ES2845609T3 - Anticuerpos dirigidos contra muerte programada-1 (PD-1) - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-PD-1 que comprende un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40 y una región constante (Fc) de cadena pesada de IgG4.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos dirigidos contra muerte programada-1 (PD-1)
Antecedentes de la invención
Muerte programada 1 (PD-1) (también conocida como muerte celular programada 1) es una proteína transmembrana de tipo I de 268 aminoácidos originalmente identificada por hibridación sustractiva de una línea de linfocitos T de ratón experimentando apoptosis (Ishida y col., Embo J., 11: 3887-95 (1992)). PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 de reguladores de linfocitos T, y se expresa en linfocitos T activadas, en linfocitos B y en células de la estirpe mieloide (Greenwald y col., Annu. Rev. Immunol., 23: 515-548 (2005); y Sharpe y col., Nat. Immunol., 8: 239-245 (2007)).
Se han identificado dos ligandos para PD-1, el ligando de PD 1 (PD-L1) y el ligando de PD 2 (PD-L2), ambos pertenecientes a la superfamilia de proteínas B7 (Greenwald y col., citado anteriormente). PD-L1 se expresa en una diversidad de tipos celulares, entre ellos células del pulmón, corazón, timo, bazo y riñón (véase, por ejemplo, Freeman y col., J. Exp. Med., 192(7): 1027-1034 (2000); y Yamazaki y col., J. Immunol., 169(10): 5538-5545 (2002)). La expresión de PD-L1 se regula al alza en macrófagos y células dendríticas (las DC) en respuesta al tratamiento con lipopolisacáridos (LPS) y GM-CSF, y en linfocitos T y linfocitos B tras la señalización a través de los receptores de linfocitos T y linfocitos B. PD-L1 también se expresa en una diversidad de líneas de células tumorales murinas (véase, por ejemplo, Iwai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(19): 12293-12297 (2002); y Blank y col., Cancer Res., 64(3): 1140-1145 (2004)). Por el contrario, PD-L2 presenta un patrón de expresión más restringido y se expresa principalmente en células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas y macrófagos) y algunas líneas de células tumorales (véase, por ejemplo, Latchman y col., Nat. Immunol., 2(3): 261-238 (2001)). La alta expresión de PD-L1 en tumores, ya sea en la célula tumoral, el estroma u otras células dentro del microambiente tumoral, se correlaciona con un mal pronóstico clínico, presumiblemente al inhibir a los linfocitos T efectores y regular al alza a los linfocitos T reguladores (Treg) en el tumor.
PD-1 regula negativamente la activación de linfocitos T, y esta función inhibidora está vinculada a un motivo de inmunorreceptor de cambio basado en tirosina (ITSM, forma siglada de immunoreceptor tyrosine-based switch motif) en el dominio citoplásmico (véase, por ejemplo, Greenwald y col., citado anteriormente; y Parry y col., Mol. Cell. Biol., 25: 9543-9553 (2005)). La deficiencia de PD-1 puede provocar autoinmunidad. Por ejemplo, se ha demostrado que ratones C57BL/6 genosuprimidos para PD-1 desarrollan un síndrome similar al lupus (véase, por ejemplo, Nishimura y col., Immunity, 11: 141-1151 (1999)). En seres humanos, un polimorfismo mononucleotídico en el gen de PD-1 se asocia con una mayor incidencia de lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo 1, artritis reumatoide y con la progresión de la esclerosis múltiple (véase, por ejemplo, Nielsen y col., Tissue Antigens, 62(6): 492-497 (2003); Bertsias y col., Arthritis Rheum., 60(1): 207-218 (2009); Ni y col., Hum. Genet., 121(2): 223-232 (2007); Tahoori y col., Clin. Exp. Rheumatol., 29(5): 763-767 (2011); y Kroner y col., Ann. Neurol., 58(1): 50-57 (2005)). La expresión anómala de p D-1 también se ha implicado en disfunciones de linfocitos T en varias patologías, tales como la evasión inmunitaria tumoral e infecciones víricas crónicas (véase, por ejemplo, Barber y col., Nature, 439: 682-687 (2006); y Sharpe y col., citado anteriormente).
Estudios recientes demuestran que la supresión de linfocitos T inducida por PD-1 también desempeña un papel en la supresión de la inmunidad antitumoral. Por ejemplo, PD-L1 se expresa en una diversidad de tumores humanos y de ratón, y la unión de PD-1 a PD-L1 en tumores da como resultado la supresión de linfocitos T y la evasión y protección inmunitaria tumoral (Dong y col., Nat. Med., 8: 793-800 (2002)). La expresión de PD-L1 por células tumorales se ha asociado directamente con su resistencia a la lisis por linfocitos T antitumorales in vitro (Polla y col., citado anteriormente; y Blank y col., Cancer Res., 64: 1140-1145 (2004)). Los ratones genosuprimidos para PD-1 son resistentes al ataque tumoral (Iwai y col., Int. Immunol., 17: 133-144 (2005)), y los linfocitos T de ratones genosuprimidos para PD-1 son altamente eficaces en el rechazo de tumores cuando se transfieren adoptivamente a ratones portadores de tumores (Blank y col., citado anteriormente. El bloqueo de las señales inhibidoras de PD-1 utilizando un anticuerpo monoclonal puede potenciar la inmunidad antitumoral del hospedador en ratones (Iwai y col., citado anteriormente; y Hirano y col., Cancer Res., 65: 1089-1096 (2005)), y los altos niveles de expresión de PD-L1 en tumores se asocian con un mal pronóstico para muchos tipos de cánceres humanos (Hamanishi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 3360-335 (2007), Brown y col., J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); y Flies y col., Yale Journal of Biology and Medicine, 84(4): 409-421 (2011)).
En vista de lo anterior, se han desarrollado estrategias para inhibir la actividad de PD-1 para tratar diversos tipos de cáncer y para inmunopotenciación (por ejemplo, para tratar enfermedades infecciosas) (véase, por ejemplo, Ascierto y col., Clin. Cancer. Res., 19(5): 1009-1020 (2013)). A este respecto, se han desarrollado anticuerpos monoclonales dirigidos a PD-1 para el tratamiento del cáncer (véase, por ejemplo, Weber, Semin. Oncol., 37(5): 430-4309 (2010); y Tang y col., Current Oncology Reports, 15(2): 98-104 (2013)). Por ejemplo, nivolumab (también conocido como BMS-936558) produjo respuestas completas o parciales en el cáncer de pulmón no microcítico, en melanoma y en cáncer de células renales en un ensayo clínico de fase I (véase, por ejemplo, Topalian, New England J. Med., 366: 2443-2454 (2012)), y actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase III. MK-3575 es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra PD-1 que ha mostrado indicios de actividad antitumoral en ensayos clínicos de fase I (véase, por ejemplo, Patnaik y col., Reunión anual de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) de 2012, Resumen n.° 2512). Además, la evidencia reciente sugiere que las terapias que tienen como objetivo a PD-1 pueden potencias las respuestas inmunitarias contra patógenos, tal como el VIH (véase, por ejemplo, Porichis y col., Curr. HIV/AIDS Rep., 9(1): 81-90 (2012)). En el documento US8168757 se demostró que el anticuerpo anti-PD-1 1B8 reduce la carga vírica en macacos de la India infectados con VIS. A pesar de estos avances, sin embargo, la eficacia de estas posibles terapias en seres humanos puede ser limitada.
Por lo tanto, existe la necesidad de un agente de unión a PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo) que se una a PD-1 con alta afinidad y neutralice de forma eficaz la actividad de PD-1. La invención proporciona tales agentes de unión a PD-1.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona un anticuerpo anti-PD-1 que comprende un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40 y una región constante (Fc) de cadena pesada de IgG4.
Además, la invención proporciona secuencias de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina anteriores, vectores que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, anticuerpos anti-PD-1 aislados que comprenden los polipéptidos de inmunoglobulina anteriores, secuencias de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos anti-PD-1, vectores que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, células aisladas que comprenden tales vectores, composiciones que comprenden tales anticuerpos anti-PD-1 con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y el uso de anticuerpos anti-PD-1 para el tratamiento del cáncer en seres humanos mediante la administración de cantidades eficaces de tales composiciones a seres humanos.
Las realizaciones preferidas de la invención se describen a continuación y/o en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama que representa esquemáticamente distintas construcciones del antígeno PD-1 utilizadas para generar anticuerpos monoclonales anti-PD-1 como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 2 es un gráfico que ilustra los resultados experimentales que demuestran una actividad aumentada de un anticuerpo antagonista anti-TIM-3 en un ensayo de MLR (forma siglada mixed lymphocyte reaction, reacción linfocitaria mixta) de linfocitos T CD4+ humanos en presencia de niveles bajos de anticuerpo anti-PD-1 APE2058. La Figura 3 es un gráfico que ilustra los resultados experimentales que demuestran una actividad aumentada de un anticuerpo antagonista anti-LAG-3 en un ensayo de MLR de linfocitos T CD4+ humanos en presencia de niveles bajos de anti-PD-1 APE2058.
Descripción detallada de la invención
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado y/o un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado, o un fragmento (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) del mismo. El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que se encuentra en la sangre u otros líquidos corporales de los vertebrados, que utiliza el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños, tales como bacterias y virus. El polipéptido está "aislado" en el sentido que se retira de su entorno natural. En una realización preferente, una inmunoglobulina o anticuerpo es una proteína que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR). Las CDR forman la "región hipervariable" de un anticuerpo, la cual es responsable de la unión al antígeno (analizado más adelante). Una inmunoglobulina completa normalmente consiste en cuatro polipéptidos: dos copias idénticas de un polipéptido de cadena pesada (H) y dos copias idénticas de un polipéptido de cadena ligera (L). Cada una de las cadenas pesadas contiene una región variable N-terminal (Vh) y tres regiones constantes C-terminales (Ch1, Ch2 y Ch3), y cada cadena ligera contiene una región variable N-terminal (Vl) y una región constante C-terminal (Cl). Las cadenas ligeras de anticuerpos pueden asignarse a uno de dos tipos distintos, sea kappa (k) o lambda (A), basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En una inmunoglobulina típica, cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por enlaces disulfuro, y las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro. La región variable de la cadena ligera está alineada con la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada. Las regiones constantes restantes de las cadenas pesadas están alineadas entre sí.
