ES2601839T3

ES2601839T3 - Análogos de insulina resistentes a proteasas

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Publication number: ES2601839T3
Application number: ES07820423.7T
Authority: ES
Inventors: Peter Kresten Nielsen; Frantisek Hubalek; Inger Lautrup-Larsen; Svend Ludvigsen; Ulla Ribel-Madsen; Per Balschmidt; Per NØRGAARD; Svend Havelund
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2027-09-20
Also published as: JP5864834B2; MX2009002999A; EP2074141B1; CN101541830A; EP2074141A1; AU2007298919A1; PL2074141T3; BRPI0717098A2; HUE029512T2; PT2074141T; WO2008034881A1; CA2663074A1; KR20090071561A; KR20150031494A; US20100009898A1; KR101729986B1; ZA200901838B; IL197609A0; NO20091563L; EP2404934A1

Abstract

Un análogo de insulina que está estabilizado frente a la degradación por parte de una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por: pepsina, quimotripsina, tripsina, enzima degradadora de insulina (IDE), elastasa, carboxipeptidasa, aminopeptidasa y catepsina D respecto a la insulina humana, donde el aminoácido en la posición A14 es Glu, Asp o His, el aminoácido en la posición B25 es His y que comprende además opcionalmente una o más mutaciones adicionales, y donde T1/2 se incrementa al menos dos veces con relación a la insulina original.

Description

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donde la secuencia de aminoácidos de la cadena A y la secuencia de aminoácidos de la cadena B están conectadas mediante puentes de disulfuro entre las cisteínas en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, y entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B y donde las cisteínas en la posición 6 y 11 de la cadena A están conectadas mediante un puente de disulfuro.

Realización 19. Un análogo de insulina de acuerdo con la realización 18, donde XaaA8 se selecciona independientemente entre Thr e His; XaaA12 se selecciona independientemente entre Ser y Glu; XaaA13 se selecciona independientemente entre Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser y Glu; XaaA14 se selecciona independientemente entre Asp, His y Glu; XaaA15 se selecciona independientemente entre Gln y Glu; XaaA18 se selecciona independientemente entre Asn, Lys y Gln; XaaA21 se selecciona independientemente entre Asn y Gln; XaaB1 se selecciona independientemente entre Phe y Glu; XaaB3 se selecciona independientemente entre Asn y Gln; XaaB4 se selecciona independientemente entre Gln y Glu; XaaB10 se selecciona independientemente entre His, Asp, Pro y Glu; XaaB16 se selecciona independientemente entre Tyr, Asp, Gln, His, Arg y Glu; XaaB24 se selecciona independientemente entre Phe e His; XaaB26 se selecciona independientemente entre Tyr, Thr, Gly y Asp; XaaB27 se selecciona independientemente entre Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg y Glu; XaaB28 se selecciona independientemente entre Pro, Gly y Asp; XaaB29 se selecciona independientemente entre Lys y Gln; XaaB30 está ausente o es Thr; el extremo C se puede derivatizar opcionalmente como una amida; donde la secuencia de aminoácidos de la cadena A y la secuencia de aminoácidos de la cadena B están conectadas

mediante puentes de disulfuro entre las cisteínas en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, y entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B y donde las cisteínas en la posición 6 y 11 de la cadena A están conectadas mediante un puente de disulfuro.

Realización 20. Un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-16, donde el extremo C de la cadena B está conectado al extremo N de la cadena A con 3-15 aminoácidos o 3-7 aminoácidos, para formar una molécula de insulina monocatenaria, donde opcionalmente el extremo N de la cadena B se extiende con 1-10 aminoácidos.

Realización 21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente activa del análogo de

insulina de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-20 y un portador farmacéuticamente aceptable. Realización 22. Una composición farmacéutica que comprende dos o más análogos de insulina de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-20, donde cada análogo se define por tener al menos una mutación, la cual está ausente en al menos una de las demás variantes.

Realización 23. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11-20, que

comprende además un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante. Realización 24. Un método para el tratamiento de la diabetes mellitus en un sujeto que comprende administrar a un sujeto un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-20 o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 2121-23.

Realización 25. Un método para reducir el nivel de glucosa en sangre en mamíferos mediante la administración a un paciente que necesite dicho tratamiento de una dosis terapéuticamente activa de un análogo de insulina de acuerdo

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un derivado de insulina donde se ha unido una cadena de tetradecanoílo a la posición Nε de la lisina en la posición B29 de insulina humana des(B30).

En una realización, una insulina original de acuerdo con la invención se selecciona del grupo constituido por:

insulina humana;

insulina humana desB30;

insulina humana AspB28;

insulina humana AspB28,desB30;

insulina humana LysB3,GluB29;

insulina humana LysB28,ProB29;

insulina humana GlyA21, ArgB31, ArgB32; e

insulina humana desB30, ArgB31, ArgB32.

La expresión "análogo de insulina", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una insulina modificada, donde se han sustituido uno o más residuos aminoacídicos de la insulina por otros residuos aminoacídicos y/o donde se han eliminado uno o más residuos aminoacídicos de la insulina y/o donde se han añadido uno o más residuos aminoacídicos a la insulina.

En una realización, un análogo de insulina comprende menos de 8 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En una realización, un análogo de insulina comprende menos de 7 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En una realización, un análogo de insulina comprende menos de 6 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En otra realización, un análogo de insulina comprende menos de 5 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En otra realización, un análogo de insulina comprende menos de 4 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En otra realización, un análogo de insulina comprende menos de 3 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original. En otra realización, un análogo de insulina comprende menos de 2 modificaciones (sustituciones, deleciones, adiciones) respecto a la insulina original.

