JPH0324986B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 大きな外科的手術を受ける患者の多くが、手術
後の血栓症の発生、すなわち血餅の形成の危険を
冒しており、もしこの症状がおこれば死を招くこ
ともある。ヘパリンは、かかる生命を脅やかす血
餅の形成を予防することができる、強力な抗凝血
剤である。しかしながら血中のヘパリン量は患者
が過剰に出血しないように厳密に制御されなけれ
ばならない。ヘパリン療法は、開心臓手術及び臓
器移植のような、多くの新しい手術手法の出現と
共に特に重要なものとなつてきている。ヘパリン
はある場合には肺塞栓症及び心筋梗塞症の治療に
も用いられる。血液凝固を制御するためのヘパリ
ン療法の重要性が高まつたこと及びヘパリン濃度
を注意深く制御する必要性の故に、血液プラスマ
中のヘパリンの定量試験が開発されている。 いくつかの研究では、プラスマまたは血清中の
ヘパリンの定量試験の開発のために、発色性
（chromogenic）ペプチド基質または蛍光発生性
（fluogenic）ペプチド基質が用いられている。こ
れらの試験は、例えば、Thrombosis Research，
第13巻、第２部、285−288頁中にラーセン等
｛Larsenetal｝により記述されているような溶液
試験である。それらは、基質を加水分解する速度
により遊離のトロンビンの活性を測定することに
基づいている。試験では、(1)に示す反応系列を利
用する。 (1) トロンビン＋AT−ヘパリン ――――→ トロンビン ΓAT−＋トロンビン（残存の）＋AT−ト
ロンビンと抗トロンビン（AT−）を、一
定制限量のヘパリンの存在下で一定時間反応さ
せる。トロンビンΓAT−複合体はヘパリン
が存在しないと徐々に生成されるが、触媒量の
ヘパリンの存在下では極めて急速に生成され
る。トロンビンΓAT−複合体は不活性であ
る。トロンビン感応性基質溶液を次に加え、残
存するトロンビンの活性を測定する。 全血試料の凝固時間を測定する以前の方法を改
良したものではあるが、このタイプの溶液試験
は、依然として時間を要しかつ種々の試薬を連続
的に添加する必要がある。プラスマ中のヘパリン
の定量測定用の試験片があればそれは望ましい。
しかしながら、かかる試験片の製作は二つの理由
で問題がある。第一に、トロンビンにとつての数
多くのアミドール性の基質の存在下では、触媒量
のヘパリンが利用可能であるときでさえ、トロン
ビンΓAT−複合体の生成は極めて遅いことで
ある。この問題は、上層にAT−とトロンビン
を含有し下層に基質を含有する二重層試薬片を用
いることによつて解決することができる。この形
状を用いれば、試験されるプラスマと接触すると
上層に基質が拡散する時までに、複合体はすでに
かなりの程度まで生成されているであろうから、
トロンビンΓAT−複合体の生成についての基
質による妨害を緩和することができる。第二番目
の困難は、トロンビンとAT−はヘパリンが存
在しない場合も複合体を生成するであろうという
事実に関連する。この非触媒反応はゆつくりおこ
るが、細片を活性材（この場合はトロンビンと
AT−）の溶液で含浸し、ついで水を蒸発させ
ることによる、正常の試験片製造方法では、試験
片の製造及び保管の間にトロンビンΓAT−複
合体が生成する結果となる。例えば、室温でトロ
ンビンとAT−浸漬溶液を調製し、室温で担体
マトリツクスを含浸しついで強制送風空気炉中、
50℃で含浸担体を乾燥すると、AT−を含有し
ない対照と比較して、トロンビンの70％が妨害さ
れる結果となることが発見された。 本発明は、先に検討した困難さの両者を回避す
る、血液プラスマ中のヘパリンの定量測定用試験
片の製造方法を提供する。 本発明は、哺乳動物の血液プラスマ中のヘパリ
ンを定量的に測定するための試験具の製造方法で
ある。この方法は、 (a) トロンビン感応性で蛍光発生性もしくは発色
性の基質であつて、トロンビンと該基質が適切
