JPH0326347B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、成人型（ヒト）Ｔ細胞性白血病関連
抗原（Adulu Ｔ−cell leukemia associated
Antigen；ATLA）に特異的な新規な抗体に関す
る。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
はIUPAC IUBの規定或いは当該分野における慣
用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。ま
たアミノ酸等に関して光学異性体がありうる場合
は、特に明記しなければＬ体を示すものとする。 Pro；プロリン Val；バリン Met；メチオニン His；ヒスチジン Gly；グリシン Ala；アラニン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ヒト白血病ウイルス（ATLV又はHTLV）は、
成人型（ヒト）Ｔ細胞性白血病（ATL又は
HTL）の患者のＴ細胞の培養液中及び該細胞と
正常Ｔ細胞との混合培養により確立されたATL
細胞の培養液中に見出され、発病との関連が注目
されているウイルスである。該ウイルスあるい
は、上記ATL又はHTLに特異的なものとして、
近年数種の関連蛋白（ATLA）が報告された
〔M.Yoshida et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.
Vol.79，2031−2035，March（1982）、S.
Oroszlan et al.同Vol.79，1291−1924，
February（1982）及び厚生省癌研究助成金による
シンポジウム；成人Ｔ細胞白血病、リンパ種
（ATL）とその病因、ライフサイエンスセンター
出版、pp137−138、昭和58年１月５日発行〕。 本発明者等は上記ATLAを特異的に測定でき
る系の開発及びATLAの精製を目的として該
ATLAに特異的に反応する抗体を得るべく鋭意
研究を進めてきた。その過程において、上記
ATLAの抗原蛋白のひとつとして知られ、p24と
呼ばれている蛋白のＮ−末端ペプチド鎖を有する
ある特定のペプチドを合成し、これをハプテンと
して作成した抗原から所望のATLAに特異的な
抗体が収得できることを見い出した。本発明はこ
の知見に基づき完成されたものである。 即ち、本発明は一般式 Ｒ−Pro−Val−Met−His−Pro−His−Gly−
Ala−Pro−OH (1) 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Tyr基を示す。〕 で表わされるヒト白血病ウイルス関連ペプチドお
よびその誘導体から選ばれた化合物と担体との複
合体からなる免疫抗原を哺乳動物体に投与し、生
成する抗体を採取することを特徴とするATLA
抗体の製造法に係る。 本発明によれば入手容易な市販のアミノ酸を利
用して簡単な操作で容易に合成することができる
上記一般式(1)で表わされるペプチドをハプテンと
して用いて作成した免疫抗原を用いることに基づ
いて、ATLA、殊にp24に特異反応性を有する抗
体を、容易に、大量にしかも安定して取得するこ
とができる。該特異抗体は、これを例えばアフイ
ニテイークロマトグラフイー用担体と結合させ
て、該クロマトグラフに利用する等により
ATLAの精製における特異抗体として使用でき、
また該ATLAの各種免疫測定法における特異抗
体として使用でき、ATL又はHTLウイルス感染
の診断、ひいては、これ等ATL又はHTLに関連
する疾患の診断、研究等に有用である。 一般式(1)で表わされるペプチドは、通常のペプ
チド合成法、具体的には「ザ ペプチド（The
Peptides）」第１巻（1966年）〔Schroder and
Luhke著、Academic press，New York.USA〕
或いは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、丸善株式会
社（1975年）〕に記載される如き方法に従い、例
えばアジド法、クロライド法、酸無水物法、混酸
無水物法、DCC法、活性エステル法（ｐ−ニト
ロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸
イミドエステル法、シアノメチルエステル法等）、
ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミ
ダゾール法、酸化還元法、DCC／アデイテイブ
（HONB，HOBt，HOSu）法等により製造でき
る。上記方法においては、固相合成法及び液相合
成法のいずれをも適用できる。固相合成法を採用
する場合、DCC法、活性エステル法又はDCC／
アデイテイブ法等によるのが好ましい。通常本発
明に利用するペプチドは、上記した一般のポリペ
プチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順
次１個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステツプワ
イズ法により、又は数個のフラグメントに分けて
カツプリングさせていく方法により製造される。
より詳細には、例えば固相合成法を採用する場
合、Ｃ末端アミノ酸、即ちプロリンをそのカルボ
キシル基によつて、不溶性担体に結合させる。不
溶性担体としては、反応性カルボキシル基と結合
性を有するものであれば特に限定はなく、例えば
クロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂等のハロゲ
ノメチル樹脂やヒドロキシメチル樹脂、フエノー
ル樹脂、tert−アルキルオキシカルボニルヒドラ
ジド化樹脂等を使用できる。次いでアミノ保護基
を除去した後、一般式(1)で表わされるアミノ酸配
列に従い順次アミノ基保護アミノ酸を、その反応
性アミノ基及び反応性カルボキシル基との縮合反
応により結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を
合成した後、ペプチドを不溶性担体からはずすこ
とにより製造される。 上記においてヒスチジンは、その側鎖官能基を
保護しておくのが好ましく、これは通常の保護基
により保護され、反応終了後該保護基は脱離され
る。また反応に関与する官能基は、通常活性化さ
れる。これら各反応方法は、公知であり、それら
に用いられる試薬等も公知のものから適宜選択さ
れる。 アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、Boc，tert−アミルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル、２−クロロ−
ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシ
カルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、
ホルミル、ｏ−ニトロフエニルスルフエニル、ジ
フエニルホスフイノチオイル基等が挙げられる。 ヒスチジンのイミノ基の保護基としては、例え
ばTos、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニ
ル、トリチル基等が挙げられる。 チロシンの水酸基は、例えばアセチル、ベンゾ
イル基等によるエステル化又はベンジル、テトラ
ヒドロピラニル基等によるエーテル化により保護
することができるが、必ずしも保護する必要はな
い。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（メチルアルコ
ール、エチルアルコール、ベンジルアルコール、
ペンタクロロフエノール、ｐ−ニトロフエノー
ル、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロ
キシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−
ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等と
のエステル）等が挙げられる。尚ペプチド結合形
成反応は、縮合剤例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、カルボジイミダゾール等のカルボジイ
ミド試薬やテトラエチルピロホスフイン等の存在
下に実施し得る場合もある。 以下、一般式(1)のペプチドの製造法につき反応
行程式を挙げて具体的に説明する。 【表】 ｜ ｜
A〓Tyr〓Pro〓Val〓Met〓His〓Pro〓His〓Gly〓Ala〓pr
o〓
R^１ (リ)
↓
H〓Tyr〓Pro〓Val〓Met〓His〓Pro〓His〓Gly〓Ala〓Pr
o〓
OH (1a)
〔式中Ａはアミノ基の保護基、Ｂはヒスチジン
のイミノ基の保護基及びR¹は不溶性担体を示
す。） 上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc，tert−アミルオキシカルボニル基、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基等を、Ｂの好
ましいものとしてはTos基等を、またR¹の好まし
いものとしてはクロロメチル化ポリスチレン、ヒ
ドロキシメチルポリスチレン等をそれぞれ例示す
ることができる。 上記方法において、アミノ酸(イ)と不溶性担体
R¹との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシル基を利用してこれをR¹と結合させ
ることによつて行なわれる。該反応は適当は溶媒
中、例えばトリエチルアミン、カリウム tert−
ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウム等の
塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒として
は例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、
ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチ
ルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等
又はこれらの混合溶媒等を例示することができ
る。上記反応は、通常０〜85℃、好ましくは25〜
85℃程度、数分〜24時間程度で終了する。アミノ
酸と不溶性担体との使用割合は通常後者１当量に
対して前者を過剰量、一般に１〜３倍当量とする
のがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜１
ｇ程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶
媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃程
度で約15分〜１時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Ａのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢
酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に
上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロ
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。また該反応は、必要に応じて、通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，
Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、
Ｎ−エチル−N′−ジメチルアミノカルボジイミ
ド、１−エチル−３−ジイソプロピルアミノカル
ボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なう
ことができる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用
割合としては、特に限定はないが、通常前者に対
して後者を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等
モル量〜５倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤
の使用量も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対
して、好ましくは等モル量程度使用される。反応
温度はペプチド結合形成反応に使用される通常の
範囲、一般には約０℃〜約−60℃、好ましくは約
０℃〜約40℃の範囲から適宜選択される。反応時
間は一般に数分〜30時間程度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、一般式(1)で表わされ
るアミノ酸配列に従い、Ａ−Gly−OH、
【式】Ａ−Pro−OH、 【式】Ａ−Met−OH、Ａ−Val− OH、Ａ−Pro−OH及びＡ−Tyr−OHの各アミ
ノ酸もしくはそのカルボキシル基の活性化された
ものと順次縮合反応され、斯くして一般式(リ)で表
わされるペプチドに誘導することができる。これ
ら縮合反応及び保護基Ａの脱離反応は、それぞれ