Las regiones variables de cada pareja de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Las regiones Vh y Vl tienen la misma estructura general, comprendiendo cada región cuatro regiones marco conservadas (FW o FR). La expresión "región marco conservada", como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias de aminoácidos relativamente conservadas dentro de la región variable que están ubicadas entre las regiones determinantes hipervariables o complementarias (las CDR). Existen cuatro regiones marco conservadas en cada dominio variable, las cuales se denominan FR1, FR2, FR3 y FR4. Las regiones marco conservadas forman las láminas p que proporcionan el andamiaje estructural de la región variable (véase, por ejemplo, C.A. Janeway y col. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)).
Las regiones marco conservadas están conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (las CDR). Como se ha analizado anteriormente, los tres c Dr , conocidas como CDR1, CDR2 y CDR3, forman la "región hipervariable" de un anticuerpo, que es responsable de la unión al antígeno. Las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos comprenden parte de, la estructura de lámina beta formada por las regiones marco conservadas. Si bien las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada no están directamente implicadas en la unión del anticuerpo a un antígeno, las regiones constantes pueden influir en la orientación de las regiones variables. Las regiones constantes también presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación en la lisis mediada por el complemento dependiente de anticuerpos o la toxicidad celular dependiente de anticuerpos a través de interacciones con moléculas y células efectoras.
El polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado de la invención se unen a PD-1. Como se ha analizado anteriormente, muerte programada 1 (PD-1) (también conocida como muerte celular programada 1) es una proteína transmembrana de tipo I de 268 aminoácidos (Ishida y col., citado anteriormente). PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 de reguladores de linfocitos T, y se expresa en linfocitos T activados, en linfocitos B y en células de la estirpe mieloide (Greenwald y col., citado anteriormente; y Sharpe y col., citado anteriormente). PD-1 incluye un dominio de IgV extracelular seguido de un tallo extracelular corto, una región transmembrana y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación ubicados en un motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina y un motivo de cambio de inmunorreceptor basado en tirosina, que desempeñan un papel en la capacidad de PD-1 para regular negativamente la señalización del receptor de linfocitos T (véase, por ejemplo, Ishida y col., citado anteriormente; y Blank y col., citado anteriormente). El polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado de la invención y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado de la invención pueden formar un agente que se une a PD-1 y a otro antígeno, dando como resultado un agente de unión "doble reactivo" (por ejemplo, un anticuerpo doble reactivo). Por ejemplo, el agente puede unirse a PD-1 y a otro regulador negativo del sistema inmunitario tal como, por ejemplo, gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) y/o proteína de dominio de mucina y dominio de inmunoglobulina de linfocitos T 3 (TIM-3).
Los anticuerpos que se unen a PD-1 y los componentes de los mismos, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 8.168.757; Topalian y col., citado anteriormente; y Patnaik y col., citado anteriormente). Los anticuerpos anti-PD-1 también están disponibles en el mercado de fuentes tales como, por ejemplo, Abcam (Cambridge, MA).
Un "reemplazo" o "sustitución" de aminoácidos se refiere al reemplazo de un aminoácido en una posición o resto dado por otro aminoácido en la misma posición o resto dentro de una secuencia polipeptídica.
Los aminoácidos se agrupan ampliamente como "aromáticos" o "alifáticos". Un aminoácido aromático incluye un anillo aromático. Los ejemplos de aminoácidos "aromáticos" incluyen histidina (H o His), fenilalanina (F o Phe), tirosina (Y o Tyr) y triptófano (W o Trp). Los aminoácidos no aromáticos se agrupan en términos generales como "alifáticos". Los ejemplos de aminoácidos "alifáticos" incluyen glicina (G o Gly), alanina (A o Ala), valina (V o Val), leucina (L o Leu), isoleucina (I o Ile), metionina (M o Met), serina (S o Ser), treonina (T o Thr), cisteína (C o Cys), prolina (P o Pro), ácido glutámico (E o Glu), ácido aspártico (A o Asp), asparagina (N o Asn), glutamina (Q o Gln), lisina (K o Lys) y arginina (R o Arg).
Los aminoácidos alifáticos pueden subdividirse en cuatro subgrupos. El "gran subgrupo alifático no polar" consiste en valina, leucina e isoleucina. El "subgrupo alifático ligeramente polar" consiste en metionina, serina, treonina y cisteína. El "subgrupo alifático polar/cargado" consiste en ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, glutamina, lisina y arginina. El "subgrupo de restos pequeños" consiste en glicina y alanina. El grupo de aminoácidos cargados/polares se puede subdividir en tres subgrupos: el "subgrupo cargado positivamente" que consiste en lisina y arginina, el "subgrupo cargado negativamente" que consiste en ácido glutámico y ácido aspártico, y el "subgrupo polar" que consiste en asparagina y glutamina.
Los aminoácidos aromáticos pueden subdividirse en dos subgrupos: el "subgrupo con anillo de nitrógeno" que consiste en histidina y triptófano y el "subgrupo con fenilo" que consiste en fenilalanina y tirosina.
La sustitución o sustitución de aminoácidos puede ser conservativa, semiconservativa o no conservativa. La expresión "sustitución de aminoácidos conservativa" o "mutación conservativa" se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz y Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York (1979)). Según tales análisis, pueden definirse grupos de aminoácidos en que los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por lo tanto, se parecen más entre sí en su impacto sobre la estructura proteica global (Schulz y Schirmer, citado anteriormente).
Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen sustituciones de aminoácidos dentro de los subgrupos descritos anteriormente, por ejemplo, arginina por lisina y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva, ácido aspártico por ácido glutámico y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa, treonina por serina, de manera que se pueda mantener un -OH libre, y asparagina por glutamina, de manera que se pueda mantener un -NH libre2.
Las "mutaciones semiconservativas" incluyen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos dentro de los mismos grupos enumerados anteriormente, pero no dentro del mismo subgrupo. Por ejemplo, la sustitución de asparagina por ácido aspártico, o lisina por asparagina, implica aminoácidos dentro del mismo grupo, pero de subgrupos distintos. Las "mutaciones no conservativas" implican sustituciones de aminoácidos entre grupos distintos, por ejemplo, triptófano por lisina o serina por fenilalanina, etc.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende, consiste en o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, en las que opcionalmente (a) el resto 9 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (b) uno o más de los restos 7, 8 y 9 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (c) uno o más de los restos 1, 2 y 5 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, o (d) cualquier combinación de (a)-(c). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, y reemplazos de aminoácidos opcionales, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, y reemplazos de aminoácidos opcionales, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención).
En una realización de la divulgación, el polipéptido de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que (a) el resto 9 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (b) uno o más de los restos 7, 8 y 9 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (c) uno o más de los restos 1, 2 y 5 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, o (d) cualquier combinación de (a)-(c). Por ejemplo, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto y uno o más de los restos 7, 8 y 9 de la SEQ ID NO: 2 se reemplazan por un resto de aminoácido distinto. De manera alternativa, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, uno o más de los restos 7, 8 y 9 de la SEQ ID NO: 2 se reemplazan por un resto de aminoácido distinto y uno o más de los restos 1,2 y 5 de la SEQ ID NO: 3 se reemplazan por un resto de aminoácido distinto. En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que uno o más de los restos 1, 2 y 5 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. Cada uno del resto 9 de la SEQ ID NO: 1, los restos 7, 8 y 9 de la SEQ ID NO: 2, y los restos 1, 2 y 5 de la SEQ ID NO: 3 pueden reemplazarse por cualquier resto de aminoácido adecuado que puede ser el mismo o distinto en cada posición. Por ejemplo, el resto de aminoácido de una primera posición puede reemplazarse por un primer resto de aminoácido distinto, y el resto de aminoácido de una segunda posición se puede reemplazar por un segundo resto de aminoácido distinto, en el que el primer y segundo restos de aminoácido distintos son iguales o distintos.
En una realización de la divulgación, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la s Eq ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 1 se reemplaza por un resto de metionina (M). En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que (a) el resto 7 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza por un resto de asparagina (N), (b) el resto 8 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza por un resto de serina (S), (c) el resto 9 de la SEQ ID NO: 2 se reemplaza por un resto de treonina (T), o (d) cualquier combinación de (a)-(c). En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 3, excepto que (a) el resto 1 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de ácido glutámico, (b) el resto 2 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de tirosina (Y), (c) el resto 5 de la SEQ ID NO: 3 se reemplaza por un resto de serina (S), o (d) cualquier combinación de (a)-(c).
Los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, en las que opcionalmente (a) el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (b) el resto 8 y/o el resto 9 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (c) el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, o (d) cualquier combinación de (a)-(c). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, y reemplazos de aminoácidos opcionales, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, y reemplazos de aminoácidos opcionales, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención).
En una realización de la divulgación, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que (a) el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (b) el resto 8 y/o el resto 9 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, (c) el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, o (d) cualquier combinación de (a)-(c). Por ejemplo, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de Cd R2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, el resto 8 de la SEQ ID NO: 13 y el resto 9 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. De manera alternativa, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto y el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, el resto 8 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, el resto 9 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, y el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. Cada uno del resto 9 de la s Eq ID NO: 12, los restos 8 y 9 de la SEQ ID NO: 13, y el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 pueden reemplazarse por cualquier resto de aminoácido adecuado que puede ser el mismo o distinto en cada posición. Por ejemplo, el resto de aminoácido de una primera posición puede reemplazarse por un primer resto de aminoácido distinto, y el resto de aminoácido de una segunda posición se puede reemplazar por un segundo resto de aminoácido distinto, en el que el primer y segundo restos de aminoácido distintos son iguales o distintos. En una realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que el resto 9 de la SEQ ID NO: 12 se reemplaza por un resto de leucina (L). En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ iD NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que (a) el resto 8 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de tirosina (Y), y/o (b) el resto 9 de la SEQ ID NO: 13 se reemplaza por un resto de alanina (A). En otra realización, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la s Eq ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 14, excepto que el resto 5 de la SEQ ID NO: 14 se reemplaza por un resto de treonina (T).
Los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 21. Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la Se Q ID NO: 21, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 21, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención). Los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.