な液体環境において接触した際、蛍光法または
分光光度法により検出可能な、時間と関連した
化学変化がおこるように、トロンビンと相互反
応をおこすことが可能なもの並びに緩衝液を包
含した担体マトリツクス用材料からなる第１の
細片を用意する工程； (b) トロンビンを溶液に添加する以前から約20℃
以下の温度に保持しておいた、緩衝液、AT−
及びトロンビンを含有する、調製したばかり
の水溶液と、担体マトリツクス用材料からなる
第２の細片を接触させて、該細片を該溶液で飽
和させる工程； (c) 上記第２の細片を溶液から取り出し、それを
急速冷凍し、ついで凍結乾燥により溶媒を除去
して、緩衝液、AT−及びトロンビンを含有
する第２の細片を用意する工程； (d) 上記第１の細片を水不透過性の材料からなる
細片に付着させる工程；及び (e) 上記(c)工程で得られた第２の細片を第１細片
の露出面に付着させて、目的に適つた３層構造
の試験具を形成する工程 よりなる。 上述の方法により製造される試験具及びプラス
マ試料中のヘパリンの定量測定のための本試験具
の使用もまた本発明の範囲に含まれる。 合成蛍光発生性基質または合成発色性基質を用
いる、ヘパリン試験のための溶液手法を、紙試薬
片に応用することは、試薬を時間を調整して連続
的に導入する必要性のために複雑である。２層片
方式を用いる場合には、成功させるためには、２
つの必須試薬、トロンビンとAT−は、トロン
ビンΓAT−含有層の調製中もまたその保管中
もトロンビンとAT−が互いに反応して複合体
を生成することがないように、一方の層に合わせ
られねばならないという事実を考慮しなければな
らない。基質を含有する下層及びトロンビンと
AT−を含有する最上層を有する二重層試薬片
を構成し、トロンビンとAT−が互いに反応し
て不活性複合体を生成することがないように最上
層を調製することにより、前述の問題を処理する
ことができる。調製したばかりの、かつ約20℃以
下（好ましくは５℃以下）の温度に保持された溶
液から、トロンビンとAT−を試薬片最上層へ
施こすことにより、活性成分間のいかなる反応も
最小にすることができる。トロンビンとAT−
との間のいかなる反応も望ましくないので、溶液
の調製後直ちに適用すること並びに調製及び担体
マトリツクスへの適用の間中その凍結温度の僅か
に高い温度にかかる液体を保持することが提案さ
れる。試験具の上層はヘパリン試験においてその
使用後、残存するトロンビンを含有する必要があ
る。トロンビンが確実に残存するために、この浸
漬溶液中のトロンビンのAT−に対する比は
0.05NIH単位トロンビン／1μｇAT−より大き
くすべきであり、好ましくは0.2NIH単位トロン
ビン／1μｇAT−から0.5NIH単位トロンビ
ン／1μｇAT−の範囲とすべきである。今や飽
和された担体マトリツクスを溶液から取り出した
ら直ちに凍結し続いて凍結乾燥することが、それ
以上のいかなる反応を防ぐために望ましい。溶媒
の蒸発により、物質を凍結させたまゝに保つのに
十分な熱を凍結物質から取り出せる程度まで圧力
を減じることができる装置中に凍結物質を置くこ
とにより凍結乾燥は行われる。また、減圧乾燥装
置中に冷蔵保管すれば、すべての水が蒸発し物質
が乾燥するまで、その凍結温度以下に物質を保つ
ことができる。乾燥工程中、凍結状態に物質を保
持することが可能な、冷蔵温度と圧力のいかなる
組合せも許容しうる。好ましい保管温度は−20℃
であり、好ましい減圧は１ミリメートル水銀以下
である。 上述のように最上層を調製し、それをトロンビ
ン感応性蛍光発生性基質またはトロンビン感応性
発色性基質及び緩衝液を含有する下層に付着させ
て二重層試薬片を構成すると、最上層中のトロン
ビンとAT−間の反応は、最上層へヘパリン含
有プラスマを施せば、下層からの基質の拡散がこ
の複合体生成を妨害するのに十分に有為なものに
なるまでに、かなりの程度まで進行する機会を有
する。試料溶液が測定機器の台上に流出しないよ