La expresión "derivado de insulina", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una insulina original modificada químicamente o un análogo de esta, donde al menos un sustituyente no está presente en la proteína original o un análogo de esta, es decir, una proteína original que se ha modificado covalentemente. Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres, PEGilaciones y similares. Algunos ejemplos de derivados de insulina humana de acuerdo con la invención son insulina humana éster metílico de la treonina-B30, insulina humana Nε-B29-tetradecanoílo des(B30), insulina humana Nε-B29-tetradecanoílo GlnB3 des(B30), insulina humana Nε-B29-tridecanoílo, insulina humana Nε-B29-tetradecanoílo, insulina humana Nε-B29-decanoílo e insulina humana Nε-B29-dodecanoílo.

La expresión "insulina humana", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la hormona humana cuya estructura y propiedades son muy conocidas. La insulina humana contiene dos cadenas polipeptídicas que están conectadas mediante puentes de disulfuro entre los residuos de cisteína, a saber la cadena A y la cadena B. La cadena A es un péptido de 21 aminoácidos y la cadena B es un péptido de 30 aminoácidos, estando las dos cadenas conectadas mediante tres puentes de disulfuro: uno entre las cisteínas en la posición 6 y 11 de la cadena A, el segundo entre la cisteína en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, y el tercero entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B.

Las mutaciones en la molécula de insulina se denominan indicando la cadena (A o B), la posición y el código de tres letras para el aminoácido que sustituye al aminoácido nativo. El término "desB30" se refiere a una cadena B de insulina natural o un análogo de esta que carece del aminoácido B30. De este modo, la insulina humana A21Gly, B28Asp, desB30 es un análogo de la insulina humana en el que la posición 21 en la cadena A se ha mutado para obtener glicina, la posición 28 en la cadena B se ha mutado para obtener ácido aspártico y la posición 30 en la cadena B se ha eliminado.

Una "proteasa" o una "enzima de tipo proteasa" es una enzima digestiva que degrada proteínas y péptidos y la cual se encuentra en varios tejidos del cuerpo humano tales como, p. ej., el estómago (pepsina), el lumen intestinal (quimotripsina, tripsina, elastasa, carboxipeptidasas, etc.) o superficies mucosas del aparato GI (aminopeptidasas, carboxipeptidasas, enteropeptidasas, dipeptidilpeptidasas, endopeptidasas, etc.), el hígado (enzima degradadora de insulina, catepsina D, etc.) y en otros tejidos.

En la presente, se debe sobreentender que un análogo de insulina proteolíticamente estable es un análogo de insulina que experimenta una degradación más lenta por parte de una o más proteasas en comparación con la

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insulina humana. En una realización, un análogo de insulina proteolíticamente estable de acuerdo con la invención experimenta una degradación más lenta por parte de una o más proteasas en comparación con la insulina original. En una realización adicional de la invención, un análogo de insulina de acuerdo con la invención está estabilizado frente a la degradación por parte de una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por: pepsina (tal como,

p. ej., las isoformas pepsina A, pepsina B, pepsina C y/o pepsina F), quimotripsina (tal como, p. ej., las isoformas quimotripsina A, quimotripsina B y/o quimotripsina C), tripsina, enzima degradadora de insulina (IDE), elastasa (tal como, p. ej., las isoformas elastasa pancreática I y/o II), carboxipeptidasa (p. ej., las isoformas carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa A2 y/o carboxipeptidasa B), aminopeptidasa, catepsina D y otras enzimas presentes en extractos intestinales derivados de rata, cerdo o de ser humano.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención está estabilizado frente a la degradación por parte de una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por: quimotripsina, tripsina, enzima degradadora de insulina (IDE), elastasa, carboxipeptidasas, aminopeptidasas y catepsina D. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención está estabilizado frente a la degradación por parte de una o más enzimas seleccionadas del grupo constituido por: quimotripsina, carboxipeptidasas e IDE. En una realización adicional más, un análogo de insulina de acuerdo con la invención está estabilizado frente a la degradación por parte de una o más enzimas seleccionadas entre: quimotripsina y carboxipeptidasas.

Se puede determinar T½ según se describe en los Ejemplos como una medida de la estabilidad proteolítica de un análogo de insulina de acuerdo con la invención frente a enzimas tipo proteasa tales como quimotripsina, pepsina y/o carboxipeptidasa A. En una realización de la invención T½ se incrementa al menos 2 veces respecto a la insulina original. En una realización adicional más, T½ se incrementa al menos 3 veces respecto a la insulina original. En una realización adicional más, T½ se incrementa al menos 4 veces respecto a la insulina original. En una realización adicional más, T½ se incrementa al menos 5 veces respecto a la insulina original. En una realización adicional más, T½ se incrementa al menos 10 veces respecto a la insulina original.

Se debe sobreentender que los sitios de escisión de proteasas (también denominados en la presente sitios de proteasas) son residuos aminoacídicos que son reconocidos por proteasas y/o residuos aminoacídicos cuyo enlace peptídico es escindido por proteasas. Los sitios de escisión de proteasas se pueden determinar estableciendo los "puntos clave" de escisión mediante análisis de HPLC, MS o LC-MS y/o mediante predicción basada en la especificidad enzimática de la enzima de tipo proteasa para la cual se ha de determinar el sitio de escisión de proteasas. Un experto en la técnica sabrá cómo determinar los sitios de escisión de proteasas, por ejemplo, basándose en las especificidades enzimáticas como, por ejemplo, se describe en Handbook of Proteolytical Enzymes, 2.a ed., editores Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F., Elsevier Academic Press 2004. Por ejemplo, se predice que la quimotripsina escindirá enlaces peptídicos en el extremo C respecto a residuos aromáticos (Trp, Tyr, Phe o Leu), que no vayan seguidos de Pro. De forma similar, se predice que la tripsina escindirá enlaces peptídicos en el extremo C respecto a residuos básicos de Lys o Arg que no vayan seguidos de Pro, se predice que la elastasa escindirá residuos en el extremo C respecto a Ala, Val, Gly o Ser y que la carboxipeptidasa A eliminará cualquier aminoácido en el extremo C que no sea Arg, Lys o Pro. Se predice que la enzima degradadora de insulina (IDE) escindirá las siguientes posiciones de la insulina humana: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 y A14-15.