Además, en los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina mencionados anteriormente pueden insertarse uno o más aminoácidos. En la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede insertarse cualquier número de aminoácidos adecuados. A este respecto, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina pueden insertarse al menos un aminoácido (por ejemplo, 2 o más, 5 o más, o 10 o más aminoácidos), pero no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, 18 o menos, 15 o menos, o 12 o menos aminoácidos). Preferentemente, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina se insertan 1-10 aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos). A este respecto, el aminoácido (o aminoácidos) puede insertarse en uno cualquiera de los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina mencionados anteriormente en cualquier ubicación adecuada. Preferentemente, el aminoácido (o aminoácidos) se inserta en una CDR (por ejemplo, CDR1 CDR2 o CDR3) del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica (por ejemplo, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica) a una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-11, las SEQ ID NO: 15-18 y las SEQ ID NO: 22­ 25. La "identidad" de secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, como se describe en el presente documento, puede determinarse comparando una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de interés con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de referencia. El porcentaje de identidad es el número de nucleótidos o restos de aminoácido que son iguales (es decir, que son idénticos) entre la secuencia de interés y la secuencia de referencia, dividido por la longitud de la secuencia más larga (es decir, la longitud de la secuencia de interés o la secuencia de referencia, la que sea más larga). Se conocen varios algoritmos matemáticos para obtener el alineamiento óptimo y calcular la identidad entre dos o más secuencias, y están incorporados en varios programas de programas informáticos disponibles. Los ejemplos de tales programas incluyen CLUSTAL-W, T-Coffee y ALIGN (para el alineamiento de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos), los programas BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ y versiones posteriores del mismo) y los programas FASTA (por ejemplo, FASTA3x, FASTM y SSEARCH) (para búsquedas de alineamiento de secuencia y de similitud de secuencia). Los algoritmos de alineamiento de secuencias también se desvelan en, por ejemplo, Altschul y col., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin y col., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), y Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido (1997)).
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 27. En una realización, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 27. Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 27, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 27, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención). Los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender la SEC ID NO: 28 o la SEC ID NO: 29.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31. En una realización, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31, en las que opcionalmente el resto 12 de la SEQ ID NO: 30 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31, y reemplazos de aminoácidos opcionales, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31, y reemplazos de aminoácidos opcionales, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención).
A este respecto, por ejemplo, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado de la divulgación puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31, excepto que el resto 12 de la SEQ ID NO: 30 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. El resto 12 de la SEQ ID NO: 30 se puede reemplazar por cualquier resto de aminoácido adecuado. En una realización, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 31, excepto que el resto 12 de la SEQ ID NO: 30 se reemplaza por un resto de treonina (T). Los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad 1 (CDR) de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37. En una realización, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37, en el que, opcionalmente, (a) el resto 5 de la SEQ ID NO: 36 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, y/o (b) el resto 4 de la SEQ ID NO: 37 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37, y reemplazos de aminoácidos opcionales, se pueden incluir componentes adicionales en el polipéptido que no afecten materialmente al polipéptido (por ejemplo, fracciones proteicas, tales como biotina, que facilitan la purificación o el aislamiento). Cuando el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37, y reemplazos de aminoácidos opcionales, el polipéptido no comprende ningún componente adicional (es decir, componentes que no son endógenos al polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención). A este respecto, por ejemplo, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37. De manera alternativa, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado puede comprender una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37, excepto que (a) el resto 5 de la SEQ ID NO: 36 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto, y/o (b) el resto 4 de la SEQ ID NO: 37 se reemplaza por un resto de aminoácido distinto. Cada uno del 5 de la SEQ ID NO: 36, y el resto 4 de la SEQ ID NO: 37 pueden reemplazarse por cualquier resto de aminoácido adecuado que puede ser el mismo o distinto en cada posición. Por ejemplo, el resto de aminoácido de una primera posición puede reemplazarse por un primer resto de aminoácido distinto, y el resto de aminoácido de una segunda posición se puede reemplazar por un segundo resto de aminoácido distinto, en el que el primer y segundo restos de aminoácido distintos son iguales o distintos.
En una realización de la divulgación, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de la SEQ ID NO: 35, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de la SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de la SEQ ID NO: 37, excepto que (a) el resto 5 de la SEQ ID NO: 36 se reemplaza por un resto de leucina (L), y/o (b) el resto 4 de la SEQ ID NO: 37 se reemplaza por un resto de asparagina (N). Los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina ilustrativos como se describen anteriormente pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.
Además, en los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina mencionados anteriormente pueden insertarse uno o más aminoácidos. En la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede insertarse cualquier número de aminoácidos adecuados. A este respecto, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina pueden insertarse al menos un aminoácido (por ejemplo, 2 o más, 5 o más, o 10 o más aminoácidos), pero no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, 18 o menos, 15 o menos, o 12 o menos aminoácidos). Preferentemente, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina se insertan 1-10 aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos). A este respecto, el aminoácido (o aminoácidos) puede insertarse en uno cualquiera de los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina mencionados anteriormente en cualquier ubicación adecuada. Preferentemente, el aminoácido (o aminoácidos) se inserta en una CDR (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina.
La divulgación proporciona un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica (por ejemplo, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica) a una cualquiera de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ iD NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41. La "identidad" de secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, como se describe en el presente documento, puede determinarse utilizando los procedimientos descritos en el presente documento.
La divulgación proporciona un agente de unión a muerte programada 1 (PD-1) aislado, que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, las secuencias de aminoácidos aisladas de la invención descritas en el presente documento. Por "agente de unión a muerte programada 1 (PD-1)" se entiende una molécula, preferentemente una molécula proteinácea, que se une específicamente a la proteína muerte programada 1 (PD-1). Preferentemente, el agente de unión a PD-1 es un anticuerpo o un fragmento (por ejemplo, un fragmento inmunogénico) del mismo. El agente de unión a PD-1 aislado de la invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina aislado de la invención y/o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado de la invención. En una realización, el agente de unión a PD-1 aislado comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención. En otra realización, el agente de unión a PD-1 aislado comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención.
La divulgación no se limita a un agente de unión a PD-1 aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polipéptido de cadena pesada y/o un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene reemplazos, inserciones y/o deleciones de los restos de aminoácido específicos desvelados en el presente documento. De hecho, se puede reemplazar cualquier resto de aminoácido del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención y/o el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, en cualquier combinación, por un resto de aminoácido distinto, o se puede delecionar o insertar, siempre que la actividad biológica del agente de unión a PD-1 se potencie o mejore como resultado de los reemplazos, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos. La "actividad biológica" de un agente de unión a PD-1 se refiere a, por ejemplo, la afinidad de unión por PD-1 o un epítopo de PD-1 particular, la neutralización o inhibición de la unión de la proteína PD-1 a sus ligandos PD-L1 y PD-L1, la neutralización o inhibición in vivo de la actividad de la proteína PD-1 (por ejemplo, CI50), la farmacocinética y la reactividad cruzada (por ejemplo, con homólogos u ortólogos no humanos de la proteína PD-1, o con otras proteínas o tejidos). Otras propiedades o características biológicas de un agente de unión a antígeno reconocidas en la técnica incluyen, por ejemplo, avidez, selectividad, solubilidad, plegamiento, inmunotoxicidad, expresión y formulación. Las propiedades o características mencionadas anteriormente se pueden observar, medir y/o evaluar utilizando técnicas convencionales, que incluyen, pero no limitado a, ELISA, ELISA competitivo, análisis de resonancia de plasmón superficial (BIACORE™), o KINEXA™, ensayos de neutralización in vitro o in vivo, ensayos de unión receptor-ligando, ensayos de producción y/o secreción de citocinas o factores de crecimiento, y ensayos de transducción de señales e inmunohistoquímica.
Los términos "inhibir" o "neutralizar", como se usa en el presente documento con respecto a la actividad de un agente de unión a PD-1, se refieren a la capacidad de antagonizar, prohibir, prevención, restringir, ralentizar, interrumpir, alterar, eliminar, detener o invertir sustancialmente la progresión o gravedad de, por ejemplo, la actividad biológica de una proteína PD-1, o una enfermedad o afección asociada con una proteína PD-1. El agente de unión a PD-1 aislado de la invención preferentemente inhibe o neutraliza la actividad de una proteína PD-1 en al menos aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 100 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
El agente de unión a PD-1 aislado de la divulgación puede ser un anticuerpo completo, como se describe en el presente documento, o un fragmento de anticuerpo. Las expresiones "fragmento de un anticuerpo", "fragmento de anticuerpo", y "fragmento funcional de un anticuerpo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (véase, generalmente, Holliger y col., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). El agente de unión a PD-1 aislado puede contener cualquier fragmento de anticuerpo de unión a PD-1. El fragmento de anticuerpo comprende convenientemente, por ejemplo, una o más CDR, la región variable (o partes de la misma), la región constante (o partes de la misma) o combinaciones de las mismas. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 , (ii) un fragmento F(ab')2 , que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra, (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo de un anticuerpo individual, (iv) un fragmento Fab', que es el resultado de la ruptura del puente disulfuro de un fragmento F(ab')2 utilizando condiciones reductoras suaves, (v) un fragmento Fv estabilizado por disulfuro (dsFv) y (vi) un anticuerpo de dominio (dAb), que es un polipéptido de dominio de región variable (VH o VL) individual de anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
En realizaciones de la divulgación en que el agente de unión a PD-1 aislado comprende un fragmento del polipéptido de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, el fragmento puede ser de cualquier tamaño siempre que el fragmento se una a, y preferentemente inhiba la actividad de, una proteína PD-1. A este respecto, un fragmento del polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina comprende, convenientemente, entre aproximadamente 5 y 18 (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores) aminoácidos. De manera similar, un fragmento del polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina comprende, convenientemente, entre aproximadamente 5 y 18 (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores) aminoácidos.
Cuando el agente de unión a PD-1 es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende, convenientemente, una región constante (Fc) de cadena pesada de cualquier clase adecuada. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que se basa en anticuerpos IgG1, IgG2 o IgG4 de tipo silvestres, o variantes de los mismos.
El agente de unión a PD-1 de la divulgación también puede ser un fragmento de anticuerpo monocatenario. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos monocatenarios incluyen, pero sin limitación, (i) un Fv monocatenario (scFv), que es una molécula monovalente que consiste en los dos dominios del fragmento Fv (es decir, Vl y Vh) unidos por un engarce sintético que permite sintetizar los dos dominios como una única cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Bird y col., Science, 242: 423-426 (1988); Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); y Osbourn y col., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) y (ii) a diacuerpo, que es un dímero de cadenas polipeptídicas, en el que cada cadena polipeptídica comprende un Vh conectado a un Vl mediante un engarce polipéptido que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre el Vh y el Vl en la misma cadena polipeptídica, dirigiendo así el emparejamiento entre los dominios complementarios en cadenas polipeptídicas de Vh -Vl distintas para generar una molécula dimérica que tiene dos sitios de unión a antígeno funcionales. Los fragmentos de anticuerpo se conocen en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, la Publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2009/0093024 A1.