うにおよび基質が最上層へ確実に拡散するように
下層の下に水不透過性材料があるべきである。 試験具の上層は、先に述べた方法によりその中
に非複合体化トロンビン及びAT−を吸収せし
めた担体マトリツクス材料の細片よりなる。担体
マトリツクスは、血液プラスマを吸収することが
でき、一方その一部を下層中に流出させることが
できる材料からなるものでなければならない。同
様の担体マトリツクス材料からなつてもよい下層
は、その中に基質を吸収せしめ、かつプラスマ液
体に基質を溶解させそれによつてトロンビンΓ
AT−複合体が生成された後、下層より上層へ
基質を流動させる機能を有する。上層を血液プラ
スマと接触させると、この複合体生成はそこに含
まれるヘパリンの触媒効果のために急速におこ
る。 診断用試験細片の製作に通常用いられる材料
は、本願の担体マトリツクスとしての使用に適切
である。かかる材料としてはゼラチンまたはアガ
ロースから作られたフイルムを挙げることができ
る。具体的には、例えば、紙、セルロース、木
材、合成樹脂フリース、織布及び不織布等のよう
な吸水性材料を用いて担体マトリツクスを形成す
る。 担体マトリツクスは、緩衝剤を含む蛍光発生性
または発色性基質溶液を用いて浸漬、含浸、噴霧
印刷され、室温乾燥または強制送風空気乾燥のよ
うな適切な手段で乾燥して、乾燥基質／マトリツ
クスの組合せを残すことができる。担体が吸水性
材料の場合は、これらの操作によつて、試薬が担
体マトリツクス中に吸収された状態になるであろ
う。トロンビン酵素反応の速度はPHに依存するの
で緩衝液は必要である。試験具の両層中の緩衝液
のPHは、トロンビンと基質の反応を最大にすると
ころに設定する。基質がＳ−2238の場合、最高の
トロンビンアミドール性応答はPH8.0から8.5にお
いて達せられる。適切な緩衝液としてはトリス
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（TRIS）；
Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシメチル）グリシ
ン及びトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ
プロパンスルホン酸を挙げることができる。基質
含有下層を調製するのに用いたものと同様でもま
たは異なつていてもよい緩衝液を溶液中に用い、
その溶液からトロンビンとAT−を最上層に施
こす。下層は、典型的なものとして、緩衝水溶液
中１リツトル当り約５ミリモルの基質を含有する
溶液から調製する。 適切な発色性基質または蛍光発生性基質、商品
名がある場合にはそれらの商標名、式及び検出方
法を第１表に挙げた。この表に用いたアミノ酸に
ついての略号は、ピコリン酸を表わすpip以外は、
Biochemistry、ワースΓパブリツシヤーズ、イ
ンコーポレーテツト｛Worth Publishers，
Inc。｝、ニユーヨーク、ニユーヨーク（1970）67
頁においてエーΓエルΓレーニンガー｛Ａ。Ｌ。
Lehninger｝により用いられたものに従う。 【表】 【表】 先の表に記載したようにして製造した３層試験
具は、試験具の最上層、すなわちトロンビンと
AT−含有層にプラスマ試料を先ず施すことに
より、未知のプラスマ試料中のヘパリンの定量測
定に用いる。かかる接触の後、基質中の、時間と
関連した化学変化のいずれも、ある一定期間中繰
り返し、反射率分光蛍光度法または反射率分光光
度法により監視して、少くとも２つの分光蛍光光
度値または分光光度値を時間の関数として得、得
られた値を、既知量のヘパリンを含有するプラス
マ試料を用いて同様の方法で得られた値と比較
し、かかる比較を用いて、試験されるプラスマ試
料中のヘパリン濃度を測定する。 本発明を更に次の実施例により説明する。これ
らの実施例において、TRIS及びトロンビン（仔
ウシトロンビン）はリサーチΓプロダクツΓデイ
