JPH0339047B2 - - Google Patents

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JPH0339047B2
JPH0339047B2 JP58048000A JP4800083A JPH0339047B2 JP H0339047 B2 JPH0339047 B2 JP H0339047B2 JP 58048000 A JP58048000 A JP 58048000A JP 4800083 A JP4800083 A JP 4800083A JP H0339047 B2 JPH0339047 B2 JP H0339047B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、光学異性体の分離を可能とする液体
クロマトグラフイー用充てん剤に関するものであ
る。さらに詳しくは、水溶液系でのゲル浸透クロ
マトグラフイーに使用されている親水性のゲルに
光学活性アミノ酸を固定化し、アミノ酸等の光学
異性体などの分離ができる液体クロマトグラフイ
ー用充てん剤に関するものである。
従来、光学異性体の液体クロマトグラフイーに
よる分離法として、配位子交換クロマトグラフイ
ーが利用され、その充てん剤としてイオン交換樹
脂，逆相クロマトグラフイー用オクタデシルシラ
ン、化学結合型シリカゲル等が利用されている。
しかし、上記の方法では光学活性アミノ酸を溶
離液自身に添加しておく必要があり、分離法とし
ては煩雑であり、かつ、高価な方法となる。
したがつて、光学活性物質を充てん剤自身に化
学結合させ、より簡易に分離する方法が考えられ
るが、充てん剤がスチレンゲルのような非極性の
場合、配位子交換以外の吸着性が水溶液系溶離液
では認められ、ピークのひろがり（理論段数の低
下），分析時間の長期化等、特に芳香族系の試料
では好ましくない現象が発生するため、新しい分
離法が望まれている。
本発明者は、上記問題に鑑み鋭意研究の結果、
吸着性の比較的少ないシリカゲルに光学活性アミ
ノ酸を固定化し、アミノ酸等の光学異性体の分離
に適する充てん剤を見い出し本発明を完成した。
すなわち、本発明はシリカゲル細孔表面を通常
の方法でアミノプロピル化し、活性化Ｎ−アシル
を導入できる試薬を作用させてアミノ酸を固定化
し、アミノ酸等の光学異性体の分離に適する液体
クロマトグラフイー用充てん剤を提供するもので
ある。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、アミノ基を有するシランカツプリン
グ剤を用いてアミノプロピル化が行なわれたアミ
ノプロピル化シリカゲルを有機溶媒中において活
性Ｎ−アシルを導入できる試薬と保護基を有する
光学活性アミノ酸を反応させた反応液に加えるこ
とによつてアミノ酸がシリカゲル細孔表面に0.3
〜0.5ｍ mol／ｇ固定化された多孔性球状で、
平均粒子径１〜50μ、好ましくは５〜40μ、平均
孔径10Å〜500Å、好ましくは50〜300Å、表面積
100〜500m2／ｇ、好ましくは200〜350m2／ｇを有
し、かつ、機械的強度が300Kg／cm2以上である充
てん剤である。
平均粒子径が1μ未満では分離効率の優れたカ
ラムが得られるが、カラムへの充てんが難かし
く、逆に粒子径が50μを越えるとカラムへの充て
んが容易で試料負荷量も多いが、分離効率が悪く
なるため好ましくない。平均孔径が10Å未満では
有効表面積が小さくなり、また500Åを越えると
機械的強度が弱くなるため好ましくない。
本発明においてアミノプロピル化シリカゲルを
得る方法は、通常のアミノプロピル化反応を用い
ることができる。すなわち、多孔性球状で、平均
粒子径１〜50μ，平均孔径10〜500Å，表面積100
〜500cm2／ｇのシリカゲルを芳香族系有機溶媒中
で温度80〜150℃において反応時間15〜48時間ア
ミノ基を有するシランカツプリング剤と反応させ
てアミノプロピル化シリカゲルを得るものであ
る。
芳香族系有機溶媒としては、ベンゼン，トルエ
ン，キシレン，メチルベンゼン，シクロヘキサン
などを挙げることができるが、特にトルエンが好
ましい。
アミノ基を有するシランカツプリング剤として
は、３−アミノ−プロピルトリエトキシシラン，
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメ
チルジメトキシシラン，Ｎ−（２−アミノエチル）
