poskytují aminokyselinové sekvence a SEKV. ID. Č. 29, 31, 33, 35 a 43 poskytovat nukleotidová sekvence zárodečného těžkého řetězce DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 a VIV-4, v daném pořadí. Obr. 2A-2D ukazují srovnání aminokyselinových sekvencí variabilních • · · · úseků šesti anti-IGF-IR protilátek s jim odpovídající zárodečnou sekvencí. Na základě popisu vynálezu odborník může určit kódované aminokyselinové sekvence pro těchto šest antiIGF IR těžkých řetězců a zárodečného těžkého řetězce a stanovit rozdíly mezi zárodečnou sekvencí a sekvencí protilátky.
Ve výhodném provedení VH anti-IGF-IR protilátky obsahuje stejné substituce aminokyselin, vzhledem k zárodečné aminokyselinové sekvenci, jako kterýkoliv jeden nebo více VH protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. Podobně jak bylo již diskutováno výše, VH anti-IGF-IR protilátky může obsahovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které jsou stejné jako substituce přítomné v protilátce 2.13.2, další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako substituce přítomná v protilátce 2.14.3 a další aminokyselinovou substituci, která je stejná jako v protilátce
4.9.2. Tímto způsobem se mohou mísit a spojovat různé rysy vazby protilátky, aby se např. změnila afinita protilátky pro IGF-IR nebo její rychlost disociace od antigenů. V jiném provedení jsou aminokyselinové substituce vytvořeny ve stejných polohách, ve kterých byly zjištěny v kterékoliv jedné nebo více VH z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2. 4.17.3 nebo 6. 1,1, přičemž jsou tvořeny konzervativní substituce místo použití zcela stejných aminokyselin.
V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je shodná jako aminokyselinová sekvence VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším vysoce výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence, které jsou stejné jako CDR úseky těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci z alespoň jednoho CDR úseku těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinové sekvence z CDR z různých těžkých řetězců. Ve výhodnějším provedení CDR z různých těžkých řetězců jsou získány z 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 23. V dalším provedení těžký řetězec obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23 nebo sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci mající 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí. Výhodně, substituce aminokyselin jsou konzervativní substituce aminokyselin.
Inhibice IGF-IR aktivity anti-IGF-IR protilátkou
Inhibice vazby IGF-I k IGF-IR
V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která inhibuje vazbu IGF-I k IGF-IR nebo vazbu IGF-II k IGF-IR. Ve výhodném provedení IGF-IR je humánní. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka je humánní protilátka. V dalším provedení protilátka nebo její část inhibuje vazbu mezi IGF-IR a IGF-I s hodnotou IC50 ne vyšší než 100 nM. Ve výhodném provedení IC50 není vyšší než 10 nM. Ve výhodnějším provedení IC50 není vyšší než 5 nM. Hodnota IC5o může být měřena jakýmkoliv způsobem známým v oboru. Typicky, IC50 může být měřena ELISA nebo RIA. Ve výhodném provedení IC50 je měřena pomocí RIA.
- 46 V dalším provedení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která zabraňuje aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-I. Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje IGF-IR-indukovanou fosforylaci tyrosinu, která nastává po obsazení receptoru. V dalším výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje další „downstream (po směru) buněčné události. Například anti-IGF-IR může inhibovat fosforylaci tyrosinu Shc a substrátu inzulínového receptoru (IRS) 1 a 2, kdy každý z nich je normálně fosforylován, když jsou buňky ošetřeny IGF-I (Kim et al., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998) . Může se určovat, zda anti-IGF-IR protilátka může zabránit aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-1 tím, že se určují hladiny autofosforylace pro IGF-IR, Shc, IRS-1 nebo IRS-2 pomocí Western blotu nebo imunoprecipitace. Ve výhodném provedení se určí hladiny autofosforylace IGF-IR Western blotem (viz např. příklad 7).
V dalším aspektu vynálezu, protilátka způsobuje down-regulaci IGF-IR z buněk ošetřených protilátkou. V jednom provedení je IGF-IR internalizován do cytoplasmy buňky. Po navázání anti-IGF-IR protilátky na IGF-IR je protilátka internalizována, jak ukázala konfokální mikroskopie. Bez vazby na jakékoliv teorie, má se za to, že komplex protilátka-IGFIR je internalizován do lysosomu a degradován. Může být měřena down-regulace IGF-IR jakýmkoliv způsobem známým v oboru včetně imunoprecipitace, konfokální mikroskopie nebo Western blotu (viz např. příklad 7). Ve výhodném provedení protilátka je vybrána z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje jejich těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebný úsek.
» « · · · <
• · · · · « • · • «
- 47 napodobuje IGF-I zesiluje účinek
Aktivace IGF-IR vlivem anti-IGF-IR protilátky
Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje aktivační anti-IGF-IR protilátky. Aktivační protilátka se liší od inhibiční protilátky, protože zesiluje nebo nahrazuje účinky IGF-I na IGF-IR. V jednom provedení aktivační protilátka je schopný vázat sena IGF-IR a přimět ho, aby byl aktivován bez přítomnosti IGF-I. Tento typ aktivační protilátky v podstatě V dalším provedení aktivační protilátka IGF-I na IGF-IR. Tento typ protilátky nezpůsobuje aktivaci IGF-IR samotný, ale spíše zvyšuje aktivaci IGF-IR v přítomnosti IGF-1. Napodobují anti-IGF-IR protilátka může být snadno odlišena od zesilující anti-IGF-IR protilátky, a sice ošetřením buněk in vitro protilátkou v přítomnosti nebo nepřítomnosti nízké hladiny IGF-1. Jestliže je protilátka schopná způsobit aktivaci IGF-IR bez výskytu IGF-I, např. zvyšuje se tyrosinová fosforylace IGF-IR, pak protilátka je napodobující protilátka. Jestliže protilátka nemůže způsobit aktivaci IGF-IR bez výskytu IGF-I, ale je schopná zesílit míru aktivace IGF-IR, pak protilátku je zesilující protilátka. Ve výhodném provedení aktivační protilátka je 4.17.3. V dalším výhodném provedení protilátka obsahuje jeden nebo více úseků CDR z 4.17.3. V dalším výhodném provedení protilátka je odvozena buďto z jedné nebo z obou zárodečných sekvencí 012 (lehký řetězec) a/nebo D71 (těžký řetězec).
• · · ·
- 48 Inhibice fosforylace tyrosinu IGF-IR, hladiny IGF-IR a nádorové buňky
Růst in vivo s anti-IGF-IR protilátkou
Další provedení vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která in vivo inhibuje fosforylaci tyrosinu IGF-IR a hladiny receptoru. V jednom provedení podávání anti-IGF-IR protilátky zvířeti vyvolá snížení IGF-IR fosfotyrosinové signalizace v IGF-IR-exprimujících nádorech. Ve výhodném provedení anti-IGFIR protilátka vyvolá snížení fosfotyrosinového signálu alespoň o 20 %. Ve výhodnějším provedení anti-IGF-IR protilátka způsobí pokles fosfotyrosinového signálu alespoň o 60 %, výhodněji 50 %. V ještě výhodnějším provedení protilátka způsobí pokles fosfotyrosinového signálu alespoň o 40 %, výhodněji o 30 %, dokonce výhodněji o 20 %. Ve výhodném provedení protilátka je podávána přibližně 24 hodin před tím, než jsou hladiny tyrosinové fosforylace měřeny. Hladiny fosforylace tyrosinu mohou být měřeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru, jako byly například způsoby zmíněné výše (viz také např. příklad 3 a obr. 5). Ve výhodném provedení protilátka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje její těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část.
V dalším provedení podávání anti-IGF-IR protilátky zvířeti vyvolá snížení IGF-IR hladiny v IGF-IR-exprimujících nádorech. Ve výhodném provedení anti-IGF-IR protilátka vyvolá snížení hladiny receptorů alespoň o 20 % ve srovnání s neošetřeným zvířetem. Ve výhodnějším provedení anti-IGF-IR protilátka způsobí pokles hladiny receptorů na alespoň 60 %, výhodněji % hladiny receptoru u neošetřeného zvířete. V ještě výhodnějším provedení protilátka způsobí pokles hladiny
receptoru na alespoň 40 %, výhodněji 30 %. Ve výhodném provedení protilátka je podávána přibližně 24 hodin před tím, než jsou měřeny IGF-IR hladiny. IGF-IR hladiny mohou být měřeny jakýmkoliv způsobem známým v oboru, jak byly např. zmíněny výše (viz také příklad 7 a obr. 6) . Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje její těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část.
V dalším provedení anti-IGF-IR protilátka inhibuje in vivo růst nádorových buněk. Nádorové buňky mohou pocházet z jakéhokoliv buněčného typu, a to včetně, bez jakéhokoliv omezení, epidermálních, epiteliálních a endotelových buněk, leukemických buněk, buněk sarkomu, buněk mnohačetného myelomu nebo mesodermálních buněk. Příklady nádorové buňky zahrnují buňky A54 9 (nemalobuněčný plicní karcinom), buňky MCF-7, buňky Colo 205, buňky 3T3/IGF-IR a buňky A431. Ve výhodném provedení protilátka inhibuje růst nádorových buněk ve srovnání s růstem nádoru u neošetřeného zvířete. Ve výhodnějším provedení protilátka inhibuje růst nádorových buněk z 50 %. V ještě výhodnějším provedení protilátka inhibuje růst nádorových buněk z 60 %, 65 %, 70 % nebo 75 %. V jednom provedení vynálezu je inhibice růstu nádorových buněk měřena alespoň 7 dnů po tom, co zvířata zahájila léčbu s protilátkou. Ve výhodnějším provedení je inhibice růstu nádorových buněk měřena alespoň 14 dnů po tom, co zvířata zahájila léčbu s protilátkou. V dalším výhodném provedení je zvířeti s antiIGF-IR protilátkou podáváno jiné antineoplázické agens. Ve výhodném provedení antineoplázické agens je schopno další inhibice růstu nádorových buněk. V ještě výhodnějším provedení antineoplázické agens je adriamycin, taxol, tamoxifen, 5-fluordeoxyuridin (5-FU) nebo CP-358,774. Ve výhodném provedení souběžné podávání antineoplázického agens a anti-IGF-IR protilátky inhibuje růst nádorových buněk alespoň z 50 %, výhodně 60 %, 65 %, 70 % nebo 75 %, výhodněji z 80 %, 85 % nebo 90 % po dobu 22 až 24 dnů (viz např. obr. 7 a příklad 9) . Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a
6.1.1, nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část takové protilátky.
Indukce apoptózy anti-IGF-IR protilátkami
Další aspekt vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, která indukuje buněčnou smrt. V jednom provedení protilátka způsobuje apoptózu. Protilátka může indukovat apoptózu buď in vivo nebo in vitro. Obecně, nádorové buňky jsou citlivější k apoptóze než normální buňky, takže podávání anti-IGF-IR protilátky způsobí apoptózu nádorové buňky spíše než normální buňky. V dalším provedení vynálezu podávání anti-IGF-IR protilátky sníží hladiny enzymu akt, fosfatidylinositolkinázové (PI-kináza) dráha je zase zapojena do buněčné proliferace a prevence apoptózy. Takže inhibice akt může způsobit apoptózu. Ve výhodnějším provedení je protilátka podávána in vivo, aby způsobila apoptózu IGF-IR-exprimujících buněk. Ve výhodném provedení je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 6. 1,1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo antigen-vazebnou část takové protilátky.
který se podílí na dráze. PI-kinázová
Způsoby produkce protilátek a přípravy buněčné linie produkující protilátky
- 51 V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou humánní protilátky produkovány imunizací zvířete jiného než lidského
Imunizace původu, které obsahují imunoglobulinové lokusy s některé nebo všechny IGF-IR antigenem. Ve • · <9 · « · · ·
5,916,771, 6,091,001,
Států č. 6,075,181,
91/10741, humánní výhodném provedení je zvíře odlišné od člověka XENOMOUSE™, což je geneticky upravený myší kmen, který obsahuje velké fragmenty humánních imunoglobulinových lokusů a přitom je defektní v produkci myších protilátek (viz např. Green et al. Nátuře Genetics 7: 13-21, 1994, a patenty Spojených
5, 939, 598, 5, 985, 615, 5, 998,209,
6,114,598 a 6,130,364, a také WO publikovaná 25. července 1991, WO 94/02602, publikovaná 3. února 1994, WO 96/34096 a WO 96/33735, obě publikované 31. října 1996, WO 98/16654, publikovaná 23. dubna 1998, WO 98/24893, publikovaná 11. června 1998, WO 98/50433, publikovaná 12. listopadu 1998, WO 99/45031, publikovaná 10. září 1999, WO 99/53049, publikovaná 21. října 1999, WO 00 09560, publikovaná 24. února 2000 a WO 00/037504, publikovaná 29. Června 2000. Myši XENOMOUSE™ vytvářejí humánní, dospělému podobný repertoár plně humánních protilátek a generují antigen-specifické humánní monoklonální protlátky. Druhá generace myší XENOMOUSE™ obsahuje přibližně 80 repertoáru humánních protilátek, vnesený zárodečnou konfigurací YAC fragmentů megabázové velikosti obsahujících lokusy humánního těžkého řetězce a lokusy lehkého řetězce κ (viz Mendez et al. Nátuře Genetics 15: 146-156, 1997, Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998, které jsou tímto zahrnut formou odkazu).
Vynález také poskytuje způsob přípravy anti-IGF-IR protilátek ze zvířat kromě člověka a myši, a sice imunizací
- 52 transgenních zvířat s výjimkou člověka, která obsahují humánní imunoglobulinové lokusy. Taková zvířata mohou být připravena využitím metod popsaných výše. Metody popsané v těchto patentech mohou být modifikovány jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5,994,619. Ve výhodném provedení vynálezu zvířata jiného než lidského původu jsou laboratorní potkani, ovce, prasata, kozy, hovězí dobytek nebo koně.
V dalším provedení vynálezu zvíře jiného než lidského původu obsahující genové lokusy humánního imunoglobulinu je zvíře, které obsahuje minilokus humánního imunoglobulinu. V metodě „minilokusu je exogenní Ig místo napodobeno tím, že jsou vloženy jednotlivé geny z Ig lokusu. Takže jeden nebo více VH genů, jeden nebo více DH genů, jeden nebo více JH genů, konstantní úsek mí (μ) a druhý konstantní úsek (výhodně konstantní úsek gama (y) ) jsou spojeny do jednoho konstruktu pro inzerci do zvířete. Tento přístup je popsán, inter alia, v patentech Spojených Států č. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 a 5,643,763, které jsou tímto zahrnuty formou odkazu.
Výhodou metody „minilokusů je rychlost, se kterou lze vytvářet konstrukty obsahující části Ig lokusů vnášet je do zvířat. Nicméně, potenciální nevýhodou metody „minilokusů je někdy není dostatečná diverzita imunoglobulinů, která by podporovala plný vývoj B lymfocytů, takže může být nižší produkce protilátek.
Aby bylo možné produkovat humánní anti-IGF-IR protilátku, zvíře (jiného než lidského původu) obsahující některé nebo všechny lokusy humánního imunoglobulinu je imunizováno IGF-IR antigenem a pak jsou ze zvířete izolovány protilátky nebo buňky produkující protilátky. IGF-IR antigen může být izolovaný a/nebo purifikovaný IGF-IR a je to výhodně humánní IGF-IR. V dalším provedení IGF-IR antigen je fragment IGF-IR, výhodně extracelulární doména IGF-IR. V dalším provedení IGF-IR antigen je fragment, který obsahuje alespoň jeden epitop IGF-IR. V dalším provedení IGF-IR antigen je buňka, která exprimuje IGF-IR na svém buněčném povrchu, výhodně buňka, která nadměrně exprimuje (over-expression) IGF-IR na buněčném povrchu.
Imunizace zvířat může být provedena jakýmkoliv způsobem známým v oboru (viz např. Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Metody imunizace zvířat (jiného než lidského původu) jako jsou například myši, laboratorní potkani, ovce, kozy, prasata, hovězí dobytek a koně jsou v oboru dobře známy (viz např. Harlow and Lané, cit. Výše, a patent Spojených Států č. 5,994,619). Ve výhodném provedení IGF-IR antigen je podáván s adjuvans stimulujícím imunitní reakci.
Taková adjuvancia zahrnují úplné nebo neúplné Freundovo adjuvans, RIBI (muramyldipeptidy) nebo ISCOM (imunostimulační komplexy). Tato adjuvancia mohou chránit polypeptid před rychlým rozptýlením tím, že ho zadrží v lokálním depositu nebo mohou obsahovat látky, které stimulují hostitele, aby sekretoval faktory, který jsou chemotaktické pro makrofágy a jiné složky imunitního systému. Výhodně, jestliže je podáván polypeptid, imunizační schéma bude zahrnovat dvě nebo více podání polypeptidů v časovém rozpětí několika týdnů.
Příklad 1 poskytuje protokol pro imunizaci myší
XENOMOUSE™ humánním IGF-IR plné délky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty.
Produkce protilátek a buněčné linie produkující protilátky
Po imunizace zvířete IGF-IR antigenem, protilátky a/nebo buňky produkující protilátky mohou být získány ze zvířete. Sérum obsahující anti-IGF-IR protilátku se získá odběrem krve nebo utracením zvířete. Sérum může být použito tak, jak je získáno ze zvířete, nebo může být ze séra získána imunoglobulinová frakce nebo mohou být ze séra purifikovány anti-IGF-IR protilátky. Sérum nebo imunoglobulíny získané tímto způsobem jsou polyklonální, což je nevýhodné, protože množství protilátek, které mohou být získány, je omezené, a polyklonální protilátka má heterogenní matici vlastností.
V dalším provedení vynálezu jsou připraveny z imunizovaného zvířete imortalizované hybridomy produkující protilátku. Po imunizaci je zvíře utraceno a splenické B lymfocyty jsou fúzovány s imortalizovanými myelomovými buňkami, jak je v oboru známo (viz např. Harlow and Lané, cit. Výše). Ve výhodném provedení myelomové buňky nesekretují imunoglobulinové polypeptidy (neskretující buněčná linie). Po fúzi a selekci antibiotiky jsou screenovány s použitím IGF-IR, jeho části nebo buněk exprimujících IGF-IR. Ve výhodném provedení počáteční screening je prováděn s použitím ELISA testu nebo radioimunotestu (RIA), výhodně ELISA. Příklad screeningu pomocí ELISA je poskytnut ve WO 00/37504, v tomto textu zahrnuté formou odkazu.
V jiném provedení buňky produkující protilátky mohou být připraveny z člověka, který má autoimunitní nemoc, a který exprimuje anti-IGF-IR protilátky. Buňky exprimující anti-IGFIR protilátky mohou být izolovány tak, že se izolují bílé krvinky a podrobí se fluorescencí aktivovanému třídění buněk (FACS), nebo tak, že prohledávají destičky potažené IGF-IR nebo jeho částí. Tyto buňky mohou být fúzovány s humánními • »
nesekretujícími myelomy, čímž se připraví humánní hybridomy exprimující humánní anti-IGF-IR protilátky. Obecně je toto méně výhodné provedení, protože je pravděpodobné, že anti-IGFIR protilátky budou mít nízkou afinitu pro IGF-IR.
Hybridomy produkující protilátky ANTI-IGF-IR jsou selektovány, klonovány a dále podrobeny screeningu na žádoucí vlastnosti, zahrnující robustní růst hybridomu, vysokou produkci protilátky a požadované vlastnosti protilátky, jak bude diskutováno dále. Hybridomy mohou být pěstovány a množeny in vivo v syngenních zvířatech, ve zvířatech postrádajících imunitní systém, jako jsou např. nahé myši, nebo in vitro ve tkáňových kulturách. Metody selekce, klonování a množení hybridomů jsou odborníkům dobře známy.
Výhodně je imunizované zvíře jiné zvíře než lidského původu, které exprimuje geny humánního imunoglobulinu, a splenické B lymfocyty byly izolovány z myelomu pocházejícího ze stejného druhu zvířete jiného než lidského původu. Výhodněji, imunizované zvíře je myš XENOMOUSE™ a myelomová buněčná linie je nesekretujcí myší myelom, jako je například myelomová buněčná linie NSO-BCL2 (viz např. příklad 1).
V jednom aspektu vynález poskytuje hybridomy, které produkují humánní anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodném provedení jsou hybridomy myší hybridomy, jak bylo popsáno výše. V dalším výhodné provedení hybridomy jsou vytvořeny z biologického druhu jiného než člověka a jiného než myši, jako například laboratorního potkana, ovce, prasate, kozy, hovězího dobytka nebo koně. V dalším provedení jsou hybridomy humánní hybridomy, ve kterých je humánní nesekretující myelom fúzován s humánními buňkmai exprimujícími anti-IGF-IR protilátku.
• φ · ·
- 56 Nukleové kyseliny, vektory, hostitelské buňky a rekombinantní metody přípravy protilátek
Nukleové kyseliny
Molekuly nukleové kyseliny kódující anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu jsou poskytnuty. V jednom provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje těžký a/nebo lehký řetězec anti-IGF-IR imunoglobulinu. Ve výhodném provedení vynálezu jediná molekula nukleové kyseliny kóduje těžký řetězec antiIGF-IR imunoglobulinu a další molekula nukleové kyseliny kóduje lehký řetězec anti-IGF-IR imunoglobulinu. Ve výhodnější provedení vynálezu kódovaný imunoglobulin je humánní imunoglobulin, výhodně humánní IgG. Kódovaný lehký řetězec může být λ řetězec nebo κ řetězec, výhodně je to κ řetězec.
Molekula nukleové kyseliny kódující variabilní úsek lehký řetězec může pocházet z A30, A27 nebo 012 Vk genu. Ve výhodném provedení vynálezu lehký řetězec pochází z A30 Vk genu. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec obsahuje spojovací úsek pocházející z Jkl, Jk2 nebo Jk4. V ještě výhodnější provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec obsahuje ne více než deset aminokyselinových substitucí z A30 Vk genu zárodečné linie, výhodně ne více než šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce.
Vynález poskytuje molekulu nukleové kyseliny, která kóduje variabilní úsek lehkého řetězce (VL) obsahující nejméně tří aminokyselinové substituce ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, přičemž aminokyselinové substituce jsou identické s aminokyselinovými substitucemi ze sekvence VL zárodečné • 4» · · · · « · « » · «
5Ί linie jedné z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce z
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více úseků CDR z kteréhokoliv lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci všech úseků CDR kteréhokoliv lehkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvencí jedné ze sekvencí SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo obsahuje jednu ze sekvencí SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR s kteroukoliv ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jednoho nebo více CDR s kteroukoliv sekvencí ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci všech CDR z kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny všech CDR z kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21.
Vynález také poskytuje molekuly nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinové sekvence VL, které mají aminokyselinové sekvence alespoň ze 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, • · · ·
- 58 97 %, 98 % nebo 99 % identické s VL popsanou výše, konkrétně s VL, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která je alespoň ze 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická se sekvencí nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21. V dalším provedení vynálezu vynález poskytuje molekulu nukleové kyseliny kódující VL, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny kódující VL, jak byla popsána výše, konkrétně s molekulou nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny kódující VL, který hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 1, 5, 9, 13, 17 nebo 21.
Vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny kódující variabilní úsek těžkého řetězce (VH) pocházející z DP-35, DP-47, DP-71 nebo Vit-4/4.35 VH genu, výhodně DP-35 VH genu. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující spojovací úsek pocházející z JH6 nebo JH5, výhodněji JH6. V dalším výhodném provedení vynálezu D segment pochází z 3-3, 6-19 nebo 4-17. V ještě výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující ne více než deset aminokyselinových substitucí z DP-47 genu zárodečné linie, výhodně ne více než šest aminokyselinových substitucí a dokonce výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce. Ve vysoce výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje VH obsahující alespoň jednu aminokyselinovou substitucí ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, přičemž kde aminokyselinové ttt·
substituce jsou identické s aminokyselinovými substitucemi sekvence zárodečné linie od těžkého řetězce jedné z protilátek
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V ještě výhodnějším provedení vynálezu VH obsahuje alespoň tři aminokyselinové substituce ve srovnání se sekvencí zárodečné linie, kde substituce jsou identické se substitucemi ze sekvence VH zárodečné linie jedné z protilátek 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, -3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6. 1. 1.
V jednom provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR těžkého řetězce z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinové sekvence všech CDR těžkého řetězce z 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jedné ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. V dalším výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinovou sekvenci jednoho nebo více CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny jednoho nebo více CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. Ve výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje aminokyselinové sekvence všech CDR • · · ·
- 60 kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 nebo obsahuje sekvenci nukleové kyseliny všech CDR kterékoliv ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23.
V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kóduje aminokyselinovou sekvenci VH, která je alespoň ze 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická s jednou z aminokyselinových sekvencí kódujících VH, jak byly popsány bezprostředně výše, konkrétně s VH, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, která je alespoň ze 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo 99 % identická s jednou ze sekvencí nukleových kyselin SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23. V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující VH je molekula, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek se sekvencí nukleové kyseliny kódující VH, jak byl popsán výše, konkrétně VH obsahující aminokyselinovou sekvenci jedné ze SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24. Vynález také poskytuje sekvenci nukleové kyseliny kódující VH, který hybridizuje za vysoce stringentních podmínek s molekulou nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny ze SEKV. ID. Č. 3, 7, 11, 15, 19 nebo 23.