ビジヨンΓオブΓマイルスΓラボラトリーズ、イ
ンコーポレーテツド｛Research Products
Division of Miles Laborator−ies，Inc。｝、ワ
ツトマン｛Whatman｝54紙はワツトマンΓペー
パーΓカンパニー｛Whatman Paper
Company｝、プラスマはカターΓラボラトリー
ズ、インコーポレーテツド｛Cutter
Laboratories，InC。｝よりのトロンボスクリー
ンΓユニバーサルΓコアギユレーシヨンΓレフア
レンスΓプラスマ｛Thromboscreen Universal
Coagulation Reference Plasma｝、Ｓ−2238基
質はエーΓビーΓカービ｛Ａ。Ｂ。KABI｝より
入手した。 これらの実施例において、反射率または蛍光測
定は、プラスマ希釈液を試験片に施した後、指示
薬にとつての最適波長（Ｓ−2238については
405nｍ）において行つた。パーセント反射率の
値は次式： Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）²／2R ｛式中、Ｋは試料の吸光度係数、Ｓはマトリツ
クスの光散乱係数、Ｒは試薬片から入射光の反射
された分｝を用いてＫ／Ｓ値に変換した。これは
クベルカームンク｛Kubelka−Munk｝式の簡略
型である。Ｋ／Ｓ値は反射率測定に関係する。 実施例 7.62cm×7.62cm片のワツトマン｛Whatman｝
54紙を、Ｈ−Ｄ−phe−pip−arg−pNA（Ｓ−
2238トロンビン基質）の５ミリモル（mM）水溶
液１ミリリツトル（ml）に浸漬し、ついで強制送
風空気炉中、35℃で30分間乾燥することにより、
基質パツドを調製した。乾燥した紙を銀マイラー
箔上に、次に両面接着剤上に取り付け、端縁を切
り落した。裏打ちされた紙を１cm巾の細片に裁断
し、細片肥手として用いるトリサイト
｛Trycite｝ポリスチレン片の末端から0.64cmの位
置にこれを取り付けた。 7.62cm×7.62cm片のワツトマン｛Whatman｝
54紙を、0.2モル（Ｍ）トリス−シーエル｛Tris
−Cl｝、0.73MNaCl、0.03Mエチレンジアミン四
酢酸（EDTA）、ミリリツトル当り200マイクロ
リツトル（μ／ml）の脱フイブリノーゲン化プ
ラスマ（AT−含有）及び5.6NIH単位／mlの
仔ウシトロンビンを含有する溶液（PH8.4）２ml
に浸漬することによりトロンビン／AT−パツ
ドを調製した。浸漬溶液成分は、最後に添加され
る仔ウシトロンビンと、氷水浴温度で一緒にされ
る。トロンビンを浸漬溶液に混合したら直ちに紙
を浸漬し、すり切り棒（Scraping bar）を通し
て引ぱり、ついでドライアイス上にある金属盆上
に紙を載置することにより急速冷凍する。凍結乾
燥により紙から湿気を除去し、紙から端縁を切り
落し、ついで紙を１センチメートル（cm）巾の細
片に裁断した。 １−２ミリメートル（mm）巾の両面接着テープ
片を裁断し、既にトリサイト｛Trycite｝プラス
チツク上に取り付けられた基質パツドの裏端上に
置いた。１cm巾のトロンビン（及びプラスマAT
−）含有紙片を基質細片上に置き、接着剤で、
基質細片にその裏端で付着させた。端部を各プラ
スチツク片から切り落し、調製物を0.5cm細片に
裁断した。細片は、３個の分子篩錠剤
（Molecular sieve tablets）を含有する蓋つきビ
ン中に４℃で保管し、１ないし２日以内に使用し
た。 １ml中に0.01ないし1.0USP単位のヘパリンを
含有するヘパリン水溶液｛ブタ（porcine）腸粘
膜よりのNaヘパリン｝を調製した。これらの細
片のヘパリンに対する応答を、細片にヘパリン溶
液30μを添加し、400nｍ干渉フイルターを用い
て反射率光度計で３分間10秒毎の反射率変化を監
視することにより試験した。Ｋ／Ｓ応答は120秒
から180秒まで直線状であり、従つて勾配をこの
時間内のデータの回帰直線により決定した。ヘパ
