JPH01181792A - 生理活性物質ｃｉ−０１０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規生理活性物質Ｃｌ−０１０に関する。

［従来の技術］ 本発明の生理活性物質Ｃｌ−０１０は、分子量３６８、
分子式Ｃｘ　ｓ　Ｈｓ　−Ｏｎの物質であって、これと
同一の理化学的性質および生理活性を有する物質の存在
は、現在まで報告されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ コラゲナーゼは、リウマチ患者の軟骨破壊［コーストン
（Ｃａｗｓｔｏｎ）’ＩＦ　＋アースライテイスφアン
ド・リウマチ患者（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆　Ｒｈｅｕｍ
ａｔｉｓｍ）、第２７巻、第２８５〜２９０ページ（１
９８４年）コ、歯根膜病［ゴルブ（Ｇｏｌｕｂ　）等、
ジャーナル・才ブ・ペリオドンタ）Ｌ−リサーチ（Ｊ　
、　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ−ｃｈ）、
第２０巻、第１２〜２３ページ（１９８５年）コ、ある
いは癌細砲の転移［リオッタ（Ｌｉｏｔｔａ　）等、ネ
イチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２８４巻、第６７〜６
８ページ（１９８０年〉］に重要な役割を果す酵素の１
つと考えられている。従って、ヒトのコラゲナーゼに特
異的な阻害剤を供することは、これらコラゲナーゼが関
与する疾病の予肪あるいは治療に有用である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、そのような性質を有する化合物を鋭意検
索の結果、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）　Ａ　４４５７がヒトのコ
ラゲナーゼを特異的に阻害する物質を生産することを発
見し、本発明を完成した。

本発明の目的物質を生産する菌株は、本発明者らが東京
都八王子市の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称１ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）Ａ　４４５７　Ｊ　、微生
物寄託番号１微工研菌寄第９７０５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−
９７０５）　Ｊとして工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されており、この菌株を培養して得られる本発明
の目的物質を生理活性物質Ｃｌ−０１０と命名した。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

１）形態 栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよ
く発達し不規則に分枝するが隔壁は認められない。胞子
はスターチ無機塩寒天培地、イースト・麦芽寒天培地お
よびオートミール寒天培地などで良好に形成きれる。顕
微鏡で観察すると胞子形成菌糸の分校方法は単純分枝で
胞子は直線状に形成されるが、まれに２〜３巻のラセン
状も認められる。胞子は通常１０個以上の連鎖が認めら
れ、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形でそ・・の
大きさは０．４３〜０．６０Ｘ０．９３〜１．１８５　
ｍである。

菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察されない。

２）培地上での生育状態 各種培地上で３０°Ｃ１１４日間培養したときの肉眼に
よる観察結果を第１表に示す。

３）生理学的性質 （υ生育温度範囲 オートミール寒天培地において２０〜３７℃の範囲で良
好に生育する。１０°Ｃ以下、４５°Ｃ以上の温度範囲
では生育しない。

（り生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別　　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化　　　　　　陽性（弱い）Ｃ）脱脂乳の凝固　　　
　　　　陰性 ｄ）脱脂乳のペプトン化　　　　陽性 ｅ）スターチの加水分解　　　　陽性 ｆ）メラニン様色素生成　　　　陰性 ０）炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地上）利用する＝Ｄ−
アラビノース、Ｄ−キシロース。

Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース。

ラフィノース、Ｄ−マンニトール 利用しない：シュウクロース、イノシトール、Ｌ−ラム
ノース 以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を「ジ・インターナショナル・ストレ
プトマイセス・プロジェクト（１，Ｓ、Ｐ、）Ｊ−バー
ジエ著「マニュアル・オブ・ディターミネイティブ・バ
タテリオロジー」第８版（１９７４年）およびワックス
マン著１ジ・アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）
に報告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はストレプトマイセス・アルプス（ロッジ−ドリア、
１８９１）ワッ°クスマン・アンド・ヘンリッジ［Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ　ａｌｂｕｓ（Ｒｏ２６ｉ−Ｄ
ｏｒｉａ、１８９１）Ｗａｋｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｈｅｎ
ｒ−ｉｃｉ　］に最も近い性状を示していたが、断定で
きないため本菌株をストレプトマイセス・エスピーＡ　
４４５７と命名した。

生理活性物質Ｃｌ−０１０の生産は、大略一般の発酵生
産物を生産する方法に準じ、各種の栄養物質を含む培地
でストレプトマイセス・エスピーＡ　４４５７を好気的
条件下で培養することにより行なう。

培地は主として液体培地を用い、炭素源とじてはグルコ
ース、廃糖蜜、スターチなどを単独か、または混合して
用いる。

その他、本菌株の生育を助は生理活性物質Ｃｌ−０１０
の生産を促進する有機物および無機塩を適当に添加する
ことができる。消泡剤としては、アデカノール、シリコ
ンなど常用の消泡剤を用いることができる。