Molekula nukleové kyseliny kódující buď jeden nebo oba, jak těžký tak lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky nebo jejich variabilní úseky, může být získána z jakéhokoliv zdroje, který vytváří anti-IGF-IR protilátky. Metody izolace mRNA kódující protilátky jsou v oboru známy (viz např. Sambrook et al.). mRNA mohou být použity pro přípravu cDNA pro další použití v polymerázové řetězové reakci (PCR) nebo cDNA klonování protilátkových genů. V jednom provedení vynálezu, molekuly nukleové kyseliny mohou být získány z hybridomu, který exprimuje anti-IGF-IR protilátku, jak bylo popsáno výše, výhodně hybridomu, který má jako jeden z fúzních partnerů buňku transgenního zvířete jiného než člověka, jako je například XENOMOUSE™, která exprimuje humánní imunoglobulinové geny, nebo zvířete jiného než člověka, např. myši, nebo zvířete jiného než člověka a jiného než myš. V dalším provedení vynálezu hybridom pochází ze zvířete, které není lidského původu, a není transgenní, a které může být použito např. pro humanizován protilátky.
Molekula nukleové kyseliny kódující celý těžký řetězec z anti-IGF-IR protilátky může být konstruována fúzováním molekuly nukleové kyseliny kódující variabilní doménu těžkého řetězce nebo její antigen-vazebnou doménu s konstantní doménou těžkého řetězce. Podobně, molekula nukleové kyseliny kódující lehký řetězec z anti-IGF-IR protilátky může být konstruována fúzováním molekuly nukleové kyseliny kódující variabilní doménu lehkého řetězce nebo její antigen-vazebnou doménu s konstantní doménou lehkého řetězce. Molekuly nukleové kyseliny kódující VH a VL řetězec mohou být přeměněny na geny kompletních protilátek tím, že se vloží do expresního vektoru, který již kóduje konstantní úseky těžkého řetězce a lehkého řetězce, v daném pořadí, a to tak, že VH segment je operativně spojen se segmentem nebo segmenty konstantního úseku těžkého řetězce (CH) ve vektoru a VL segment je operativně spojen se segmentem nebo segmenty konstantního úseku lehkého řetězce (CL) ve vektoru. Alternativně, molekuly nukleové kyseliny kódující VH nebo VL řetězce jsou změněny na geny kompletní protilátky spojením, např. ligací, molekuly nukleové kyseliny kódující VH řetězec s molekulou nukleové kyseliny kódující CH řetězec s použitím standardních metod molekulární biologie. Stejného výsledku může být dosaženo s použitím molekuly nukleové kyseliny kódující VL a CL řetězce. Sekvence
- 62 konstantních úseků humánního těžkého a lehkého řetězce sou v oboru dobře známy (viz např. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publ. 91-3242, 1991). Molekuly nukleové kyseliny kódující kompletní těžký a/nebo lehký řetězce mohou pak být exprimovány v buňce, do které byly vloženy, a pak izolovány anti-IGF-IR protilátky.
Ve výhodném provedení vynálezu nukleová kyselina kódující variabilní úsek těžkého řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 4, 8, 12, 16, 20 nebo 24 a molekula nukleové kyseliny kódující variabilní úsek lehkého řetězce kóduje aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 2, 6, 10, 14, 18 nebo 22. Sekvence SEKV. ID. Č. 28 ukazuje aminokyselinovou sekvenci a SEKV. ID. Č. 27 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny kódující konstantní úsek těžkého řetězce z anti-IGF-IR
protilátky 2.12.1, 2.13. 2, 2.14. 3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a
6.1.1. SEKV. ID. Č. 26 ukazuj e aminokyselinovou sekvenci a
SEKV. ID. Č. 25 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny kóduj ící
konstantní úsek lehkého řetězce z anti-IGF-IR protilátky
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1. Ve
výhodném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující konstantní doménu těžkého řetězce kóduje SEKV. ID. Č. 28 a molekula nukleové kyseliny kódující konstantní doménu lehkého řetězce kóduje SEKV. ID. Č. 26. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující konstantní doménu těžkého řetězce má sekvenci nukleové kyseliny SEKV. ID. Č. 27 a molekula nukleové kyseliny kódující konstantní doménu má sekvenci nukleové kyseliny SEKV. ID. Č. 25.
V dalším provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny kódující buďto těžký řetězec z anti-IGF-IR protilátky nebo její antigen-vazebnou doménu, nebo lehký řetězec z anti-IGF-IR
protilátky nebo jeho antigen-vazebnou doménu, může být izolována ze zvířete jiného než člověk a jiného než myš, které exprimuje humánní imunoglobulinové geny a bylo imunizováno IGF-IR antigenem. V jiném provedení vynálezu molekula nukleové kyseliny může být izolována z buněk produkujících anti-IGF-IR protilátky, kde buňky pocházejí z netransgenního zvířete nebo z humánního pacienta, který vytváří anti-IGF-IR protilátky. Metody izolace mRNA z buněk produkujících anti-IGF-IR protilátky jsou známy: RNA je z buněk izolována standardními technikami, klonována a/nebo amplifikována s použitím PCR a knihovna je konstruována a pak screenována s použitím standardních postupů, čímž se získají molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězec anti-IGF-IR.
Molekuly nukleové kyseliny mohou být použity pro rekombinantní expresi velkého množství anti-IGF-IR protilátky, jak bude popsáno níže. Molekuly nukleové kyseliny mohou také být použity pro vytvoření chimérických protilátek, jednořetězcových protilátek, imunoadhesinů, „diabodies, mutovaných protilátek a protilátkových derivátů, jak bude ještě popsáno níže. Jestliže molekuly nukleové kyseliny nepocházejí z člověka ani z transgenního zvířete, molekuly nukleové kyseliny mohou být použit pro humanizaci protilátky, jak bude popsáno níže.
V dalším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být použity jako sondy nebo PCR primery pro specifické protilátkové sekvence. Například molekula nukleové kyseliny jakožto sonda může být použita v diagnostických metodách nebo molekula nukleové kyseliny jakožto PCR primer může být použita k amplifikování úseku DNA, který může být použit, inter alia, k izolaci sekvence nukleové kyseliny pro použití při produkci variabilních domén anti-IGF• · · · · ·
IR protilátky. Ve výhodném provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny jsou oligonukleotidy. Ve výhodnějším provedení vynálezu oligonukleotidy jsou z vysoce variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce požadované protilátky. V ještě výhodnějším provedení vynálezu oligonukleotidy kódují celý nebo část jednoho nebo více CDR.
Vektory
Vynález poskytuje vektory obsahující molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část . Vynález také poskytuje vektory obsahující molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která kóduje lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část . Vynález také poskytuje vektory obsahující molekuly nukleové kyseliny kódující fúzní proteiny, modifikované protilátky, protilátkové fragmenty a sondy.
Pro expresi protilátek nebo částí protilátek podle vynálezu, DNA kódující část nebo kompletní lehký a těžký řetězec, získané způsobem popsaným výše, mohou být vloženy do expresního vektoru, takže geny jsou operativně spojeny s transkripčními a translačními kontrolními sekvencemi. Expresní vektory zahrnují plazmidy, retroviry, kozmidy, YAC, episomy odvozené z EBV apod. Protilátkový gen je ligován do vektoru tak, že transkripční a translační kontrolní sekvence ve vektor slouží zamýšlené funkci a řídí transkripci a translaci protilátkového genu. Expresní vektor a expresní kontrolní sekvence jsou zvoleny tak, aby byly kompatibilní s použitými expresními hostitelskými buňkami. Gen pro lehký řetězec protilátka a gen pro těžký řetězec protilátky mohou být vloženy do oddělených vektorů. Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba geny vloženy do stejného expresního vektoru.
• ·
Protilátkové geny se vloží do expresního vektoru standardními metodami (jako je např. ligace komplementárních restrikčních míst na fragmentu protilátkového genu a vektoru nebo ligace tupých konců, jestliže žádná restrikční místa nejsou přítomna), které jsou odborníkům známy.
Vhodným vektorem je vektor, který kóduje funkčně kompletní humánní CH nebo CL imunoglobulinové sekvence, s vhodnými restrikčními místy, která jsou vložena metodami genového inženýrství tak, že jakákoliv VH nebo VL sekvence může být do vektoru snadno vložena a exprimována, jak bylo popsáno výše. V takovém vektoru sestřih obvykle nastává mezi donorovým sestřihovým místem vloženým do J úseku a akceptorovým sestřihovým místem předcházejícím humánní C úsek, a také v sestřihových úsecích, které se vyskytují v humánních CH exonech. Polyadenylace a terminace transkripce nastávají v nativních chromozómových místech po směru („downstream) od kódujícího úseku. Rekombinantní expresní vektor může také kódovat signální peptid, který usnadní sekreci protilátky z hostitelské buňky. Gen pro protilátkový řetězec může být klonován do vektoru tak, že signální peptid je spojen ve shodném čtecím rámci s aminokoncem protilátkového řetězce. Signální peptid může být imunoglobulinový signální peptid nebo heterologní signální peptid (tj. signální peptid z jiného proteinu než je imunoglobulin).
Kromě genů pro protilátkové řetězce nesou rekombinantní expresní vektory podle vynálezu regulační sekvence, které řídí expresi genů pro protilátkové řetězce v hostitelské buňce. Odborník si je vědom toho, že konstrukce expresního vektoru, včetně výběru regulační sekvence, závisí na různých faktorech, jako je např. volba hostitelské buňky, která má být transformovaná, hladina exprese proteinu, která má být • < · · • ·
dosažena apod. Výhodné regulační sekvence pro expresi v savčí hostitelské buňce zahrnují virové elementy, které řídí vysoké hladiny proteinové exprese v savčích buňkách, jako jsou například promotory a/nebo enhancery (zesilovače) pocházející z retrovirových LTR, cytomegaloviru (CMV) (jako například promotor CMV), opičího viru 40 (SV40) (jako například promotor SV40), adenoviru (např. adenovirový hlavní pozdní promotor (ADMLP)), polyoma a silné savčí promotory jako například nativní promotory imunoglobulinového a aktinového genu. Pro další popis virových regulačních prvků a sekvencí viz např. patent Spojených Států č. 5,168,062, Stinski, patent Spojených Států č. 4,510,245, Bell et al., a patent Spojených Států č. 4,968,615, Schaffner et al.
Kromě genů pro protilátkové řetězce a regulačních sekvencí může rekombinantní expresní vektor podle vynálezu nést další sekvence, jako například sekvence, které regulují replikaci vektoru v hostitelských buňkách (např. počátek replikace), a dále geny selekčních markérů. Geny selekčních markérů umožňují selekci hostitelských buněk, do kterých byl vnesen vektor (viz např. patenty Spojených Států č. 4,399,216, 4,634,665 a 5,179,017, Axel et al.). Například typicky gen selekčního markéru uděluje rezistenci k léčivu, jako například G418, hygromycinu nebo methotrexatu, hostitelské buňce, do které byl příslušný vektor vnesen. Výhodné markerové geny zahrnují gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) (pro použití v dhfr hostitelských buňkách s methotrexatovou selekcí/amplifikací) a gen neo (pro selekce G418) .
Nehybridomové hostitelské buňky a metody rekombinantní produkce proteinů
Molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo • * · • » · · • · *
- 67 jeho antigen-vazebnou část a/nebo lehký řetězec neb^ jeho antigen-vazebnou část z anti-IGF-IR protilátky a ýektory obsahující tyto molekuly nukleové kyseliny mohou být pjoužity pro transformaci vhodné savčí hostitelské buňky. Transformace může být provedena kterýmkoliv známým způsobem pro vinášení polynukleotidů do hostitelské buňky. Metody vnesení heterologního polynukleotidu do savčích buněk jsou v I oboru dobře známy a zahrnují metody jako je např. dexitranem zprostředkovaná transfekce, precipitace s fosfátem vápenatým, polybreneem zprostředkovaná transfekce, fúze protop|Lastů, elektroporace, zabalení polynukleotidů(ů) do lipdzomu, biolistická injekce a přímá mikroinjekce DNA do jádra. Kromě toho, molekuly nukleové kyseliny mohou být vneseny do savčích buněk prostřednictvím virových vektorů. Metody transformace buněk jsou v oboru dobře známy, viz např. patenty Spojených Států č. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 a 4,959,455 (které jsou tímto zahrnut formou odkazu). :
Savčí buněčné linie dostupné jakožto hostitelé pro expresi jsou v oboru dobře známy a patří k nim mnohé imortali2:ované buněčné linie z Americké sbírky mikroorganizmů ATCC (American Type Culture Collection). Patří sem, inter alia, Jbuňky vaječníků čínského křečka (CHO), NSO, SP2 buňky, HeLa buňky, ledvinné buňky mláďat křečků (BHK), opičí ledvinné buňky (COS) , buňky humánního hepatocelulárního karcinomu (napři. Hep i
G2), A549 buňky, 3T3 buňky a řada dalších buněčných ijinií.
i
Savčí hostitelské buňky zahrnují humánní a myší buňky, a dále buňky laboratorního potkana, psa, opice, prasete, koza, hovězího dobytka, koní a křečků. Výhodné buněčné linie se vyberou tak, že se určí, které buněčné linie mají vysoký hladiny exprese. Další buněčné linie, které mohou být použity, jsou hmyzí buněčné linie, jako například Sf9 buňky, buňky obojživelníků, bakteriální buňky, rostlinné buňky a houbové hostitelských protilátky v buňky. Když rekombinantni expresní vektory kódující těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část, lehký řetězec a/nebo jeho antigen-vazebnou část jsou vneseny do savčích hostitelských buněk, protilátky jsou vytvořeny kultivací buněk po období dostatečné pro expresi hostitelských buňkách nebo, výhodněji, pro sekreci protilátky do kultivačního média, ve kterém jsou hostitelské buňky pěstovaný. Protilátky mohou být získány z kultivačního média užitím standardních metod purifikace proteinů.
Dále, exprese protilátky podle vynálezu (nebo jejích částí) z produkční buněčné linie může být zesílena s použitím řady známých technik. Například expresní systém glutaminsyntetázového genu (GS systém) je běžný způsob pro zesílení exprese za určitých podmínek. GS systém je diskutován jako celek nebo část v evropských patentech č. 0 216 846, 0 256 055 a 0 323 997 a evropské patentové přihlášce č. 89303964.4.
Je pravděpodobné, že protilátky exprimované v různých buněčných liniích nebo v transgenních zvířatech budou mít vzájemně odlišnou glykosylaci. Nicméně, všechny protilátky kódované molekulami nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nebo obsahující aminokyselinové sekvence podle předkládaného vynálezu spadají do rozsahu předkládaného vynálezu bez ohledu na glykosylaci protilátek.
Transgenní zvířata
Vynález také poskytuje transgenní zvířata s výjimkou člověka obsahující jednu nebo více molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, kterých lze využít k produkci protilátek podle vynálezu. Protilátky mohou být produkovány a získávány
z tkáně nebo tělesné tekutiny, jako je například mléko, krev nebo moč, zvířat jako jsou kozy, krávy, koně, prasata, laboratorní potkani, myši, králíci, křečci nebo jiní savci. Viz např. patenty Spojených Států č. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 a 5,741,957. Jak bylo popsáno výše, transgenní zvířata jiného než lidského původu, která obsahují humánní imunoglobulinové lokusy, mohou být vytvořena imunizací IGF-IR nebo jeho částí.
V dalším provedení vynálezu transgenní zvířata jiného než lidského původu jsou vytvořena tak, že se jedna nebo více molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vnese do zvířete standardními transgenními technikami. Viz např. Hogana, cit. výše. Transgenní buňky použité pro přípravu transgenního zvířete mohou být embryonální kmenové buňky nebo somatické buňky. Transgenní organismy jiného než lidského původu mohou být chimérické, nechimérické heterozygoty a nechimérické homozygoty. Viz např. Hogan et al., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press, 1999, Jackson et al., Mouše Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000, and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academie Press, 1999. V dalším provedení vynálezu transgenní organismy jiného než lidského původu mohou mít cílené přerušení a nahrazení, které kóduje požadovaný těžký řetězec a/nebo lehký řetězec. Ve výhodném provedení vynálezu transgenní zvířata obsahují a exprimují molekuly nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězce, které se vážou specificky k IGF-IR, výhodně humánnímu IGF-IR. V dalším provedení vynálezu transgenní zvířata obsahují molekuly nukleové kyseliny kódující modifikované protilátky jako je například jednořetězcová protilátka, chimérická protilátka nebo humanizovaná protilátka. anti-IGF-IR protilátky mohou být • · · ·
- 70 produkovány ve kterémkoliv transgenním zvířeti. Ve výhodném provedení vynálezu zvířata jiného než lidského původu jsou myši, laboratorní potkani, ovce, prasata, kozy, hovězí dobytek nebo koně. Transgenní zvíře jiného než lidského původu exprimuje kódované polypeptidy v krvi, mléku, moči, slinách, slzách, hlenu či jiných tělesných tekutinách.
Fágové displejové knihovny
Vynález poskytuje způsob přípravy anti-IGF-IR protilátky nebo jejích antigen-vazebných částí zahrnující kroky syntézy knihovny humánních protilátek ve fágu, screening knihovny pomocí IGF-IR nebo jeho části, izolace fágu, který váže IGF-IR a získání protilátky z fága. Jeden způsob přípravy knihovny protilátek obsahuje kroky imunizace hostitelského zvířete jiného než lidského původu obsahujícího humánní imunoglobulinový lokus s IGF-IR nebo jeho antigenní částí, aby se vyvolala imunitní reakce, extrakce buněk z hostitelského zvířete, které jsou zodpovědné za produkci protilátek, izolace RNA z extrahovaných buněk, reverzní transkripce RNA za vzniku cDNA, amplifikace cDNA s použitím primeru a inzerce cDNA do fágového displejového vektoru, aby byly protilátky exprimovány na fágu. Rekombinantní anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být získány právě tímto způsobem.
Rekombinantní anti-IGF-IR humánní protilátky podle vynálezu navíc k anti-IGF-IR protilátkám popsaným v tomto textu mohou být izolovány pomocí screeningu rekombinantní kombinační protilátkové knihovny, výhodně scFv fágové displejové knihovny, připravený s použitím humánní VL a VH cDNA získané z mRNA pocházející z humánních lymfocytů. Metody pro přípravu a screening takové knihovny jsou v oboru známy. Také jsou komerčně dostupné soupravy pro přípravu fágové
- 71 displejové knihovny (např. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog č. 27-9400-01, a Stratagene SurfZAPTM phage display kit, katalog č. 240612) . Existují také jiné metody a činidla, která mohou být použita pro přípravu a screening protilátkové displejové knihovny (viz např. Ladner et al. patent Spojených Států č. 5,223,409, Kang et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/18619, Dower et al., publikovaná PCT přihláška WO 91/17271, Winter et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/20791, Markland et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/15679, Breitling et al., publikovaná PCT přihláška WO 93/01288, McCafferty et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/01047, Garrard et al., publikovaná PCT přihláška WO 92/09690, Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1370-1372, Hay et al., 1992, Hum. Antibod.
Hybridomas 3: 81-85, Huse et al., 1989, Science 246: 12751281, McCafferty et al. , Nátuře, 1990, 348: 552-554, Griffiths et al., 1993, EMBO J 12: 725-734, Hawkins et al., 1992, J.
Mol. Biol. 226: 889-896, Clackson et al., 1991, Nátuře 352:
624-628, Gram et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:
3576-3580, Garrad et al., 1991, Bio/Technology 9: 1373-1377,
Hoogenboom et al., 1991, Nuc Acid Res 19: 4133-4137, and
Barbas et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
Ve výhodném provedení vynálezu pro izolaci humánní antiIGF-IR protilátky s požadovanými vlastnostmi, humánní antiIGF-IR protilátka, jak byla popsána v tomto textu, je nejdříve užita pro výběr sekvence humánního těžkého a lehkého řetězce, které mají podobnou vazebnou aktivitu k IGF-IR, s použitím metody epitopového imprintingu, jak byla popsána v Hoogenboom et al., PCT publikace č. WO 93/06213. Protilátkové knihovny použité při tomto způsobu jsou výhodně scFv knihovny připravený a screenované, jak bylo popsáno v McCafferty et al., PCT publikace č. WO 92/01047, McCafferty et al., Nátuře, • · » • ·
- 72 1990, 348: 552-554 a Griffiths et al., 1993, EMBO J 12: 725734. ScFv protilátkové knihovny jsou výhodně screenována s použitím humánního IGF-IR jako antigenu.
Jakmile jsou výchozí humánní VL a VH segmenty vybrány, provedou se experimenty mix and match, ve kterých jsou různé páry na začátku vybraných VL a VH segmentů podrobeny screeningu na IGF-IR vazbu, aby se vybraly výhodné kombinace párů VL/VH. A navíc pro další zlepšení kvality protilátky, VL a VH segmenty výhodných párů VL/VH mohou být náhodně mutovány, výhodně v úseku CDR3 VH a/nebo VL, a sice postupem, který je analogický in vivo somatickému mutačnímu postup zodpovědnému za afinitní zrání protilátek během přirozené imunitní reakce. Toto afinitní zrání in vitro může být uskutečněno tím, že se amplifikuji VH a VL úseky s použitím PCR primerů komplementárních k VH CDR3 nebo VL CDR3, v daném pořadí, přičemž tyto primery byly zaostřeny náhodnou směsí čtyř nukleotidových bází v určité poloze, takže výsledné PCR produkty kódují VH a VL segmenty, do kterých byly zavedeny náhodné mutace do úseků VH a/nebo VL CDR3. Tyto náhodně mutované VH a VL segmenty mohou být testovány screeningem na vazbu k IGF-IR.
Následně po screeningu a izolaci anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu z rekombinantní imunoglobulinové displejové knihovny, může být získána nukleová kyselina kódující vybranou protilátku z displejového balíčku (např. z fágového genomu) a subklonována do jiného expresní vektoru standardními rekombinantní DNA technikami. Je-li to třeba, nukleová kyselina může být dále upravena, aby se vytvořila jiná protilátkové forma podle vynálezu, jak bude popsáno níže. Pro expresi rekombinantní humánní protilátky izolované screening kombinační knihovny je DNA kódující protilátku klonována do * · · ·
- 73 rekombinantního expresního vektoru a vnesena do savčího hostitelské buňky, jak bylo popsáno výše.
Přesmyk tříd
(změněna) na jiný
nukleové kyseliny
v oboru tak, že
kóduj ící CL nebo
nebo VH je pak
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje mechanismus, kterým jedna třída anti-IGF-IR protilátky může být přesmyknuta jiný. Podle jednoho aspektu vynálezu se molekula .iny kódující VL nebo VH izoluje metodami známými že neobsahuje žádné sekvence nukleové kyseliny ebo CH. Molekula nukleové kyseliny kódující VL pak operativně spojena se sekvencí nukleové kyseliny kódující CL nebo CH z odlišné třídy imunoglobulinových molekul. Toho může být dosažena použitím vektoru nebo molekuly nukleové kyseliny obsahující CL nebo CH řetězec, jak byl popsán výše. Například anti-IGF-IR protilátka, která byla původně IgM může být přesmyknuta na třídu IgG. Dále přesmyk tříd může být využit k přestavbě jedné IgG podtřídy na jinou, např. IgGl na IgG2. Výhodný způsob přípravy protilátky podle vynálezu obsahující požadované isotypy obsahuje kroky izolace nukleové kyseliny kódující těžký řetězec anti-IGF-IR protilátky a nukleové kyseliny kódující lehký řetězec anti-IGF-IR protilátky, získání variabilního úseku těžkého řetězce, ligace variabilního úseku těžkého řetězce s konstantní doménou těžkého řetězce požadovaného izotypu, exprese lehkého řetězce a ligovaného těžkého řetězce v buňce a odběr anti-IGF-IR protilátky požadovaného izotypu.
Deriváty protilátek
Molekuly nukleové kyseliny popsané výše mohou být použity • · · »
- 74 • · · · · ·· ·
k přípravě derivátů protilátek s použitím technik a metod, které jsou odborníkům známé.
Humanizované protilátky
Jak byl již popsáno výše v souvislosti s generováním humánních protilátek, je výhodné produkovat protilátky s redukovanou imunogenicitou. To lze uskutečnit v určitém rozsahu s použitím techniky humanizace a displejové techniky s využitím vhodných knihoven. Odborníkům je známo, že myší protilátky nebo protilátky z jiného biologického druhu mohou být humanizovány nebo primatizovány technikami, které jsou v oboru dobře známy (viz např. Winter and Harris Immunol Today 14: 43-46, 1993, a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125168, 1992). Požadovaná protilátka může být geneticky upravena technikami rekombinantní DNA tak, že se nahradí CH1, CH2, CH3, kloubové domény, a/nebo rámcové domény odpovídajícími humánními sekvencemi (viz WO 92/02190 a patenty Spojených Států č. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 a 5,777,085). Ve výhodném provedení vynálezu antiIGF-IR protilátka může být humanizována tím, že se substituují CHl, CH2, CH3, kloubové doména a/nebo rámcová doména odpovídající humánní sekvencí, zatímco se ponechají všechny CDR těžkého řetězce, lehkého řetězce nebo jak těžkého tak i lehkého řetězce.