リン濃度に対してプロツトした回帰線の勾配ｄ
（Ｋ／Ｓ）／dt（図１）はヘパリンに対してはつき
りした用量応答を示した。この関係を対数−対数
でプロツトしたもの（図２）はほぼ直線状であつ
た。 実施例 実施例において述べたようにして調製した発
色性試薬片を、血液プラスマと類似のマトリツク
ス中に既知量のヘパリンを含有する２またはそれ
以上の検量溶液について用いた。各検量溶液を水
で10倍に希釈し、ついで希釈検量溶液30マイクロ
リツトル量を試薬片に施こし、各々の反射率を試
料適用後３分間400nｍにおいて監視した。これ
らの動力学的曲線の勾配、ｄ（Ｋ／Ｓ）／dtを、
90秒と180秒間に集めたデータを用い回帰曲線に
より算出した。検量溶液についての勾配を、ヘパ
リンの既知量に対してプロツトして、プラスマ試
料のヘパリン濃度を測定するために用いる、検量
もしくは標準曲線プロツトを作成した。 検量曲線の作成後、ヘパリン濃度試験が望まれ
ているプラスマ試料を水で10倍に希釈した。各希
釈プラスマ試料30マイクロリツトル量を試薬片に
施こし、その反射率を３分間５秒毎に400nｍに
おいて監視した。各動力学的曲線の勾配、ｄ
（Ｋ／Ｓ）／dtを、90秒と180秒間のデータからの
回帰直線分析により算出した。この勾配値を検量
曲線上に載せ、試料のヘパリン濃度を反対軸より
読み取つた。

【図面の簡単な説明】

図１はヘパリン濃度に対して勾配ｄ（Ｋ／
Ｓ）／dtをプロツトしたものであり、図２は上の
関係を対数−対数でプロツトしたものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 哺乳動物の血液プラスマ中のヘパリンを定量
   的に測定するための試験具の製造方法であつて、 (a) 緩衝液、並びにトロンビン感応性で蛍光発生
   性もしくは発色性の基質であつて、トロンビン
   と該基質が適切な液体環境において接触した
   際、蛍光法または分光光度法により検出可能
   な、時間と関連した化学変化がおこるように、
   トロンビンと相互反応をおこすことが可能なも
   のを包含した担体マトリツクス用材料からなる
   第１の細片を用意する工程； (b) トロンビンを溶液に添加する以前から約20℃
   以下の温度に保持しておいた、緩衝液、AT−
   及びトロンビンを含有する、調製したばかり
   の水溶液と、担体マトリツクス用材料からなる
   第２の細片を接触させて、該細片を該溶液で飽
   和させる工程； (c) 上記第２の細片を溶液から取り出し、それを
   急速冷凍し、ついで凍結乾燥により溶媒を除去
   して、緩衝液、AT−の及びトロンビンを含
   有する第２の細片を用意する工程； (d) 上記第１の細片を水不透過性の材料からなる
   細片に付着させる工程；及び (e) 上記(c)工程で得られた第２の細片を第１細片
   の露出面に付着させて、目的に適つた３層構造
   の試験具を形成する工程 よりなることを特徴とする方法。 ２ AT−及びトロンビンを含有する溶液を５
   ℃以下の温度に保持する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３ 第１層及び第２層のいずれかまたは両方の担
   体マトリツクスがフイルムもしくは吸水性材料で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ フイルムがゼラチンまたはアガロースより形
   成されている特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 吸水性材料が紙、セルロース、木材、合成樹
   脂フリースまたは織布もしくは不織布である特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 緩衝液がトリス（ヒドロキシメチル）−アミ