En la presente, la expresión "sustituir (un) aminoácido en un sitio de escisión de proteasas o cerca de él" se utiliza para indicar la sustitución de un aminoácido en una posición de la insulina original que se ha determinado que es un sitio de escisión de proteasas o cerca de ella. En una realización, se sustituyen dos o más aminoácidos hidrófobos en dos o más sitios de proteasas o cerca de ellos en una insulina, donde dichos aminoácidos hidrófobos se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En una realización adicional, dos o más aminoácidos hidrófobos en dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En otra realización adicional, dos o más aminoácidos hidrófobos situados a continuación de dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En una realización adicional más, dos o más aminoácidos hidrófobos situados dos aminoácidos más allá de dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En otra realización adicional, dos o más aminoácidos hidrófobos situados tres aminoácidos más allá de dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En una realización adicional más, dos o más aminoácidos hidrófobos situados hasta cuatro aminoácidos más allá de dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En otra realización adicional, dos o más aminoácidos hidrófobos situados uno, dos o tres aminoácidos más allá de o en dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En una realización adicional más, dos o más aminoácidos hidrófobos situados uno o dos aminoácidos más allá de o en dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos. En otra realización adicional, dos o más aminoácidos hidrófobos situados a continuación de o en dos o más sitios de proteasas en una insulina se sustituyen con aminoácidos hidrófilos.

Un análogo de insulina de acuerdo con la invención puede tener una carga neta diferente a la carga neta de la insulina original. En una realización, la carga neta de un análogo de insulina de acuerdo con la invención es más positiva que la carga neta de la insulina original. En una realización, la carga neta de un análogo de insulina de acuerdo con la invención es más negativa que la carga neta de la insulina original. En una realización, la carga neta positiva media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre 0.5 y 5 cuando se mide en una solución acuosa. En una realización, la carga neta positiva media de un análogo de insulina de acuerdo

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con la invención está comprendida entre 1 y 5. En una realización, la carga neta positiva media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre 1 y 4. En una realización, la carga neta positiva media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre 1 y 3. En una realización, la carga neta positiva media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre 2 y 3. En una realización, la carga neta negativa media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre -0.5 y -5 cuando se mide en una solución acuosa. En una realización, la carga neta negativa media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre -1 y -5. En una realización, la carga neta negativa media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre -1 y -4. En una realización, la carga neta negativa media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre -1 y -3. En una realización, la carga neta negativa media de un análogo de insulina de acuerdo con la invención está comprendida entre -2 y -3.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención puede presentar un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 3-9. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 4-8.5. En una realización adicional más, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 4-8. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 4.5-8. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 5-8. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 5.5-8. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 6-8.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina humana a un pH de 2-4.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención puede presentar un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 3-9. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 4-8.5. En una realización adicional más, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 4-8. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 4.5-8. En una realización adicional más, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 5-8. En otra realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 5.5-8. En una realización adicional, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 6-8.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención presenta un incremento de la solubilidad respecto a la insulina original a un pH de 2-4.

La expresión "un incremento de la solubilidad a un pH determinado"se refiere a que se disuelve una concentración más elevada de un análogo de insulina de la invención en una solución acuosa o tampón al pH de la solución respecto a la insulina con la que se compara, es decir, insulina humana o la insulina original. Los métodos para determinar si la insulina contenida en una solución se ha disuelto son conocidos en la técnica.

En una realización, la solución se puede someter a una centrifugación durante 20 minutos a 30 000 g y a continuación se puede determinar la concentración de insulina en el sobrenadante mediante RP-HPLC. Si esta concentración es igual, dentro del error experimental, a la concentración de insulina utilizada originalmente para preparar la composición, entonces la insulina es totalmente soluble en la composición de la invención.

En otra realización, la solubilidad de la insulina en una composición de la invención se puede determinar simplemente examinando visualmente el envase en el cual está contenida la composición. La insulina es soluble si la solución se ve transparente cuando se examina visualmente y no se observa materia particulada suspendida ni precipitada en las paredes laterales/el fondo del envase.

Un análogo de insulina de acuerdo con la invención puede presentar un incremento de la potencia y/o biodisponibilidad respecto a la insulina original cuando se compara después de su medición.

Los ensayos estándar para medir la potencia o biodisponibilidad de la insulina son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, entre otros, (1) ensayos de radioreceptores de insulina, donde la potencia relativa de una insulina se define como la relación de insulina respecto a análogo de insulina requerida para desplazar un 50% de 125Iinsulina unida específicamente a receptores de insulina presentes en membranas celulares, p. ej., una fracción de membrana plasmática de hígado de rata; (2) ensayos de lipogénesis, realizados, p. ej., con adipocitos de rata, donde

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En una realización, los sitios de escisión sometidos a mutación se encuentran en dos o más posiciones seleccionadas del grupo constituido por: B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25, B2526, A13-14, A14-15 y A19-20 de la insulina humana.

En una realización, los sitios de escisión sometidos a mutación se encuentran en dos o más posiciones seleccionadas del grupo constituido por: B2-3, B6-7, B16-17, B22-23, B24-25 y/o A19-20 de la insulina humana.

En una realización, los sitios de escisión sometidos a mutación se encuentran en dos o más posiciones seleccionadas del grupo constituido por: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15.

En una realización, se obtiene un análogo de insulina de acuerdo con la invención, donde la cadena A del análogo de insulina comprende al menos una mutación y la cadena B del análogo de insulina comprende al menos una mutación respecto a la insulina original, donde la o las mutaciones en la cadena A se encuentran en uno o más sitios de escisión seleccionados del grupo constituido por: A13-14, A14-15 y A19-20, y la o las mutaciones en la cadena B se encuentran en uno o más sitios de escisión seleccionados del grupo constituido por: B2-3, B6-7, B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B16-17, B22-23, B24-25 y B25-26.