El agente de unión a PD-1 aislado de la divulgación puede ser un intracuerpo o un fragmento del mismo. Un intracuerpo es un anticuerpo que se expresa y que funciona de forma intracelular. Los intracuerpos carecen normalmente de enlaces disulfuro y son capaces de modular la expresión o actividad de genes diana a través de su actividad de unión específica. Los intracuerpos incluyen fragmentos de dominio único tales como dominios Vh y Vl aislados y scFvs. Un intracuerpo puede incluir señales de tráfico subcelular unidas al extremo N o C del intracuerpo para permitir la expresión a altas concentraciones en los compartimentos subcelulares donde se encuentra una proteína diana. Tras la interacción con un gen diana, un intracuerpo modula la función de la proteína diana y/o logra la desactivación fenotípica/funcional mediante mecanismos tales como la aceleración de la degradación de la proteína diana y el secuestro de la proteína diana en un compartimento subcelular no fisiológico. Otros mecanismos de inactivación génica mediada por intracuerpos pueden depender del epítopo al que se dirige el intracuerpo, tal como la unión al sitio catalítico en una proteína diana o a epítopos que están implicados en interacciones proteína-proteína, proteína-ADN o proteína-ARN.
El agente de unión a PD-1 aislado de la divulgación puede ser un conjugado de anticuerpo. A este respecto, el agente de unión a PD-1 aislado puede ser un conjugado de (1) un anticuerpo, un armazón alternativo o fragmentos de los mismos, y (2) una fracción proteica o no proteica que comprenda al agente de unión a PD-1. Por ejemplo, el agente de unión a PD-1 puede ser todo o parte de un anticuerpo conjugado a un péptido, una molécula fluorescente o un agente quimioterapéutico.
El agente de unión a PD-1 aislado de la divulgación puede ser o puede obtenerse de, un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano o un anticuerpo quimérico. Por "quimérico" se entiende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende regiones tanto humanas como no humanas. Preferentemente, el agente de unión a PD-1 aislado es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo monoclonal que comprende un armazón de anticuerpo humano y al menos una c Dr obtenida o procedente de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos no humanos incluyen anticuerpos aislados de cualquier animal no humano, tal como, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata). Un anticuerpo humanizado puede comprender, uno, dos o tres c Dr obtenidas o procedentes de un anticuerpo no humano. En una realización preferente, el CDRH3 del agente de unión a PD-1 de la invención se obtiene o procede de un anticuerpo monoclonal de ratón, mientras que las regiones variables restantes y la región constante del agente de unión a PD-1 de la invención se obtienen o proceden de un anticuerpo monoclonal humano.
Un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado se puede obtener por cualquier medio, incluyendo a través de fuentes in vitro (por ejemplo, un hibridoma o una línea celular que produce un anticuerpo de forma recombinante) y de fuentes in vivo (por ejemplo, roedores). Los procedimientos para la generación de anticuerpos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual,
CSH Press (1988); y Janeway y col. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En determinadas realizaciones, se puede generar un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico utilizando un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) en el que se reemplazan uno o más genes de inmunoglobulina endógenos por uno o más genes de inmunoglobulina humanos. Los ejemplos de ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpos endógenos se reemplazan de forma eficaz por genes de anticuerpos humanos incluyen, pero sin limitación, e1HUMAB-MOUSE™ de Medarex, el TC MOUSE™ de Kirin y el KM-Mo Us E™ de Kyowa Kirin (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), y Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Se puede generar un anticuerpo humanizado utilizando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica (véase, por ejemplo, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, Nueva Jersey (2009)), incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR no humana en un armazón de anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri y col., Methods, 36(1): 25-34 (2005); y Hou y col., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). En una realización, se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando los procedimientos descritos en, por ejemplo, la Publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2011/0287485 A1.
En una realización preferente, el agente de unión a PD-1 se une a un epítopo de una proteína PD-1 que bloquea la unión de PD-1 a PD-L1. La invención también proporciona un epítopo aislado o purificado de una proteína PD-1, que bloquea la unión de PD-1 a PD-L1 de manera indirecta o alostérica.
La invención también proporciona una o más secuencias de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención y el anti-anticuerpo de PD-1 de la invención
La expresión "secuencia de ácido nucleico" pretende abarcar un polímero de ADN o ARN, es decir, un polinucleótido, que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o modificados. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" como se usan en el presente documento se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estas expresiones se refieren a la estructura primaria de la molécula y, por lo tanto, incluyen ADN bicatenario y monocatenario y ARN bicatenario y monocatenario. Las expresiones incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN preparados con análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque sin limitación, polinucleótidos metilados y/o protegidos. Los ácidos nucleicos están unidos normalmente a través de enlaces fosfato para formar secuencias de ácido nucleico o polinucleotídicas, aunque se conocen muchos otros enlaces en la técnica (por ejemplo, de fosforotioatos, boranofosfatos y similares). Las secuencias de ácido nucleico ilustrativas que codifican los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55. Las secuencias de ácido nucleico ilustrativas que codifican los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, la SEQ iD No : 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64.
La invención proporciona además un vector que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, del anti-anticuerpo de PD de la invención. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, episoma, cósmido, vector vírico (por ejemplo, retrovírico o adenovírico) o fago. Los vectores adecuados y los procedimientos de preparación de vectores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994)).
Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina de la invención y del polipéptido pesado, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, del agente de unión a PD-1 anti-anticuerpo de la invención, el vector comprende preferentemente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES, forma siglada de internal ribosome entry sites), y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora. Se conocen en la técnica secuencias de control de la expresión de ejemplo, y se describen en, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
Se conocen bien en la técnica un gran número de promotores, incluidos promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, de una variedad de fuentes distintas. Las fuentes representativas de promotores incluyen, por ejemplo, virus, mamíferos, insectos, plantas, levaduras y bacterias, y los promotores adecuados de estas fuentes están fácilmente disponibles, o pueden fabricarse sintéticamente, basándose en secuencias disponibles públicamente, por ejemplo, de depositarios tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en una dirección) o bidireccionales (es decir, iniciar la transcripción en dirección 3' o 5'). Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, por ejemplo, el sistema de expresión bacteriana T7, sistema de expresión bacteriana pBAD (araA), el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de SV40, el promotor de VSR. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, el sistema Tet (Patentes de Estados Unidos 5.464.758 y 5.814.618), el sistema inducible por Ecdisona (No y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346­ 3351 (1996)), el sistema T-REX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), el sistema LACSWiTCH™ (Stratagene, San Diego, CA) y el sistema de recombinasa inducible por tamoxifeno Cre-ERT (Indra y col., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); la patente de Estados Unidos 7.112.715; y Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).
El término "potenciador" como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN que aumenta la transcripción de, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico a la que está unida operativamente. Los potenciadores se pueden ubicar a muchas kilobases de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico y pueden mediar en la unión de factores reguladores, los patrones de metilación del ADN o cambios en la estructura del ADN. Se conoce bien en la técnica un gran número de potenciadores de una diversidad de fuentes distintas y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (de, por ejemplo, depositarios tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Varios polinucleótidos que comprenden promotores (tales como el promotor de CMV comúnmente utilizado) también comprenden secuencias potenciadoras. Los potenciadores se pueden ubicar corriente arriba, dentro o corriente abajo de las secuencias codificantes.
El vector también puede comprender un "gen marcador de selección". La expresión "gen marcador de selección", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que permite que las células que expresan la secuencia de ácido nucleico se seleccionen específicamente a favor o en contra, en presencia de un agente de selección correspondiente. Los genes marcadores de selección adecuados se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la Publicaciones de solicitud de patente internacional WO 1992/008796 y WO 1994/028143; Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527­ 1531 (1981); Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre y col., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent y col., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler y col., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy y col., Cell, 22: 817-823 (1980); y las Patentes de EE.UU. 5.122.464 y 5.770.359.
En algunas realizaciones, el vector es un "vector de expresión episómico" o "episoma", que es capaz de multiplicarse en una célula hospedadora y persiste como un segmento de ADN extracromosómico dentro de la célula hospedadora en presencia de una presión de selección adecuada (véase, por ejemplo, Conese y col., Gene Therapy, 11: 1735­ 1742 (2004)). Los vectores de expresión episómicos disponibles en el mercado representativos incluyen, pero sin limitación, plásmidos episómicos que utilizan el antígeno nuclear de Epstein Barr 1 (EBNA1) y el origen de replicación (oriP) del virus de Epstein Barr (v Eb ). Los vectores pREP4, pCEP4, pREP7 y pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representan ejemplos no limitantes de un vector episómico que utiliza el antígeno T y el origen de replicación de SV40 en lugar de EBNA1 y oriP.
Otros vectores adecuados incluyen vectores de expresión de integración, que pueden integrarse aleatoriamente en el ADN de la célula hospedadora o que pueden incluir un sitio de recombinación para permitir la recombinación específica entre el vector de expresión y el cromosoma de la célula hospedadora. Dichos vectores de expresión de integración pueden utilizar las secuencias de control de expresión endógenas de los cromosomas de la célula hospedadora para efectuar la expresión de la proteína deseada. Los ejemplos de vectores que se integran de una manera específica de sitio incluyen, por ejemplo, los componentes del sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por ejemplo, pcD-NA™5/FRT), o el sistema cre-lox, tal como se puede encontrar en los vectores pExchange-6 Core de Stratagene (La Jolla, CA). Los ejemplos de vectores que se integran aleatoriamente en los cromosomas de la célula hospedadora incluyen, por ejemplo, pcDNA3.1 (cuando se introduce en ausencia de antígeno T) de Invitrogen (Carlsbad, CA), UCOE de Millipore (Billerica, MA) y pCI o pFN10A (ACT) FLEXI™ de Promega (Madison, WI).