−γ−アミノプロピルトリメトキシシランなどを
挙げることができるが、特に３−アミノ−プロピ
ルトリエトキシシランが好ましい。
次に、保護基を有する光学活性アミノ酸と活性
化Ｎ−アシルを導入できる試薬と反応させ、そこ
へ上記のアミノプロピル化シリカゲルを加えて光
学活性アミノ酸を固定化するものである。
保護基を有する光学活性アミノ酸としては、光
学活性アミノ酸の失活を防ぐために、ブチルオキ
シカルボニル（以下、Boc.という）基，トシル
基，ベンジル基，カルボベンダキシ基を有するヒ
スチジン，フエニルアラニン，トリプトフアン等
が挙げることができるが、特にBoc.ヒスチジ
ン・トシレートが好ましい。
活性化Ｎ−アシルを導入できる試薬としては、
１，1′−カルボニルジイミダゾール，Ｎ−アセチ
ルイミダゾール，無水コハク酸を挙げることがで
きるが、特に、１，1′−カルボニルジイミダゾー
ルが好ましい。
保護基を有する光学活性アミノ酸と活性化Ｎ−
アシルを導入できる試薬の反応は、０℃以下、有
機溶媒の存在下、保護基を有する光学活性アミノ
酸と活性化Ｎ−アシルを導入できる試薬を混合す
る任意の態様をとることができるが、特に、有機
溶媒に保護基を有する光学活性アミノ酸を溶解
し、撹拌しながら活性化Ｎ−アシルを導入できる
試薬を加え、反応容器を氷冷し、二酸化炭素の発
生が止むまで撹拌し続けることにより均一反応溶
液を得ることが好ましい。
この反応に用いる活性化Ｎ−アシルを導入でき
る試薬の量は、アミノプロピル化シリカゲルに対
してモル比で１〜４倍、好ましくは２〜３倍の量
が望ましい。モル比が１倍未満では、固定化され
るアミノ酸量が少なくなり、４倍を越えると固定
化されるアミノ酸量は変らなく経済的でなく好ま
しくない。
上記操作により得られた均一反応溶液に、上記
のアミノプロピル化シリカゲルを加え、10〜40
℃、好ましくは20〜25℃で、15時間以上、好まし
くは20〜30時間撹拌することにより、シリカゲル
細孔表面に、保護基を有するアミノ酸を固定化す
るものである。
温度が10℃未満では固定化が急激に進み、シリ
カゲルの細孔表面を覆う恐れがあるため好ましく
ない。また、撹拌時間が15時間未満では十分な固
定化ができないため好ましくない。保護基を有す
るアミノ酸の固定化量は、ケルダール窒素分析お
よび重量変化によつて決定することができる。
最後に保護基の除去、例えばBoc.基の除去は、
トリフルオロ酢酸処理によつて行なう。すなわ
ち、蒸留，乾燥したジクロロメタン中のトリフル
オロ酢酸30wt％溶液中に、Boc.アミノ酸を固定
化したシリカゲルを加え、室温にて１時間反応さ
せ、Boc.アミノ酸のBoc.基を除去するものであ
る。各保護基の除去は、その反応前後の赤外線吸
収スペクトルの吸収帯変化により簡単に確認する
ことができる。
以上の方法により得られた本発明の充てん剤
は、従来の光学活性アミノ酸のシリカゲルへの固
定化により得られた充てん剤と比較して多重のア
ミノ酸をシリカゲルへの固定化が可能であるた
め、各種アミノ酸光学異性体を良好に分離するこ
とができる。
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例 １〜６ 粒径10μ，孔径100Å，表面積350m2／ｇのシリ
カゲル５ｇを無水トルエン70ml中、90℃，24時
間、３−アミノ−プロピルトリエトキシシラン５
ｇと反応させてアミノプロピル化シリカゲルを合
成した。
次に乾燥したジメチルホルムアミド（以下、
DMFという）70mlにBoc.ヒスチジン・トシレー
ト10ｇを溶かし、撹拌しながら１，1′−カルボニ
ルジイミダゾール（以下、CDIという）3.2ｇを
加える。反応容器を氷冷し、二酸化炭素の発生が
止むまで撹拌を続ける。その後、先に合成したア
ミノプロピル化シリカゲルを反応物に加え、室温
で24時間撹拌した。その時のCDIの添加量は、ア
ミノプロピル化シリカゲルにアミノ基の量の２倍
のモル数である。ここでアミノプロピル化シリカ
ゲルのアミノ酸プロピル化度は、２ｍ mole／
ｇであつた。
このように合成したゲルをDMF，メタノール，
ジクロルメタンで順次完全に洗う。アミノシリカ
ゲルへのBoc.ヒスチジン・トシレートの固定化
量は、ケルダール窒素分析により、0.36ｍ
mole／ｇと求められた。この値は、重量変化に
よつて求めた値と完全に一致した。
Boc.基の除去は、トリフルオロ酢酸処理*によ