   ノメタン；Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシメチ
   ル）グリシンまたはトリス（ヒドロキシメチル）
   メチルアミノプロパンスルホン酸である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ７ 水溶液中のAT−に対するトロンビンの比
   が0.05NIH単位トロンビン／1μｇAT−より大
   きい特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 比が0.2NIH単位トロンビン／1μｇAT−
   から0.5NIH単位トロンビン／1μｇAT−まで
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 基質がＨ−Ｄ−phe−pip−arg−pNAであつ
   て、緩衝液がPHを8.0〜8.5の範囲に維持しうるも
   のである特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０ 哺乳動物の血液プラスマ中のヘパリンを定
   量的に測定するに適した試験具であつて、 緩衝液、AT−及びトロンビンを含有する
   担体マトリツクス用材料からできた第１上層； 上記第１層に隣接し、かつ該第１層と液体が
   連通できる状態にある第２層であつて、トロン
   ビンと基質が適切な液体環境において接触した
   際、蛍光法または分光光度法により検出可能
   な、時間と関連した化学変化がおこるように、
   トロンビンと相互反応をおこすことが可能なト
   ロンビン感応性蛍光発生性もしくは発色性の基
   質、及び緩衝液を含有する担体マトリツクスか
   らなる層；及び 第２層の下に位置する水不透過性材料からで
   きた第３層、 よりなることを特徴とする試験具。 １１ 第１層及び第２層のいずれかまたは両方の
   担体マトリツクスがフイルムもしくは吸水性材料
   である特許請求の範囲第１０項記載の試験具。 １２ 担体マトリツクスがゼラチンまたはアガロ
   ースより形成されているフイルムである特許請求
   の範囲第１１項記載の試験具。 １３ 担体マトリツクスが紙、セルロース、木
   材、合成樹脂フリースまたは織布もしくは不織布
   からなる群より選択される吸水性材料である特許
   請求の範囲第１１項記載の試験具。 １４ 基質がＨ−Ｄ−phe−pip−arg−pNAであ
   り、緩衝液がPHを8.0から8.5の範囲に維持できる
   ものである特許請求の範囲第１０項記載の試験
   具。 １５ 哺乳動物の血液プラスマ中のヘパリンを定
   量的に測定するための方法であつて、 (a) プラスマを、下記よりなる試験具と接触させ
   る工程 緩衝液、AT−及びトロンビンを含有す
   る担体マトリツクス用材料からできた第１上
   層； 上記第１層に隣接し、かつ該第１層と液体
   が連通できる状態にある第２層であつて、ト
   ロンビンと基質が適切な液体環境において接
   触した際、蛍光法または分光光度法により検
   出可能な、時間と関連した化学変化がおこる
   ように、トロンビンと相互反応をおこすこと
   が可能なトロンビン感応性蛍光発生性もしく
   は発色性の基質、及び緩衝液を含有する担体
   マトリツクスからなる層；及び 第２層の下に位置する水不透過性材料から
   できた第３層、 (b) 基質中の化学変化を、一定期間中繰り返し、
   反射率分光蛍光光度法または反射率分光光度法
   により監視して、少なくとも２つの分光蛍光光
   度値または分光光度値を時間の関数として得る
   工程；次いで (c) 工程(b)において得られた値と、既知量のヘパ
   リンを含有するプラスマ試料を用いて同様の方
   法で得られた値とを比較し、かかる比較試料を
   用いて、試験されるプラスマ試料中のヘパリン
   濃度を測定する工程 よりなることを特徴とする方法。