También se pueden utilizar vectores víricos. Los vectores de expresión víricos disponibles en el mercado representativos incluyen, pero sin limitación, el sistema Per.C6 basado en adenovirus disponible de Crucell, Inc. (Leiden, Países Bajos), pLP1 basado en lentivirus de Invitrogen (Carlsbad, CA) y los vectores retrovíricos pFB-ERV más pCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden proporcionar a una célula en el mismo vector (es decir, en cis). Para controlar la expresión de cada secuencia de ácido nucleico puede utilizarse un promotor unidireccional. En otra realización, para controlar la expresión de múltiples secuencias de ácido nucleico puede utilizarse una combinación de promotores bidireccionales y unidireccionales. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden proporcionar a la población de células en vectores distintos (es decir, en cis). Cada una de las secuencias de ácido nucleico en cada uno de los vectores distintos puede comprender las mismas o distintas secuencias de control de la expresión. Los vectores distintos se pueden proporcionar a las células de forma simultánea o secuencial.
El vector (o vectores) que comprenden el ácido nucleico (o ácidos nucleicos) que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención se pueden introducir en una célula hospedadora que sea capaz de expresar los polipéptidos codificados por el mismo, incluyendo cualquier célula procariota o eucariota adecuada. Así pues, la invención proporciona una célula aislada que comprende el vector de la invención. Las células hospedadoras preferidas son las que pueden cultivarse de forma fácil y fiable, tienen tasas de crecimiento razonablemente rápidas, tienen sistemas de expresión bien caracterizados y pueden transformarse o transfectarse de forma fácil y eficaz.
Los ejemplos de células procariotas adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de los géneros Bacilo (tal como Bacillus subtilis y Bacillus brevis), Escherichia (tal como E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella y Erwinia. Las células procariotas particularmente útiles incluyen las diversas cepas de Escherichia coli (por ejemplo, K12, HB101 (ATCC N.° 33694), DH5a, DH10, MC1061 (ATCC N.° 53338) y CC102).
Preferentemente, el vector se introduce en una célula eucariota. Las células eucariotas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de levadura, células de insectos y células de mamífero. Los ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen las del género Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces y Schizosaccharomyces. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisae y Pichia pastoris.
Las células de insecto adecuadas se describen en, por ejemplo, Kitts y col., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); y Lucklow y col., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Las células de insecto preferidas incluyen Sf-9 e HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Preferentemente, en la invención se utilizan células de mamífero. Se conocen en la técnica varias células hospedadoras de mamífero adecuadas, y muchas están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO) (ATCC N.° CCL61), células CHO DHFR (Urlaub y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), células de riñón embrionario humano (HEK) 293 o 293T (ATCC N.° CRL1573) y células 3T3 (ATCC N.° CCL92). Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares COS-1 de mono (ATCC N.° CRL1650) y COS-7 (ATCC N.° CRL1651), así como la línea celular CV-1 (ATCC N.° CCL70). Otras células hospedadoras de mamífero ilustrativas incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo líneas celulares transformadas. Las células diploides normales, las estirpes celulares obtenidas del cultivo in vitro de tejido primario, así como los explantes primarios, también son adecuados. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLa, células L-929 de ratón y las líneas celulares de hámster BHK o HaK, las cuales están disponibles en la ATCC. Los procedimientos para la selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas y los procedimientos de transformación, cultivo, amplificación, cribado y purificación de células son conocidos en la técnica.
Muy preferentemente, la célula de mamífero es una célula humana. Por ejemplo, la célula de mamífero puede ser una línea celular obtenida linfoide o linfoide humana, tal como una línea celular de origen en linfocitos pre-B. Los ejemplos de líneas de células linfoides humanas incluyen, sin limitación, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), células Raji (CCL-86) y derivados de las mismas.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la invención puede introducirse en una célula mediante "transfección", "transformación", o "transducción". "Transfección" "transformación", o "transducción", como se usa en el presente documento, se refieren a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula hospedadora mediante el uso de procedimientos físicos o químicos. En la técnica se conocen muchas técnicas de transfección e incluyen, por ejemplo, coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash y col., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Se pueden introducir fagos o vectores víricos en las células hospedadoras, después del cultivo de partículas infecciosas en células de empaquetamiento adecuadas, muchas de los cuales están disponibles en el mercado.
La invención proporciona una composición que comprende una cantidad eficaz del anti-anticuerpo PD-1 de la invención. Preferentemente, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, fisiológicamente aceptable), que comprende un vehículo, preferentemente un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, fisiológicamente aceptable) y las secuencias de aminoácidos de la invención, Se puede utilizar cualquier vehículo adecuado dentro del contexto de la invención, y tales vehículos son bien conocidos en la técnica. Se determinará la elección del vehículo, en parte, por el sitio particular al que se puede administrar la composición y el procedimiento particular utilizado para administrar la composición. La composición opcionalmente puede estar estéril. La composición puede congelarse o liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. Las composiciones se pueden generar en conformidad con técnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA (2001).
La divulgación proporciona además un procedimiento de tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno en que la expresión incorrecta (por ejemplo, sobreexpresión) o la actividad aumentada de una proteína PD-1 provoque o contribuya a los efectos patógenos de la enfermedad, o en que una disminución de los niveles o actividad de la proteína PD-1 tiene un beneficio terapéutico en mamíferos, preferentemente en seres humanos. La divulgación también proporciona un procedimiento de tratamiento de un cáncer o una enfermedad infecciosa en un mamífero. El procedimiento comprende administrar la composición mencionada anteriormente a un mamífero que tiene un cáncer o una enfermedad infecciosa, con lo cual se trata el cáncer o la enfermedad infecciosa en el mamífero. Como se analiza en el presente documento, PD-1 se expresa de manera anómala en una diversidad de cánceres (véase, por ejemplo, Brown y col., J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); y Flies y col., Yale Journal of Biology and Medicine, 84: 409-421 (2011)), y la expresión de PD-L1 en algunos pacientes con carcinoma de células renales se correlaciona con la agresividad del tumor. El procedimiento de la invención puede utilizarse para tratar cualquier tipo de cáncer conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de vesícula biliar, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de glándulas salivales, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y carcinoma de células de Merkel (véase, por ejemplo, Bhatia y col., Curr. Oncol. Rep., 13(6): 488-497 (2011)). El procedimiento de la invención puede utilizarse para tratar cualquier tipo de enfermedad infecciosa (es decir, una enfermedad o trastorno provocado por una bacteria, un virus, un hongo o un parásito). Los ejemplos de enfermedades infecciosas que pueden tratarse mediante el procedimiento de la invención incluyen, pero sin limitación, enfermedades provocadas por un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus respiratorio sincicial (VRS), un virus de la gripe, un virus del dengue, un virus de la hepatitis B (VHB o virus de la hepatitis C (VHC)). La administración de una composición que comprende el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina de la invención, el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina de la invención, el agente de unión a PD-1 de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica cualquiera de los anteriores, o el vector de la invención que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención, induce una respuesta inmunitaria contra un cáncer o una enfermedad infecciosa en un mamífero. Una "respuesta inmunitaria" puede implicar, por ejemplo, la producción de anticuerpos y/o activación de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T).
Como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento", "que trata", y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Preferentemente, el efecto es terapéutico, es decir, el efecto cura parcial o completamente una enfermedad y/o un síntoma adverso atribuible a la enfermedad. Para este fin, el uso terapéutico de la invención implica la administración de una "cantidad terapéuticamente eficaz" del anti-anticuerpo PD-1. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el cuadro clínico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente de unión a PD-1 para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anti-anticuerpo PD-1 de la invención es una cantidad que disminuye la bioactividad de la proteína PD-1 en un ser humano y/o potencia la respuesta inmunitaria contra un cáncer o
De manera alternativa, el efecto farmacológico y/o fisiológico puede ser profiláctico, es decir, el efecto previene total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma. A este respecto, el uso profiláctico de la invención implicó la administración de una cantidad profilácticamente eficaz" del anti-anticuerpo PD-1. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos necesarios, para lograr un resultado profiláctico deseado (por ejemplo, la prevención de la aparición de la enfermedad).
Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1 pg/kg a 20 mg/kg de peso corporal del animal o ser humano; sin embargo, las dosis por debajo o por encima de este intervalo ilustrativo están dentro del ámbito de la invención. La dosis parenteral diaria puede ser de aproximadamente 0,00001 pg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, de aproximadamente 0,001 pg/kg, aproximadamente 0,1 pg/kg, aproximadamente 1 pg/kg, aproximadamente 5 pg/kg, aproximadamente 10 pg/kg, aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), preferentemente de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 pg/kg, aproximadamente 1 pg/kg, aproximadamente 50 pg/kg, aproximadamente 150 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 750 pg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), más preferentemente de aproximadamente 1 pg/kg a 5 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, de aproximadamente 3 pg/kg, aproximadamente 15 pg/kg, aproximadamente 75 pg/kg, aproximadamente 300 pg/kg, aproximadamente 900 pg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), e incluso más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal por día (por ejemplo, de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). La eficacia terapéutica o profiláctica se puede controlar mediante la evaluación periódica de los pacientes tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento puede repetirse hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y están dentro del ámbito de la invención. La dosificación deseada puede suministrarse mediante la administración de una única inyección en embolada de la composición, mediante múltiples administraciones de inyección en embolada de la composición o mediante la administración de infusión continua de la composición.
La composición que comprende una cantidad eficaz del anti-anticuerpo PD-1 de la invención se puede administrar a un ser humano utilizando técnicas de administración convencionales, incluyendo la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o por supositorio. Preferentemente, la composición es adecuada para administración parenteral. El término "parenteral", como se usa en el presente documento, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. Más preferentemente, la composición se administra a un ser humano mediante suministro sistémico periférico mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
Una vez administrado a un ser humano, la actividad biológica del anti-anticuerpo de PD-1 de la invención se puede medir mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad biológica puede evaluarse determinando la estabilidad de un anticuerpo anti-PD-1 particular. En una realización de la divulgación, el agente de unión a PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo) tiene una semivida in vivo de entre aproximadamente 30 minutos y 45 días (por ejemplo, de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 5 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 35 días, aproximadamente 40 días, aproximadamente 45 días, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). En otra realización, el agente de unión a PD-1 tiene una semivida in vivo de entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 20 días (por ejemplo, de aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 19 días, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). En otra realización, el agente de unión a PD-1 tiene una semivida in vivo de entre aproximadamente 10 días y aproximadamente 40 días (por ejemplo, de aproximadamente 10 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 23 días, aproximadamente 26 días, aproximadamente 29 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 33 días, aproximadamente 37 días, aproximadamente 38 días, aproximadamente 39 días, aproximadamente 40 días, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores).