Mutované protilátky
V dalším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny, vektory a hostitelské buňky mohou být použity pro přípravu mutovaných anti-IGF-IR protilátek. Protilátky mohou být mutovány ve variabilních doménách těžkého a/nebo lehkého řetězce, aby se změnily vazebné vlastnosti protilátky. Například mutace může být vytvořena v jednom nebo více CDR úsekách pro zvýšení nebo snížení hodnoty Kd protilátky pro IGFIR, pro zvýšení nebo snížení Koff nebo kvůli změně vazebné specifičnosti protilátky. Techniky místně cílené mutageneze jsou v oboru dobře známy (viz např. Sambrook et al. a Ausubel et al., cit. Výše). Ve výhodném provedení vynálezu jsou mutace vytvořeny v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo, že je ve variabilním úseku odlišný ve srovnání se zárodečnou linií anti-IGF-IR protilátky. Ve výhodnějším provedení vynálezu jedna nebo více mutací je vytvořenu v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo, že byl ve srovnání s variabilním úsekem zárodečné linie nebo CDR úsekem změněn u anti-IGF-IR protilátky 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo
6.1.1. V jiném provedení vynálezu je jedna nebo více mutací vytvořeno v aminokyselinovém zbytku, o kterém je známo, že byl změněn ve srovnání s variabilním úsekem zárodečné linie nebo CDR úsekem jejichž sekvence jsou uvedeny jako aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24 nebo jejichž sekvence nukleových kyselin jsou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 nebo
23. V dalším provedení vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny mutovány v jednom nebo více rámcových úsekách.
Mutace mohou být vytvořeny v rámcovém úseku nebo konstantní doméně pro zvýšení poločasu anti-IGF-IR protilátka (viz např. WO 00/09560, publikovaná 24. února 2000, zahrnuta formou odkazu) . V jednom provedení vynálezu zde může být jedna, tři nebo pět bodových mutací, ale ne více než deset bodových mutací. Mutace v rámcovém úseku nebo konstantní doméně může také být vytvořena, aby se změnila imunogenicita protilátky, poskytlo místo pro kovalentní nebo nekovalentní vazbu k další molekule nebo změnily takové vlastnosti jako je např. fixace • · · · · · · · · · • · « · ····· · · ·· komplementu. Mutace mohou být vytvořeny v každém z rámcového úseku, konstantní domény a variabilních úseků, v jediné mutované protilátce. Alternativně mutace mohou být vytvořeny pouze v jednom z rámcového úseku, variabilních úseků nebo konstantní domény v jediné mutované protilátce.
V jednom provedení není více než deset aminokyselinových substitucí buďto ve VH nebo VL úseku mutované anti-IGF-IR protilátka ve srovnání s anti-IGF-IR protilátkou před mutací. Ve výhodnějším provedení vynálezu existuje ne více než pět aminokyselinových substitucí buďto ve VH nebo VL úseku mutované anti-IGF-IR protilátky, ještě výhodněji ne více než tři aminokyselinové substituce. V dalším provedení vynálezu je ne více než patnáct aminokyselinových substitucí v konstantních doménách, výhodněji, ne více než deset aminokyselinových substitucí, dokonce ještě výhodněji ne více než pět aminokyselinových substitucí.
Modifikované protilátky
V dalším provedení vynálezu mohou být vytvořeny fúzní protilátky nebo imunoadhesiny, které obsahují celou nebo část anti-IGF-IR protilátky spojenou s dalším polypeptidem. Ve výhodném provedení vynálezu jsou s polypeptidem spojeny pouze variabilní úseky anti-IGF-IR protilátky. V dalším výhodném provedení vynálezu VH doména anti-IGF-IR protilátky je spojena s prvním polypeptidem, zatímco VL doména anti-IGF-IR protilátky je spojena s druhým polypeptidem, který asociuje s prvním polypeptidem takovým způsobem, že VH a VL domény mohou interagovat a tím vytvořit protilátkové vazebné místo. V dalším výhodném provedení vynálezu VH doména je oddělena od VL domény spojovací sekvencí (linkerovou sekvencí, linkerem), takže VH a VL domény mohou vzájemně interagovat (viz kapitola
jednořetězcové protilátky). Protilátka „VH-linker-VL je pak spojena s požadovaným polypeptidem. Fúzní protilátka je užitečná pro cílení polypeptidu do IGF-IR-exprimující buňky nebo tkáně. Polypeptid může být terapeutické agens, jako je například toxin, růstový faktor nebo jiný regulační protein, nebo to může být diagnostické agens, jako je například enzym, který může být snadno zviditelněn, jako například křenová peroxidáza. Kromě toho mohou být vytvořeny fúzní protilátky, ve kterých dvě (nebo více) jednořetězcové protilátky spojeny k sobě. To je užitečné, jestliže je třeba vytvořit dvojmocné nebo polyvalentní protilátky s jednoduchým polypeptidovým řetězcem nebo jestliže je třeba vytvořit bispecifickou protilátku.
Pro vytvoření jednořetězcové protilátky (scFv) jsou VH a VL-kódující DNA fragmenty operativně spojeny s dalším fragmentem kódujícím flexibilní spojovací sekvenci (linker), např. kódujícím aminokyselinovou sekvenci (Gly4~Ser)3 (SEKV. ID. Č. 60) , takže VH a VL sekvence mohou být exprimovány jako souvislý jednořetězcový protein, s VL a VH úseky spojenými flexibilním linkerem (viz např. Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, McCafferty et al., Nátuře, 1990, 348: 552-554). Jednořetězcové protilátka může být jednomocná, jestliže je použito pouze po jednom VH a VL, dvojmocná, jestliže jsou použity dva VH a VL, nebo polyvalentní, jestliže jsou použity více než dva VH a VL.
V dalším provedení vynálezu mohou být připraveny jiné modifikované protilátky s použitím anti-IGF-IR-kódující molekuly nukleové kyseliny. Například tzv. Kappa-bodies (111 et al., Protein Eng 10: 949-57, 1997), Minibodies (Martin et al., EMBO J 13: 53039, 1994), diabodies (Holliger et • 4 al., PNAS USA 90: 6444-6448, 1993) nebo Janusiny (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659, 1991, a Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7: 51-52, 1992) mohou být připraveny s použitím standardních technik molekulární biologie na základě předloženého popisu vynálezu.
mohou být tvořeny Může být vytvořena rámcové úseky vynálezu CDR retezce
Podle dalšího aspektu vynálezu chimérické a bispecifické protilátky, chimérická protilátka, která obsahuje CDR a z různých protilátek. Ve výhodném provedení chimérické protilátky obsahuje všechny CDR variabilního úseku lehkého řetězce nebo těžkého řetězce z anti-IGF-IR protilátky, zatímco rámcové úseky jsou odvozeny z jedné nebo více různých protilátek. Ve výhodnějším provedení vynálezu CDR chimérické protilátky obsahuje všechny z CDR variabilních úseků lehkého těžkého řetězce anti-IGF-IR protilátky.
Rámcové úseky mohou být z jiného druhu (biologického) a mohou být, ve výhodném provedení vynálezu, humanizovány. Alternativně rámcové úseky mohou být z jiné humánní protilátky.
Může být také vytvořena bispecifická protilátka, která se váže specificky k IGF-IR prostřednictvím jedné vazebné domény a k druhé molekule prostřednictvím druhé vazebné domény. Bispecifická protilátka může být vytvořena rekombinantními technikami molekulární biologie nebo může být vytvořena vzájemným fyzickým spojením. Kromě toho může být vytvořena jednořetězcová protilátka obsahující víc než jeden úsek VH a VL, která se váže specificky k IGF-IR a k další molekule. Takové bispecifické protilátky mohou být tvořen s využitím technik, které jsou odborníkům dobře známy, například v spojení s (i) a (ii) viz např. Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81, 1994, a Wright a Harris, výše, a ve spojení s (iii) viz např. Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52, 1992. Ve výhodném provedeni vynálezu se bispecifická protilátka váže k IGF-IR a k další molekule, která je exprimována ve vysoké hladině na karcinomových nebo nádorových buňkách. Ve výhodnějším provedení vynálezu je další molekula erbB2 receptor, VEGF, CD20 nebo EGF-R.
V provedení vynálezu jsou modifikované protilátky popisované výše připraveny s použitím jednoho nebo více variabilních úseků nebo jednoho nebo více CDR úseků z jedné z protilátek vybrané z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 nebo 6.1.1. V dalším provedení vynálezu jsou připraveny modifikované protilátky použitím jednoho nebo více variabilních úseků nebo jednoho nebo více CDR úseků, jejichž aminokyselinové sekvence sou uvedeny jako SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 nebo 24 nebo jejichž sekvence nukleové kyseliny je uvedena jako SEKV. ID. Č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 nebo 23.
Derivatizované a značené protilátky
Protilátka nebo část protilátky podle vynálezu mohou být derivatizovány nebo spojeny s další molekulou (např. dalším peptidem nebo proteinem). Obecně platí, že protilátky nebo jejich části jsou derivatizovány tak, že vazba IGF-IR není nepříznivě ovlivněna derivatizací nebo značením. Tudíž protilátky a části protilátky podle vynálezu zahrnují jak intaktní tak i modifikované formy humánní anti-IGF-IR protilátky popsané v tomto textu. Například protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být funkčně spojena (tím, že chemicky kondenzována, geneticky fúzována, nekovalentně asociována nebo jinak napojena) s jednou nebo více dalšími molekulárními entitami, jako je například další protilátka (např. bispecifická protilátka nebo „diabody), detekční agens, cytotoxické agens, farmaceutické agens, a/nebo protein nebo peptid který, může zprostředkovat asociaci protilátky nebo část protilátky s další molekulou (jako je například streptavidinový jádrový úsek nebo polyhistidinový „tag („značka).
Jeden typ derivatizované protilátky je vytvořen zesítěním („crosslinking) dvou nebo více protilátek (stejného typu nebo různých typů, např. pro vytvoření bispecifické protilátky). Vhodná zesíťující činidla (crosslinkery) zahrnují taková, která jsou heterobifunkční, mají dvě odlišně reaktivní skupiny oddělené vhodným spacerem (např. m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysukcinimid) nebo homobifunkční (např. disukcinimidyl suberát). Takové linkery jsou dostupné např. od firmy Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Další typ derivatizované protilátky je značena protilátka. Použitelná detekční činidla, kterými protilátka nebo část protilátky podle vynálezu může být derivatizována, zahrnují fluorescenční sloučeniny, včetně fluoresceinu, isothiokyanátu fluoresceinu, rhodaminu, 5-dimethylamin-l-naftalenesulfonylchloridu, fykoerytrinu, lanthanidových fosforů apod. Protilátka může také být značena enzymy, které jsou použitelné pro detekci, jako například křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza, glukózaoxidáza apod. Když je protilátka značena detekovatelným enzymem, je detekována po přidání dalších činidel, která enzym použije za vzniku reakčního produktu, který může být snadno rozpoznán. Například když je jako agens přítomna křenová peroxidáza, přidání peroxidu vodíku a diaminobenzidinu vede k barevnému reakčnímu produktu, který je detekovatelný. Protilátka může také být značen biotinem a detekována • · · ·
- 81 prostřednictvím nepřímého měření vazby avidinu nebo streptavidinu. Protilátka může být také značena magnetickým agens, jako je například gadolinium. Protilátka může také být značena s předurčeným polypeptidovými epitopy, rozpoznanými sekundárním reportérem (např. párové sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátky, vazebné domény kovů, epitopové přívěsky). V některých provedeních vynálezu jsou značka připojeny oddělovacím raménkem (spacerem) různých délek, aby se redukovaly potenciální sterické zábrany.
Anti-IGF-IR protilátka může být také značena pomocí radioaktivně značené aminokyseliny. Radioaktivní značka může být použita jak pro diagnostické tak i terapeutické účely. Například radioaktivní značka může být použita k detekci IGFIR-exprimujících nádorů rentgenem nebo jinou diagnostickou technikou. Dále radioaktivní značka terapeuticky jako toxin pro rakovinné buňky nebo nádory. Příklady štítků pro polypeptidy zahrnují, ale bez omezení k, následujícím radioizotopům nebo radionuklidům 3H, 14C, 15N, 35S,
9°γ, 99TCř 111Ιη, 125^ 13!^ může být použita
Anti-IGF-IR protilátka může také být derivatizována chemickými skupinami jako je například polyethylenglykol (PEG), methylová skupina nebo ethylová skupina nebo sacharidová skupina. Tyto skupiny mohou být použity ke zlepšení biologických vlastností protilátky, např. prodloužení sérového poločasu nebo zvýšení tkáňové vazby.
Farmaceutické přípravky a soupravy
Vynález se také týká farmaceutického přípravku pro léčení hyperproliferativních chorobných stavů u savce, který obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. V jednom provedení vynálezu
farmaceutický přípravek je určen pro léčbu karcinomu jako je například karcinom mozku, buněk, močového měchýře, krku, ledviny, vaječníků, plic, dlaždicových (skvamózních) žaludku, pankreatu, prsu, hlavy, prostaty, kolorektální karcinom, karcinom jícnu, karcinom dělohy a štítné žlázy. V jiném provedení vynálezu je farmaceutický přípravek určen k léčení nerakovinných hyperproliferativních chorobných stavů, jako je například restenóza po angioplastice a psoriáza, přičemž tento výčet není omezující. V dalším provedení vynálezu je farmaceutický přípravek určen pro léčbu savce, který potřebuje aktivaci IGF-IR, kde farmaceutický přípravek obsahuje terapeuticky účinné množství aktivační protilátky podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutické přípravky obsahující aktivační protilátky mohou být použity k léčbě zvířat, která trpí nedostatkem IGF-I nebo IGF-II, nebo mohou použity k léčbě osteoporózy nebo zdravotního oslabení nebo chorobného stavu, kdy savec vylučuje příliš málo aktivního růstového hormonu nebo je neschopen reagovat na růstový hormon.
Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být inkorporovány do farmaceutické přípravku vhodného k podávání pacientovi. Typicky farmaceutický přípravek obsahuje protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Jak se v tomto textu používá, termín farmaceuticky přijatelný nosič zahrnuje kterékoliv a všechna rozpouštědla, disperzivní média, obalovací činidla, antibakteriální a protiplísnová činidla, izotonizující činidla, činidla zpožďující absorpci apod., která jsou fyziologicky kompatibilní. Příklady farmaceuticky přijatelného nosiče zahrnují jeden nebo více z následujících: voda, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosfáty, dextróza, glycerol, ethanol apod., a také jakékoliv jejich kombinace. V mnoha případech bude
výhodné zahrnout do farmaceutického přípravku izotonizující činidla, například sacharidy, polyalkoholy jako například mannitol nebo sorbitol, nebo chlorid sodný. Farmaceuticky přijatelné látky zahrnují také látky jako například smáčedla nebo menší množství pomocných látek jako například smáčedla nebo emulgační činidla, konzervační činidla nebo pufry, kteréžto látky zlepšují skladovatelnost nebo účinnost protilátky nebo části protilátky.
Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být v mnoha různých formách. Tyto formy kapalná, polotuhá a tuhá léková (např. roztok pro injekci a jsou např. například forma forma, jako například roztoky pro infúzi), disperze nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, lipozomy a čípky. Výhodná forma závisí na zamýšleném způsobu podávání a terapeutickém použití. Typické výhodný přípravky jsou ve formě roztoku pro injekci nebo pro infúzi, podobně jako například přípravky používané pro pasivní imunizaci lidí jinými protilátkami. Výhodný způsob podávání je parenterální (např. intravenózní, subkutánní, intraperítoneální, intramuskulární). Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána intravenózní infúzi nebo injekcí. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána intramuskulární nebo subkutánní injekcí.
Terapeutické přípravky typicky musejí být sterilní a stabilní v podmínkách výroby a uskladnění. Přípravky mohou být formulovaný jako roztok, mikroemulze, disperze, lipozomy nebo jiná uspořádaná struktura vhodná pro vysokou koncentraci léčiva. Sterilní roztoky pro injekci mohou být připraveny tak, že se anti-IGF-IR protilátka vnese v požadovaném množství do vhodného rozpouštědla v kombinaci s jednou nebo více dalšími složkami uvedenými výše, podle potřeby, a pak se provede sterilizace filtrováním. Obecně, disperze jsou připravovány
tak, že se vnese účinná sloučenina do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzivní médium a požadované další složky z výše uvedených. V případě sterilního prášku pro přípravu sterilního roztoku pro injekci, výhodné metody přípravy jsou vakuové sušení a lyofilizace, které poskytují účinnou složku včetně kterýkoliv další požadované složky ve formě prášku z roztoku, který byl před tím sterilizován filtrováním roztoku. Potřebná tekutost roztoku může být udržována například použitím povlaku, například lecitinu, udržováním požadované velikosti částic a v případě disperze použitím surfaktantů. Prodloužená absorpce injekčních přípravků může být upravena tím, že se do přípravku zahrne agens pro zpožděnou absorpci, například monosoli kyseliny stearové nebo želatina.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být podávány celou řadou způsobů známých v oboru, ačkoli pro mnohé terapeutické aplikace je výhodným způsobem podávání způsob intraperitoneální, subkutánní, intramuskulární, intravenózní nebo infúzní. Jak je odborníkovi zřejmé, způsob podávání se bude měnit a bude záviset na požadovaném výsledku. V jednom provedení vynálezu jsou protilátky podle předkládaného vynálezu podávány jako jednoduchý (jediná) dávka nebo mohou být podávány jako opakované (mnohonásobné) dávky.
V určitém provedení vynálezu může být účinná sloučenina připraven s nosičem, který bude chránit sloučeninu před rychlým uvolňování, jako je například léková forma s řízeným uvolňováním léčiva, která zahrnuje implantáty, transdermální náplasti a mikro-opouzdřené aplikační systémy. Biologicky rozložitelné, biologicky kompatibilní polymery mohou být použity, jako je například ethylvinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyorthoestery a kyselina » · · · · · polymléčná. Mnoho z těchto způsobů přípravy takových formulací je patentováno a nebo je odborníkům obecně známo (viz např. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, vyd., Marcel Dekker, lne., New York, 1978).
V určitém provedení vynálezu anti-IGF-IR podle vynálezu může být podávána perorálně, například s inertním ředidlem nebo stravitelným jedlým nosičem. Sloučenina (a případně další složky, jsou-li třeba) mohou také být uzavřeny v tvrdé nebo měkké želatinové tobolce, lisovány do tablety nebo přimíchávány přímo do pacientovy stravy. Pro perorální terapeutické podávání se sloučeniny vnesou do excipientů a užívají se pak ve formě jako jsou tablety (k polykání), bukální tablety, pastilky, tobolky, elixíry, suspenze, sirupy, oplatky, apod. Pro podávání sloučeniny podle vynálezu jiným než parenterálním
Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství nebo profylakticky účinné množství protilátky nebo části protilátky podle vynálezu. Termín terapeuticky účinné množství označuje množství účinné, v dávce a po období, které je nutné, pro dosažení požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množství protilátky nebo části protilátky se může měnit podle různých faktorů jako například stav onemocnění, věk, pohlaví a hmotnost jedince, a dále schopnost protilátky nebo části protilátky vyvolat požadovanou reakci v jedinci. Terapeuticky účinné množství je také takové množství, při kterém jakékoliv toxické nebo škodlivé účinky protilátky nebo části protilátky jsou převáženy terapeuticky prospěšnými účinky. Termín profylakticky účinné množství označuje množství účinné, v dávce a po období, které je nutné, pro dosažení požadovaného profylaktického účinku. Typicky platí, protože profylaktická » · · 4 · « dávka je používaná u pacienta před onemocněním nebo v časnější fázi onemocnění, že profylakticky účinné množství je menší než terapeuticky účinné množství.
Dávkovači schémata mohou být upravena tak, aby poskytovala optimální požadovanou odpověď (např. terapeutickou nebo profylaktickou odpověď). Například může být podán jednoduchý bolus, několik dílčích dávek v průběhu určité doby nebo může být podána proporcionálně redukovaná nebo naopak zvýšená dávka v závislosti na okolnostech terapeutické situace. Farmaceutický přípravek obsahující protilátku nebo obsahující kombinaci obsahující protilátku a jedno nebo více dalších terapeutický agens může být formulován pro podávání jednorázových nebo opakovaných dávek. Je zvláště výhodné formulovat parenterální přípravky do jednotkové lékové formy pro snadnost podávání a udržení uniformity dávky. Jednotková léková forma, jak se termín v tomto textu používá, se týká fyzicky oddělené jednotky určené jako nečleněná dávka pro podávání savci, který má být léčen, kdy každá jednotka obsahuje předurčené množství účinné sloučeniny vypočtené tak, aby poskytla požadovaný terapeutický účinek, ve spojení s požadovaným farmaceutickým nosičem. Specifikace jednotkové lékové formy podle vynálezu je určována a přímo závisí na (a) jedinečných vlastnostech účinné sloučeniny a konkrétním terapeutickém nebo profylaktickém účinku, který má být dosažen, a (b) limitacích, které jsou vlastní oboru přípravy účinných sloučenin pro léčbu senzitivity. Konkrétně užitečná formulace je 5 mg/ml anti-IGF-IR protilátky v pufru obsahujícím 20mM citrát sodný, pH 5,5, 140mM NaCl a 0,2 mg/ml polysorbát 80.
Příkladem, který však není omezující, rozsahu terapeuticky nebo profylakticky účinného množství protilátky nebo části » · · · · ♦ protilátky podle vynálezu je 0,1 až 100 mg/kg, výhodněji 0,5 až 50 mg/kg, výhodněji 1 až 20 mg/kg a dokonce ještě výhodněji 1 až 10 mg/kg. Je třeba poznamenat, že dávka se může měnit s typem a závažností onemocnění nebo stavu, který má být zmírněn. Je pro zřejmé, že pro konkrétního pacienta by měla být upravena specifická dávkovači schémata v průběhu času podle individuální potřeby a profesionálního názoru odborníka, který přípravek podává nebo na podávání dohlíží, a že dávky uvedené v tomto textu jsou pouze příklady a nijak neomezují skutečný rozsah dávek přípravku podle vynálezu. V jednom provedení vynálezu je terapeuticky nebo profylakticky účinné množství protilátky nebo její antigen-vazebné části podáváno společně s jedním nebo více dalšími terapeutickými agens.
V dalším aspektu se vynález týká podávání anti-IGF-IR protilátky pro léčbu karcinomu v dávce nižší než 300 mg za měsíc.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje soupravy obsahující anti-IGF-IR protilátky a farmaceutické přípravky obsahující tyto protilátky. Souprava může obsahovat, kromě protilátky nebo farmaceutického přípravku, diagnostická nebo terapeutická agens. Souprava může také obsahovat instrukce pro použití při diagnostickém nebo terapeutickém způsobu. Ve výhodném provedení vynálezu souprava obsahuje protilátku nebo její farmaceutický přípravek a diagnostické agens, které mohou být použity při způsobu popsaném níže. V dalším výhodném provedení vynálezu souprava obsahuje protilátku nebo její farmaceutický přípravek a jedno nebo více terapeutických agens, jako je například další antineoplázické agens, protinádorové agens nebo chemoterapeutické agens, která mohou být použita při způsobu popsaném dále.
Předkládaný vynález se také týká farmaceutického přípravku
• · · · » · * · pro inhibici abnormální buněčného růstu u savce, který obsahuje množství sloučeniny podle vynálezu v kombinaci s množstvím chemoterapeutického agens, kde množství sloučeniny, její soli, solvátů nebo předléčiva a chemoterapeutického agens jsou společně účinná při inhibici abnormálního buněčného růstu. V oboru je současnosti známo mnoho chemoterapeutických agens. V jednom provedení vynálezu je chemoterapeutické agens vybráno ze skupiny, která obsahuje mitotické inhibitory, alkylační činidla, antimetabolity, interkalující antibiotika, inhibitory růstových faktorů, inhibitory buněčného cyklu, enzymy, inhibitory topoisomerázy, protipřežívací agens („anti-survival agens), modifikátory biologické reakce, antihormony, např. antiandrogeny, a antiangiogenní činidla.