En una realización, se obtiene un análogo de insulina de acuerdo con la descripción, donde la cadena A del análogo de insulina comprende al menos una mutación y la cadena B del análogo de insulina comprende al menos una mutación respecto a la insulina original, donde la o las mutaciones en la cadena A se encuentran en uno o más sitios de escisión seleccionados del grupo constituido por: A13-14 y A14-15, y la o las mutaciones en la cadena B se encuentran en uno o más sitios de escisión seleccionados del grupo constituido por: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25 y B25-26.

Los residuos aminoacídicos adecuados para la sustitución se seleccionan con el objetivo de eliminar los sitios de escisión. En una realización, los aminoácidos se seleccionan con el objetivo adicional de incrementar la solubilidad. En una realización adicional, el incremento de la solubilidad se produce en el intervalo de pH de 3-9. En otra realización adicional, el incremento de la solubilidad se produce en el intervalo de pH de 4-8. La insulina o el análogo de insulina puede presentar una sustitución en una o más posiciones con cualquier aminoácido natural o se puede añadir cualquier aminoácido natural a la insulina original o al análogo de insulina original. Para su conveniencia, a continuación se indican los nombres de los aminoácidos naturales que pueden ser codificados, con los códigos de tres letras habituales y los códigos de una letra entre paréntesis: glicina (Gly y G), prolina (Pro y P), alanina (Ala y A), valina (Val y V), leucina (Leu y L), isoleucina (Ile e I), metionina (Met y M), cisteína (Cys y C), fenilalanina (Phe y F), tirosina (Tyr y Y), triptófano (Trp y W), histidina (His y H), lisina (Lys y K), arginina (Arg y R), glutamina (Gln y Q), asparagina (Asn y N), ácido glutámico (Glu y E), ácido aspártico (Asp y D), serina (Ser y S) y treonina (Thr y T). Si, debido a errores tipográficos, se producen desviaciones de los códigos utilizados habitualmente, los códigos utilizados habitualmente prevalecerán. Los aminoácidos presentes en las insulinas de esta invención son, preferentemente, aminoácidos que pueden ser codificados por un ácido nucleico. En una realización, la insulina o análogo de insulina presenta una sustitución con Gly, Glu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg y/o Pro, y/o se añade Gly, Glu, Asp, His, Gln, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg y/o Pro a la insulina o análogo de insulina. En una realización, la insulina o análogo de insulina presenta una sustitución con Glu, Asp, His, Gln, Asn, Lys y/o Arg, y/o se añade Glu, Asp, His, Gln, Asn, Lys y/o Arg a la insulina o análogo de insulina.

Los análogos de insulina pueden ser aquellos en los que la posición 25 de la cadena B puede estar modificada respecto al residuo de Phe natural con His, junto con una sustitución de la Tyr natural en la posición A14 con Glu, Asp o His. Una o más mutaciones adicionales pueden incluir desB30 y los análogos de insulina se podrían modificar adicionalmente mediante la extensión del extremo N o la extensión del extremo C de la cadena A y/o la cadena B tal como, p. ej., la extensión del extremo N de la cadena A y/o B del análogo de insulina con GGP, GGPP, GP o GPP. Otros ejemplos incluyen, sin carácter limitante, mutaciones adicionales en las que se pueden añadir uno o dos residuos de Pro a las posiciones A0 y/o B0, se puede añadir Leu a la posición B31 y/o se puede añadir Glu a la posición B32. Se pueden seleccionar una o más mutaciones adicionales entre: la posición A8 modificada con His, la posición A21 con Gly, la posición B1 con Glu o Gln, la posición B16 con Glu, la posición B26 con Asp, la posición B27 con Glu y/o la posición B28 con Asp.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención se selecciona del grupo constituido por:

insulina humana A14E, B25H, desB30;

insulina humana A14H, B25H, desB30;

insulina humana A14E, B1 E, B25H, desB30;

insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30;

insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30;

insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30;

insulina humana A14E, B1 E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B1 E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30;

5 insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30;

10 insulina humana A14E, B1 E, B27E, desB30; insulina humana A14E, B27E, desB30; insulina humana A14E, B28D, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30;

15 insulina humana A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B30T, B31L, B32E; insulina humana A14E, B25H; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30;

20 insulina humana A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14H, B10E, B25H, desB30;

25 insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A13H, A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30;

30 insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H-amida, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H-amida, desB27, desB28, desB29, desB30;

35 insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30;

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insulina humana EEAEAEAPK-B(1-29)-B16E, B25H-AAK-A(1-21)-A8H. A14E; insulina humana B(1-29)-B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E; insulina humana B(1-29)-B16E, B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A14E; insulina humana B(1-29)-B25H, B29Q-TGLGGGQ-A(1-21)-A8H, A14E;

5 insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30;

10 insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30;

15 insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30;

20 insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30;

25 insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30;

30 insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B25H, desB30; y

35 insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30.

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La insulina es una hormona polipeptídica secretada por las células β del páncreas y está constituida por dos cadenas polipeptídicas, A y B, las cuales están unidas mediante dos puentes de disulfuro intercatenarios. Además, la cadena A se caracteriza por contener un puente de disulfuro intracatenario.

La hormona se sintetiza como un precursor monocatenario, la proinsulina (preproinsulina), el cual está constituido por un prepéptido de 24 aminoácidos y a continuación proinsulina, que contiene 86 aminoácidos en la siguiente configuración: prepéptido-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A, donde C es un péptido conector de 31 aminoácidos. Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de escisión para escindir el péptido conector de las cadenas A y B.

Se han utilizado tres métodos principales para la producción de insulina humana en microorganismos. Dos de ellos implican Escherichia coli, con o bien la expresión de una proteína de fusión grande en el citoplasma (Frank et al. (1981) en Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, III. pág. 729-739) o bien el uso de un péptido señal para hacer posible la secreción en el espacio periplásmico (Chan et al. (1981) PNAS 78:5401-5404). Un tercer método utiliza Saccharomyces cerevisiae para secretar un precursor de insulina en el medio (Thim et al. (1986) PNAS 83:6766-6770). La técnica anterior describe una serie de precursores de insulina que se expresan en o bien E. coli o Saccharomyces cerevisiae, remítase a la Patente de EE. UU. N.o 5.962.267, WO 95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 y EP 0741188.