La actividad biológica de un agente de unión a PD-1 particular también puede evaluarse determinando su afinidad de unión a una proteína PD-1 o un epítopo de la misma. El término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como la constante de disociación (KD). La afinidad de un agente de unión a un ligando, tal como la afinidad de un anticuerpo por un epítopo, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 picomolar (pM) a aproximadamente 100 micromolar (pM) (por ejemplo, de aproximadamente 1 picomolar (pM) a aproximadamente 1 nanomolar (nM), de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 micromolar (pM), o de aproximadamente 1 pM hasta aproximadamente 100 pM). En una realización, el agente de unión a PD-1 puede unirse a una proteína PD-1 con una Kd menor o igual a 1 nanomolar (por ejemplo, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM, 0,001 nM, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). En otra realización, el agente de unión a PD-1 puede unirse a PD-1 con una Kd menor o igual a 200 pM (por ejemplo, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). La afinidad de las inmunoglobulinas por un antígeno o epítopo de interés puede medirse utilizando cualquier ensayo reconocido en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), perlas separables (por ejemplo, perlas magnéticas), resonancia de plasmón superficial (SPR, forma siglada de surface plasmon resonance), competición de fase en solución (KINEXA™), selección de antígenos y/o ELISA (véase, por ejemplo, Janeway y col. (eds.), Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, Nueva York, Ny , 2001).
El anti-anticuerpo PD-1 de la invención puede administrarse solo o en combinación con otros fármacos (por ejemplo, como un adyuvante). Por ejemplo, el anti anticuerpo PD-1 se puede administrar en combinación con otros agentes para el tratamiento o la prevención de las enfermedades desveladas en el presente documento. A este respecto, el anticuerpo anti-PD-1 se puede utilizar en combinación con al menos otro agente antineoplásico que incluye, por ejemplo, cualquier agente quimioterapéutico conocido en la técnica, radiación ionizante, agentes antineoplásicos de molécula pequeña, vacunas contra el cáncer, terapias biológicas (por ejemplo, otros anticuerpos monoclonales, virus que destruyen el cáncer, terapia génica y transferencia adoptiva de linfocitos T) y/o cirugía.
En otra realización, el anti-anticuerpo PD-1 de la invención se puede administrar en combinación con otros agentes que inhiben las rutas de puntos de control inmunitarios. Por ejemplo, el agente anti-anticuerpo PD-1 de la invención se puede administrar en combinación con agentes que inhiben o antagonizan las rutas de CTLA-4, TIM-3 o LAG-3. Los tratamientos combinados que se dirigen simultáneamente a dos o más de estas rutas de punto de control inmunitario han demostrado una actividad antitumoral mejorada y potencialmente sinérgica (véase, por ejemplo, Sakuishi y col., J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow y col., Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); y Woo y col., Cancer Res., 72: 917-927 (2012)). En una realización, el anti-anticuerpo PD-1 de la invención se administra en combinación con un anticuerpo que se une a TIM-3 y/o un anticuerpo que se une a LAG-3. A este respecto, el uso terapéutico de la invención de tratamiento de un cáncer en un ser humano puede comprender además administrar al ser humano una composición que comprende (i) un anticuerpo que se une a una proteína TIM-3 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, o una composición que comprende (i) un anticuerpo que se une a una proteína LAG-3 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además de los usos terapéuticos, el agente de unión a PD-1 descrito en el presente documento puede utilizarse en aplicaciones de diagnóstico o investigación. A este respecto, el agente de unión a PD-1 puede utilizarse en un procedimiento para diagnosticar un cáncer o una enfermedad infecciosa. De forma similar, el agente de unión a PD-1 puede utilizarse en un ensayo para controlar los niveles de proteína PD-1 en un sujeto que se somete a prueba para detectar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala de PD-1. Las aplicaciones en investigación incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilizan el agente de unión a PD-1 y un marcador para detectar una proteína PD-1 en una muestra, por ejemplo, en un líquido corporal humano o en un extracto de células o tejidos. El agente de unión a PD-1 puede utilizarse con o sin modificación, tal como marcaje covalente o no covalente con una fracción detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo (por ejemplo, 3H, 14C, 32P, 35S o 125I), un compuesto fluorescente o quimioluminiscente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante), o grupos protésicos. En el contexto de la invención puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar por separado un agente de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) con una fracción detectable (véase, por ejemplo, Hunter y col., Nature, 194: 495-496 (1962); David y col., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)).
Los niveles de proteína PD-1 pueden medirse utilizando el agente de unión a PD-1 de la invención mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) y FACS. Los valores de expresión normales o convencionales de la proteína PD-1 se pueden establecer utilizando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, mediante la combinación de una muestra que comprende, o se sospecha que comprende, un polipéptido PD-1 con un anticuerpo específico para PD-1 en condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable, para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las substancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos (véase, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). La cantidad de polipéptido PD-1 expresada en una muestra se compara luego con un valor patrón.
El agente de unión a PD-1 se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación de reactivos empaquetada en cantidades predeterminadas, con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Si el agente de unión a PD-1 está marcado con una enzima, el kit incluye convenientemente sustratos y cofactores necesarios para la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona un cromóforo o fluoróforo detectable). Además, en el kit pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos (normalmente liofilizados), incluyendo excipientes que al disolverse proporcionarán una solución del reactivo con la concentración apropiada.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse como una limitación de su ámbito.
EJEMPLO 1
Este ejemplo demuestra un procedimiento para la generación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la PD-1 humana.
Se generaron varias formas de genes que codifican PD-1 humana y sus ligandos PD-L1 y PD-L2 como antígenos para su uso en la inmunización de ratones, el cribado de hibridomas y la maduración de afinidad de anticuerpos injertados con CDR, y se muestran esquemáticamente en la Figura 1. Los genes de PD-1 humanos y de mono cinomolgo de longitud completa se expresaron con su secuencia líder nativa y sin etiquetas añadidas, utilizando un vector de expresión individual con elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) con selección por higromicina (Millipore, Billerica, MA). Se transfectaron células CHO-K1 de forma estable con Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la selección con higromicina, las células que expresaban PD-1 en la superficie celular se identificaron mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo de ratón conjugado con PE frente a PD-1 humana (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) y se subclonaron. A continuación, se seleccionaron los subclones en cuanto a una expresión de PD-1 uniforme y de alto nivel.
Se construyeron secuencias de ácido nucleico que codificaban formas monoméricas solubles del dominio extracelular (ECD, forma siglada de extracellular domain) de PD-1 humana y de mono cinomolgo con etiquetas de His unidas al extremo C del ECD o como proteínas de fusión diméricas solubles con el Fc de IgG2a de ratón, como se indica en la Figura 1. Se construyeron secuencias de ácido nucleico que codificaban formas diméricas solubles de los ECD de PD-L1 y PD-L2 humanos como proteínas de fusión con el Fc de IgG1 de ratón, como se indica en la Figura 1. Las proteínas solubles se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 o en líneas de células CHO estables utilizando técnicas convencionales. Las proteínas etiquetadas con His se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía en columna de afinidad de Ni seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. Las proteínas de fusión con el Fc de IgG se purificaron utilizando cromatografía de afinidad de proteína A/G. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño para asegurar la homogeneidad. Adicionalmente, la identidad y el tamaño se confirmaron mediante espectrometría de masas.
Para experimentos de clasificación por FACS, las proteínas purificadas se marcaron con biotina utilizando un reticulante de éster de NHS (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) o con el colorante fluorescente DyLight 650 (Thermo-Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) utilizando técnicas convencionales.
Los ratones se inmunizaron con células CHO que expresaban PD-1 de longitud completa en la superficie celular o con la proteína ECD His de PD-1. Específicamente, se adquirieron ratones BALB/c hembra (7 semanas de edad) de Harlan Laboratories, Inc. (Indianapolis, IN) y se dividieron en dos grupos. Después de seis días de aclimatación, un grupo de animales se inmunizó con cuatro dosis semanales de ECD-His de PD-1 humana purificada a 50 pg/ratón, como una emulsión 1:1 con TITERMAX GOLD™ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). La inmunización se llevó a cabo por vía subcutánea alrededor de las axilas y las regiones inguinales. Al segundo grupo de animales se le inyectaron cuatro dosis semanales de células CHO-K1 que expresaban de forma estable PD-1 humana de longitud completa (5 x 106 células/ratón) por vía subcutánea alrededor de las regiones inguinales. Después de diez días, se les extrajo sangre a los animales para medir el título en suero para PD-1, y un animal de cada grupo se reforzó con PD-1 humana soluble después de un descanso de 3 semanas. Después de tres días, se recogieron los bazos, los ganglios linfáticos axilares/braquiales y los ganglios linfáticos inguinales de cada animal. Se agruparon las suspensiones de células individuales de células de todos los tejidos recogidos de ambos animales y se utilizaron para la generación de hibridomas mediante fusión celular utilizando técnicas convencionales. Para la fusión se utilizaron dos líneas celulares de mieloma distintas, F0 (como se describe en de St. Groth y Scheidegger, J. Immunol. Methods, 35: 1-21 (1980)) y P3X63Ag8.653 (como se describe en Kearney y col., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)).
Los sobrenadantes de hibridomas de diez placas de 96 pocillos se cribaron en cuanto a la unión a un clon de células CHO-K1 transfectado de manera estable con una secuencia de ácido nucleico que codifica la PD-1 humana de longitud completa y se comparó con la unión a células CHO-K1 no transfectadas. Específicamente, los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron 1:1 con PBS/SFB al 2 % y se incubaron con un volumen igual de células PD-1 CHO-K1 (2,5x105 células en PBS, SFB al 2 %) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se centrifugaron, se lavaron una vez con PBS/SFB al 1 % y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón conjugada con APC (H+L) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces en PBS/SFB al 2 %, se resuspendieron en PBS, SFB al 2 %, paraformaldehído al 1 %, y se analizó la fluorescencia en un bioanalizador b D FACSARRAY™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Los niveles de IgG de ratón se cuantificaron mediante ELISA.