Ve spojení se sloučeninami podle vynálezu mohou být použita anti-angiogenní agens jako například inhibitory MMP-2 (matrix-metaloproteináza 2), MMP-9 (matrix-metaloproteináza 9) a inhibitory COX-II (cyklooxygenáza II) . Příklady použitelných COX-II inhibitorů zahrnují CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib a rofecoxib. Příklady použitelných inhibitorů matrixových metalloproteináz jsou popsány v dokumentech: WO 96/33172 (publikovaná 24. října 1996), WO 96/27583 (publikovaná 7. března 1996), Evropská patentová přihláška č. 97304971.1 (podaná 8. července 1997), Evropská patentová přihláška č. 99308617.2 (podaná 29. října 1999), WO 98/07697 (publikovaná 26. únoru 1998), WO 98/03516 (publikovaná 29. ledna 1998), WO 98/34918 (publikovaná 13. srpna 1998), WO 98/34915 (publikován 13. srpna 1998), WO 98/33768 (publikován 6. srpna 1998), WO 98/30566 (publikovaná 16. července 1998), Evropský patent 606,046 (publikován 13. července 1994), Evropský patent 931,788 (publikován 28. července 1999), WO 90/05719 (publikovaná 31. května, 1990), WO 99/52910 (publikován 21. října 1999), WO 99/52889 (publikován 21. října 1999), ···· ·· • · ·« ··
WO 99/29667 (publikovaná 17. června 1999), PCT Mezinárodní přihláška č. PCT/IB98/01113 (podaná 21. července 1998), Evropská patentová přihláška č. 99302232.1 (podaná 25. března 1999), Britská patentová přihláška č. 9912961.1 (podaná 3. června 1999), prozatímní přihláška Spojených Států č. 60/148,464 podaná 12. srpna 1999), patent Spojených Států č. 5,863,949 (publikovaný 26. ledna 1999), patent Spojených Států č. 5,861,510 (publikovaný 19. ledna 1999) a Evropský Patent 780,386 (publikovaný 25. června 1997), přičemž každá z těchto publikací je jako celek zahrnuta formou odkazu. Výhodné MMP inhibitory jsou ty, u kterých se neprojevuje arthralgie. Výhodnější jsou ty, který selektivně inhibují MMP-2 a/nebo MMP-9 vzhledem k ostatním matrixovým metaloproteinázám (tj. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 a MMP-13). Některé specifické příklady MMP inhibitorů použitelných v předkládaném vynálezu jsou AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 a dále sloučeniny uvedené v následujícím seznamu:
3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensufonyl]-(1-hydroxykarbamoyl-cyklopentyl)amino]propionová kyselina, hydroxamid 3-exo-3-[4-(4fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3.2.1]oktan-3karboxylové kyseliny, hydroxamid (2R,3R)-1-[4-(2-chlor-4fluorbenzyloxy)benzensulfonyl]-3-hydroxy-3-methylpiperidin-2karboxylové kyseliny, hydroxamid 4-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulf onylamino] tetrahydropyran-4-karboxylové kyseliny, 3-[[4(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(1-hydroxykarbamoylcyklobutyl)amino]propionová kyselina, hydroxamid 4-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino]tetrahydropyran-4-karboxylové kyseliny, hydroxamid (R)-3-[4(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino] tetrahydropyran-3-karboxylové kyseliny, hydroxamid (2R,3R)-1-[4-(4-fluor-2-methylbenzyloxy)benzensulfonyl]-3hydroxy-3-methylpiperidin-2-karboxylové kyseliny, 3-[[4-(4- 90 fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(1-hydroxykarbamoyl-l-methylethyl)amino]propionové kyselina, 3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(4-hydroxykarbamoyltetrahydropyran-4yl)amino]propionová kyselina, hydroxamid 3-exo-3-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxaicyklo[3.2.1]oktan-3-karboxylové kyseliny, hydroxamid 3-endo-3-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino] -8-oxaicyklo[3.2.1]oktan-3-karboxylové kyseliny a hydroxamid (R)-3-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino] tetrahydrofuran-3-karboxylové kyseliny, a farmaceuticky přijatelné soli a solváty těchto sloučenin.
Sloučenina podle vynálezu může také být použita s inhibitory signální transdukce, jako jsou například činidla, která inhibují reakce EGF-R (receptor epidermálního růstového faktoru), jako například EGF-R protilátky, EGF protilátky a molekuly, které jsou inhibitory EGF-R, inhibitory VEGF (růstový faktor cévního endotelu), jako například VEGF receptory a molekuly, které inhibují VEGF, a inhibitory erbB2 receptoru, jako například organické molekuly nebo protilátky, které se vážou k erbB2 receptoru, například HERCEPTIN™ (Genentech, lne.). inhibitory EGF-R jsou popsány například v následujících publikacích: WO 95/19970 (publikovaná 27. července 1995), WO 98/14451 (publikovaná
WO 98/02434 (publikovaná 22. ledna 1998),
Států 5,747,498 (publikovaný 5. května 1998), a tyto látky mohou být použity v předkládaném vynálezu jak bylo popsáno. EGFR-inhibující činidla zahrnují, aniž by výčet byl omezující, monoklonální protilátky C225 a anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex lne. a Merck KgaA) a sloučeniny ZD1834, ZD-1838 a ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis) , PKI-166/CGP75166
9. dubna 1998), patent Spojených (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomid • · · · · ·
- 91 (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst) , BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche) , Naamidin A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC310 (Ventech Research), EGF fúzní toxin (Seragen lne.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperiál Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) a EGF-R vakcínu (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Tato a ještě další EGF-R-inhibující činidla mohou být použita v předkládaném vynálezu.
Se sloučeninami podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány dále VEGF inhibitory, například SU-5416 a SU-6668 (Sugen lne.), SH-268 (Sobering) a NX-1838 (NeXstar). VEGF inhibitory jsou popsány například v následujících publikacích: WO 99/24440 (publikovaná 20. května 1999), PCT mezinárodní přihláška PCT/IB99/00797 (podaná 3. května 1999), WO 95/21613 (publikovaná 17. srpna 1995), WO 99/61422 (publikovaná 2. prosince 1999), patent Spojených Států 5,834,504 (publikovaný 10. Listopadu 1998), WO 98/50356 (publikovaná 12. listopadu 1998), patent Spojených Států 5,883,113 (publikovaný 16. března 1999), patent Spojených Států 5,886,020 (publikovaný 23. března 1999), patent Spojených Států 5,792,783 (publikovaný 11. srpna 1998), WO 99/10349 (publikovaná 4. března 1999), WO 97/32856 (publikovaná 12. záři 1997), WO 97/22596 (publikovaná 26. června 1997), WO 98/54093 (publikovaná 3. prosince 1998), WO 98/02438 (publikovaná 22. ledna 1998), WO 99/16755 (publikovaná 8. dubna 1999) a WO 98/02437 (publikovaná 22. ledna 1998), každá z těchto publikací je zahrnuta formou odkazu. Další příklady některých specifických VEGF inhibitorů použitelných v předkládaném vynálezu jsou IM8 62 (Cytran lne.), anti-VEGF monoklonální protilátka (Genentech, lne.) a angiozym, syntetický ribozym (Ribozyme a Chiron). Tyto a ještě další VEGF inhibitory mohou být použity v předkládaném vynálezu jak bylo popsáno výše.
Se sloučeninami podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány dále inhibitory ErbB2 receptoru, jako například GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) a monoklonální protilátky AR209 (Aronex Pharmaceuticals lne.) a 2B-1 (Chiron), například jak byly uvedeny v následujících publikacích: WO 98/02434 (publikovaná 22. Ledna 1998), WO 99/35146 (publikovaná 15. července 1999), WO 99/35132 (publikovaná 15. července 1999), WO 98/02437 (publikovaná 22. ledna 1998), WO 97/13760 (publikovaná 17. dubna 1997), WO 95/19970 (publikovaná 27. července 1995), patent Spojených Států 5,587,458 (publikovaný 24. prosince 1996) a patent Spojených Států 5,877,305 (publikovaný 2. března 1999), které jsou všechny zahrnuty formou odkazu. Inhibitory ErbB2 receptoru užitečné v předkládaném vynálezu jsou také popsány v prozatímní patentové přihlášce Spojených Států č. 60/117/, 341, podané 27. ledna 1999 a č. 60/117/, 346, podané 27. ledna 1999, které jsou zahrnuty formou odkazu. Inhibitory ErbB2 receptoru a sloučeniny popsané ve výše citovaných PCT přihláškách, patentech Spojených Států a prozatímních přihláškách Spojených Států, a také další sloučeniny a látky, které inhibují erbB2 receptor, mohou být použity se sloučeninami podle vynálezu ve smyslu předkládaného vynálezu.
Protipřežívací činidla zahrnují anti-IGF-IR protilátky a anti-integrinová činidla, jako například anti-integrinové protilátky.
Diagnostické metody
Anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro detekování IGF-IR v biologickém vzorku in vitro nebo in vivo. Anti-IGF-IR protilátky mohou být použit v obvyklých imunotestech, včetně testů ELISA, RIA, FACS, tkáňových imunohistochemických testech, Western blotu nebo imunoprecipitaci, aniž by tento výčet byl omezující. Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou být použity k detekování IGF-IR u lidí. V dalším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity k detekování IGF-IR u primátů Starého světa jako jsou makakové (např. rhesus), šimpanzové a lidoopi.
Vynález poskytuje způsob pro detekci anti-IGF-IR v biologickém vzorku, který zahrnuje kontaktování biologického vzorku s anti-IGF-IR protilátkou podle vynálezu a detekci navázané protilátky, která je navázaná k
IGF-IR v biologickém vzorku. V detekci vynálezu anti-IGF-IR protilátka je anti-IGF-IR, pro jednom provedení přímo značena detekovatelnou značkou. V dalším provedení vynálezu je antineznacena druhá
IGF-IR protilátka (první protilátka) protilátka nebo jiná molekula, která se váže na anti-IGF-IR protilátku, je značená. Jak je v oboru dobře známo, druhá protilátka je zvolena tak, že je schopná specificky vázat specifický druh a třídu první protilátky. Například jestliže anti-IGF-IR protilátka je humánní IgG, pak sekundární protilátka může být anti-humánní-IgG. Jiné molekuly, které se mohou vázat k protilátkám, zahrnují protein A a protein G, které jsou oba komerčně dostupné od firmy Pierce Chemical Co., přičemž tento výčet není omezující.
Vhodné značka pro protilátku nebo sekundární protilátku byly popsán výše a zahrnují různé enzymy, prostetické skupiny, fluorescenční látky, luminiscenční látky, magnetická činidla a
radioaktivní látky. Příklady vhodného enzymy zahrnují křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktosidázu a acetylcholinesterázu, příklady vhodných komplexů prostetické skupiny zahrnují streptavidin/biotin a avidin/biotin, příklady vhodné fluorescenční látky zahrnují umbeliferon, fluorescein, fluorescein isothiokyanát, rhodamin, dichlortriazinylamin fluoresceinu, dansylchlorid nebo fykoerytrin, příkladem luminiscenční látky je luminol, příkladem magnetického agens je gadolinium a příkladem vhodné radioaktivní látky jsou 125I, 131I, 35S nebo 3H.
V alternativním provedení vynálezu IGF-IR mohou být testován v biologickém vzorku kompetitivním imunotestem využívajícím IGF-IR standardy značené detekovatelnou látkou a neznačené anti-IGF-IR protilátky. V tomto testu se kombinují biologický vzorek, značený IGF-IR standard a anti-IGF-IR protilátka a stanovuje se množství značeného IGF-IR standardu navázaného k neznačené protilátce. Množství IGF-IR v biologickém vzorek je nepřímo úměrné množství značeného IGF-IR standardu vázaného k anti-IGF-IR protilátce.
Imunotesty popsané výše lze použít pro velký počet účelů. V jednom provedení vynálezu mohou být anti-IGF-IR protilátky použity pro detekci IGF-IR v buňkách v tkáňových kulturách. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro určování hladiny fosforylace tyrosinu, autofosforylace tyrosinu z IGF-IR a/nebo množství IGF-IR na buněčném povrchu po ošetření buněk různými sloučeninami. Tento způsob může být použit pro testování sloučenin, které mohou být použity pro aktivaci nebo inhibici IGF-IR. V tomto způsobu je jeden vzorek buněk podroben působení testované sloučeniny po určité časové období, zatímco další vzorek byl ponechán neošetřen. Jestliže má být měřena autofosforylace tyrosinu, • · · • · · • · · ·
- 95 buňky jsou lyžovány a fosforylace tyrosinů IGF-IR je měřena s použitím imunotestu popsaného výše nebo tak, jak bylo popsáno v příkladu III, který používá test ELISA. Jestliže má být měřena hladina celkového IGF-IR, buňky jsou lyžovány a hladina celkového IGF-IR je měřena s použitím jednoho z imunotestů popsaných výše.
Výhodným imunotestem pro určování IGF-IR fosforylace tyrosinů nebo pro měření hladin celkového IGF-IR je ELISA nebo Western blot. Jestliže má být měřena pouze hladina IGF-IR buněčného povrchu, buňky nejsou lyžovány a hladiny IGF-IR buněčného povrchu jsou měřeny s použitím jednoho z imunotestů popsaných výše. Výhodný imunotest pro určování hladiny IGF-IR buněčného povrchu zahrnuje kroky značení proteinů buněčného povrchu detekovatelnou značkou, jako je například biotin nebo 125I, imunoprecipitaci IGF-IR s anti-IGF-IR protilátkou, a pak detekce značeného IGF-IR. Další výhodný imunotest pro určování lokalizace IGF-IR, např. hladiny buněčného povrchu, je použití imunohistochemického vyšetření. Metody, jako je například ELISA, RIA, Western blot, imunohistochemické vyšetření, značení buněčného povrchu proteinů základní membrány a imunoprecipitace, jsou v oboru dobře známy. Viz např. Harlow a Lané, výše. Kromě toho imunotesty mohou být zvětšeny pro vysoce výkonný screening, aby se testoval velký počet sloučenin buď na aktivaci nebo inhibici IGF-IR.
Anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu mohou také být použity pro určování hladin IGF-IR v tkáni nebo v buňkách pocházejících z tkáně. Ve výhodném provedení vynálezu tkáň je nemocná tkáň. Ve výhodnějším provedení vynálezu tkáň je nádor nebo jeho biopsie. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu, tkáně nebo jejich biopsie jsou odebrány z pacienta. Tkáň nebo biopsie je pak použita v imunotestu pro určování
- 96 např. hladiny IGF-IR, hladiny IGF-IR buněčného povrchu, hladiny fosforylace tyrosinu IGF-IR nebo lokalizace IGF-IR způsoby diskutovanými výše. Způsob může být použit pro určování, zdali nádor exprimuje IGF-IR ve vysoké hladině.
Výše popsaný diagnostický způsob může být použit pro určování toho, zda nádor exprimuje vysoké hladiny IGF-IR, které mohou být indikativem, že nádor bude dobře odpovídat na léčbu anti-IGF-IR protilátkou. Diagnostický způsob může také být použit pro určování, zda nádor je potenciálně rakovinný, jestliže exprimuje vysoké hladiny IGF-IR nebo benigní, jestliže exprimuje nízké hladiny IGF-IR. Dále může také být diagnostický způsob použit pro určování, zda léčba anti-IGF-IR protilátkou (viz níže) způsobuje, že nádor exprimuje nižší hladiny IGF-IR a/nebo vykazuje nižší hladiny autofosforylace tyrosinu, a tak může být použit pro určování toho, zda léčebný postup je úspěšný. Obecně, způsob určování, zda anti-IGF-IR protilátka sníží fosforylaci tyrosinu, obsahuje kroky měření hladiny fosforylace tyrosinu v buňce nebo požadované tkáni, inkubaci buňky nebo tkáně s anti-IGF-IR protilátkou nebo její antigen-vazebnou částí, a pak opakované měření hladiny fosforylace tyrosinu v buňce nebo tkáni. Může být měřena fosforylace tyrosinu IGF-IR nebo dalšího proteinu (proteinů). Diagnostický způsob může také být použit pro určování, zda tkáň nebo buňka neexprimuje dostatečně vysoké hladiny IGF-IR nebo dostatečně vysoké hladiny aktivovaného IGF-IR, což může být případ u jedinců s nanismem, osteoporózou nebo diabetem. Diagnóza, že hladiny IGF-IR nebo účinného IGF-IR jsou příliš nízké, může být použita pro léčení aktivujícími anti-IGF-IR protilátkami, IGF-I nebo dalšími terapeutickými agens pro zvyšování IGF-IR hladin nebo aktivity.
- 97 • · · ·
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou také být používány in vivo, aby se lokalizovaly tkáně a orgány, které exprimují IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátky mohou být použity pro lokalizaci IGF-IRexprimujících nádorů. Výhoda anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu je ta, že nebudou tvořit imunitní reakci při podávání. Způsob obsahuje kroky podávání anti-IGFIR protilátky nebo jejího farmaceutického přípravku pacientovi, který takový diagnostický test potřebuje, a podrobení pacienta zobrazovací analýze pro určování lokalizace IGF-IR-exprimujících tkání. Zobrazovací analýza je dobře známa v lékařském oboru a zahrnuje, bez omezení, rentgenovou analýzu, zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) nebo počítačovou tomografii (CE). V dalším provedení způsobu podle vynálezu je od pacienta získávána spíše biopsie pro určování, zda požadovaná tkáň exprimuje IGF-IR, než podrobování pacienta zobrazovací analýze. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGFIR protilátky mohou být značeny detekovatelným agens, které může být zobrazeno v pacientovi. Například protilátka může být značena kontrastním agens, jako například baryem, které může být použito pro rentgenovou analýzu nebo magnetické kontrastní agens, jako například chelát gadolinia, který může být použit pro MRI nebo CE. Další značící činidla zahrnují, bez omezení, radioizotopy, jako je například 99Tc. V dalším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je neznačena a je zobrazena podáváním druhé protilátky nebo další molekuly, která je detekovatelná a která může vázat anti-IGF-IR protilátku.
Terapeutické způsoby použití
V dalším provedení vynález poskytuje způsob inhibice IGF-IR aktivity podáváním anti-IGF-IR protilátky pacientovi, « ·
- 98 který to potřebuje. Každý z typů protilátek popsaných v tomto textu může být použit terapeuticky. Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je humánní, chimérická nebo humanizovaná protilátka. V dalším výhodném provedení vynálezu IGF-IR je humánní a pacient je člověk. Alternativně, pacient může být savec, který exprimuje IGF-IR, se kterým anti-IGF-IR protilátka reaguje zkříženě. Protilátka může být podávána savci jiného než lidského původu exprimujícímu IGF-IR, se kterým protilátka zkříženě reaguje (tj. primáti nebo makakové Macaca fascicularis („cynomologous) nebo Macaca mullata („rhesus)) pro veterinární účely nebo jako zvířecímu modelu humánního onemocnění. Takové zvířecí modely mohou být použitelné pro hodnocení terapeutické účinnosti protilátek podle tohoto vynálezu.
Jak se v tomto textu používá, termín chorobný stav, ve kterém IGF-IR aktivita je škodlivá zahrnuje nemoci a další chorobné stavy, ve kterých bylo prokázáno, že přítomnost vysokých hladin IGF-IR u pacienta trpícího chorobným stavem přímo je, nebo je podezřívána, že je, zodpovědná buď za patofyziologii chorobného stavu nebo je faktorem, který přispívá ke zhoršování chorobného stavu. V souladu s tím, chorobný stav, ve kterém jsou škodlivé vysoké hladiny IGF-IR aktivity, je chorobný stav, kdy je očekáváno, že inhibice IGFIR aktivity zmírní symptomy a/nebo průběh chorobného stavu. Takové chorobné stavy mohou být prokázány například zvýšením hladin IGF-IR buněčného povrchu nebo zvýšenou autofosforylací tyrosinu IGF-IR v postižených buňkách nebo tkáních pacienta trpícího chorobným stavem. Zvýšení IGF-IR hladin může být detekováno například s použitím anti-IGF-IR protilátky, jak bylo popsáno výše.
Ve výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který má nádor exprimující IGF-IR. Nádor může být solidní nádor nebo to může být nádor nesolidní, jako je například lymfom. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který má IGF-IR-exprimující nádor, který je rakovinný. V ještě výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je podávána pacientovi, který má plicní nádor, nádor prsu, prostaty nebo tračníku. Ve vysoce výhodném provedení způsob podle vynálezu způsobí, že nádor nezvýší hmotnost nebo objem nebo se jeho hmotnost nebo objem sníží. V dalším provedení způsob podle vynálezu způsobí, že IGF-IR na nádoru budou internalizovány. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo jejich úsek vázající antigen.
V dalším výhodném provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka může být podávána pacientovi, který exprimuje nepřiměřeně vysoké hladiny IGF-I. V oboru je známo, že vysoká hladina exprese IGF-I může vést k celé řada běžných karcinomů. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je podávána pacientovi s karcinomem prostaty, gliomem nebo fibrosarkomem. V ještě výhodnějším provedení způsob podle vynálezu způsobí, že karcinom přestane abnormálně proliferovat nebo se nezvyšuje jeho hmotnost či objem nebo se hmotnost či objem snižuje.
V jednom provedení vynálezu se způsob týká léčby karcinomů, jako jsou například karcinomy mozku, spinocelulární karcinom, karcinom močového měchýře, žaludku, pankreatu, prsu, hlavy, krku, jícnu, prostaty, kolorektální karcinomy, karcinomy plic, ledvin, vaječníků, gynekologické karcinomy
100
nebo karcinomy štítné žlázy. Pacienti, kteří mohou být léčeni sloučeninami podle vynálezu způsoby podle tohoto vynálezu zahrnují například pacienty, u kterých bylo diagnostikováno, že mají plicní karcinom, karcinom kostí, karcinom pankreatu, karcinom kůže, karcinomy hlavy a krku, kožní nebo intraokulární melanom, karcinom dělohy, karcinom vaječníků, rektální karcinom, karcinom řitní oblasti, karcinom žaludku, karcinom tračníku, karcinom prsu, gynekologické nádory (např. sarkomy dělohy, karcinom vejcovodů, karcinom endometria, karcinom krčku děložního, karcinom vagíny nebo karcinom vulvy), Hodgkinova nemoc, karcinom jícnu, karcinom tenkého střeva, karcinomy endokrinního systému (např. karcinom štítné žlázy, příštítných tělísek nebo nadledvinek), sarkomy měkkých tkání, karcinom uretry, karcinom penisu, karcinom prostaty, chronická nebo akutní leukémie, solidní nádory dětského věku, lymfocytární lymfomy, karcinom močového měchýře, karcinom ledvin nebo ureterů (např. karcinom ledvinných buněk, karcinom ledvinných pánviček) nebo novotvary centrálního nervového systému (např. primární lymfom CNS, nádory míchy, gliomy mozkového kmene nebo adenomy hypofýzy).
Protilátka může být podávána jednou, ale výhodněji je podávána vícekrát. Protilátka může být podávána třikrát denně až jednou každých šest měsíců. Podávání může být plánované, jako například třikrát denně, dvakrát denně, jednou denně, jednou každé dva dny, jednou každé tři dny, jednou týdně, jednou každé dva týdny, jednou každý měsíc, jednou každé dva měsíce, jednou každé tři měsíce a jednou každých šest měsíců. Protilátka může být podávána prostřednictvím perorální, slizniční, bukální, intranazální, inhalační, intravenózní, subkutánní, intramuskulární, parenterální, intranádorové nebo topické cesty. Protilátka může být podávána do místa vzdáleného od místa nádoru. Protilátka může také být podávána
- 101 -
objem. Protilátka bude farmaceutického přípravku, kontinuálně prostřednictvím minipumpy. Protilátka může být podávána jednou, alespoň dvakrát nebo alespoň po časové období, dokud není chorobný stav léčen, zmírněn nebo vyléčen. Protilátka obecně bude podávána alespoň tak dlouho, dokud je nádor přítomný za předpokladu, že protilátka způsobí, že nádor nebo karcinom zastaví růst nebo se sníží jeho hmotnost či obecně podávána jako část jak bylo popsáno výše. Dávka protilátky bude obecně v rozsahu 0,1 až 100 mg/kg, výhodněji 0,5 až 50 mg/kg, výhodněji 1 až 20 mg/kg a ještě výhodněji 1 až 10 mg/kg. Sérová koncentrace protilátky může být měřena každou metodou v oboru známou, např. viz příklad XVII níže. Protilátka může také být podávána profylakticky, aby se zabránilo výskytu karcinomu nebo nádoru. To může být obzvláště užitečné u pacientů, kteří mají vysoce normální hladinu IGFI, protože bylo ukázáno, že tito pacienti mají vyšší riziko rozvoje běžných karcinomů. Viz Rosen et al., výše.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být společně podávána s dalšími terapeutickými agens, jako jsou například antineoplázické léky nebo molekuly, pacientovi, který má hyperproliferativní chorobný stav, jako je například karcinom nebo nádor. V jednom aspektu se vynález týká způsobu léčby hyperproliferativního chorobného stavu u savce obsahujícího podávání savcovi terapeuticky účinného množství sloučeniny podle vynálezu v kombinaci s anti-nádorovým agens vybraným ze skupiny, kterou tvoří, bez omezení, mitotické inhibitory, alkylační činidla, anti-metabolity, interkalující činidla, inhibitory růstového faktoru, inhibitory buněčného cyklu, enzymy, inhibitory topoizomerázy, modifikátory biologické reakce, anti-hormony, inhibitory kináz, inhibitory metaloproteáz mezibuněčné hmoty, genetická léčiva a antiandrogeny. Ve výhodnějším provedení vynálezu protilátka může
102
být podávána s antineoplázickým agens, jako je například adriamycin nebo taxol. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka nebo kombinační léčba podávána spolu s radioterapií, chemoterapií, fotodynamickou terapií, chirurgickou léčbou nebo jinou imunoterapií. V ještě dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána s další protilátkou. Například anti-IGF-IR protilátka může být podávána s protilátkou nebo jiným agens, o kterém je známo, že inhibuje proliferací buněk nádoru nebo karcinomu, např. protilátka nebo agens, které inhibuje erbB2 receptor, EGF-R, CD20 nebo VEGF.
Společné podávání protilátky s dalším terapeutickým agens (kombinační léčba) zahrnuje podávání farmaceutického přípravku obsahujícího anti-IGF-IR protilátku a další terapeutické agens a podávání dvou nebo více samostatných farmaceutických přípravků, jeden obsahující anti-IGF-IR protilátku a druhý obsahující další terapeutické agens. Dále, ačkoli společné podávání nebo kombinační léčba obecně znamená, že protilátka a další terapeutická činidla jsou podávána současně ve stejnou dobu, zahrnuje také příklady, kdy jsou protilátka a další terapeutická agens podávána v různé časy. Například protilátka může být podávána jednou každé tři dny, zatímco další terapeutické agens je podáváno jednou denně. Alternativně, protilátka může být podávána před nebo po léčbě chorobného stavu dalším terapeutickým agens. Podobně podávání anti-IGF-IR protilátky může být aplikováno před nebo po další terapii, jako je například radioterapie, chemoterapie, fotodynamická terapie, chirurgický výkon nebo jiná imunoterapie.