Los análogos de insulina se producen mediante la expresión de una secuencia de ADN que codifica el análogo de insulina en cuestión en una célula huésped adecuada utilizando técnicas conocidas según se describe en, p. ej., la Patente de EE. UU. N.o 6500645. El análogo de insulina se expresa o bien directamente o como una molécula precursora que presenta una extensión del extremo N en la cadena B. Esta extensión del extremo N puede tener la función de incrementar el rendimiento del producto expresado directamente y puede tener una longitud de hasta 15 residuos aminoacídicos. La extensión del extremo N debe ser escindida in vitro tras el aislamiento a partir del caldo de cultivo y, por consiguiente, tendrá un sitio de escisión al lado de B1. Las extensiones del extremo N del tipo adecuado en la presente invención se describen en la Patente de EE. UU. N.o 5.395.922, y la Patente Europea N.o 765.395A.

El análogo de insulina aislado se puede acilar en la posición deseada utilizando métodos de acilación conocidos y los ejemplos de tales análogos de insulina se describen, p. ej., en las Solicitudes de Patente Europea con N.os de publicación EP 214826, EP 375437 y EP 383472.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido del análogo de insulina respectivo se puede preparar sintéticamente utilizando métodos estándar establecidos, p. ej., el método de fosfoamidito descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869 o el método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3:801

805. De acuerdo con el método de fosfoamidito, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se forman los dúplex y se ligan para formar el constructo de ADN sintético. Un modo preferido actualmente para preparar el constructo de ADN consiste en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las secuencias de ácido nucleico también pueden ser de ADNc, genómico mixto y de origen sintético. Por ejemplo, una secuencia de ADNc o genómico que codifique un péptido líder se puede unir a una secuencia de ADNc o genómico que codifique las cadenas A y B, después de lo cual la secuencia de ADN se puede modificar en un sitio insertando oligonucleótidos sintéticos que codifiquen la secuencia de aminoácidos deseada para la recombinación homóloga de acuerdo con procedimientos conocidos o, preferentemente, generando la secuencia deseada mediante PCR utilizando oligonucleótidos adecuados.

El vector recombinante capaz de replicarse en la célula huésped o el microorganismo seleccionado y el cual contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido del análogo de insulina en cuestión puede ser un vector que se replique de forma autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los que se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que contengan de forma conjunta el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula huésped, o se puede utilizar un transposón. El vector puede ser un plásmido circular cerrado o lineal y contendrá preferentemente uno o más elementos que permitan la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

En una realización, el vector de expresión recombinante es capaz de replicarse en levadura. Algunos ejemplos de secuencias que hacen posible que el vector se replique en levadura son las del origen de replicación y los genes de replicación REP 1-3 del plásmido de 2 µm para levadura.

Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o

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se introduce en una cápsula de gelatina de cubierta dura y de tamaño adecuado utilizando máquinas de rellenado de cápsulas convencionales.

En una realización adicional de la descripción, el tampón se selecciona del grupo constituido por acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de estos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención.

En una realización adicional de la descripción, la formulación comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. El conservante está presente en una cantidad suficiente para obtener un efecto conservante. El experto estará familiarizado con la cantidad de conservante en una formulación farmacéutica y esta se puede determinar, p. ej., a partir de la bibliografía de la técnica y/o la o las cantidades conocidas de conservante en, p. ej., productos comerciales. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una realización alternativa de la invención.

El experto estará familiarizado con el uso de un conservante en las composiciones farmacéuticas. Para su conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, 1995.

En una realización adicional de la descripción, la formulación comprende además un agente quelante. El experto estará familiarizado con el uso de un agente quelante en las composiciones farmacéuticas. Para su conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, 1995.

En una realización adicional de la descripción, la formulación comprende además un estabilizante. El término "estabilizante", tal como se utiliza en la presente, se refiere a agentes químicos añadidos a formulaciones farmacéuticas que contienen un polipéptido con el fin de estabilizar el péptido, es decir, para incrementar la vida útil y/o el periodo de validez de las formulaciones. El experto estará familiarizado con el uso de un estabilizante en las composiciones farmacéuticas. Para su conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, 1995.

En una realización adicional de la descripción, la formulación comprende además un surfactante. El término "surfactante", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualesquiera moléculas o iones que comprenden una parte hidrosoluble (hidrófila), la cabeza, y un segmento soluble en grasa (lipófilo). Los surfactantes se acumulan preferentemente en las interfases, donde la parte hidrófila se orienta hacia el agua (fase hidrófila) y la parte lipófila hacia la fase hidrófoba u oleosa (es decir, vidrio, aire, aceite, etc.). La concentración en la que los surfactantes empiezan a formar micelas se conoce como concentración micelar crítica o CMC. Además, los surfactantes reducen la tensión superficial de un líquido. Los surfactantes también se conocen como compuestos anfifáticos. El término "detergente" es un sinónimo utilizado para los surfactantes en general. El experto estará familiarizado con el uso de un surfactante en las composiciones farmacéuticas. Para su conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edición, 1995.

En una realización adicional de la descripción, la formulación comprende además inhibidores de proteasas.

Es posible que haya otros ingredientes presentes en la formulación farmacéutica del análogo de insulina de la presente invención. Tales ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes aglutinantes, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (p. ej., albúmina de suero humano, gelatina o proteínas) y un zwitterión (p. ej., un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tales ingredientes adicionales, obviamente, no deben afectar de forma adversa a la estabilidad global de la formulación farmacéutica de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un análogo de insulina de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un paciente que necesite tal tratamiento en varios puntos, por ejemplo, en puntos tópicos, por ejemplo, puntos de mucosas y cutáneos, en puntos en los que no se produzca absorción, por ejemplo, la administración en una arteria, en una vena, en el corazón, y en puntos que impliquen absorción, por ejemplo, la administración en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo mediante varias vías de administración, por ejemplo, lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estómago y el intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a través de los bronquiolos y alveolos o una combinación de estos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo, a través de la conjuntiva, uretal y parenteral a pacientes que necesiten un tratamiento de este tipo.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar en varias formas farmacéuticas, por ejemplo, como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, múltiples emulsiones, espumas, pomadas, pastas, yesos, ungüentos, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, esprays, polvos, aerosoles, inhalantes, gotas para los ojos, ungüentos oftálmicos, enjuagues oftálmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales,

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ungüentos vaginales, solución para inyección, soluciones de transformación in situ, por ejemplo, gelificación in situ, deposición in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución de infusión e implantes.