Basándose en una fuerte unión a las células CHO PD-1, se expandieron 46 pocillos parentales y se analizó la capacidad de los sobrenadantes para bloquear la unión de la proteína de fusión PD-L1-Fc de IgG1r marcada con DyL650 a células PD-1 CHO. Específicamente, los anticuerpos monoclonales de ratón purificados se incubaron de una forma de respuesta a la dosis con la concentración de Ce30 de PD-L1-DyL650 (10 nM), y la inhibición se cuantificó mediante citometría de flujo. Las células de los pocillos que mostraban la mejor actividad de bloqueo de PD-L1 y los niveles más altos de IgG de ratón se subclonaron para el análisis posterior, incluyendo purificación y secuenciación de las cadenas pesada y ligera (Vh y Vl). Se seleccionaron once de los bloqueadores más fuertes de la interacción PD-1/PD-L1 para la subclonación. Después de la reconfirmación de la unión a PD-1 y el bloqueo de PD-L1, se aumentó la escala de los subclones seleccionados y el sobrenadante se sometió a purificación de anticuerpos. Se verificó la unión de los anticuerpos purificados a PD-1 humana y de mono cinimolgo, y la actividad de bloqueo de PD-L1. Se determinaron los valores de Kd mediante resonancia de plasmón superficial en un instrumento BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Waukesha, WI) y se determinaron las constantes cinéticas utilizando el programa informático de evaluación BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Waukesha, WI). A este respecto, los anticuerpos se capturaron en un chip CM5 de BIACORE™ al que se acopló IgG anti-ratón GE. Se hizo fluir monómero de PD-1-His sobre el anticuerpo capturado utilizando diluciones en serie con factor dos o tres, comenzando con 500 nM en la concentración más alta. Los sensogramas resultantes se ajustaron globalmente utilizando un modelo de unión 1:1 para calcular las constantes de asociación y disociación, y las afinidades consiguientes (Kd).
Los resultados de este ejemplo demuestran un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales que se unen a PD-1 humana y de mono cinomolgo y bloquean la unión del ligando de PD-1.
EJEMPLO 2
Este ejemplo describe el diseño y generación de anticuerpos monoclonales anti-PD-1 quiméricos y de CDR injertada.
Se isotiparon los subclones de los hibridomas que produjeron anticuerpos de unión a PD-1 con actividad bloqueante de PD-L1 como se describe en el Ejemplo 1, se sometieron a RT-PCR para clonar la región variable de cadena pesada (Vh) y la región variable de cadena ligera (Vl) de anticuerpo y se secuenciaron. Específicamente, se aisló ARN de sedimentos celulares de clones de hibridoma (5 x 105 células/sedimento) utilizando el kit RNEASY™ (Qiagen, Venlo, Países Bajos), y se preparó ADNc utilizando el SUPERSCRIPT™ III First-Strand Synthesis System (Life Technologies, Carlsbad, CA) cebado con oligo-dT. La amplificación por PCR de la Vl utilizó un grupo de 9 u 11 cebadores directos degenerados para Vl de ratón (véase Kontermann y Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer-Verlag, Berlín (2001)) y un cebador inverso para la región constante k de ratón. La amplificación por PCR de la Vh utilizó un grupo de 12 cebadores directos degenerados para V h de ratón (Kontermann y Dubel, citado anteriormente) y un cebador inverso de para la región constante y1 o Y2a de ratón (basado en el isotipado del anticuerpo purificado de cada clon), con el protocolo recomendado en el SUPERSCRIPT™ III First-Stand Synthesis System (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los productos de PCR se purificaron y clonaron en pcDNA3.3-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, CA). Las colonias individuales de cada sedimento celular (24 cadenas pesadas y 48 cadenas ligeras) se seleccionaron y secuenciaron utilizando la metodología de secuenciación convencional de Sanger (Genewiz, Inc., South Plainfield, Nueva Jersey). Las secuencias de la región variable se examinaron y alinearon con la secuencia de la línea germinal de la región V de la cadena pesada o de la cadena ligera humana más cercana. Para el injerto de CDR se seleccionaron tres anticuerpos: (1) 9A2, que comprende una Vh de la SEQ ID NO: 4 y una Vl de la SEQ ID NO: 28, (2) 10B11, que comprende una Vh de la SEQ ID NO: 15 y una Vl de la SEQ ID NO: 32, y (3) 6E9, que comprende una Vh de la SEQ ID NO: 22 y una Vl de la SEQ ID NO: 38.
Las secuencias de anticuerpos injertadas con CDR se diseñaron injertando restos de CDR de cada uno de los anticuerpos de ratón descritos anteriormente en el homólogo de línea germinal de ser humano más cercano. Se sintetizaron las regiones variables de anticuerpos injertadas con CDR y se expresaron con regiones constantes de IgG1/K de ser humano para su análisis. Además, se construyeron anticuerpos quiméricos ratón:ser humano utilizando las regiones variables de los anticuerpos de ratón descritos anteriormente unidas a regiones constantes de IgG1/K de ser humano. Los anticuerpos quiméricos e injertados con CDR se caracterizaron en cuanto a su unión a los antígenos PD-1 humana y de mono cinomolgo, y en cuanto a su actividad en el ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 como se describe anteriormente.
La actividad antagonista funcional de los anticuerpos quiméricos e injertados con CDR también se analizó en un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR) de linfocitos T CD4+ humanos, en el que se evalúa la activación de los linfocitos T CD4+ en presencia de anticuerpos anti-PD-1 midiendo la secreción de IL-2. Debido a que PD-1 es un regulador negativo de la función de los linfocitos T, se esperaba que el antagonismo de PD-1 diera como resultado una activación aumentada de linfocitos T medida por el aumento de la producción de IL-2. Los anticuerpos injertados con CDR 9A2, 10B11 y 6E9 demostraron actividad antagonista y se seleccionaron en cuanto a la maduración de afinidad.
Los resultados de este ejemplo demuestran un procedimiento de generación de anticuerpos monoclonales quiméricos e injertados con CDR que se unen e inhiben específicamente a PD-1.
EJEMPLO 3
Este ejemplo demuestra la maduración de afinidad de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PD-1.
Los anticuerpos injertados con CDR obtenidos de los anticuerpos monoclonales murinos originales, (9A2, 10B11 y 6E9), se sometieron a maduración de afinidad a través de hipermutación somática in vitro. Cada anticuerpo se presentó en la superficie de células HEK 293c18 utilizando el sistema temporal SHM-XEL (véase Bowers y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 20455-20460 (2011) y la publicación de Solicitud de Patente de EE.UU n.° 2013/0035472). Después del establecimiento de líneas episómicas estables, se transfectó en las células un vector para la expresión de citosina desaminasa inducida por activación (DIA) para iniciar la hipermutación somática como se describe en Bowers y col., citado anteriormente. Después de múltiples rondas de clasificación por FACS en condiciones de creciente rigurosidad de unión al antígeno, se identificaron varias mutaciones en la región variable de cada anticuerpo y se recombinaron para producir anticuerpos humanizados maduros con propiedades mejoradas.
Se emparejó un panel de seis secuencias de región variable de cadena ligera y pesada humanizadas con afinidad madurada (indicadas como APE1922, APE1923, APE1924, APE1950, APE1963 y APE2058) y seleccionaron para la caracterización, y se exponen en la Tabla 1. Las propiedades de unión a PD-1 de cada una de estas secuencias de anticuerpo se sometieron a ensayo utilizando resonancia de plasmón superficial (SPR) y análisis de afinidad basado en solución. Los anticuerpos se expresaron a partir de células HEK 293 como anticuerpos IgG1 humanos y se compararon con el anticuerpo de referencia, una versión de IgG1 humana de BMS-936558, designada BMS.
Los análisis de SPR se llevaron a cabo utilizando un instrumento BIACORE™ T200 y las constantes cinéticas se determinaron utilizando el programa informático de evaluación BIACORE™ T200. Se eligieron parámetros experimentales para asegurar que se alcanzara la saturación a las concentraciones más altas de antígeno y que los valores de Rmáx se mantuvieran por debajo de 30 UR. Se inmovilizó IgG anti humano GE (específico para Fc, aproximadamente 7.000 UR) en un chip CM5 de BIACORE™ utilizando química de acoplamiento de amina activada por EDC. A continuación, se capturaron los anticuerpos (0,5 pg/ml, tiempo de captura de 60 segundos) utilizando esta superficie. A continuación, se hizo fluir PD1-Avi-His humana soluble monomérica sobre el anticuerpo capturado (asociación de 300 segundos, disociación de 300 segundos) utilizando una serie de diluciones en serie con factor tres de 500 nM a 2 nM. El anticuerpo y el antígeno capturados se retiraron entre cada ciclo utilizando MgCl23 M (tiempo de contacto de 60 segundos) para asegurar una superficie de unión fresca para cada concentración de antígeno. Los sensogramas resultantes se ajustaron globalmente utilizando un modelo de unión 1:1 para calcular las constantes de asociación y disociación (ka y kd, respectivamente), así como las afinidades (Kd).
Los análisis de afinidad basados en soluciones se llevaron a cabo utilizando un ensayo KINEXA™ 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) y los resultados se analizaron con el programa informático KINEXA™ Pro 3.2.6. Los parámetros experimentales se seleccionaron para alcanzar una señal máxima con anticuerpo solo de entre 0,8 y 1,2 V, al tiempo que se limita la señal de unión inespecífica con tampón solo a menos del 10 % de la señal máxima. Se recubrieron perlas de azlactona (50 mg) con antígeno mediante la dilución en una solución de PD-1-Avi-His (50 pg/ml en 1 ml) en Na2CO3 50 mM. La solución se hizo girar a temperatura ambiente durante 2 horas y las perlas se sedimentaron en una picofuga y se lavaron dos veces con solución de bloqueo (BSA 10 mg/ml, T ris-HCl 1 M, pH 8,0). Las perlas se resuspendieron en solución de bloqueo (1 ml), se hicieron girar a temperatura ambiente durante 1 hora y se diluyeron en 25 volúmenes de PBS/NaN3 al 0,02 %. Para medir la afinidad, el anticuerpo secundario fue colorante anti-IgG humana colorante ALEXFLUOR™ 647 (500 ng/ml). Las concentraciones de anticuerpo de la muestra se mantuvieron constantes (50 pM o 75 pM), mientras que el antígeno PD1-Avi-His se tituló utilizando una serie de diluciones con factor tres de 1 pM a 17 pM. Todas las muestras se diluyeron en PBS, NaN3 al 0,2 %, BSA 1 mg/ml, y se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 30 horas. Adicionalmente, se analizaron muestras que contenían solo anticuerpo y solo tampón para determinar la señal máxima y la señal de unión inespecífica, respectivamente. Los resultados de los análisis de afinidad se muestran en la Tabla 1. Todos los anticuerpos seleccionados presentaron mayores afinidades por PD-1 que el anticuerpo de referencia BMS, siendo APE2058 el anticuerpo con mayor afinidad.