培養方法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が
適しておりｐＨ４〜８．２５〜３５℃で３〜６日間、望
ましくはｐＨ６〜７．２８〜３０ＪＣで４日間培養する
。

この培養により生産された生理活性物質Ｃｌ−０１０を
単離するには、発酵生産物を採取する一般的な方法に準
じて行なえばよい。

生理活性物質Ｃｌ−０１０は主に菌体内に蓄積されるの
で、たとえば次の方法が効果的である。

すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により分離
した菌体から生理活性物質Ｃｌ−０１０を低級アルコー
ル、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。この抽出液を
濃縮後、酢酸エチル、クロロホルムなどの非水溶性有機
溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。この
シロップを再度酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、
メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲル［ワコ
ーゲルＣ−２００（商品名、和光純薬工業（株）製）］
を用いたカラムクロマトグラフィーおよびセファデック
スＬＨ−２０（商品名、ファルマシア社製）を用いたゲ
ル濾過に付し、活性区分を集めることにより生理活性物
質Ｃｌ−０１０を精製、単離することができる。

以上の精製方法で単離きれた生理活性物質Ｃｌ−０１０
は、下記の理化学的性質を有している。

理化学的性質 ａ）外観：淡黄色粉末 ｂ）融点：９７〜９９℃ Ｃ）元素分析値： Ｃ：　６８．０％、Ｈ：９．７％ ｄ）分子量二３６８ ｅ）分子式：　Ｃ，、Ｈ，，０゜ ｆ）比旋光度： ［α］　　＝＋５７℃（Ｃ＝１％、　ｃＨｃＩ２３）ｇ
）紫外線吸収スペクトル： 酸性メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトル
を第１図に示す。

ｈ）赤外線吸収スペクトル： ＫＢｒ錠剤中で測定した赤外線吸収スペクトルを第２図
に示す。

ｉ　）”Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ジメチルスルホキシド−α６中で測定した”Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを第３図に示す。−ｊ）溶媒に対する溶解性
： 水に不溶、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに可
溶 ｋ）呈色反応： 陰性：ニンヒドリン、アンスロン、モーリシュ 陽性：ヨード反応 ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 以上の理化学的性質と一致する性質を有するフラゲナー
ゼ阻害剤は報告されておらず、生理活性物質Ｃｌ−０１
０は新規なフラゲナーゼ阻害剤である。

［発明の効果］ 本発明の目的物質である生理活性物質Ｃｌ−０１０は、
ヒト由来のコラゲナーゼを特異的に阻害するので、慢性
関節リウマチや変形性関節症患者の軟骨破壊の抑制剤、
あるいは癌の転移抑制剤として有用なものである。

［実施例コ 以下、実施例および試験例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。

（実施例） （１）５００ｍ１１坂ロフラスコに、培地１００ｍ１１
当りグルフース２ｇ、オートミール２ｇ、肉エキス０．
３ｇ１食塩０．３ｇ、炭酸カルシウム０．２５　ｇ　、
硫酸第二鉄０．０４ｇ、塩化マンガン０．０４　ｇから
なるｐＨ７の無菌液体培地を入れ、これにストレプトマ
イセス・エスピーＡ　４４５７株を接種し、３０℃、７
２時間振とう培養し、種培養液とした。次に内容量５０
１のジャーファーメンタ−を用いて、種培養と同じ組成
の無菌培地３０１に前記種培養液６００ｍ１１を接種し
、３０°Ｃ１９６時間攪拌通気培養を行なった。この際
の攪拌数は３５０ｒ、ｐ、ｍ、通気量は３０１．／分で
あった。

培養終了後、遠心分離機で上澄液と菌体に分け、得られ
た菌体２Ｋｇ（湿重量）より５ｉのメタノールで２回抽
出を行なった。この抽出液を合わせ、濃縮してメタノー
ルを留去後、１１の酢酸エチルで２回抽出した。

この酢酸エチル抽出区分を合わせ、無水硫酸ナトリウム
で脱水した。−夜脱水後、減圧濃縮し、得られた褐色シ
ロップに１２０ｍ１ｌのクロロホルムを加え溶解した。

このクロロホルム溶液の半量を、クロロホルムで調製し
たシリカゲル［ワフーゲルＣ−２００（商品名、和光紬
薬工業（株）製）コニ。５１カラムに吸着させた。３１
のクロロホルムで洗浄後、２％メタノールを含むクロロ
ホルム３１で不純物を溶出し、次いで１０％メタノール
を含むクロロホルムで溶出される区分を集め、減圧濃縮
し淡褐色シロップ８ｇを得た。このシロップ２ｇを秤取
し、２０ｍ１のメタノールを加えて溶解し、２ｊ２のセ
ファデックスＬＨ−２０（商品名、ファルマシア社製）
カラムを用い、メタノールでゲル濾過を行なった。得ら
れた活性区分を濃縮乾固後、５０ｍ１のクロロホルムに
溶解し、このクロロホルム溶液を同量の希塩酸で２回、
続いて水で２回洗浄した後、濃縮乾固した。得られた１
、３ｇの粉末をメタノールに溶解し、再び同じ条件のセ
ファデックスＬ　Ｈ−２０のカラムでゲル濾過を行ない
、活性区分を濃縮乾固すると１．１ｇの淡黄色粉末が得
られた。。