Además, las composiciones de la invención pueden formar un compuesto con, o estar unidas a, por ejemplo, mediante interacciones covalentes, hidrófobas y electrostáticas, un portador de fármacos, un sistema de suministro de fármacos y un sistema de suministro de fármacos avanzado con el fin de mejorar adicionalmente la estabilidad del compuesto que es un análogo de insulina, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su solubilidad, reducir sus efectos adversos, conseguir la cronoterapia con la cual estarán familiarizados los expertos en la técnica e incrementar el cumplimiento del paciente o cualquier combinación de estos factores.

Las composiciones de la presente invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvos y soluciones para la administración pulmonar de un análogo de insulina, utilizando, por ejemplo, un inhalador de dosis controlada, un inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos ellos dispositivos muy conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones de la presente invención pueden ser útiles en la formulación de sistemas de suministro farmacológico de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta. Más concretamente, sin carácter limitante, las composiciones pueden ser útiles en la formulación de sistemas de liberación sostenida y liberación controlada parenteral (implicando ambos sistemas una reducción de varios factores en el número de administraciones), muy conocidos por los expertos en la técnica. Aún más preferentemente, son sistemas de liberación sostenida y liberación controlada administrados por vía subcutánea. Sin limitar el alcance de la invención, algunos ejemplos de composiciones y sistemas de liberación controlada útiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

Algunos métodos para producir sistemas de liberación controlada útiles para las composiciones de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, cristalización, condensación, cocristalización, precipitación, coprecipitación, emulsificación, dispersión, homogeneización a alta presión, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación del disolvente para producir microesferas, extrusión y procesos de fluidos supercríticos. Se hace una referencia general a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.

99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000).

La administración parenteral se puede llevar a cabo mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa utilizando una jeringa, opcionalmente una jeringa en forma de bolígrafo. Como alternativa, la administración parenteral se puede llevar a cabo utilizando una bomba de infusión. Otra opción consiste en una composición que puede ser una solución o suspensión para la administración del compuesto que es análogo de insulina en forma de un espray nasal o pulmonar. Como otra opción más, las composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto que es un análogo de insulina de la invención también se pueden adaptar para la administración transdérmica, p. ej., mediante una inyección sin aguja o a partir de un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o para la administración transmucosa, p. ej., bucal.

El análogo de insulina de acuerdo con la invención se puede administrar mediante la vía pulmonar en un vehículo, como una solución, suspensión o un polvo seco, utilizando cualquiera de los tipos conocidos de dispositivos adecuados para el suministro farmacológico pulmonar. Los ejemplos de estos comprenden, sin carácter limitante, los tres tipos generales de generadores de aerosoles para el suministro farmacológico pulmonar y pueden incluir nebulizadores ultrasónicos o de chorro, inhaladores de dosis controlada o inhaladores de polvo seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395453).

En una realización adicional, la formulación se podría aerosolizar mediante cualquier tecnología de aerosolización conocida, tal como la nebulización, para conseguir un MMAD (siglas en inglés correspondientes a Mass Median Aerodynamic Diameter, el diámetro aerodinámico de la masa media) de las partículas de aerosol inferior a 10 µm, más preferentemente comprendido entre 1 y 5 µm, y aún más preferentemente comprendido entre 1 y 3 µm. El tamaño de partícula preferido se basa en el tamaño más eficaz para el suministro del fármaco en la parte más profunda del pulmón, donde la proteína se absorbe de forma óptima (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379385).

La deposición en la parte más profunda del pulmón de las formulaciones pulmonares que comprenden el compuesto que es un análogo de insulina se puede optimizar adicionalmente de forma opcional utilizando modificaciones de las técnicas de inhalación, por ejemplo, sin carácter limitante: un flujo de inhalación lento (p. ej., 30 L/min), manteniendo la respiración y programando la activación.

La expresión "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con un incremento de la estabilidad física, un incremento de la estabilidad química o un incremento de la estabilidad física y química.

La expresión "estabilidad física" de la formulación proteica, tal como se utiliza en la presente, se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados insolubles y/o biológicamente inactivos de la proteína como resultado

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gelatina blanda, polvos, gránulos, soluciones de transformación in situ, por ejemplo, gelificación in situ, deposición in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, una formulación que flote en el estómago tal como una suspensión flotante, un comprimido flotante o similares.

En otra realización, la presente invención se refiere a un análogo de insulina de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento.

En una realización, un análogo de insulina de acuerdo con la descripción se utiliza para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de hiperglucemia, diabetes de tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, cardiopatía isquémica y otros trastornos cardiovasculares, síndrome intestinal inflamatorio, dispepsia y úlceras gástricas.

En otra realización, un análogo de insulina de acuerdo con la invención se utiliza como un medicamento para retrasar o prevenir la evolución de la enfermedad en la diabetes de tipo 2.

En otra realización, un análogo de insulina de acuerdo con la descripción se utiliza como un medicamento para reducir el consumo de alimentos, reducir la apoptosis de las células β, incrementar la función de las células β y la masa de las células β, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa en las células β.