Protilátka a jedno nebo více dalších terapeutických agens (kombinační léčba) může být podávána jednou, dvakrát nebo alespoň po časové období, dokud není chorobný stav léčen,
- 103 zmírněn nebo vyléčen. Výhodně je kombinační léčba podávána vícekrát. Kombinační léčba může být podávána třikrát denně až jednou každých šest měsíců. Podávání může být plánované, jako například třikrát denně, dvakrát denně, jednou denně, jednou každé dva dny, jednou každé tři dny, jednou týdně, jednou každé dva týdny, jednou každý měsíc, jednou každé dva měsíce, jednou každé tři měsíce a jednou každých šest měsíců nebo může být podávánu kontinuálně prostřednictvím minipumpy. Kombinační léčba může být podávána prostřednictvím perorální, slizniční, bukální, intranazální, inhalační, intravenózní, subkutánní, intramuskulární, parenterální, intranádorové nebo topické cesty. Kombinační léčba může být podávána do místa vzdáleného od místa nádoru. Kombinační léčba obecně bude podávána alespoň tak dlouho, dokud je nádor přítomný za předpokladu, že protilátka způsobí, že nádor nebo karcinom zastaví růst nebo se sníží jeho hmotnost či objem.
V ještě dalším provedení vynálezu je anti-IGF-IR protilátka značena radioaktivní značkou, imunotoxinem nebo toxinem nebo fúzním proteinem obsahujícím toxický peptid. Anti-IGF-IR protilátka nebo anti-IGF-IR protilátkový fúzní protein řídí radioaktivní značku, imunotoxin, toxin nebo toxický peptid k IGF-IR-exprimujícímu nádoru nebo karcinomové buňce. Ve výhodném provedení vynálezu radioaktivní značka, imunotoxin, toxin nebo toxický peptid je internalizován poté, co se anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-IR na povrchu nádorové nebo karcinomové buňky.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být použita terapeuticky k indukci apoptózy specifických buněk u pacienta, který to potřebuje. V mnoha případech buňky cílené pro apoptózu jsou rakovinné nebo nádorové buňky. Ve výhodném provedení tedy vynález poskytuje způsob indukce apoptózy » · · · · 4
104
podáváním terapeuticky účinného množství anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který to potřebuje. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 nebo 6.1.1 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo její úsek vázající antigen.
V dalším aspektu anti-IGF-IR protilátka může být použita k léčbě nerakovinných stavů, kdy jsou vysoké hladiny IGF-I a/nebo IGF-IR asociovány s nerakovinným stavem nebo onemocněním. V jednom provedení vynálezu způsob obsahuje krok podávání anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který má nerakovinný patologický stav způsobený nebo exacerbovaný vysokými hladinami IGF-I a/nebo hladinami či aktivitou IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu nerakovinný patologický stav je akromegalie, gigantismus, psoriáza, ateroskleróza, restenóza hladkého svalstva krevních cév nebo nepatřičná mikrovaskulární proliferace, jako například proliferace zjišťovaná jako komplikace diabetes, obzvláště oka. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka zpomaluje progresi nerakovinného patologického stavu. Ve výhodnějším provedení vynálezu anti-IGF-IR protilátka zastaví nebo zvrátí, alespoň částečně, nerakovinný patologický stav.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob podávání aktivující anti-IGF-IR protilátky pacientovi, který to potřebuje. V jednom provedení vynálezu aktivující protilátka nebo farmaceutický přípravek je podáván pacientovi, který to potřebuje, v množství účinném ke zvýšení IGF-IR aktivity. Ve výhodnějším provedení vynálezu aktivující protilátka je schopna obnovit normální IGF-IR aktivitu. V dalším výhodném provedení vynálezu aktivující protilátka může být podávána pacientovi, který má malou postavu, neuropatii, snížení «
- 105 4 4 4 4 -»4
4
4 svalové hmoty nebo osteoporózu. V dalším výhodném provedení vynálezu aktivující protilátka může být podávána s jedním nebo více dalšími faktory, které zvyšují buněčnou proliferaci, zabraňují apoptóze nebo zvyšují IGF-IR aktivitu. Takové faktory zahrnují růstové faktory, jako je například IGF-I, a/nebo analogy IGF-I, které aktivují IGF-IR. Ve výhodném provedení vynálezu je protilátka vybrána ze skupiny, kterou tvoří 4.17.3 nebo obsahuje těžký řetězec, lehký řetězec nebo jejich část vázající antigen.
Genová terapie
Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podávány pacientovi, který to potřebuje, prostřednictvím genové terapie. Terapie může být buď in vivo nebo ex vivo. Ve výhodném provedení vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny kódující jak těžký řetězec tak lehký řetězec podávány pacientovi. Ve výhodnějším provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny jsou podávány tak, že jsou trvale začleněny do chromozómu B lymfocytů, protože tyto buňky jsou specializovány na produkci protilátek. Ve výhodném provedení vynálezu prekurzorové B lymfocyty jsou transfekovány nebo infikovány ex vivo a opětně transplantovány pacientovi, který potřebuje léčbu. V dalším provedení vynálezu prekurzorové B lymfocyty nebo další buňky jsou infikovány in vivo s použitím viru známého infikovat požadovaný buněčný typ. Typické vektory použité pro genovou terapii zahrnují lipozomy, plazmidy nebo virové vektory, jako jsou například retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Po infekci buď in vivo nebo ex vivo mohou být hladiny exprese protilátek monitorovány odběrem vzorku léčenému pacientovi a s použitím kteréhokoliv imunotestu v oboru známého a popsaného v tomto textu.
·· ····
9 9 99 9 9 9 · · • a · * · · ··· ·· ·· ·· ··· · · • 9 · · ··· · 9 · 9
9 9 9 999 9 9 9 9 99
- 106 Ve výhodném provedení vynálezu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny. V dalším provedení vynálezu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny. Ve výhodnějším způsobu způsob genové terapie zahrnuje kroky podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a účinné množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část humánní protilátky nebo její části a exprimující molekulu nukleové kyseliny. Způsob genové terapie může také zahrnovat krok podávání dalších anti-rakovinných agens, jako je například taxol, tamoxifen, 5-FU, adriamycin nebo CP-358,774.
Pro lepší pochopení vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Tyto příklady jsou pouze pro ilustrační účely a nelze je vykládat jako příklady omezující rozsah vynálezu.
107
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Příprava hybridomů produkujících anti-IGF-IR protilátku
Protilátky podle vynálezu byly připraveny, vybrány a testovány následujícím způsobem:
Imunizace a vytvoření hybridomů
Osm až deset týdnů staré myši XENOMICE™ byly imunizovány intraperitoneálně nebo do chodidel jejich zadních nohou buď extracelulární doménou humánního IGF-IR (10 gg/dávka/myš) nebo buňkami 3T3-IGF-IR nebo 300.19-IGF-IR, což jsou dvě transfekované buněčné linie, které exprimuji humánní IGF-IR na svých plazmatických membránách (10 x 106 buněk/dávka/myš). Tato dávka byla opakována pět až sedmkrát po období tří až osmi týdnů. Čtyři dny před fúzí myši dostaly konečnou injekci extracelulární domény humánního IGF-IR v PBS. Slezina a lymfocyty z lymfatické uzliny imunizovaných myší byly fúzovány s buněčnou linií nesekrečního myelomu P3-X63-Ag8.653 a byly podrobeny HAT selekci, jak bylo popsáno dříve (Galfre a Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Byl získán panel hybridomů, které všechny sekretovaly IGF-IR specifické humánní IgG2K protilátky. Sedm hybridomů produkujících monoklonální protilátky specifické pro IGF-IR bylo vybráno pro další studie a byly nazvány 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1.
Hybridomy 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3 byly uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 « · · ·
- 108 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 12. prosince
2000 s následujícími přístupovými čísly:
Hybridom Deposit č.
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
Příklad II
Stanovení afinitních konstant (Kd) plně humánních anti-IGF-IR monoklonálních protilátek pomocí BIAcore
Byla prováděna měření afinity purifikovaných protilátek povrchovou plazmonovou rezonancí s použitím přístroje BIAcore 3000, podle protokolů výrobce.
Protokol 1
Pro provádění kinetických analýz byl protein-A imobilizován na povrchu senzorového čipu BIAcore. Senzorový čip pak byl použit pro zachycení anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu. Na senzorový čip byly injikovány různé koncentrace extracelulární domény IGF-IR a byla analyzována vazebná a disociační kinetika interakcí mezi anti-IGF-IR protilátkami a extracelulární doménou IGF-IR. Data byla vyhodnocena globální shodou dle Langmuira 1:1, s použitím
109
modelů posunu základní linie, které jsou ze software BIAevaluation poskytovaného BIAcore.
Protokol 2
Měření na přístroji BIAcore byla prováděna v podstatě tak, jak bylo popsáno autory Fagerstam et al. Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping. J. Mol. Recog. 3: 208-214.,
1990.
Tabulka I uvádí v seznamu měření afinity pro zástupce anti-IGF-IR protilátek podle předkládaného vynálezu.
Tabulka I
Monoklonální Kd (M) Kd (M)
protilátka Protokol 1 Protokol 2
2.12.1 7,37 x 10'9
2.13.2 3,5 x 109 1,53 x 109
2.14.3 6,41 x 1O'10
3.1.1 1,15 x 10’9
4.9.2 6,84 x 1O10 4,27 x 1O'10
4.17.3 13 x 10-8
6.1.1 5,65 x 1O’10
Kinetické analýzy vyjadřují, že protilátky připravené podle vynálezu mají vysoké afinity a silné vazebné konstanty pro extracelulární doménu IGF-IR.
110
Příklad III
Protilátkou zprostředkovaná inhibice IGF-I-indukované fosforylace IGF-IR
Byly prováděny experimenty ELISA, aby se určilo, zda protilátky podle tohoto vynálezu jsou schopné blokovat IGF-Izprostředkovanou aktivaci IGF-IR. IGF-I- zprostředkovaná aktivace IGF-IR byla detekována zvýšenou fosforylaci tyrosinu spojenou s receptorem.
Příprava ELISA destiček
Byly připraveny ELISA záchytné destičky přidáním 100 μΐ blokovacího pufru (3% bovinní sérový albumin [BSA] v Trispufrovaném fyziologickém roztoku [TBS]) do každé jamky 96 jamkových destiček potažených ReactiBind Protein G (Pierce) a destičky byly inkubovány za třepání po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Králičí pan-specifická SC-713 anti-IGF-IR protilátka byla naředěna (Santa Cruz) v blokovacím pufru na koncentraci 5 pg/ml a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ naředěné protilátky. Destičky byly inkubovány za třepání po dobu 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem (TBS + 0,1 % Tween 20) a zbývající pufr byl jemně odsát na papírových ručníkách. Před přidáním lyzátu nebyly destičky ponechány vyschnout.
Příprava lyzátu z IGF-IR-exprimujících buněk
Buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR byly vloženy (5xl04/ml) do 100 μΐ růstového média (DMEM médium s vysokým obsahem glukózy doplněné 0,29 mg/ml L-glutaminu, 10% teplem « · »
111 dobu j edné hodiny. v koncentraci 600 inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu na 96 jamkové destičky se dnem jamek ve tvaru U. Destičky byly přes noc inkubovány ve 37 °C, 5% CO2, aby se umožnilo přichycení buněk. Médium bylo slito z destiček a nahrazeno 100 μΐ čerstvého růstového média na jamku. Pro testování byly potenciální anti-IGF-IR protilátky naředěny na pětinásobek požadované konečné koncentrace v růstových médiích a přidány po 25 μΐ na jamku. Všechny vzorky byly testovány v trojím opakování. Pak byly destičky inkubovány ve 37 °C po Buňky byly stimulovány 25 μΐ/jamka IGF-1 ng/ml (připraveno v růstovém médiu) a destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Pak bylo médium slito převrácením destiček a jemným osušením na papírových ručníkách a adherované buňky byly lyžovány přidáním 50 μΐ lyzačního pufru (50mM HEPES, pH 7,4, lOmM EDTA, 150mM NaCl, l,5mM MgCl2, l,6mM NaVO4, 1% Triton X100, 1% glycerol, doplněný bezprostředně před použitím jednou tabletou inhibitoru proteázy bez EDTA [Roche Molecular
Sciences] na 50 ml) a třepány po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Do každé jamky bylo přidáno 200 μΐ ředicího pufru (50mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaV04) a mícháno opakovaným pipetováním. 100 μΐ lyzátu z každé jamky bylo přeneseno do každé jamky ELISA záchytné destičky připravené tak, jak bylo popsáno výše a inkubováno za jemného třepání po dobu dvou hodin při teplotě místnosti.
ELISA s protilátkami anti-tyrosinfosfát (pTYR)
Buněčný lyzát byl odstraněn převrácením destiček, destičky byly promyty pětkrát promývacím pufrem a osušeny na papírových ručníkách. Na jamku bylo přidáno 100 μΐ pTYR-specifické
- 112 protilátky (HRP-PY54) naředěné blokovacím pufrem na koncentraci 0,2 μς/πιΐ a destičky byly inkubovány za třepání po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacim pufrem a osušeny na papírových ručníkách.
Vazba HRP-PY54 protilátky byla detekována přidáním 100 μΐ TMB peroxidázového substrátového roztoku (Kirkegaard & Perry) na jamku a inkubací za třepání při vývoji barvy (přibližně 2 až 10 minut). Rozvoj barevné reakce byl zastaven přidáním 100 μΐ na jamku TMB stopovacího roztoku (Kirkegaard &Perry). Pak byly destičky třepány po dobu 10 sekund při teplotě místnosti, aby se roztok promíchal a kvantifikovány měřením V OD450nm·
Tabulka II a obrázek 4 ukazují výsledky tohoto experimentu prováděného s několika protilátkami podle vynálezu. Výsledky tohoto experimentu demonstrují schopnost protilátek podle tohoto vynálezu blokovat IGF-I-zprostředkovanou aktivaci IGFIR, jak ukázáno zvýšenou fosforylaci tyrosinu spojenou s receptorem. Kromě toho mohou být tyto výsledky použity pro kvantifikaci relativní účinnosti protilátek podle tohoto vynálezu.
Tabulka II
Monoklonální protilátka IC50 ^g/ml)
2.12.1 0,172
2.13.2 0,0812
2.14.3 0, 325
4.9.2 0,0324
• · · ·
- 113 -
Příklad IV
Protilátkou zprostředkovaná blokáda vazby IGF-I/IGF-IR
Byly prováděny ELISA experimenty pro kvantifikaci schopnosti protilátek podle vynálezu inhibovat IGF-I vazbu k IGF-IR v testu založeném na buňkách. Na 96 jamkové destičky se dnem jamek ve tvaru U byly naneseny buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5xl04/ml) do 100 μΐ DMEM média s vysokým obsahem glukózy doplněného 0,29 mg/ml L-glutaminu, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 gg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu. Pak byly destičky přes noc inkubovány ve 37 °C, 5% CO2, aby se umožnilo přichycení buněk. Médium bylo slito z destiček a nahrazeno 100 μΐ čerstvého růstového média na jamku. Pro testování byly protilátky naředěny v testovacím médiu (DMEM médium s vysokým obsahem glukózy doplněné L-glutaminem, 10% teplem inaktivovaným FBS, 200 μ9/ιη1 BSA a 500 μς/ιηΐ každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu) na požadovanou konečnou koncentraci a na jamku bylo přidáno 50 μΐ. Všechny vzorky byly prováděn v trojím opakování. Pak byly destičky inkubovány ve 37 °C po dobu deseti minut. [125I]-IGF-I byl naředěn na koncentraci 1 pCi/ml v testovacím médiu a do každé jamky destičky bylo přidáno 50 μΐ. Jako kontrola pro radioaktivitu pozadí byl přidán neznačený IGF-I do konečné koncentrace 100 ng/ml. Destičky byly inkubovány po dobu 10 minut ve 37 °C, média byla slita, destičky byly jemně osušeny na papírových ručníkách a promyty dvakrát testovacím médiem. Pak byly buňky lyžovány přidáním 50 μΐ 0,lN NaOH, 0,1% SDS a destičky byly třepány pět minut při teplotě místnosti. Pak byly vzorky přeneseny na scintilační destičku, přidáno 150 μΐ
114
OptiPhase Supermix a signály odečítány na počítači Wallac Micro-Beta.
Tabulka III a obrázek 3 ukazují výsledky tohoto experimentu prováděného se třemi reprezentativními protilátkami podle vynálezu. Tento experiment demonstroval, že protilátky podle vynálezu specificky inhibují vazbu [125I]-IGFI k buňkám nadměrně exprimujícím IGF-IR.
Tabulka III
Monoklonální protilátka IC50
2.12.1 0,45 gg/ml
2.13.2 0,18 gg/ml
4.9.2 0,1 μg/ml
Příklad V
Studie mapování epitopu
Při dokazování, že protilátky podle vynálezu rozpoznávají IGF-IR, byly prováděny studie mapování epitopu s několika protilátkami podle vynálezu. Tyto experimenty byly konkrétně zaměřeny na protilátky 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 a 4.9.2.
Byly prováděny kompetitivní studie na přístroji BIAcore pro určování, zda se protilátky podle tohoto vynálezu vážou ke stejnému nebo odlišnému místu na IGF-IR molekule. Extracelulární doména (ECD) IGF-IR byla navázána k senzorovému čipu BIAcore, jak bylo popsáno výše v příkladu II. První protilátka podle vynálezu byla navázána k tomuto IGF-IR • fr * · · · · ···· • · · · ····· · · · ·
- 115 navázaném na senzorovém čipu v saturujících podmínkách. Pak byla měřena schopnost následných sekundárních protilátek podle vynálezu kompetovat s primární protilátkou o vazbu k IGF-IR.
Tato technika umožnila přiřadit protilátky podle tohoto vynálezu k různým vazebným skupinám.
Tento experiment byl prováděn s protilátkami 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3 a 4.9.2. Bylo pozorováno, že 2.13.2 a 4.9.2 kompetovaly o stejné místo na extracelulární doméně IGF-IR.
Další protilátky, 2.12.1 a 2.14.3, se vážou k místům na IGFIR, která jsou odlišná od sebe navzájem a od místa vázaného 2.13.2 a 4.9.2.
Příklad VI
Druhová zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu
Aby se určila druhová zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu, bylo prováděno několik experimentů včetně imunoprecipitace, protilátkou zprostředkované blokády IGF-Iindukované fosforylace receptoru a analýza FACS.
Pro provádění imunoprecipitačních pokusů byly buňky naneseny do T25 láhví s DMEM médiem s vysokým obsahem glukózy doplněným 0,29 mg/ml L-glutaminu, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 gg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu do 50% konfluence. Pak bylo přidáno 100 μΐ protilátky podle vynálezu v Hankově pufrovaném fyziologickém roztoku (HBSS, Gibco BRL) v koncentraci 1 gg/ml. Destičky byly inkubovány po dobu 30 minut ve 37 °C v inkubátoru, a pak byly buňky stimulovány IGF-I v koncentraci 100 ng/ml po dobu 10 minut při
116
teplotě místnosti. Buňky byly lyžovány v RIPA pufru (Harlow a Lané, výše) a imunoprecipitovány IGF-IR s 2 pg pan-specifické SC-713 anti-IGF-IR protilátky (Santa Cruz) plus protein A agarózovými perličkami po dobu 1 hodiny ve 4 °C. Perličky byly peletovány a byly třikrát promyty PBS/T (PBS +0,1% Tween-20), a pak byly perličky povařeny ve 40 μΐ Laemmliho pufru obsahujícím 5% β-ΜΕ.
Vzorky připravené tak, jak bylo popsáno výše, pak byly analyzovány technikou Western blot. 12 μΐ každého vzorku na dráhu bylo naneseno na gely Novex™ s 4-10% gradientem provozované v lx MES pufru (Novex™) . Gely byly prováděny ve 150 V po dobu 1 hodiny nebo ve 200V po dobu přibližně 30 minut. Pak byly gely přeneseny na membránu v Novex™ přenosovém pufru s 10% methanolem buď přes noc ve 100 mA nebo po dobu 11,5 hodiny ve 250 mA. Pak byla membrána ponechána úplně uschout a blokována při teplotě místnosti pufrem TBS (Trisem pufrovaný fyziologický roztok, pH 8,0) obsahujícím Superblock (Pierce Chemical Co.). Pro detekci imunoprecipitovaného IGF-IR byla přidána IGF-IR blotovací protilátka SC713 (Santa Cruz).
Tento experiment byl prováděn s protilátkami podle vynálezu, konkrétně 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 a 4.9.2, na buňkách z celé řada zvířat. Bylo zjištěno, že protilátky 2.12.1, 2.13.2 a 4.9.2 byly schopny vázat humánní, ale ne psí, morčecí nebo králičí IGF-IR. Dále byly tyto protilátky schopny vázat IGF-IR z COS7 a opic Rhesus, pocházející z opic Starého světa, ale ne IGF-IR z marmoseta, což je opice z Nového světa. Tyto experimenty ukazují, že protilátky jsou vysoce specifické.
- 117 Protilátkou zprostředkovaná blokáda vazby IGF-I/IGF-IR u primátů jiného než lidského původu
Po pozorování, že protilátky podle vynálezu rozpoznávají IGF-IR z opic Starého světa, byla také testována jejich schopnost blokovat vazbu IGF-I/IGF-IR v buňkách pocházejících z těchto opic Starého světa. Buňky byly naneseny do T25 láhví s DMEM médiem s vysokým obsahem glukózy doplněným s L-glutaminem, 10% teplem inaktivovaným FBS a 500 gg/ml každého z geneticinu, penicilinu a streptomycinu do 50% konfluence. Pak byla přidána protilátka podle vynálezu nebo médium bez protilátky jako kontrola a buňky byly stimulovány IGF-I v koncentraci 100 ng/ml po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Po stimulaci buňky byly lyžovány a imunoprecipitovány IGF-IR s pan-specifickou IGF-IR protilátkou SC713, jak bylo popsáno výše. Pak byla prováděna analýza Western blot, jak bylo popsáno výše, s použitím HRP-PY54 protilátky pro detekci fosforylovaného tyrosinu v aktivovaném IGF-IR.
Bylo zjištěno, že protilátky podle tohoto vynálezu, konkrétně 2.13.2 a 4.9.2, mohou blokovat IGF-I indukovanou fosforylaci IGF-IR v buňkách COS7 i Rhesus. Hodnota IC50 pro pozorovanou inhibici byla 0,02 gg/ml a 0,005 gg/ml pro IGF-IR COS7 a Rhesus, v daném pořadí.
Stanovení mezidruhové (zkřížené) afinity protilátek podle vynálezu
Byla prováděna FACS analýza pro určování afinity protilátek podle vynálezu pro IGF-IR z ostatních zvířat, konkrétně opic Starého světa popsaných výše. Byly inkubovány alikvoty humánních a opičích buněk (5xl05) po dobu 1 hodiny na
- 118 ledu se stoupajícími koncentracemi biotinylovaných anti-IGF-IR protilátek podle vynálezu nebo s biotinylovanou protilátkou anti-hemokyanin přílipky (KLH) (Abgenix) jako negativní kontroly. Pak byly vzorky inkubovány po dobu 30 minut na ledu s RPE (fykoerytrin) konjugovaným se streptavidinem. Vazba byla měřena průtokovou cytometrií a analyzována histogramy intenzity fluorescence (F12-H) proti počtu buněk (Počty) s použitím software CellQuest. Vazba (Kd) byla vypočtena pro každou protilátku z grafů průměrné intenzity fluorescence proti koncentraci protilátky. Ve většině experimentů byla měřena vazba v pěstovaných humánních buňkách MCF-7 a buňkách tkáňových kultur makaků rhesus {Macaca mullata) nebo cynomologus (M. fascicularis) . Deplece protilátky byla kontrolována měřením vazby v rozsahu koncentrací buněk.
Výše uvedená FACS analýza byla prováděna pro testování schopnosti protilátek podle vynálezu, konkrétně 2.13.2 a 4.9.2, vázat se na humánní buňky a buňky makaků rhesus {Macaca mullata) nebo cynomologus {M. fascicularis). Byla pozorována poloviční maximální vazba (Kd) 0,1 Mg/ml pro všechny testované buněčné linie.
Příklad VII
Down-regulace receptoru IGF-I
Byly prováděny blokující experimenty v podstatě tak, jak bylo popsáno výše v příkladu IV, až po přidání IGF-I značeného [125I] . V tomto bodě byly buňky povařeny ve 40 μΐ Laemmliho pufru obsahujícího 50% ME. Vzorky pak byly analyzovány analýzou Western bloty, jak bylo popsáno výše v příkladu VI, a
119
bloty byly zkoušeny s pan-specifickou IGF-IR protilátkou SC713 ke kvantifikaci hladin IGF-IR a s protilátkou HRP-PY54 ke sledování hladin fosforylovaného tyrosinu v aktivovaném IGF-IR jako sondami.
Jak bylo pozorováno dříve (příklad III), byla zjištěna blokáda IGF-I indukované fosforylace IGF-IR po ošetření buněk protilátkou podle tohoto vynálezu (obrázek 4). Dále bylo pozorováno, že tato blokáda IGF-I indukované fosforylace byla následována down-regulací IGF-IR v těchto buňkách. Viz např. obr. 4., IGF-IR hladiny byly maximálně redukovány 16 hodin po stimulaci s IGF-I v přítomnosti protilátky podle vynálezu.