この粉末の融点は９７〜９９℃で、また元素分析値は次
のとおりであった。

実測値；　Ｃ：　６８．０％、Ｈ：９．７％理論値；Ｃ
：６ｇ、５％、Ｈ：９．８％（試験例） 試験法 基質：ハートレー系雄性モルモットの皮膚よりＴ、Ｅ、
−ｆｆ−ストン（Ｔ　、　Ｅ　、　Ｃａｗｓｔｏｎ）ら
の方法［メソッズφイン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）、第８０巻、第
７１１〜７２３ページ（１９８１年）コに従い、酸可溶
性フラーゲンを抽出した。

これを用いて［”Ｃコ無水酢酸によるアセチル標識体を
調製し、基質とした。また、細菌由来コラゲナーゼの基
質としてはアゾコール（Ａｚｏｃｏｌｌ　、カルビオケ
ム社製）を使用した。

酵素液：ヒト慢性関節リウマチ患者関節液をトリプシン
を用いた方法［炎症、第４巻、第２４７〜２５４ページ
（１９８４年）コにより活性化したものをヒトコラゲナ
ーゼとした。また、細菌由来コラゲナーゼとしては、ク
ロストリデイウム　ヒストリティカムタイプ■（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕ＋ｎｒｙｐ
ｅ■、シグマ社製）を用いた。

活性測定法：ヒトコラゲナーゼの活性測定はナガイ（Ｎ
ａｇａｉ）らの方法［バイオシミ力・工・バイオフイジ
力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ
ｃｔ−ａ）、第４９７巻、第１９０〜１９９ページ（１
９７９）　］に準じた。即ち、５ｍＭの酢酸にて標識フ
ラーゲンを０．３％になる様に溶解し、この溶液２００
μに等量の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５、１
０ｍＭ塩化カルシウムを加え、３７℃で充分ゲル化きせ
た後、１００μの酵素液を加え、３７℃、１８時間反応
させた。

反応終了後、１０．０００ｒ、　ｐ、　ｍで１０分間遠
心分離し、上清に遊離した放射能を液体シンチレーショ
ンカウンター（ミナキシ、トリーカーブ４．０００　。

パラカードジャパン社製）で測定した。

また、細菌由来のコラゲナーゼ活性測定法はＡ、Ｊ、パ
レット（Ａ　、　Ｊ　、　Ｂａｒｒｅｔｔ　）らの方法
［バイオケミカＬ−ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
　）、第２０１巻、第１８９〜１９８ページ（１９８２
年）］に準じた。即ち、アゾコールを２０ｍｇ／　ｙｎ
Ｑとなる様、０．５Ｍシュウクロース、　２０ｍＭ塩化
カルシウムを含む０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，
５に懸濁し、この溶液１ｍＨに対し、１ｍｌの酵素液を
加え、３７℃、３０分間反応を行なった。反応は、１ｍ
ｌの１００ｍＭエチレンジアンテトラアセティツクアシ
ッドジナトリウム（ＥＤ−’ＩＡ　　２Ｎａ）溶液を加
えて止め、濾紙で濾過後、濾液の５２０ｎｍでの吸光度
を測定した。

試験結果 上記測定法における生理活性物質Ｃｌ−０１０の５０％
活性阻害濃度（ＩＣ１゜）は、ヒトコラゲナーゼに対し
て、５　Ｘｌ０−’Ｍ　、細菌由来のコラゲナーゼに対
してｌＸｌ０−”Ｍであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物質の紫外線吸収スペクトルを、第２図
は本発明物質の赤外線吸収スペクトルを、第３図は本発
明物質の”Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する生理活性物質ｃ I
   −０１０ ａ）外観：淡黄色粉末 ｂ）融点：９７〜９９℃ ｃ）元素分析値： Ｃ：６８．０％、Ｈ：９．７％ ｄ）分子量：３６８ ｅ）分子式：Ｃ＿２＿１Ｈ＿２＿６Ｏ＿５ ｆ）比旋光度： ［α］＾２＾６＿Ｄ＝＋５７℃（Ｃ＝１％、ＣＨＣｌ＿
   ３） ｇ）紫外線吸収スペクトル： 酸性メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトル
   を第１図に示す。 ｈ）赤外線吸収スペクトル： ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルを第２図
   に示す。 ｉ）＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ジメチルスルホキシド−α＿６中で測定した＾１Ｈ−Ｎ
   ＭＲスペクトルを第３図に示す。 ｊ）溶媒に対する溶解性： 水に不溶、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに可
   溶 ｋ）呈色反応： 陰性：ニンヒドリン、アンスロン、モーリシュ 陽性：ヨード反応 ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性