En una realización de la descripción, el derivado de acuerdo con la invención es para ser utilizado como un medicamento para el tratamiento o la prevención de hiperglucemia, diabetes de tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, cardiopatía isquémica y otros trastornos cardiovasculares, accidente cerebrovascular, síndrome intestinal inflamatorio, dispepsia y úlceras gástricas o para retrasar o prevenir la evolución de la enfermedad en la diabetes de tipo 2 o para reducir el consumo de alimentos, reducir la apoptosis de las células β, incrementar la función de las células β y la masa de las células β, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa en las células β.

En una realización adicional de la descripción, se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de hiperglucemia, diabetes de tipo 2, intolerancia a la glucosa, diabetes de tipo 1, obesidad, hipertensión, síndrome X, dislipidemia, trastornos cognitivos, aterosclerosis, infarto de miocardio, cardiopatía isquémica y otros trastornos cardiovasculares, accidente cerebrovascular, síndrome intestinal inflamatorio, dispepsia y úlceras gástricas o para retrasar o prevenir la evolución de la enfermedad en la diabetes de tipo 2 o para reducir el consumo de alimentos, reducir la apoptosis de las células β, incrementar la función de las células β y la masa de las células β, y/o restablecer la sensibilidad a la glucosa en las células β, donde el método comprende administrar a un paciente que necesite tal tratamiento una cantidad eficaz para tal tratamiento de un análogo de insulina de acuerdo con la invención.

El tratamiento con un análogo de insulina de acuerdo con la presente invención también se puede combinar con una segunda sustancia farmacológicamente activa o con más sustancias farmacológicamente activas, p. ej., seleccionadas entre agentes antidiabéticos, agentes contra la obesidad, agentes reguladores del apetito, agentes contra la hipertensión, agentes para el tratamiento y/o la prevención de complicaciones resultantes de la diabetes o asociadas con ella y agentes para el tratamiento y/o la prevención de complicaciones y trastornos resultantes de la obesidad o asociados con ella. Algunos ejemplos de estas sustancias farmacológicamente activas son: GLP-1 y derivados y análogos de GLP-1, GLP-2 y derivados y análogos de GLP-2, Exendina-4 y derivados y análogos de Exendina-4, amilina y derivados y análogos de amilina, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de glucosidasas, antagonistas de glucagón, inhibidores de DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV), inhibidores de enzimas hepáticas que participan en la estimulación de la gluconeogénesis y/o glicogenólisis, moduladores de la captación de glucosa, compuestos que modifican el metabolismo de los lípidos tales como agentes antihiperlipidémicos como inhibidores de HMG CoA (estatinas), compuestos que reducen el consumo de alimentos, agonistas de RXR y agentes que actúan en el canal de potasio dependiente de ATP de las células β; Colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; bloqueadores β tales como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de ACE (enzima convertidora de angiotensina) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril y ramipril, bloqueadores del canal del calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamil, y bloqueadores α tales como doxazosina, urapidil, prazosina y terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado de cocaína y anfetamina), antagonistas de NPY (neuropéptido Y), agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (factor de necrosis tumoral), agonistas de CRF (factor liberador de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de unión al factor liberador de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas de β3, agonistas de MSH (hormona estimuladora de melanocitos), antagonistas de MCH (hormona concentradora de melanocitos), agonistas de CCK (colecistocinina), inhibidores de la recaptación de serotonina, inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, compuestos noradrenérgicos y de serotonina mixtos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormona del crecimiento, compuestos liberadores de la hormona del crecimiento, agonistas de TRH (hormona liberadora de tireotropina), moduladores de UCP 2 o 3 (proteína desacopladora 2 o 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inhibidores de lipasas/amilasas, moduladores de RXR (receptor retinoide X), agonistas de TR β; antagonistas de histamina H3, gastrina y análogos y derivados de gastrina.

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Se llevó a cabo la identificación de sitios de escisión de proteasas mediante un análisis en el transcurso del tiempo de la proteolisis limitada de la insulina y los análogos de insulina por parte de varias enzimas (pepsina, quimotripsina, carboxipeptidasa A) mediante LC-MS. Los fragmentos peptídicos generados se identificaron mediante MS o MS/MS y se cuantificaron a 214 nm con el fin de identificar los sitios de escisión mayoritarios y minoritarios (puntos clave). Se identificaron los siguientes puntos clave para la pepsina (B24-25, B25-26, B26-27) y la quimotripsina (B16-17, B24-25, B25-26, B26-27, A14-15 y A19-20) en la insulina humana. Cabe destacar que los puntos clave se superponen con la enzima degradadora de insulina (IDE), remítase más adelante, y la catepsina D (Hanne Refsgaard, Novo Nordisk A/S, comunicación personal).

También se predijeron los sitios de escisión en la secuencia de insulina basándose en la especificidad enzimática de la quimotripsina, tripsina y enzima degradadora de insulina (IDE) según se muestra más adelante en el ejemplo 3. Los sitios de escisión previstos para la tripsina (residuos básicos, extremo C respecto a Lys, Arg), elastasa (residuos alifáticos, extremo C respecto a Ala, Val, Gly, Ser), carboxipeptidasa A (especificidad amplia, pero no es Arg, Lys ni Pro), pepsina A (residuos aromáticos, extremo N respecto a Trp, Tyr, Phe y Leu y varios residuos más) y quimotripsina (residuos aromáticos, extremo C respecto a Trp, Tyr, Phe y Leu, pero no Xxx-Pro) se describen en varios libros de bioquímica. Recientemente, se han publicado los sitios de escisión para IDE en la insulina: B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14, A14-15 (Duckworth et al., Biochemistry. 21 de marzo de 1989;28(6):2471-7) y se ha demostrado que las siguientes sustituciones inhiben la degradación de la insulina por parte de IDE: B10D y B4E_B16Q_B17F (Bennett et al., J Endocrinol., junio de 2003;177(3):399-405).

EJEMPLO 3 Ciclos repetidos de identificación de puntos clave en la insulina humana A14E, B25H, desB30

Se identificaron los puntos clave mayoritarios para la escisión de la quimotripsina (B16-17, B24-25, A19-20) y los sitios de escisión minoritarios (B1-2, B6-7) en la insulina humana A14E, B25H, desB30 de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 2. Los análogos de insulina se designaron basándose en los sitios de escisión identificados y los sitios de escisión previstos a partir de la especificidad enzimática. Los residuos aminoacídicos para la sustitución se seleccionaron con el fin de eliminar los sitios de escisión y de aumentar la solubilidad.