Příklad VIII
Účinky protilátek podle vynálezu na IGF-IR in vivo
Bylo zjišťováno, zda účinky protilátek podle vynálezu na IGF-IR, jak byly popsány v předchozích příkladech, by nastaly in vivo. V athymických myších byly indukovány nádory podle publikovaných metod (V. A. Pollack et al., Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in šitu and antitumor effects in athymic mice, J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748, 1999). Krátce, buňky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5xl06) byly inj ikovány subkutánně athymickým (nu/nu) myším ve věku 3 až 4 týdnů s 0,2 ml přípravku Matrigel. Pak byly myši intraperitoneálně injikovány protilátkou podle vynálezu poté, co se byly vytvořeny stabilní nádory (tj. přibližně 400 mm3).
120
Po 24 hodinách byly nádory extrahovány, homogenizovány a byla určena hladina IGF-IR. Aby se určily hladiny IGF-IR, byla SC-713 protilátka naředěna v blokovacím pufru na konečnou koncentraci μρ/ιηΐ a 100 μΐ bylo přidáno do každé jamky destičky potažené Reacti-Bind kozí anti-králičí protilátkou (GAR) (Pierce). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny za třepání a pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem. Pak byly zváženy vzorky nádorů, které byly připraveny tak, jak bylo popsáno výše, a homogenizovány v lyzačním pufru v množství 1 ml/100 mg. 12,5 μΐ nádorového extraktu bylo naředěno lyzačním pufrem na konečný objem 100 μΐ a toto bylo přidáno do každé jamky 96 jamkové destičky. Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti za třepání po dobu 1 až 2 hodin, a pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem. Pak bylo přidáno 100 μΐ HRP-PY54 nebo biotinylované anti-IGF-IR protilátky v blokovacím pufru do každé jamky a inkubováno při teplotě místnosti za třepání po dobu 30 minut. Pak byly destičky pětkrát promyty promývacím pufrem a destičky byly vyvolány. Destičky testované s HRP-PY54 byly vyvolány přidáním 100 μΐ TMB mikrojamkového substrátu na jamku a rozvoj barvy byl zastaven přidáním 100 μΐ 0,9M H2SO4. Pak byl signál kvantifikován třepáním po dobu 10 sekund a měřením OD450nm· Signál byl normalizován k celkovému proteinu. Destičky zkoušené s anti-IGF-IR protilátkou byly vyvolány přidáním 100 μΐ streptavidinu-HRP naředěného v blokovacím pufru do každé jamky, inkubací při teplotě místnosti za třepání po dobu 30 minut, a pak bylo pokračováno tak, jak bylo popsáno pro HRP-PY54.
Bylo zjištěno, že intraperitoneální injekce protilátky podle tohoto vynálezu, obzvláště 2.13.2 a 4.9.2, měla za následek inhibici IGF-IR aktivity, jak bylo měřeno poklesem
121
[obou IGF-IR fosfotyrosinu (fosforylovaného IGF-IR) a] celkového IGF-IR proteinu (obrázek 6) . Kromě toho byl také pozorován pokles IGF-IR fosfotyrosinu (fosforylovaného IGF-IR) (obrázek 5) . Bez vazby na kteroukoliv teorii snížené hladiny IGF-IR fosfotyrosinu mohou být způsobeny sníženými hladinami IGF-IR proteinu in vivo po ošetření protilátkou nebo mohou být způsobeny kombinací snížených hladin IGF-IR proteinu a poklesem fosforylace tyrosinu na IGF-IR, která je přítomná díky blokádě aktivace ligandem (např. IGF-I nebo IGF-II). Kromě toho tato inhibice byla citlivá na dávku injikované protilátky (obrázek 6). Tato data dokazují, že protilátky podle vynálezu jsou schopny cílit IGF-IR in vivo způsobem analogickým způsobu, který byl pozorován in vitro.
Příklad IX
Inhibice růstu (TGI) 3T3/IGF-IR buněčných nádorů
Bylo testováno, zda anti-IGF-IR protilátky podle vynálezu by působily na inhibici nádorového růstu. Nádory byly indukovány tak, jak bylo popsáno výše (příklad VIII) a když se vytvořily ustavené zřetelné nádory (tj. 250 mm3, během 6 až 9 dnů), byly myši ošetřeny jednou dávkou 0,20 ml protilátky intraperitoneální injekcí. Velikost nádoru byla měřena Vernierovým kaliperem ve dvou průměrech každý třetí den a objem byl vypočten s použitím vzorce (délka x [šířka]2)/2 s použitím metod zavedených autory Geran, et al., Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems, Cancer Chemother. Rep. 3: 1-104.
122
Když byla prováděna tato analýza s protilátkou podle vynálezu, bylo zjištěno, že jedno ošetření protilátkou 2.13.2 samotnou inhibovalo růst nádorů indukovaných NIH-3T3 buňkami transfekovanými IGF-IR (obrázek 7, levý panel). Kromě toho, v kombinačních studiích s jednou dávkou 7,5 mg/kg intravenózně podávaného adriamycinu bylo pozorováno, že podávání jedné dávky 2.13.2 zesílilo účinnost adriamycinu, známého inhibitoru nádorového růstu. Kombinace adriamycinu s protilátkou podle vynálezu, 2.13.2, vykázala zpoždění růstu 7 dnů oproti léčbě samotnou protilátkou nebo samotným adriamycinem (obrázek 7, pravý panel).
Příklad X
Vztah hladin protilátek k down-regulaci IGF-IR
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu VIII. Myši pak byly ošetřeny 125 μg 2.13.2 intraperitoneální injekcí, jak bylo popsáno v příkladu VIII. Nádory byly extrahovány a hladiny IGF-IR byly měřeny testem ELISA tak, jak bylo popsáno v příkladu VIII. Obrázek 8 ukazuje sérové hladiny protilátky 2.13.2 a hladiny receptoru IGF-IR v průběhu času. Experiment demonstruje, že IGF-IR je downregulován protilátkou a že stupeň IGF-IR inhibice je dle dávky úměrný sérové koncentraci protilátky.
123
Příklad XI
Inhibice růstu 3T3/IGF-IR nádorů mnohonásobnou dávkou protilátky v kombinaci s adriamycinem
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny ve dnech 1, 8, 15 a různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 9 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje růst nádorových buněk a zvýší inhibici růstu nádorových buněk v kombinaci s adriamycinem, známým nádorovým inhibitorem.
Příklad XII
Inhibice růstu velkých nádorů
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s velkými ustavenými subkutánními nádory trochu menšími než 2000 mm3 byly ošetřeny ve dnech 1 a 8 různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 10 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Kontrolní skupina zvířat, skupina zvířat se samotnou protilátkou a samotným adriamycinem byly ukončeny v den 5, • · · · · ·
124 když velikost nádoru překročila 2000 mm3. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou v kombinaci s adriamycinem je vysoce účinné proti velkým nádorům, když jsou podávány mnohonásobné dávky.
Příklad XIII
Inhibice růstu buněk kolorektálních nádorů
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX kromě toho, že byly použity buňky Colo 205 (ATCC CCL 222). Colo 205 buňky jsou buňky humánního kolorektálního adenokarcinomu. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo 5-fluordeoxyuridinem (5-FU, i.v.) v dávce 100 mg/kg, buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 11 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou inhibuje růst buněk humánního kolorektálního karcinomu, když byla poskytnuta jako jedno agens a zesiluje účinnost 5-FU, známého nádorového inhibitoru.
Myši s ustavenými Colo 205 nádory byly ošetřeny ve dnech 1, 8, 15 a 22 s 500 Mg 2.13.2 (i.p.), 100 mg/kg 5-FU (i.v.) nebo jejich kombinací. Obrázek 12 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje růst buněk humánního kolorektálního karcinomu a zesiluje účinnost 5-FU.
125
Příklad XIV
Inhibice růstu buněk karcinomu prsu
Nahým myším, jak byly popsány v příkladu VIII, byly implantovány biologicky rozložitelné tablety s estrogenem (0,72 mg 17-p~estradiol/tableta, 60 dnů uvolňování, Innovative Research of America). Po 48 hodinách byly v nahých myších indukovány nádory v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX, kromě toho, že byly použity buňky MCF-7 (ATCC HTB-22). Buňky MCF-7 jsou na estrogenu závislé buňky humánního karcinomu prsu. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny 50 gg protilátky 2.13.2 (i.p.) ve dnech 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 a 22 (q3dx7) nebo taxolem v dávce 6,25 mg/kg (i.p.) ve dnech 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 13 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou samotnou inhibuje růst buněk humánního karcinomu prsu, když je podávána jednou každé tři dny, a také zesiluje účinnost taxolu, známého inhibitoru karcinomu prsu, když je podávána v kombinaci.
Myši s ustavenými nádory z buněk MCF-7, jak bylo popsáno bezprostředně výše, byly ošetřeny v den 1 různým množstvím protilátky 2.13.2 (i.p.) samotnou nebo s adriamycinem v dávce 3,75 mg/kg (i.v.), v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Obrázek 14 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment dokazuje, že jedno ošetření anti-IGF-IR protilátkou samotnou inhibuje růst buněk humánního karcinomu prsu a zesiluje účinnost adriamycinu, známého nádorového inhibitoru.
»··· ·« • · • ·
- 126 Myši s ustavenými nádory z buněk MCF-7, jak bylo popsáno bezprostředně výše, byly ošetřeny 250 pg protilátky 2.13.2 (i.p.) ve dnech 1, 8, 15 a 23 nebo biologicky rozložitelnou tabletou s tamoxifenem v dávce 25 mg/tableta (volná báze, 60 dnů uvolňování, Innovative Research of America) , buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Tableta s tamoxifenem byla implantována v den 1 poté, co byl prokázán nádor. Obrázek 15 ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGF-IR protilátkou podávanou jednou každých sedm dnů inhibuje samotné růst humánního karcinomu prsu a zesiluje účinnost tamoxifenu, známého nádorového inhibitoru.
Příklad XVI
Inhibice růstu buněk epidermoidního karcinomu
V nahých myších byly indukovány nádory v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu IX kromě toho, že byly použity buňky A431 (ATCC CRL 1555) . Buňky A431 jsou buňky humánního epidermoidního karcinomu, které nadměrně exprimují EGFR. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 250 mm3 byly ošetřeny ve dnech 1, 8, 15, 22 a 29 s 500 pg protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo byly ošetřeny jednou denně po dobu 27 dnů s CP-358,774 v dávce 10 mg/kg, podávané perorálně (p.o.), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. CP-358,774 je popsána v patentu Spojených Států 5 747 498 a v práci autorů Moyer et al., Cancer Research, 57: 4838-4848, 1997, zahrnuto formou odkazu v tomto textu. Obrázek • · · ·
- 127 -
ukazuje velikost nádoru ve vztahu k různému ošetření v průběhu času. Experiment demonstruje, že ošetření anti-IGFIR protilátkou zesiluje účinnost CP-358,774, známého inhibitoru EGF-R tyrosinkinázy, v inhibici růstu humánního epidermoidního karcinomu.
Příklad XVII
Farmakokinetika anti-IGF-IR protilátek in vivo
Aby se vyhodnotila farmakokinetika anti-IGF-IR protilátek, cynomolgním opicím (Macaca fascicularis) byla podávána intravenózní injekce protilátky 2.13.2 v acetátovém pufru v dávce 3, 30 nebo 100 mg/kg. Opicím bylo odebíráno sérum v různých časových bodech a v období až deset týdnů byla určována koncentrace anti-IGF-IR protilátky u opic. Pro kvantifikaci funkčních sérových hladin protilátky byla extracelulární doména humánního IGF-IR (IGF-I-sR, R&D Systems, katalog, č. 391GR) navázána na 96 jamkové destičky. Opičí sérum (naředěné mezi 1:100 a 1:15 000) bylo přidáno na testovací destičky tak, že každý vzorek byl v lineárním rozsahu kalibrační křivky a inkubován v podmínkách, ve kterých se každá anti-IGF-IR protilátka váže k IGF-I-sR. Po promytí destiček značená anti-humánní IgG protilátka byla přidána na destičky a inkubována v podmínkách, ve kterých se anti-humánní IgG protilátka váže k anti-IGF-IR protilátce. Destičky pak byly promyty a vyvolány a kontrolní kalibrační křivka a její lineární regrese byly použity pro kvantifikaci množství antiIGF-IR protilátky. Obrázek 17 ukazuje koncentraci z 2.13.2 v séru v průběhu času. Experiment demonstruje, že poločas • · · ·
- 128 -
anti-IGF-IR protilátky je 4,6 až 7,7 dnů a má distribuční objem 74 až 105 ml/kg. Dále experiment demonstruje, že podávaná množství jsou u opic úměrná dávce, což ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka saturovala každé dostupné IGF-IR vazebné místo v organismu dokonce i v nejnižší dávce 3 mg/kg.
Příklad XVIII
Kombinační léčba anti-IGF-IR protilátkou a adriamycinem downreguluje IGF-IR in vivo
V nahých myších byly indukovány nádory tak, jak bylo popsáno v příkladu IX. Myši s ustavenými subkutánními nádory o velikosti přibližně 400 mm3 byly ošetřeny jednou injekcí 250 pg protilátky 2.13.2 (i.p.) nebo adriamycinem v dávce 7,5 mg/kg (i.v.), buď jako jednotlivými agens nebo v kombinaci, jak bylo popsáno v příkladu IX. 72 hodin po podávání agens byly nádory extrahovány, jak bylo popsáno v příkladu VIII, a stejná množství nádorových extraktů byla podrobena elektroforéze v polyakrylamidovém gelu s dodecylfosfátem sodným (SDS-PAGE) a analýze Western blot s použitím anti-IGF-IR protilátky SC-713 (Santa Cruz). Obrázek 18 ukazuje množství IGF-IR v nádorových buňkách u kontrolních zvířat (první tři dráhy každého panelu), u zvířat ošetřených samotnou protilátkou (horní panel), u zvířat ošetřených samotným adriamycinem (prostřední panel) a u zvířat ošetřených protilátkou a adriamycinem (spodní panel). Každá dráha reprezentuje stejné množství proteinu z jednotlivých nádorů od individuálních myší. Experiment demonstruje, že ošetření adriamycinem samotným má malý účinek na hladiny IGF-IR, a že ošetření samotnou protilátkou ukazuje • · · ·
- 129 určitý pokles hladin IGF-IR. Překvapivě, léčba adriamycinem a protilátkou společně ukazuje dramatický pokles hladin IGF-IR, což demonstruje, že adriamycin a protilátka značně downregulují hladiny IGF-IR.
Všechny publikace a patentové přihlášky, které byly citovány v tomto popisu, jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu, jako by každá jednotlivá publikace nebo patentová přihláška byla specificky a individuálně uvedena jako zahrnutá formou odkazu. Ačkoli některé detaily předkládaného vynálezu byly popsány ilustrativním způsobem a pomocí příkladů pro účely lepšího porozumění, odborníkům v oboru je zřejmé ve světle nauky tohoto vynálezu, že určité změny a modifikace mohou být vytvořeny bez odchýlení se od vynálezecké myšlenky nebo rozsahu připojených patentových nároků.
130
Seznam sekvencí <160> 60 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 291 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60 ' tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120 ccgtttacaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180 tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240 taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa c 291 <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 2
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp
1 5 10 15
Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro
20 25 30
Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser
35 40 45
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
50 55 60
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn
65 70 75 80
Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val Glu Ile Ile Arg
85 90 95
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
100 105 110
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
115 120 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 • · · ·
- 131 <210> 3 <211> 352 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcact 60 ttcagtgact actatatgag ctggatccgq caggctccag ggaaggggct ggaatgggtt 120 tcatacatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag actctgtgaa gggccgattc 180 accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacttt ttactactac 300 tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc ag 352 <210> 4 <211> 174 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 4 Gly Arg 1 Leu Gly Gin 5 Ala Trp Arg
ser Gly Phe Thr 20 Phe Ser Asp Tyr
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp Val 40
Thr Arg 50 Asp Tyr Ala Asp Ser 55 Val
Asp 65 Asn Ala Lys Asn Ser 70 Leu Tyr
Glu Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys
Phe Tyr Tyr Tyr 100 Tyr Tyr Gly Met
val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120
Ala Pro 130 Cys Ser Arg Ser Thr 135 Ser
Leu 145 val Lys Asp Tyr Phe 150 Pro Glu
Ser Leu 10 Arg Leu ser Cys Ala 15 Ala
Tyr 25 Met Ser Trp ile Arg 30 Gin Ala
Ser Tyr Ile Ser Ser 45 Ser Gly Ser
Lys Gly Arg Phe 60 Thr Ile Ser Arg
Leu Gin Met 75 Asn Ser Leu Arg Ala 80
Val Arg 90 Asp Gly Val Glu Thr 95 Thr
Asp 105 val Trp Gly Gin Gly 110 Thr Thr
Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Glu Ser Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys
Pro Val Thr 155 val Ser Trp Asn· Ser 160
• · · ·
- 132 -
Oly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Cys Ala 165 170 <210> 5 <211> 322 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 5 gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa ac 322 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 6
Asp 1 Ile Gin Met Thr Gin 5 Phe Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Arg 30 Asn Asp
Leu Gly Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu Ile
Tyr Ala 50 Ala Ser Arg Leu His 55 Arg Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Leu Gin 90 His Asn Ser Tyr Pro 95 Cys
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 7 <211> 375 <212> DNA <213> Homo Sapiens « · · ·
- 133 -
<400> 7 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg 180 cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Gly ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccttca cttgccgggc aagtcaggac 60 attagacgtg atttaggctg gtatcagcag aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc 120 tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 180 acagaattca ctctcacaat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgt 240 ctacagcata ataattatcc tcggacgttc ggccaaggga ccgaggtgga aatcatacga 300 ac 302
- 134 -
<210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg
1 5 10 15
Ala Ser Gin Asp 20 Ile Arg Arg Asp Leu 25 Gly Trp Tyr Gin Gin 30 Lys Pro
Gly Lys Ala 35 Pro Lys Arg Leu Ile 40 Tyr Ala Ala Ser Arg 45 Leu Gin Ser
Gly Val 50 Pro Ser Arg Phe Ser 55 Gly Ser Gly Ser Gly 60 Thr Glu Phe Thr
Leu 65 Thr Ile Ser Ser Leu 70 Gin Pro Glu Asp Phe 75 Ala Thr Tyr Tyr Cys 80
Leu Gin His Asn Asn 85 Tyr Pro Arg Thr Phe 90 Gly Gin Gly Thr Glu 95 Val
Glu Ile Ile Arg 100 <210> 11 <211> 338 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 11 gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg 60 ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg 120 gattgggcgt atctatacca gtgggagccc caactacaac ccctccctca agagtcgagt 180 caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgaact ctgtgaccgc 240 C9C93acacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt ggagtggtta ttatctttga 300 ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 338 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Homo Sapiens « · · · · ·
- 135 -
<400> 12 Gly Pro Gly 1 Leu Val 5 Lys Pro Ser Glu Thr 10 Leu Ser Leu Thr Cys 15 Thr
Val Ser Gly Gly 20 ser Ile Ser Asn Tyr 25 Tyr Trp Ser Trp Ile 30 Arg Gin
Pro Ala Gly 35 Lys Gly Leu Glu Trp 40 Ile Gly Arg Ile Tyr 45 Thr Ser Gly
Ser Pro 50 Asn Tyr Asn Pro Ser 55 Leu Lys Ser Arg Val 60 Thr Met Ser Val
Asp 65 Thr Ser Lys Asn Gin 70 Phe Ser Leu Lys Leu 75 Asn Ser Val Thr Ala 80
Ala Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Ala Val 90 Thr Ile Phe Gly val 95 Val
Ile Ile Phe
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105
Val Thr Val Ser Ser 110
<210> 13
<211> 322
<212> DNA
<213> Homo
<400> 13
Sapiens gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga agtgatttag getggtttca gcagaaacca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccaaat tacaccgtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagccg cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa ac
120
180
240
300
322 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens • ·
- 136 -
<400> 14
Asp 1 Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
5 10
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Ser Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 - 40 45
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 15 <211> 376 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac ggctacggtg acttttacta ctactactae ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 agctatgcca tgagctgggt cčgccaggct 120 attagtggta gtggtggtat cacatactac 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acggccgtat attactgtgc gaaagatctg 300 ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag
376 <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo Sapiens
137
<400> 16
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17 <211> 279 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt 60 ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta aactcctgat ccatgttgca tccagtttac 120 aaggtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca 180 tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagagt taoaatgccc 240 cactcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaac 279 <210> 18 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Thr 15 10 15
Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 20 25 30
- 138 -
Ile His Val Ala Ser Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin
50 55 60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asn Ala Pro
65 70 75 80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
90
<210> 19
<211> 341
<212> DNA
<213> Homo
<400> 19
sapiens cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc catcagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag ctgagttctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca g
120
180
240
300
341 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 20
Pro 1 Gly Leu Val Lys 5 Pro Ser Glu Thr Leu 10 Ser Leu Thr Cys Thr 15 Val
Ser Gly Gly Ser 20 Ile Ser Ser Tyr Tyr 25 Trp Ser Trp Ile Arg 30 Gin Pro
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp Ile 40 Gly Tyr Ile Tyr Tyr 45 Ser Gly Ser
Thr Asn Tyr 50 Asn Pro Ser Leu 55 Lys Ser Arg Val Thr 60 Ile Ser Val Asp
Thr 65 Ser Lys Asn Gin Phe 70 Ser Leu Lys Leu Ser 75 Ser Val Thr Ala Ala 80
Asp Thr Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg Thr 90 Tyr Ser Ser Ser Phe 95 Tyr
Tyr Tyr Gly Met 100 Asp Val Trp Gly Gin 105 Gly Thr Thr Val Thr 110 Val Ser
Ser
139 ···· ·· • · <210> 21 <211> 274 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220>
<221> modifikovaná báze <222> (240) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 21 agagccaccc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac 60 cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 120 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 100 agactggagc ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn 240 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaac 274 <210> 22 <211> 91 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 22
Arg 1 Ala Thr Leu Ser 5 Cys Arg Ala Ser Gin 10 Ser Val Arg Gly Arg 15 Tyr
Leu Ala Trp Tyr 20 Gin Gin Lys Pro Gly 25 Gin Ala Pro Arg Leu 30 Leu Ile
Tyr Gly Ala 35 Ser Ser Arg Ala Thr 40 Gly ile Pro Asp Arg 45 Phe Ser Gly
Ser Gly 50 Ser Gly Thr Asp Phe 55 Thr Leu Thr Ile Ser 60 Arg Leu Glu Pro
Glu 65 Asp Phe Ala Val Phe 70 Tyr Cys Gin Gin Tyr 75 Gly Ser Ser Pro Arg 80
Thr Phe Gly Gin Gly 85 Thr Lys Val Glu Ile 90 Lys
<210> 23 <211> 367 <212> DNA <213> Homo Sapiens
- 140 <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca 300 gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 24 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25 <211> 320 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt 320
141
<210> 26 <211> 106 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 26
Thr 1 Val Ala Ala Pro 5 Ser Val Phe Ile Phe 10 Pro Pro Ser Asp Glu 15 Gin
Leu Lys Ser Gly Thr 20 Ala Ser Val Val Cys 25 Leu Leu Asn Asn Phe 30 Tyr
Pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val Asp Asn Ala 45 Leu Gin Ser
Gly Asn 50 Ser Gin Glu Ser Val 55 Thr Glu Gin Asp Ser 60 Lys Asp Ser Thr
Tyr 65 Ser Leu Ser Ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser Lys 75 Ala Asp Tyr Glu Lys 80
His Lys Val Tyr Ala 85 Cys Glu Val Thr His 90 Gin Gly Leu Ser Ser 95 Pro
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 <210> 27 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 <210> 28 <211> 326 <212> PRT <213> Homo Sapiens
- 142 -
<400> 28 Lys Gly 5 Pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
Ala 1 Ser Thr
10 15
Ser Thr Ser Glu Ser 20 Thr Ala Ala Leu Gly Cys 25 Leu Val Lys Asp Tyr 30
Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 40 Gly Ala Leu Thr Ser 45
Gly val His 50 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 55 Ser Gly Leu Tyr Ser 60
Leu 65 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn 70 75 Phe Gly Thr Gin Thr 80
Tyr Thr Cys Asn Val 85 Asp His Lys Pro Ser Asn 90 Thr Lys Val Asp Lys 95
Thr Val Glu Arg Lys 100 Cys Cys Val Glu Cys Pro 105 Pro Cys Pro Ala Pro 110
Pro Val Ala 115 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 120 Pro Lys Pro Lys Asp 125
Thr Leu Met 130 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 135 Cys Val Val Val Asp 140
Val 145 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn 150 155 Trp Tyr Val Asp Gly 160
Val Glu Val His Asn 165 Ala Lys Thr Lys Pro Arg 170 Glu Glu Gin Phe Asn 175
Ser Thr Phe Arg Val 180 Val Ser Val Leu Thr Val 185 Val His Gin Asp Trp 190
Leu Asn Gly 195 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 200 Asn Lys Gly Leu Pro 205
Ala Pro Ile 210 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 215 Gly Gin Pro Arg Glu 220
Pro 225 Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 230 235 Glu Met Thr Lys Asn 240
Gin Val Ser Leu Thr 245 Cys Leu Val Lys Gly Phe 250 Tyr Pro Ser Asp Ile 255
Ala Val Glu Trp Glu 260 Ser Asn Gly Gin Pro Glu 265 Asn Asn Tyr Lys Thr 270
Thr Pro Pro 275 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 280 Phe Leu Tyr Ser Lys 285
Leu Thr Val 290 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 295 Asn Val Phe Ser Cys 300
Ser 305 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 310 315 Thr Gin Lys Ser Leu 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 • · ·
• »
- 143 <210> 29 <211> 296 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 30 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gin 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly Gly 15
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Tyr
Tyr Met Ser 35 Trp Ile Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Tyr 50 Ile Ser Ser Ser Gly 55 Ser Thr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg
<210> 31
<211> 296
<212> DNA
<213> Homo
<400> 31
sapiens gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 • · • ·
- 144 <210> 32 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly Gly 55 Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys <210> 33 <211> 296 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 33 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180 aacccgtccc teaagagtcg agtcaceata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 34 <211> 98 <212> PRT <213> Homo Sapiens
• · · · · · • · · • · · • « ·
- 145 c400> 34
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly Leu 10 Val Lys Pro Ser 15 Gly
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Ala Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Ser
Asn Trp Trp 35 Ser Trp Val Arg Gin 40 Pro Pro Gly Lys Gly 45 Leu Glu Trp
Ile Gly 50 Glu Ile Tyr His Ser 55 Gly Ser Thr Asn Tyr 60 Asn Pro Ser Leu
Lys 65 Ser Arg Val Thr Ile 70 Ser Val Asp Lys Ser 75 Lys Asn Gin Phe Ser 80
Leu Lys Leu Ser Ser 85 Val Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg
<210> 35
<211> 293
<212> DNA
<213> Homo
<400> 35
sapiens caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210> 36 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens « · • · • ·
- 146 -
<400> 36 Gin Glu 5 Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
Gin Val 1 Gin Leu
10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lle Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Xle Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lle
35 40 45
Gly Tyr lle Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn' Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr lle Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg <210> 37 <211> 290 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 37 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccaco 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc 290 <210> 38 <211> 96 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 38 Glu lle Val 1 Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu
lle Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly lle Pro 60 ASp Arg Phe Ser