つて行ない、トシレルト基の除去は、ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール処理**にて行なつた。各保護
基の除去は、その前後の赤外線吸収スペクトルす
なわち、Boc.基1700cm-1，トシル基1420〜1330cm
-1の吸収帯の吸収変化により確認した。
固定化したシリカゲルは、２mmφ，100mmのス
テンレスカラムにテトラブロムエタン，メタノー
ル，四塩化炭素からなる平衡スラリーとして充て
んした。充てん後にCu2+イオンの負荷を行なつ
た。
実施例１〜６として第１図〜６図に、下記の測
定条件でのトリプトフアン、フエニルアラニン，
チロシン，バリン，ドーパミン，マンデル酸のＬ
一体，Ｄ一体の分割されたクロマトグラムを示
す。
装 置高速液体クロマトグラフ （東洋曹達工業株式会社製 商品名、
HLC803D） カラム ステンレス製２mmφ，100mm 溶離液 １／15Mリン酸緩衡液（PH4.6）＋
10-4MCu2+ 流 速 1.0ml／min 検出器 紫外，210nm ＊トリフルオロ酢酸処理 蒸留，乾燥したジクロロメタン100mlにトリフ
ルオロ酢酸30％を入れ、室温で１時間反応させ
てBoc.アミノ酸のBoc.基をとる。
＊＊ヒドロキシベンゾトリアゾール処理 THF100ml中でヒドロキシベンゾトリアゾール
0.5ｇを少過剰加え、室温で２時間反応させる。
２時間後、イソブチレンの発生が終了し、反応
は終了する。
比較例 ピリジン175ml中、17.5mlの３−トリエトキシ
シリルプロピルアミンに7.5ｇのＬ−プロリンを
加える。混合物を室温で15時間撹拌し、５時間無
水の状態で還流した。そして、15時間、０℃の状
態に保つ。未反応のＬ−プロリンをフイルターで
除き、溶液を70℃，17mmHg下蒸発させる。乾燥
したベンゼンを加えて、まだ溶液中に残つている
Ｌ−プロリンを再結晶化させることにより除く。
続いて60℃にて溶液を真空乾燥することによつて
15ｇのＮ−〔３−（トリエトキシシリル−プロピ
ル）〕−Ｌ−プロリンアミドが得られた。
乾燥したトルエン70ml中に５ｇのシリカゲルを
加え、再蒸留によつて吸着水を除く。再蒸留温度
が109℃に達した時、15mlのトルエンに2.5mgのＮ
−〔３−（トリエトキシシリル−プロピル）〕−Ｌ−
プロリンアミドの溶解した溶液を加える。混合溶
液を無水の状態で８時間還流した。こうして得ら
れた化学結合シリカゲルをトルエン，エタノー
ル，水，エタノール，トルエンの順に、そして最
後にジエチルエーテルで洗浄する。化学結合シリ
カゲルを真空中、60℃で８時間乾燥する。
こうして得られたＬ−プロリンの結合した固定
相を四塩化炭素を溶媒としたスラリーで、25cm，
4.8mm IDのステンレスカラムに通常の方法でエ
タノールを用いてパツキングする。パツキング
後、0.02M硫酸銅溶液をカラムに流す。
Ｌ−プロリン1mole当り0.7moleのCu（）イ
オンが固定されて平衡に達した。
こうして得られたカラムをHPLC装置に接続
し、下記の測定条件でトリプトフアン，フエニル
アラニンおよびチロシンのそれぞれのＤ−体，Ｌ
−体のクロマトグラムを第７図〜９図に示す。
装 置高速液体クロマトグラフ （スペクトラ・フイジツクス社製商品名、
SP8000） カラム ステンレス製4.8mmID，250mm 溶離液 H2O−CH3CN（47：53）−0.15M
NH4Cl 流 速 1.0ml／min 検出器 紫外，210nm
【図面の簡単な説明】
第１図〜第６図は、本発明の充てん剤を用いて
得られたトリプトフアン，フエニルアラニン，チ
ロシン，バリン，ドーパミンおよびマンデル酸の
Ｌ−体，Ｄ−体が分割されたクロマトグラムであ
る。第７図〜第９図は、従来のシリカゲルに光学
活性アミノ酸を固定化した充てん剤を用いて得ら
れたトリプトフアン，フエニルアラニンおよびチ
ロシンのＬ−体，Ｄ−体が分割されたクロマトグ
ラムである。 １ 各種アミノ酸およびマンデル酸のＬ−体 ２ 各種アミノ酸およびマンデル酸のＤ−体

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ シリカゲル細孔表面にヒスチジンを固定化し
    たことにより得られたことを特徴とする光学異性
    体分離用充てん剤。
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