Quimotripsina, diseño de análogos basado en puntos clave identificados mediante LC-MS de digestiones de insulina humana A14E, B25H, desB30:

A14X1 B25H desB30X12 HI B1X2 B6X3 B16X6 B24X8 A19X11 X1= E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12= desB30/aa nativo Nota: es probable que la sustitución de B24 y/o A19 en la insulina humana reduzca significativamente la afinidad del

receptor. A14X1 B25P desB30X12 HI B1X2 B6X3 B16X6 B24X8 A19X11 X1= E/D/H/Q/N/S/T/M/P X2= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X3= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12= desB30/aa nativo Nota: es probable que la sustitución de B25 con Pro reduzca significativamente la escisión por parte de la

quimotripsina en B24-25.

imagen15

X4= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X5= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X6= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X7= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

5 X8= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X9= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X10= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X11= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X12= desB30/aa nativo

10 X13= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X14= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X15= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X16= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo X17= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo

15 X18= E/D/H/Q/N/S/T/M/P/aa nativo EJEMPLO 4 Estabilidad proteolítica (semivida) de los análogos de insulina frente a la quimotripsina Se evaluaron los análogos de insulina en ensayos de estabilidad y se identificaron los análogos que exhibieron una mayor resistencia frente a la digestión proteolítica mediante semividas más elevadas de acuerdo con los métodos

20 descritos en el ejemplo 1. Los resultados demuestran el potencial de los análogos de insulina mejorados adicionalmente para presentar una mayor biodisponibilidad debido a su resistencia mejorada frente a la degradación proteolítica y a su solubilidad mejorada.

Se ha evaluado la estabilidad de los siguientes análogos de insulina frente a la quimotripsina respecto a la insulina humana:

Análogos de insulina: Digestión con quimotripsina [factor de estabilidad respecto a la insulina humana]

insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30: 43.8

insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30: 38.9

insulina humana EEAEAEAPK-B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)-A14E: 33.2

insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30: 22.8

insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30: 17.4

insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30: 16.6

insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30: 14.1

insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30: 13.3

Claims

imagen1

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imagen3

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imagen5

imagen6

insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; 5 insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30;

10 e insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30.
25. Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por: insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B25H, desB30;

15 insulina humana A14E, B1 E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B1 E, B25H, B27E, desB30;

20 insulina humana A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30;

25 insulina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30;

30 insulina humana A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B30T, B31L, B32E; insulina humana A14E, B25H; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30;

35 insulina humana A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30;

44

insulina humana A14H, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14H, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A13H, A14E, B10E, B25H, desB30;

5 insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30;

10 insulina humana A14E, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30;

15 insulina humana A13H, A14E, B1 E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B1 E, B25H, desB30; insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30;

20 insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, A18K, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, A22K, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30;

25 insulina humana A14E, A22K, B25H, desB30; insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30;

30 insulina humana A14E, B25H, B27R, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB28-B30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30;

35 insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A15E, A14E, B25H, desB30;

45

insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30;

5 insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30;

10 insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30;

15 insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30;

20 insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30;

25 insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; e insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30.
26. Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por: insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B1 E, B25H, desB30;

30 insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B1 E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30;

35 insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30;

46

insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30;

5 insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B30T, B31L, B32E; insulina humana A14E, B25H;

10 insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30;

15 insulina humana A13H, A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B10D, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30;

20 insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB26, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30;

25 insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B1 E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B1 E, B25H, desB30;

30 insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30;

35 insulina humana A14E, A18K, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, A22K, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, A22K, B25H, desB30;

47

insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, desB1, desB2, desB3, B16H, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30;

5 insulina humana A14E, B25H, B27R, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB28-B30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB28-B30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30;

10 insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A15E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, B27E, desB30;

15 insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30;

20 insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30;

25 insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30;

30 insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30;

35 insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; e insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30.

48
27. Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por: insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B1 E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30;

5 insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30; insulina humana A14E, B25H;

10 insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30;

15 insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A22K, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30;

20 insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A15E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30;

25 insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30;

30 insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30;

35 insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30;

49

5

10

15

20

25

30

35

insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; e insulina humana A14E, B25H, desB30.
28.

Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona del grupo constituido por: insulina humana A14E, B25H, desB27, desB28, desB29, desB30 insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30 insulina humana EEAEAEAPK-B(1-29)-B25H-AAK-A(1-21)-A14E insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30 insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30 insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30 insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30 insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30 insulina humana A8H,A14E,B10E,B25H,desB30 insulina humana A14E, B25H, desB30 insulina humana A14E, B1 E, B25H, B27E, desB30 insulina humana A8H, A14E, B1E, B25H, desB30 insulina humana A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 insulina humana A14D, B25H, desB30 insulina humana A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30 insulina humana A14E, B1 E, B25H, desB30 insulina humana A14H, B25H, desB30 insulina humana A14E, B25H insulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; e insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30.
29.

Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es insulina A14E, B25H, desB30.
30.

Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30.
31.

Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30.
32.

Un análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, que es insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30.

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33.

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente activa del análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador farmacéuticamente aceptable.
34.

Un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32 para su uso como un producto

farmacéutico en el tratamiento o la prevención de la hiperglucemia, diabetes de tipo 2, intolerancia a la glucosa y 5 diabetes de tipo 1.
35.

Un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32 para su uso como un producto farmacéutico con el fin de retrasar o prevenir la evolución de la enfermedad en la diabetes de tipo 2.
36.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32.

10 37. Un proceso para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 33, que comprende mezclar un análogo de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32 con sustancias y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

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