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 lle Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Ala 85 val Tyr Tyr Cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser ser 95 Pro
• ·
- 147 -
<210> 39 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> modifikovaná báze <222> (288) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagegcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn 288 <210> 40 <211> 96 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 40 Thr Gin 5 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asp Ile 1 Gin Met
10 15
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin 25 Gly Ile Arg Asn Asp 30
Leu Gly Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 45
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin Ser 55 Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly €0
Ser Gly 85 Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 Leu Gin His 90 Asn Ser Tyr Pro Pro 95
<210> 41 <211> 288 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 41 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 50 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch 288
- 148 -
<210> 42 <211> 96 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 42
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Ile Ser 30 Ser Tyr
Leu Asn Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Ser Tyr Ser Thr Pro 95 Pro
<210> 43
<211> 293
<212> DNA
<213> Homo
<400> 43
caggtgcagc acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgagct
Sapiens tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc gggcccagga ctccatcagt gattgggcgt caccatgtca cgcggacacg ctggtgaagc agttactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt cttcggagac ggagctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgag cctgtccctc 60 ccggcagccc 120 caactacaac 180 gttctccctg 240 aga 293 <210> 44 <211> 97 <212> PRT <213> Homo Sapiens
Λ ·
- 149 -
<4ΟΟ> 44
Gin 1 Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
5 · 10
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20 Val Ser Gly Gly Ser 25 Ile Ser 30 Ser Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp Ile Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly 40 Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Arg Ile 50 Tyr Thr Ser Gly 55 Ser Thr Asn Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser 65 Arg Val Thr Met Ser Val 70 Asp Thr Ser Lys Asn 75 Gin Phe Ser Leu 80
Lys Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala 85 Ala Asp Thr Ala Val 90 Tyr Tyr Cys 95 Ala
<210> 45 <211> 470 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 45 Gly Leu 5 Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
Met 1 Glu Phe
10 15
Val Gin Cys Glu Val 20 Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 25 30
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 40 Gly Phe Thr Phe 45
Ser Ser 50 Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro 55 60 Gly Lys Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr 70 75 Thr Phe Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 90 Asn Ser Arg Thr 95
Thr Leu Tyr Leu Gin 100 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 105 Asp Thr Ala Val 110
Tyr Tyr Cys 115 Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser 120 Tyr Tyr Tyr Tyr 125
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 135 140 Thr Val Ser Ser
« · «
- 150 -
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro Cys Ser Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser 165 Thr Ala Ala Leu Gly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr Val Ser Trp 185 Asn Ser Gly Ala Leu 190 Thr Ser
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val 200 Leu Gin Ser Ser Gly 205 Leu Tyr Ser
Leu Ser 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe 220 Gly Thr Gin Thr
Tyr 225 Thr Cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn 235 Thr Lys Val Asp Lys 240
Thr Val Glu Arg Lys 245 Cys Cys Val Glu Cys 250 Pro Pro Cys Pro Ala 255 Pro
Pro Val Ala Gly 260 Pro Ser Val Phe Leu 265 Phe Pro Pro Lys Pro 270 Lys Asp
Thr Leu Met 275 Ile Ser Arg Thr Pro 280 Glu Val Thr Cys Val 285 Val Val Asp
Val Ser 290 His Glu Asp Pro Glu 295 Val Gin Phe Asn Trp 300 Tyr Val Asp Gly
Val 305 Glu Val His Asn Ala 310 Lys Thr Lys Pro Arg 31S Glu Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg Val 325 Val Ser Val Leu Thr 330 Val Val His Gin Asp 335 Trp
Leu Asn Gly Lys 340 Glu Tyr Lys Cys Lys 345 Val Ser Asn Lys Gly 350 Leu Pro
Ala Pro Ile 355 Glu Lys Thr Ile Ser 360 Lys Thr Lys Gly Gin 365 Pro Arg Glu
Pro Gin 370 Val Tyr Thr Leu Pro 375 Pro Ser Arg Glu Glu 380 Met Thr Lys Asn
Gin 385 Val Ser Leu Thr Cys 390 Leu Val Lys Gly Phe 395 Tyr Pro Ser Asp Ile 400
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro 410 Glu Asn Asn Tyr Lys 415 Thr
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Gly 425 Ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr Val 435 Asp Lys Ser Arg Trp 440 Gin Gin Gly Asn Val 445 Phe Ser Cys
* · · ·
- 151 -
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 46 <211> 470 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<400> 46 Gly
Met 1 Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys 15
5 10
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Leu Glu Ser 25 Gly Gly Gly Leu Val 30 Gin
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 40 Ala Ser Gly Phe Thr 45 Phe
Ser Ser 50 Tyr Ala Met ser Trp Val Arg Gin 55 Ala Pro Gly Lys Gly 60 Leu
Glu 65 Trp Val Ser Ala Ile 70 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 75 Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn
Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu Arg 105 Ala Glu Asp Thr Ala 110 Val
Tyr Tyr Cys 115 Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Gly 120 Trp Tyr Tyr Tyr Tyr 125 Tyr
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 135 Thr Val Thr Val Ser 140 Ser
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 155 Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr 165 Ala Ala Leu Gly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr Val Ser Trp Asn 185 Ser Gly Ala Leu Thr 190 Ser
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 200 Ser Ser Gly Leu Tyr 205 Ser
Leu Ser 210 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 215 Asn Phe Gly Thr Gin 220 Thr
Tyr 225 Thr Cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 235 Lys 240
- 152 -
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 47 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens • ·
- 153 <400> 47
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyr Pro Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg oiy Glu Cys
225 230 235
<210> 48 <211> 236 <212> PRT <213> Homo Sapiens
- 154 -
<400> 48 Met Asp 1 Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Ile Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly 50 Ile Arg Asn Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala Ser Ser 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
Ile Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Ser 115 Tyr Pro Tyr Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Leu Glu Ile
Lys Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser Val Phe Ile Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
9
9 · • · · • · »
- 155 <210> 49 <211> 470 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 49
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Gin Ala Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser ser Gly Ser Thr Arg Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
- 156 -
Ser Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Val Arg Asp Gly Val 120 Glu Thr Thr Phe Tyr 125 Tyr Tyr Tyr
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val 140 Thr Val Ser Ser
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro Cys Ser Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser 165 Thr Ala Ala Leu Gly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr Val Ser Trp 185 Asn Ser Gly Ala Leu 190 Thr Ser
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val 200 Leu Gin Ser Ser Gly 205 Leu Tyr Ser
Leu Ser 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe 220 Gly Thr Gin Thr
Tyr 225 Thr Cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn 235 Thr Lys Val Asp Lys 240
Thr Val Glu Arg Lys 245 Cys Cys Val Glu Cys 250 Pro Pro Cys Pro Ala 255 Pro
Pro Val Ala Gly 260 Pro Ser Val Phe Leu 265 Phe Pro Pro Lys Pro 270 Lys Asp
Thr Leu Met 275 Ile Ser Arg Thr Pro 280 Glu val Thr Cys Val 285 Val Val Asp
Val Ser 290 His Glu Asp Pro Glu 295 Val Gin Phe Asn Trp 300 Tyr Val Asp Gly
Val 305 Glu Val His Asn Ala 310 Lys Thr Lys Pro Arg 315 Glu Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg Val 325 Val Ser Val Leu Thr 330 Val Val His Gin Asp 335 Trp
Leu Asn Gly Lys 340 Glu Tyr Lys Cys Lys 345 Val Ser Asn Lys Gly 350 Leu Pro
Ala Pro Ile 355 Glu Lys Thr Ile Ser 360 Lys Thr Lys Gly Gin 365 Pro Arg Glu
Pro Gin 370 Val Tyr Thr Leu Pro 375 Pro Ser Arg Glu Glu 380 Met Thr Lys Asn
Gin 385 Val Ser Leu Thr Cys 390 Leu Val Lys Gly Phe 395 Tyr Pro Ser Asp Ile 400
- 157 -
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro 410 Glu Asn Asn Tyr Lys 415 Thr
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Gly 425 Ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr val 435 Asp Lys Ser Arg Trp 440 Gin Gin Gly Asn Val 445 Phe Ser Cys
Ser Val 450 Met His Glu Ala Leu 455 His Asn His Tyr Thr 460 Gin Lys Ser Leu
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 50 <211> 473 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Gin Val 20 Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 25 30 Val Lys
Pro Gly Gly Ser Leu 35 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 40 45 Thr Phe
Ser Asp Tyr Tyr Met 50 Ser Trp 55 Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys 60 Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Tyr Ile 70 Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr 75 Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 90 Lys 95 Asn
Ser Leu Tyr Leu Gin 100 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 105 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu 120 125 Tyr Tyr
Tyr Tyr -Tyr Tyr Gly 130 Met Asp 135 Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr 140 Val Thr
Val 145 Ser Ser Ala Ser Thr 150 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro 160
Cys Ser Arg Ser Thr 165 ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 170 Leu 175 Val
Lys Asp Tyr Phe Pro 180 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 185 190 Gly Ala
»« · ·
- 158 -
Leu Thr Ser 195 Gly Val His Thr Phe 200 Pro Ala Val Leu Gin 205 Ser Ser Gly
Leu Tyr 210 Ser Leu Ser Ser Val 215 Val Thr Val Pro Ser 220 Ser Asn Phe Gly
Thr 225 Gin Thr Tyr Thr Cys 230 Asn Val Asp His Lys 235 Pro Ser Asn Thr Lys 240
Val Asp Lys Thr Val 245 Glu Arg Lys Cys Cys 250 Val Glu Cys Pro Pro 255 Cys
Pro Ala Pro Pro 260 Val Ala Gly Pro Ser 265 Val Phe Leu Phe Pro 270 Pro Lys
Pro Lys Asp 275 Thr Leu Met Ile Ser 280 Arg Thr Pro Glu Val 285 Thr Cys Val
Val Val 290 Asp Val Ser His Glu 295 Asp Pro Glu Val Gin 300 Phe Asn Trp Tyr
Val 305 Asp Gly Val Glu Val 310 His Asn Ala Lys Thr 315 Lys Pro Arg Glu Glu 320
Gin Phe Asn Ser Thr 325 Phe Arg Val val Ser 330 Val Leu Thr Val Val 335 His
Gin Asp Trp Leu 340 Asn Gly Lys Glu Tyr 345 Lys Cys Lys Val Ser 350 Asn Lys
Gly Leu Pro 355 Ala Pro Ile Glu Lys 360 Thr Ile Ser Lys Thr 365 Lys Gly Gin
Pro Arg 370 Glu Pro Gin Val Tyr 375 Thr Leu Pro Pro Ser 380 Arg Glu Glu Met
Thr 385 Lys Asn Gin Val Ser 390 Leu Thr Cys Leu Val 395 Lys Gly Phe Tyr Pro 400
Ser Asp xle Ala Val 405 Glu Trp Glu Ser Asn 410 Gly Gin Pro Glu Asn 415 Asn
Tyr * Lys Thr Thr 420 Pro Pro Met Leu Asp 425 Ser Asp Gly Ser Phe 430 Phe Leu
Tyr Ser Lys 435 Leu Thr Val Asp Lys 440 Ser Arg Trp Gin Gin 445 Gly Asn Val
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 • · · ·
- 159 -
<210> 51 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp. Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Phe Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Asp 50 Ile Arg Arg Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala Ser Arg 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
Ile Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Asn 115 Tyr Pro Arg Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Glu 125 Val Glu Ile
Ile Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser val Phe Ile Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 1B5 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 φ φ φ φ φ ·
- 160 <210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Ile Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly 50 Ile Arg Asn Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala Ser Ser 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
Ile Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Ser 115 Tyr Pro Trp Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Val Glu Ile
Lys Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser Val Phe Ile Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210> 53 <211> 326 ··· · · · • ·
- 161 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220>
<221> modifikovaná báze <222> (289) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 53 gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326 <210> 54 <211> 322 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 54= gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaarctect gatcyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 55 <211> 325 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220>
<221> modifikovaná báze <222> (291) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 55 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325
162 <210> 56 <211> 376 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 56 caggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactctg ctgcaaatga gtggaaacta gtcaccgtct tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180 tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 cctcag 376
<210> 57
<211> 358
<212> DNA
<213> Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <220>
<221> modifikovaná báze <222> (337) <223> a, c, t, g, jiná nebo neznámá <400> 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300 ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 358 <210> 58 <211> 418 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 58 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac 180 gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300 ggctreksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360 gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418
- 163 • · · · · · · ··· ·· · · ·· <210> 59 <211> 364 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Kanonická sekvence <400> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300 agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Gly-Ser Linker <400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly .Gly Gly Ser 15 10 15 • · · · • ·
- 164 Protokoly o uložení vzorků biologického materiálu
Hybridom označený v popisu vynálezu 4.9.2.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2789 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 4.17.3.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2793 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
• ·
- 165 Hybridom označený v popisu vynálezu 2.12.1.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2792 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 2.13.2 byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2788 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
• ·
- 166 Hybridom označený v popisu vynálezu 2.14.3 byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2790 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
Hybridom označený v popisu vynálezu 3.1.1.
byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou dne 12. prosince 2000 pod přístupovým číslem PTA 2791 v Americké sbírce mikroorganizmů ATCC s adresou:
American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
United States of America
Vzorek uloženého biologického materiálu je možné zpřístupnit jen nezávislému expertu v souladu se zněním §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Sb.
• · · · • · ♦ • · · · · • · · » · · • · · * • · · · ·
167 -

Claims (4)

1. Humanizovaná, chimérická nebo humánní monoklonální protilátka nebo antigen-vazebná část protilátky, která se specificky váže k receptoru inzulínu podobného růstového faktoru I (IGF-IR).
2. Protilátka nebo její část podle nároku 1, kde IGF-IR je humánní IGF-IR.
3. Protilátka nebo kteréhokoliv z nároků protilátky má alespoň obsahující vlastnosti:
její antigen-vazebná část podle 1 nebo 2, kde protilátka nebo část jednu vlastnost vybranou ze skupiny,
a) neváže se k IGF-IR myši, laboratorního potkana, psa nebo králíka,
b) váže se k IGF-IR cynomolog. opice (Macaca fascicularis) nebo makaka rhesus (Macaca mullata), ale neváže se k IGF-IR marmoseta,
c) inhibuje vazbu IGF-I nebo IGF-II k IGF-IR,
d) má selektivitu pro IGF-IR, která je alespoň 50krát vyšší než je její selektivita pro inzulínový receptor,
e) inhibuje in vivo růst nádorů,
f) způsobuje mizení IGF-IR z buněčného povrchu, když je inkubována s buňkou exprimující IGF-IR,
g) inhibuje IGF-IR-indukovanou fosforylaci tyrosinu,
h) váže se k IGF-IR s Kd 8 χ 10~9 M nebo menší, a
i) má rychlost oddělení od IGF-IR Koff 10“4 nebo menší.
• · · ·
- 168 4. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 3, kde protilátka nebo část protilátky má všechny vyjmenované vlastnosti.
5. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde protilátka nebo její část
má alespoň jednu z vlastností vybranou ze skupiny obsahující vlastnosti: a) zkříženě kompetuje o vazbu k IGF-IR s protilátkou vybranou ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3, b) váže se ke stejnému epitopu IGF-IR jak protilátka vybraná ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
c) váže se ke stejnému antigenu, který je vázán protilátkou vybranou ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
d) váže se k IGF-IR s v podstatě stejnou hodnotou Kd jako protilátka vybraná ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3 a
e) váže se k IGF-IR s v podstatě stejnou rychlostí rozpadu jako protilátka vybraná ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3.
6. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 5, kde protilátka nebo její část má všechny vyjmenované vlastnosti.
Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle • ♦
I · • ·
169 kteréhokoliv z nároků 1-6, kde protilátku nebo jej i část inhibuje vazbu mezi IGF-IR a IGF-I nebo IGF-II s hodnotou IC50 menši než 100 nM.
8. Protilátka nebo jej i antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1-7, kde protilátka nebo její antigenvazebná část obsahuje variabilní úsek κ lehkého řetězce, kde sekvence variabilního úseku κ lehkého řetězce obsahuje ne více než deset aminokyselinových substitucí vzhledem k aminokyselinové sekvenci kódované genem zárodečné linie Vk A30, A27 nebo 012.
9. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 8, kde variabilní úsek κ lehkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, která obsahuje aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 18 a SEKV. ID. Č. 22 nebo aminokyselinové sekvence mající vzhledem k nim 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí.
10. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde protilátka nebo její antigen-vazebná část obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce, kde sekvence variabilního úseku obsahuje ne více než osm aminokyselinových substitucí z aminokyselinové sekvence kódované genem zárodečné linie VH DP47, DP35, DP71 nebo VIV-4.
11. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 10, kde variabilní úsek těžkého řetězce obsahuje aminokyselinovou • · · ·
- 170 sekvenci vybranou ze skupiny, která obsahuje aminokyselinové
sekvence SEKV. ID. Č. 4, S EKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 12, SEKV ID NO: 16, SEKV. ID. Č. 20 a SEKV. ID. Č. 24 nebo aminokyselinové sekvence maj ící proti nim 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí.
12. Protilátka nebo jej i antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kterou je
a) molekula imunoglobulinu G (IgG), IgM, IgE, IgA nebo IgD nebo molekula z ni pocházející, nebo
b) fragment Fab, fragment F(ab’)2, fragment Fv, jednořetězcová protilátka, humanizovaná protilátka, chimérická protilátka nebo bispecifická protilátka.
13. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde protilátka nebo její část obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň jednoho CDR úseku z variabilního úseku, kde variabilní úsek je vybrán ze skupiny obsahuj ící:
a) variabilní úsek lehkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
b) variabilní úsek lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 18 a SEKV ID. Č. 22 nebo aminokyselinovou sekvenci mající vzhledem k nim 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí,
c) variabilní úsek těžkého řetězce protilátky vybrané ze • · • ·
0 ·
- 171 skupiny obsahující 4.9.2 a 4.17.3 a
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
d) variabilní úsek těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 20 a SEKV. ID. Č. 24 nebo aminokyselinovou sekvenci mající vzhledem k nim az aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí.
14. Protilátka nebo její antigen-vazebná část podle nároku 13, kde protilátka nebo její část obsahuje všechny aminokyselinové sekvence CDR úseků variabilního úseku, kde variabilní úsek je vybraný ze skupiny obsahující:
a) variabilní úsek lehkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
b) variabilní úsek lehkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 6, SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. 14, SEKV. ID. Č. 18 a SEKV. ID. Č. 22 nebo aminokyselinovou sekvenci mající ve srovnání s nimi 1 až 10 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí,
c) variabilní úsek těžkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2 a 4.17.3,
d) variabilní úsek těžkého řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 8, SEKV. ID. Č. 12, SEKV. ID. Č. 16, SEKV. ID. Č. 20 a SEKV. ID. Č. 24 nebo aminokyselinovou sekvenci mající ve srovnání s nimi 1 až 10 • * • · · · • · · · · • · · · ·· ··
- 172 aminokyselinových inzercí, delecí nebo substitucí, a
e) variabilní úseky lehkého řetězce a těžkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3.
15. Protilátka podle nároku 1, kde protilátka je vybrána ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a
4.17.3.
16. Protilátka podle nároku 1, kde protilátka obsahuje těžký řetězec a lehký řetězec, přičemž aminokyselinové sekvence lehkého řetězce a těžkého řetězce jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří:
a) aminokyselinová sekvence těžkého řetězce aminokyselinová sekvence lehkého řetězce z 2.12.1,
b) aminokyselinová sekvence těžkého řetězce aminokyselinová sekvence lehkého řetězce z 2.13.2,
c) aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 45 a aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 47 a d) aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 49 a aminokyselinová sekvence SEKV. ID. Č. 51.
17. Protilátka podle nároku 1, kde protilátka má aminokyselinovou sekvenci obsahující aminokyselinové sekvence CDR protilátek 2.12.1 nebo 2.13.2 nebo CDR protilátek majících ne více než 5 konzervativních aminokyselinových substitucí.
18. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím že • · · · · ·
- 173 obsahuje protilátku nebo část protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.
19. Farmaceutický přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že dále obsahuje antineoplázické, chemoterapeutické nebo protinádorové agens.
20. Způsob přípravy protilátky, která se váže k IGF-IR, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
a) imunizace savce jiného než lidského původu imunogenem obsahujícím IGF-IR, kde savec je schopen exprimovat humánní protilátky v B lymfocytech,
b) izolace B lymfocytů ze savce,
c) screening B lymfocytů nebo buněčných linií z nich pocházejících pro identifikaci buněčné linie, která tvoří protilátky, které se vážou k IGF-IR,
d) kultivace buněčné linie, která exprimuje protilátky, které se vážou k IGF-IR a
e) izolace protilátek, které se vážou k IGF-IR, z buněčná linie.
21. Izolovaná buněčná linie, která produkuje protilátku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
22. Buněčná linie podle nároku 21, která produkuje protilátku vybranou ze skupiny, kterou tvoří 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3, nebo protilátku, která má stejné aminokyselinové sekvence.
• · • ·
- 174 23. Způsob diagnózy přítomnosti nebo lokalizace nádoru exprimujícího IGF-IR u pacienta, který to potřebuje, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky
a) injikování protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pacientovi,
b) určení exprese IGF-IR u pacienta tím, že se lokalizuje, kde je protilátka vázána,
c) srovnávat exprese podle bodu (b) s expresní u normálního referenčního pacienta nebo se standardem
d) diagnóza přítomnosti nebo lokalizace nádoru.
24. Způsob léčení karcinomu u člověka pomocí protilátky nebo antigen-vazebné části protilátky, která se specificky váže k IGF-IR, vyznačující se tím, že zahrnuje krok podávání množství protilátky, které je účinné pro léčbu karcinomu, pacientovi.
25. Způsob protilátkou kteréhokoliv zahrnuje krok protilátky.
léčení nebo z nároků 1 až podávání pacienta, který léčení její antigen-vazebnou
17, vyznačující pacientovi účinného potřebuje, s částí podle se tím, že množství
26. Způsob podle kteréhokoliv z vyznačující se tím, že dále antineoplázického, protinádorového, chemoterapeutického agens.
nároků 24 nebo 25, zahrnuje krok podávání antiangiogenního nebo
27. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, který obsahuje
- 175 - sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebná část z protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
28. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 27, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny obsahující:
a) sekvenci nukleové kyseliny kódující alespoň jeden CDR úsek těžkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a
4.17.3,
b) sekvenci nukleové kyseliny kódující tři CDR úseky těžkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a
4.17.3,
c) sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce nebo její antigen-vazebnou část z protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
d) sekvenci nukleové kyseliny kóduj ící alespoň jednu CDR sekvenci lehkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahuj ící2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3, e) sekvenci nukleové kyseliny kóduj ící tři CDR sekvence těžkého řetězce protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1 , 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a
4.17.3,
f) sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce nebo její antigen-vazebné • ·
- 176 • · • · · · ·· ·· části z protilátky vybrané ze skupiny obsahující 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3,
g) sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SEKV. ID. Č. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 a 22 a
h) sekvenci nukleové kyseliny vybranou ze skupiny obsahující SEKV. ID. Č. č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 19, 21 a 23, kde molekula nukleové kyseliny volitelně obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující
aminokyselinovou sekvenci SEKV. ID. Č. 28 nebo SEKV. ID. Č. 26. 29. Vektor obsahuj ící molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 27 nebo 28, kde vektor volitelně
obsahuje expresní kontrolní sekvence operativně spojené s molekulou nukleové kyseliny.
30. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 29 nebo molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 27 nebo
28.
32. Transgenní zvíře jiného než lidského původu obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 27 nebo 28,
31. Způsob přípravy anti-IGF-IR protilátky nebo její antigenvazebná části vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 30 nebo buněčné linie podle nároku 21 za vhodných podmínek a získání protilátky nebo její antigen-vazebné části.
• · · · ·· ··
- 177 přičemž transgenní zvíře jiného než lidského původu exprimuje nukleovou kyselinu.