Tabla 1
Figure imgf000018_0001
continuación
Figure imgf000019_0001
Para evaluar la unión de los anticuerpos a PD-1 de superficie celular, se determinó la unión a células CHO que expresan PD-1 humana o de mono cinomolgo mediante análisis por citometría de flujo como se describe anteriormente. Además, el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 se evaluó utilizando PD-L1 marcada con DyL650 (proteína de fusión con el Fc de IgG1 de ratón) y células CHO que expresan PD-1 como se describe anteriormente. Se observaron altas afinidades de unión por PD-1 de superficie celular para todas las secuencias de anticuerpo con afinidad madurada analizadas, con reactividad con PD-1 de mono cinomolgo dentro de un factor de 3-4 veces de la humana. El bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 también fue eficaz con todas las secuencias de anticuerpo con afinidad madurada analizadas, con valores de CI50 en el bajo intervalo de nM. Estos resultados fueron consistentes con las afinidades de unión sometidas a ensayo mediante los sistemas BIACORE™ y KINEXA™ como con los valores de CE50 de superficie celular.
La estabilidad térmica de los anticuerpos seleccionados se evaluó utilizando un ensayo de Thermofluor como se describe en McConnell y col., Protein Eng. Des. Sel., 26: 151 (2013). Este ensayo evalúa la estabilidad a través de la capacidad de un colorante fluorescente hidrófobo para unirse a parches hidrófobos en la superficie de la proteína que se exponen a medida que la proteína se despliega. Para medir la estabilidad térmica se determina la temperatura a la que se despliega el 50 % de la proteína (Tm). Este ensayo demostró que todas las secuencias de anticuerpo con afinidad madurada analizadas tenían una alta estabilidad térmica y todas eran más estables que el anticuerpo de referencia. APE2058 fue el anticuerpo más estable, presentando una Tm más de 10 °C mayor que la Tm de la versión de IgG1 de BMS-936558.
La reducción del riesgo de posibles problemas relacionados con la farmacocinética in vivo de los anticuerpos analizados se llevó a cabo a través de (a) la evaluación de la unión no específica a células diana negativas (véase, por ejemplo, Hotzel y col., mAbs, 4: 753-760 (2012)) y (b) medición de las propiedades de la disociación diferencial del receptor de Fc neonatal (FcRn) (véase, por ejemplo, Wang y col., Drug Metab. Disp., 39: 1469-1477 (2011)). Para evaluar la unión no específica, se analizaron los anticuerpos en cuanto a la unión a células HEK 293f utilizando un ensayo basado en citometría de flujo. Los anticuerpos analizados se compararon con dos anticuerpos aprobados por la f Da , infliximab y denosumab. Los resultados indicaron que la unión no específica era baja para todos los anticuerpos. Para evaluar la unión y disociación de FcRn, tanto el FcRn humano como el FcRn de cinomolgo se analizaron en un ensayo basado en BIACORE™. Los anticuerpos se unieron a FcRn a pH 6,0, y después de ajustar el pH a 7,4, se determinó el anticuerpo unido residual. Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000019_0002
Los resultados de este ejemplo demuestran un procedimiento de generación de los polipéptidos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de la invención, que presentan termoestabilidad y alta afinidad por PD-1.
EJEMPLO 4
Este ejemplo demuestra la actividad de los polipéptidos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de la invención in vitro.
Se analizó la actividad antagonista funcional de las secuencias de Vh y Vl descritas en el Ejemplo 3 en un ensayo de MLR de linfocitos T CD4+ como se describe anteriormente. Para la determinación de la potencia funcional, se determinó la CE50 para cada anticuerpo en cinco experimentos distintos utilizando distintos donantes humanos. Los resultados se muestran en la Tabla 3 y demuestran una potente actividad para cada uno de los anticuerpos seleccionados, que era indistinguible de la actividad del anticuerpo de referencia.
Tabla 3
Figure imgf000020_0001
Los resultados de este ejemplo demuestran que los polipéptidos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de la invención pueden antagonizar la señalización de p D-1, dando como resultado una activación de linfocitos T aumentada.
EJEMPLO 5
Este ejemplo demuestra que una combinación del agente de unión a PD-1 de la invención y un anticuerpo anti-LAG-3 o un anticuerpo anti-TIM-3 potencia la activación de linfocitos T in vitro.
Para establecer los parámetros para los estudios de combinación, el anticuerpo anti-PD-1 APE2058 se tituló en una respuesta a la dosis en el ensayo de MLR de linfocitos T CD4+ humanos descrito anteriormente. El antagonismo de la señalización de PD-1 dio como resultado una activación de linfocitos T aumentada y un aumento correspondiente de 4 a 5 veces de la producción de IL-2.
Basándose en los resultados de la titulación del anticuerpo APE2058 en múltiples ensayos de MLR, se seleccionaron un valor de CE50 de 20 ng/ml y una concentración 10 veces menor que representa un valor de CE10 aproximado (2 ng/ml) para estudios de combinación con anticuerpos antagonistas de las moléculas de punto de control TIM-3 o LAG-3.
Se caracterizó un anticuerpo anti-TIM-3 completamente humano en un ensayo de linfocitos T CD4+ in vitro como teniendo actividad antagonista medida por la producción aumentada de IL-2 en presencia de niveles bajos de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. El anticuerpo anti-TIM-3 demostró actividad en el ensayo de MLR con un valor de CE50 de aproximadamente 0,3 pg/ml, como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 4, que es aproximadamente 15 veces menos actividad que el anticuerpo anti-PD-1 APE2058 solo (CE50 de aproximadamente 0,02 pg/ml). En combinación con 0,02 pg/ml de APE2058, el anticuerpo antagonista anti-TIM-3 estimuló cantidades aumentadas de producción de IL-2 en comparación con APE2058 o anti-TIM-3 solo, dando como resultado una disminución de los valores de CE50 de 10 veces, como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 4. Estos resultados demuestran que la activación potenciada de los linfocitos T se produce con la inhibición combinada de las rutas de puntos de control de PD-1 y TIM-3.
Un anticuerpo anti-LAG-3 antagonista completamente humano (descrito en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2011/0150892) ha demostrado una potente actividad en el bloqueo de la unión de LAG-3 soluble recombinante a células positivas para MHC de clase II. Este anticuerpo, designado en el presente documento APE03109, se evaluó en cuanto a la actividad funcional en el ensayo de MLR de linfocitos T CD4+ humanos. APE03109 demostró actividad en el MLR con un valor de CE50 de aproximadamente 0,05 pg/ml, como se muestra en la Figura 3 y la Tabla 4, que fue similar a la actividad del anticuerpo anti-PD-1 solo. En combinación con 0,02 pg/ml del anticuerpo anti-PD-1 APE2058, el anticuerpo APE03109 estimuló cantidades aumentadas de producción de IL-2 con respecto a APE2058 o APE03109 solo, dando como resultado una disminución de 5 veces de los valores de CE50.
Además, se caracterizó una evolución temporal de la producción de IL-2 con el anticuerpo anti-LAG-3 APE03109 solo y la combinación de APE2058 con APE03109 en un ensayo de MLR de CD4+ humanos. Se observó una disminución similar del valor de la CE50 para la combinación de APE03109 y APE20580,02 pg/ml y después de 72 horas de cultivo, como se muestra en la Figura 3. Después de 96 horas de cultivo, las diferencias en los valores de CE50 no fueron tan pronunciadas; sin embargo, los niveles de IL-2 producidos en los cultivos tratados con 0,02 pg/ml del anticuerpo anti-PD-1 APE2058 y el anticuerpo anti-LAG-3 APE03109 casi se duplicaron en comparación con los cultivos tratados con APE03109 solo (2200 pg/ml frente a 1.200 pg/ml). De acuerdo con la evolución temporal de la expresión de LAG-3, después de 24 horas no se observó una producción aumentada de IL-2 al añadir APE03109 a APE2058, aunque en

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-PD-1 que comprende un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40 y una región constante (Fc) de cadena pesada de IgG4.
2. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada y el polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera como se define en la reivindicación 1.
3. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, que comprende la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 63.
4. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 4.
6. Una célula hospedadora que comprende un vector que codifica el polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada como se define en la reivindicación 1 y un vector que codifica el polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera como se define en la reivindicación 1.
7. La célula hospedadora de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en la que la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero.
8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-PD-1 de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica está formulada para administración parenteral.
10. Un procedimiento de producción de un anticuerpo anti-PD-1, comprendiendo dicho procedimiento expresar dicho anticuerpo in vitro en una célula hospedadora capaz de expresar dicho anticuerpo y en el que dicha célula hospedadora comprende el vector de la reivindicación 4 que codifica dicho anticuerpo (en cis), o comprende un vector que codifica dicho polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada de anticuerpo como se define en la reivindicación 1 y un vector que codifica dicho polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera de anticuerpo como se define en la reivindicación 1 (en trans).
11. El anticuerpo anti-PD-1 de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, para su uso como medicamento para el tratamiento de un cáncer en un ser humano.
12. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica, para su uso como medicamento, de la reivindicación 11, en el que el medicamento es para administrarse en combinación con un agente que inhibe una ruta de punto de control inmunitario.
13. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica, para su uso como medicamento, de la reivindicación 12, en el que el agente inhibe la ruta de CTLA-4, de TIM-3 o de LAG-3.
14. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica, para su uso como medicamento, de la reivindicación 11, 12 o 13, en el que el medicamento es para administrarse en combinación con un anticuerpo anti-TIM-3 o un anticuerpo anti-LAG-3.
15. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica, para su uso como medicamento, de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de vesícula biliar, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de glándulas salivales, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y carcinoma de células de Merkel.
16. El anticuerpo anti-PD-1 o la composición farmacéutica, para su uso como medicamento, de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el anticuerpo anti-PD-1 es para administrarse a una dosis de aproximadamente 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal total por día.
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