33. Způsob léčení pacienta, který léčení potřebuje, s protilátkou nebo její antigen-vazebnou částí, která se specificky váže k IGF-IR, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
a) podávání účinného množství izolované molekuly nukleové kyseliny kódující těžký řetězec nebo jeho antigenvazebnou část, izolované molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec nebo jeho antigen-vazebnou část nebo obou molekul nukleové kyseliny kódujících lehký řetězec a těžký řetězec nebo jejich antigen-vazebné části, a
b) exprese molekuly nukleové kyseliny.
CZ20032131A 2001-01-05 2001-12-20 Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku CZ301712B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20032131A3 true CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
CZ301712B6 CZ301712B6 (cs) 2010-06-02

Family

ID=22987016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032131A CZ301712B6 (cs) 2001-01-05 2001-12-20 Protilátka k receptoru IGF-I a farmaceutický prípravek obsahující tuto protilátku

Country Status (52)

Country Link
US (7) US7037498B2 (cs)
EP (4) EP2194067B1 (cs)
JP (4) JP2004531217A (cs)
KR (1) KR100830082B1 (cs)
CN (2) CN1854157B (cs)
AP (1) AP2072A (cs)
AR (1) AR032028A1 (cs)
AT (1) ATE464322T1 (cs)
AU (1) AU2002231368C1 (cs)
BG (3) BG66460B1 (cs)
BR (2) BRPI0116728B1 (cs)
CA (1) CA2433800C (cs)
CR (4) CR7045A (cs)
CU (1) CU23447B7 (cs)
CZ (1) CZ301712B6 (cs)
DE (1) DE60141855D1 (cs)
DK (1) DK1399483T3 (cs)
DZ (1) DZ3494A1 (cs)
EA (1) EA012079B3 (cs)
EC (1) ECSP034711A (cs)
EE (2) EE05724B1 (cs)
ES (1) ES2344592T3 (cs)
GE (1) GEP20084484B (cs)
GT (1) GT200100257A (cs)
HK (1) HK1203521A1 (cs)
HN (1) HN2001000283A (cs)
HR (2) HRP20130659A2 (cs)
HU (1) HUP0302525A2 (cs)
IL (2) IL156661A0 (cs)
IS (1) IS2790B (cs)
MA (1) MA26040A1 (cs)
ME (1) ME00502B (cs)
MX (2) MX349009B (cs)
MY (1) MY143465A (cs)
NO (1) NO339789B1 (cs)
NZ (2) NZ527302A (cs)
OA (1) OA12589A (cs)
PA (1) PA8535501A1 (cs)
PE (1) PE20020801A1 (cs)
PL (3) PL217921B1 (cs)
PT (1) PT1399483E (cs)
PY (1) PY0132240A (cs)
RS (1) RS51373B (cs)
SG (1) SG138469A1 (cs)
SK (1) SK287954B6 (cs)
SV (1) SV2007000775A (cs)
TN (1) TNSN01177A1 (cs)
TW (1) TWI324609B (cs)
UA (1) UA87804C2 (cs)
UY (2) UY27087A1 (cs)
WO (1) WO2002053596A2 (cs)
ZA (1) ZA200305995B (cs)

Families Citing this family (308)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0116728B1 (pt) 2001-01-05 2018-10-30 Pfizer Inc. anticorpos para receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina
PH12012502440A1 (en) 2001-06-26 2013-06-17 Amgen Inc Antibodies to opgl
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
DE60312639T2 (de) * 2002-01-18 2007-11-29 Pierre Fabre Médicament Antikörper gegen igf-ir und ihre verwendungen
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
WO2003097805A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
US7217796B2 (en) 2002-05-24 2007-05-15 Schering Corporation Neutralizing human anti-IGFR antibody
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
WO2004031347A2 (en) * 2002-09-24 2004-04-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
AU2004212344B2 (en) * 2003-02-13 2009-05-07 Pfizer Products Inc. Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
WO2004083248A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-30 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
EP1613658B1 (en) * 2003-04-02 2012-03-14 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1479695B1 (en) * 2003-05-14 2010-02-17 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
MXPA06001634A (es) * 2003-08-13 2006-04-28 Pfizer Prod Inc Anticuerpos humanos modificados igf-1r.
EP1676862B1 (en) * 2003-09-24 2010-12-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
WO2005032476A2 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cpg15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
JP2007510434A (ja) 2003-11-12 2007-04-26 シェーリング　コーポレイション 多重遺伝子発現のためのプラスミドシステム
PE20050928A1 (es) * 2003-11-21 2005-11-08 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti-igfr1
BRPI0417406A (pt) * 2003-12-08 2007-04-03 Immunogen Inc anticorpo do receptor anti-igf-i
CN1997382A (zh) * 2004-05-05 2007-07-11 梅里麦克制药股份有限公司 调节生物活性的双特异性结合剂
KR20070036130A (ko) 2004-07-16 2007-04-02 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 항-아이지에프-1알 항체를 사용하는 비-혈액학적악성종양에 대한 조합 치료
FR2873699B1 (fr) 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
EP2283831A3 (en) 2004-12-03 2013-10-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Biomakers for pre-selection of patients for anti-IGF1R therapy
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
CA2603093A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
WO2006113483A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Schering Corporation Methods and compositions for treating or preventing cancer
CA2763671A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
MX2007015476A (es) * 2005-06-14 2008-02-25 Amgen Inc Formulaciones de proteina autoamortiguadoras.
KR20080019249A (ko) * 2005-06-15 2008-03-03 쉐링 코포레이션 안정한 항체 제형
CA2612449A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Imclone Systems Incorporated Receptor antagonists for treatment of metastatic bone cancer
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
CA2621371C (en) 2005-09-07 2018-05-15 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies to activin receptor-like kinase-1
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
WO2007062037A2 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Laboratoires Serono Sa Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
ES2385054T3 (es) 2005-12-13 2012-07-17 Medimmune Limited Proteínas de unión específicas para factores de crecimiento de tipo insulina y usos de las mismas
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
WO2009051846A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
SI2671954T1 (sl) 2006-01-20 2018-11-30 Cell Signaling Technology, Inc. Translokacija in mutantna ROS kinaza v človeškem ne-drobnoceličnem karcinomu pljuč
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
JP5198289B2 (ja) 2006-02-03 2013-05-15 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 前立腺癌の治療用アジュバントとしてのｉｇｆ−ｉｒアンタゴニスト
US7884078B2 (en) * 2006-02-10 2011-02-08 Massachusetts Institute Of Technology CPG15 compounds as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists
US7612178B2 (en) * 2006-03-28 2009-11-03 Biogen Idec Ma Inc Anti-IGF-1R antibodies and uses thereof
WO2007110339A1 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-igf-1r human monoclonal antibody formulation
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
EP2450437B1 (en) 2006-04-14 2017-05-17 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
EA200802058A1 (ru) 2006-05-09 2009-06-30 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции
US20080112888A1 (en) 2006-06-30 2008-05-15 Schering Corporation Igfbp2 biomarker
CA2672828A1 (en) 2006-12-13 2008-06-26 Schering Corporation Methods of treatment
US20090068110A1 (en) * 2006-12-22 2009-03-12 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
MX2009008754A (es) * 2007-02-14 2009-11-02 Glaxo Group Ltd Anticuerpos novedosos contra igf-1r.
ATE530907T1 (de) * 2007-02-27 2011-11-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur beurteilung der hemmungsaktivität von antikörpern gegen insulinartigen wachstumsfaktor-1-rezeptor
US20100166747A1 (en) * 2007-03-02 2010-07-01 Beltran Pedro J Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
CA2683559C (en) 2007-04-13 2019-09-24 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer resistant to erbb therapeutics
EP2145021A2 (en) 2007-05-17 2010-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
CA2697612A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-igf-1r antibodies and uses thereof
CA2697922A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
CA2698103A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
EP2205280B1 (en) * 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
DK2851374T3 (en) 2007-12-14 2017-06-19 Bristol Myers Squibb Co Binding molecules to the human OX40 receptor
CN101903401B (zh) 2007-12-21 2013-06-05 罗切格利卡特公司 抗体的稳定性试验
CA2718918A1 (en) * 2008-03-25 2009-11-26 Schering Corporation Methods for treating or preventing colorectal cancer
BRPI0910482A2 (pt) 2008-04-29 2019-09-24 Abbott Lab imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
BRPI0913366A8 (pt) 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
NZ603698A (en) 2008-07-08 2014-03-28 Abbvie Inc Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
ES2378513T3 (es) 2008-08-06 2012-04-13 Pfizer Inc. Compuestos 2-heterociclilamino piracinas sustituidas en posición 6 como inhibidores de CHK-1
NZ592151A (en) 2008-12-12 2012-10-26 Boehringer Ingelheim Int Anti-igf antibodies
AU2010213578B2 (en) 2009-02-12 2015-01-29 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ROS expression in human cancer
EP3912643B8 (en) 2009-02-13 2023-08-23 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
CN102481361B (zh) 2009-04-16 2014-10-22 默沙东公司 用于治疗癌症的组合物和方法
JP5766179B2 (ja) * 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
BR112012000536A2 (pt) 2009-07-08 2020-08-11 Kymab Limited métodos para produção de anticorpo ou cadeia leve ou pesada de anticorpo específico para um antígeno desejado, para produção de anticorpo ou cadeia de anticorpo e seu uso, composição farmacêutica e derivado de anticorpo quimérico
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP3009455A1 (en) 2009-09-16 2016-04-20 Immunomedics Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
WO2011051231A1 (en) 2009-10-26 2011-05-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
SI2501817T2 (sl) 2010-02-08 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z navadno lahko verigo
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
BR112012029611A2 (pt) 2010-05-21 2017-07-25 Merrimack Pharmaceuticals Inc proteína de fusão biespecífica, composição farmacêutica, método de tratamento de dano ao tecido em um indivíduo, método de promoção da regeração ou sobrevivência do tecido em um indivíduo e molécula de ácido nucleico
WO2011156373A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2012007896A1 (en) 2010-07-12 2012-01-19 Covx Technologies Ireland, Ltd. Multifunctional antibody conjugates
US8735546B2 (en) 2010-08-03 2014-05-27 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
PE20140229A1 (es) 2010-08-26 2014-03-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
PT2614082T (pt) 2010-09-09 2018-12-03 Pfizer Moléculas de ligação a 4-1bb
UA114592C2 (uk) * 2010-09-28 2017-07-10 Ноно Інк. Пептид nd2 та спосіб лікування неврологічного захворювання
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
EP2643694B1 (en) 2010-11-24 2018-01-03 Litron Laboratories Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
CA2825894C (en) 2011-02-02 2021-11-30 Amgen Inc. Prognosis of cancer using a circulating biomarker
MX2013009151A (es) 2011-02-10 2013-08-29 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada.
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
CN105884900A (zh) * 2011-04-19 2016-08-24 梅里麦克制药股份有限公司 单特异性和双特异性抗igf-1r和抗erbb3抗体
DK2699598T3 (en) 2011-04-19 2019-04-23 Pfizer COMBINATIONS OF ANTI-4-1BB ANTIBODIES AND ADCC-INducing ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER
EP2699293B8 (en) 2011-04-20 2022-07-20 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
AU2012250924B2 (en) 2011-05-02 2017-05-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
RS59728B1 (sr) 2011-08-05 2020-02-28 Regeneron Pharma Humanizovani miševi univerzalnog lakog lanca
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
BR112014006394A2 (pt) * 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
WO2013056069A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
ES2675035T3 (es) 2011-10-14 2018-07-05 Amgen, Inc Inyector y método de ensamblaje
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
SG10201603411WA (en) 2011-10-28 2016-07-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
CA2852127C (en) 2011-11-11 2020-10-27 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
AR089529A1 (es) 2011-12-30 2014-08-27 Abbvie Inc Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
DK2838998T3 (en) 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
AU2013255511B2 (en) 2012-05-04 2016-01-28 Pfizer Inc. Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
CN104994872B (zh) 2012-06-21 2018-09-14 索伦托治疗有限公司 与igf1r结合的抗原结合蛋白
KR102165464B1 (ko) 2012-07-19 2020-10-14 레드우드 바이오사이언스 인코포레이티드 Cd22에 대해 특이적인 항체 및 이들의 사용 방법
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
KR20180008921A (ko) 2012-11-01 2018-01-24 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP3656426B1 (en) 2012-11-21 2023-05-17 Amgen Inc. Drug delivery device
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP6272897B2 (ja) 2012-11-29 2018-01-31 ケモセントリックス，インコーポレイティド Ｃｘｃｒ７アンタゴニスト
SI2900277T1 (sl) 2012-12-13 2022-05-31 Immunomedics, Inc. Odmerki imunokonjugatov protiteles in SN-38 za boljšo učinkovitost in zmanjšano toksičnost
TW201444872A (zh) 2013-03-06 2014-12-01 Merrimack Pharmaceuticals Inc 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
SG11201507417RA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Body contour adaptable autoinjector device
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
CA2904661C (en) 2013-03-15 2022-03-15 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
IL292270B2 (en) 2013-03-22 2024-04-01 Amgen Inc Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
ES2774976T3 (es) 2013-04-29 2020-07-23 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anticuerpos anti-CD38 y fusiones con interferón alfa-2b atenuado
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
EP3007704B1 (en) * 2013-06-13 2021-01-06 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy for acromegaly
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3712166A1 (en) 2013-09-05 2020-09-23 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle
MX373358B (es) 2013-10-24 2020-07-06 Amgen Inc Inyector y método de montaje.
ES3062706T3 (en) 2013-10-24 2026-04-13 Amgen Inc Drug delivery system with temperature-sensitive control
JP6835590B2 (ja) 2014-01-12 2021-02-24 アイジーエフ オンコロジー、 エルエルシー インスリン様成長因子−１および上皮増殖因子を含む融合タンパク質およびそのバリアントならびにその使用
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015126548A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
KR102276752B1 (ko) 2014-03-21 2021-07-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
KR102496507B1 (ko) 2014-05-07 2023-02-03 암겐 인코포레이티드 충격 감소 요소들을 가진 자동 주사기
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
US20170103186A1 (en) 2014-06-03 2017-04-13 Amgen Inc. Systems and methods for supporting patient use of a drug delivery device
WO2015200260A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
CN117138060A (zh) 2014-10-07 2023-12-01 免疫医疗公司 抗体-药物缀合物的新辅助剂用途
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
CA2965414C (en) 2014-10-29 2024-01-09 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon .alpha.2.beta. variants
EP3220959A1 (en) 2014-11-19 2017-09-27 ImmunoGen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016100781A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
TW201632559A (zh) * 2015-02-22 2016-09-16 索倫多醫療公司 結合ｃｄ１３７之抗體治療劑
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
WO2016172427A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP4257134A3 (en) 2015-06-25 2024-01-24 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
PL3316885T3 (pl) 2015-07-01 2021-12-06 Immunomedics, Inc. Immunokoniugaty przeciwciało-sn-38 z linkerem cl2a
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CN115960249A (zh) 2015-10-02 2023-04-14 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
KR102783230B1 (ko) 2015-11-09 2025-03-19 알.피.쉐러 테크놀러지즈 엘엘씨 항-cd22 항체-메이탄신 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
SG11201806478PA (en) 2016-02-05 2018-08-30 Immunogen Inc Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
JP6987072B2 (ja) 2016-03-10 2021-12-22 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド アクチビン２型受容体結合タンパク質及びその使用
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
AU2017345490B2 (en) 2016-10-21 2022-07-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
US12049493B2 (en) 2017-01-06 2024-07-30 Abl Bio Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and uses thereof
US20190358411A1 (en) 2017-01-17 2019-11-28 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
WO2018164829A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
AU2018235928B2 (en) 2017-03-14 2023-09-21 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
SG11201907676PA (en) 2017-03-28 2019-09-27 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system and method
WO2018217669A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
IL273323B2 (en) 2017-10-09 2024-10-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
AU2018354418B2 (en) * 2017-10-27 2025-09-11 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
JP2021501616A (ja) 2017-11-06 2021-01-21 アムジエン・インコーポレーテツド 配置及び流量検出を備える薬物送達デバイス
IL273664B1 (en) 2017-11-06 2026-02-01 Amgen Inc Full-fledged assemblies and related methods
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
EP3710089A1 (en) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
US12071483B1 (en) 2017-12-14 2024-08-27 Abl Bio Inc. Bispecific antibody to alpha-synuclein/insulin-like growth factor 1 receptor and use thereof
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
BR112020019559A2 (pt) 2018-03-26 2021-01-12 Amgen Inc. Glicoformas afucosiladas totais de anticorpos produzidos em cultura de células
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
EP3826699A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
MA53718A (fr) 2018-09-28 2022-01-05 Amgen Inc Ensemble d'activation d'échappement de fil de muscle pour un dispositif d'administration de médicament
TWI857975B (zh) 2018-10-02 2024-10-11 美商安進公司 具有內部力傳遞的用於藥物遞送之注射系統
TW202529830A (zh) 2018-10-05 2025-08-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
EP3873566B1 (en) 2018-11-01 2024-11-27 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
AU2019370159B2 (en) 2018-11-01 2025-05-29 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
TWI850288B (zh) * 2018-12-03 2024-08-01 日商帝人製藥股份有限公司 抗ｉｇｆ－ｉ受體人源化抗體
MX2021006915A (es) 2018-12-12 2021-08-24 Chemocentryx Inc Inhibidores de cxcr7 para el tratamiento de cancer.
CA3120800A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Revitope Limited Twin immune cell engager
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
JP2022533956A (ja) 2019-05-14 2022-07-27 プロメテウス バイオサイエンシーズ，インク． Ｔｌ１ａ患者を選択する方法、システム、およびデバイス
JP7608439B2 (ja) 2019-08-23 2025-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
BR112022003663A2 (pt) 2019-08-28 2022-05-24 Horizon Therapeutics Ireland Dac Método para tratar oftalmopatia tireoidiana (ted) em um indivíduo com ted; método para reduzir proptose em pelo menos 2 mm em um indivíduo com oftalmopatia tireoidiana (ted); método para tratar ou reduzir a gravidade de diplopia em um indivíduo com oftalmopatia tireoidiana (ted); método para tratar ou reduzir a gravidade de oftalmopatia tireoidiana (ted); método para reduzir proptose em um olho em um indivíduo com oftalmopatia tireoidiana (ted); método para reduzir pontuação de atividade clínica (cas) de oftalmopatia tireoidiana (ted); método para a) reduzir proptose em pelo menos 2 mm e b) reduzir a pontuação de atividade clínica (cas) em um indivíduo com oftalmopatia tireoidiana (ted); e método para melhorar a qualidade de vida em um indivíduo com oftalmopatia tireoidiana (ted)
MX2022003461A (es) 2019-09-26 2022-04-19 Amgen Inc Metodos de produccion de composiciones de anticuerpos.
TW202200622A (zh) 2020-05-13 2022-01-01 瑞士商天演藥業公司 用於治療癌症之組成物及方法
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN119792512A (zh) 2020-10-14 2025-04-11 维里迪安治疗公司 用于治疗甲状腺眼病的组合物和方法
AU2021360897A1 (en) 2020-10-15 2023-05-25 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
WO2022161314A1 (zh) 2021-01-27 2022-08-04 信达生物制药(苏州)有限公司 针对cd16a的单域抗体及其用途
EP4305069A4 (en) * 2021-03-08 2025-01-01 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66E POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
US20250073349A1 (en) 2021-05-10 2025-03-06 Kawasaki Institute Of Industrial Promotion Antibody having reduced binding affinity for antigen
KR20240011135A (ko) 2021-05-21 2024-01-25 암젠 인크 약물 용기를 위한 충전 레시피를 최적화하는 방법
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
TW202320850A (zh) 2021-08-10 2023-06-01 美商維里迪恩醫療股份有限公司 用於治療甲狀腺眼病之組合物、劑量及方法
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
KR20250169596A (ko) * 2023-04-04 2025-12-03 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 항-igf1r 항체 및 이의 용도
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025014774A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating active and chronic thyroid eye disease
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
EP1690934A3 (en) * 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE352612T1 (de) 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
EP0580752A4 (en) 1991-04-19 1994-08-24 Mannheim Gmbh Boehringer Human bone derived insulin like growth factor binding protein
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
DE69424687T2 (de) 1993-03-09 2000-09-07 Genzyme Corp., Cambridge Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
DK0821671T3 (da) 1995-04-20 2001-04-23 Pfizer Arylsulfonylhydroxamsyrederivater som MMP- og TNF-inhibitorer
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
CA2219361C (en) * 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
EP0861267A4 (en) * 1995-11-14 2000-02-02 Univ Jefferson INDUCTION AND RESISTANCE TO TUMOR GROWTH BY MEANS OF SOLUBLE IGF-1
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DE69624081T2 (de) 1995-12-20 2003-06-12 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Matrix-metalloprotease Inhibitoren
US6291455B1 (en) 1996-03-05 2001-09-18 Zeneca Limited 4-anilinoquinazoline derivatives
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
ID19609A (id) 1996-07-13 1998-07-23 Glaxo Group Ltd Senyawa-senyawa heterosiklik
ES2191187T3 (es) 1996-07-13 2003-09-01 Glaxo Group Ltd Compuestos heteroaromaticos biciclicos como inhibidores de la proteina tirosin-quinasa.
EP0923585B1 (en) 1996-07-18 2002-05-08 Pfizer Inc. Phosphinate based inhibitors of matrix metalloproteases
WO1998007697A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Pfizer Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
WO1998030566A1 (en) 1997-01-06 1998-07-16 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
EP0977733B1 (en) 1997-02-03 2003-09-03 Pfizer Products Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
EA002546B1 (ru) 1997-02-11 2002-06-27 Пфайзер Инк. Производные арилсульфонилгидроксамовой кислоты
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
CA2291709A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
AU730248B2 (en) 1997-08-08 2001-03-01 Pfizer Products Inc. Aryloxyarylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
WO1999010349A1 (en) 1997-08-22 1999-03-04 Zeneca Limited Oxindolylquinazoline derivatives as angiogenesis inhibitors
WO1999016755A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
CA2309690A1 (en) 1997-11-11 1999-05-20 Pfizer Products Inc. Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
EA005032B1 (ru) 1998-05-29 2004-10-28 Сьюджен, Инк. Пирролзамещенные 2-индолиноны (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, способ лечения или профилактики нарушения в организме, связанного с протеинкиназой
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
DK1004578T3 (da) 1998-11-05 2004-06-28 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidin-2-carboxylsyrehydroxamidderivater
DK1141028T3 (da) 1998-12-23 2010-05-25 Pfizer Humane monoklonale antistoffer til CTLA-4
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
SI2168984T1 (sl) 1999-03-25 2012-12-31 Abbott Gmbh & Co. Kg Človeška protitelesa za vezavo IL-12 in postopki izdelave
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
BRPI0116728B1 (pt) * 2001-01-05 2018-10-30 Pfizer Inc. anticorpos para receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina
PH12012502440A1 (en) 2001-06-26 2013-06-17 Amgen Inc Antibodies to opgl
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
MXPA06001634A (es) * 2003-08-13 2006-04-28 Pfizer Prod Inc Anticuerpos humanos modificados igf-1r.
MX350383B (es) 2004-01-09 2017-09-04 Pfizer Anticuerpos contra madcam.
US9697529B2 (en) 2012-03-13 2017-07-04 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
UY27087A1 (es) 2002-06-20
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
TWI324609B (en) 2010-05-11
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
US7815907B2 (en) 2010-10-19
IL156661A (en) 2008-11-26
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
GEP20084484B (en) 2008-09-25
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
PY0132240A (es) 2004-06-01
EE200300318A (et) 2003-10-15
OA12589A (en) 2006-06-08
YU54203A (sr) 2006-03-03
NO339789B1 (no) 2017-01-30
CR7045A (es) 2005-09-02
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
US7700742B2 (en) 2010-04-20
EE05715B1 (et) 2014-06-16
PT1399483E (pt) 2010-07-20
CR10786A (es) 2009-06-04
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
IS6866A (is) 2003-07-04
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
ECSP034711A (es) 2003-10-28
NZ569856A (en) 2010-03-26
SG138469A1 (en) 2008-01-28
US8642037B2 (en) 2014-02-04
MY143465A (en) 2011-05-13
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
US9234041B2 (en) 2016-01-12
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
IL156661A0 (en) 2004-01-04
CR10134A (es) 2010-09-14
CR20140001A (es) 2014-02-05
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
BG112197A (bg) 2016-05-31
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
CN1854157A (zh) 2006-11-01
NO20033074L (no) 2003-07-04
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
CN1330668C (zh) 2007-08-08
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
AR032028A1 (es) 2003-10-22
EE05724B1 (et) 2014-10-15
BR0116728A (pt) 2005-04-12
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
ZA200305995B (en) 2004-08-04
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
CN1854157B (zh) 2013-01-02
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
NZ527302A (en) 2006-10-27
RS51373B (sr) 2011-02-28
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
CU23447B7 (es) 2009-10-16
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
SV2007000775A (es) 2007-03-15
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
CN1564829A (zh) 2005-01-12
PL366340A1 (en) 2005-01-24
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
GT200100257A (es) 2002-09-02
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
EE201300037A (et) 2014-04-15
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
ME00502B (me) 2011-10-10
MX337162B (es) 2016-02-15
US7982024B2 (en) 2011-07-19
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
AP2072A (en) 2009-12-10
BG108037A (bg) 2005-04-30
MX349009B (es) 2017-07-06
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
US7037498B2 (en) 2006-05-02
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
JP2015057428A (ja) 2015-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2433800C (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
HK1072059B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
HK1098162B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20191220