前記した方法と同様にして行なわれる。 また得られるペプチド(リ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、保護基Ｂの脱離及び不溶性担体R¹の
脱離により、式(1)中ＲがＨ−Tyr基を示すペプチ
ド１ａに誘導される。ここで保護基Ｂの保護基及
び不溶性担体R¹の脱離反応は、保護基Ａの脱離
反応と同様に行ない得、この場合酸として弗化水
素又は臭化水素酸を用いるのが好ましい。 また一般式(1)中Ｒが水素原子を示すペプチド
は、上記反応において得られる一般式(ト)のペプチ
ドから、上記と同様にして、保護基Ｂ及び不溶性
担体R¹を脱離することにより得ることができる。
尚、上記方法において使用される各アミノ酸は、
いずれも公知の市販品でよい。 以上のようにして製造された一般式(1)のペプチ
ドは、反応混合物からペプチドの分離手段例えば
抽出、分配、カラムクロマトグラフイー等により
単離精製される。 かくして得られるペプチドは、これに¹²⁵、¹³¹
等の放射性物質、パーオキシダーゼ（POX）、
キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチタ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−NaSe、
Ｐ−Ngse、β−ガラクトシダーゼ、グルコース
−６−フルスフエートデハイドロゲナーゼ、オル
ニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素試薬等を
導入することにより、ラジオイムノアツセイ
（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ（EIA）
法において用いられる標識抗原として利用でき
る。上記放射性物質の導入は、通常の方法により
実施できる。例えば放射性ヨードは、クロラミン
Ｔを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.Hunter
and F.C.Greenwood；Nature，194，495
（1962）、Biochem，J.，89，114.（1963）参照〕
等によりペプチドに導入される。該方法は具体的
には、適当な溶媒例えば0.2M リン酸緩衝液
（PH＝7.4）等の溶媒中、クロラミンＴの存在下室
温付近にて10〜30秒程度で行なわれる。ペプチ
ド、放射性ヨード及びクロラミンＴの使用割合
は、例えばチロシン１個当り放射性ヨード１個を
導入する場合には、ペプチド中に含まれるチロシ
ン分子１ナノモルに対して放射性ヨードを１ミリ
キユーリー程度、クロラミンＴを10〜100ナノモ
ル程度用いるのがよく、またチロシン１個当り放
射性ヨード２個を導入する場合には、ペプチド中
に含まれるチロシン分子１ナノモルに対して放射
性ヨードを２ミリキユーリー程度、クロラミンＴ
を10〜100ナノモル程度用いるのがよい。斯くし
て製造される放射性ヨードにより標識化されたペ
プチドは、通常の分離手段、例えば抽出、分配、
カラムクロマトグラフイー、透析等により単離精
製される。このようにして得られるペプチドは必
要ならば凍結乾燥させて保存しておくこともでき
る。 酵素試薬の導入は、通常のカツプリング法例え
ばエルランガー（B.F.Erlanger）らの方法
〔Acta.Endocrinol.Suppl.，168，206（1972）〕及
びカロール（M.H.Karol）らの方法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.，USA.，57，713（1967）〕等の公知の
方法によつて行なうことができる。すなわち、ペ
プチドと酵素とをNaIO₄等の酸化剤の存在下、PH
４〜６の緩衝液、例えば１ｍＭ酢酸緩衝液（PH
4.4）中で、室温付近で２〜５時間反応させ、次
いでNaBH₄等で還元することによつて行なわれ
る。酵素はペプチド１モルに対して１〜３倍モル
量程度用いられる。酸化剤はペプチドの100〜300
倍モル程度、還元剤は酸化剤の１〜２倍モル程度
用いられるのが好ましい。斯くして製造される酵
素により標識化されたペプチドは、上記放射性ヨ
ード標識ペプチドと同様に単離精製され、保存す
ることができる。 以下、一般式(1)のペプチドをハプテンとして利
用した免疫抗原の製造方法につき詳述する。 上記免疫抗原は一般式(1)のペプチドをハプテン
とし、これをハプテン−担体結合試薬の存在下
に、適当な担体と反応させることにより製造され
る。上記においてハプテンに結合される担体とし
ては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子の
天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該
担体としては例えば馬血清アルブミン、牛血清ア
ルブミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アルブ
ミン、ヒツジ血清アルブミン等の動物の血清アル
ブミン類；馬血清グロブリン、牛血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類；馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチ
ログロブリン等の動物のチログロブリン類；馬ヘ
モグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ
ロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブ
リン等の動物のヘモグロブリン類；キーホールリ
ンペツトヘモシアニン（KLH）等の動物のヘモ
シアニン類；回虫より抽出された蛋白質（アスカ
ーリス抽出物、特開昭56−16414号公報、J.
Immun.，111，260〜268（1973）、J.Immun.，
122，302〜308（1979）、J.Immun.，98，893〜900
（1967）及びAm.J.Physiol.，199，575〜578
（1960）に記載されたもの又はこれらを更に精製
したもの）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リ
ジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニ
チンを含む共重合体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合
させる、例えばグリオキサール、マロンジアルデ
ヒド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類；チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばＮ，N′−ｏ−フエニレンジマレイミ
ド、Ｎ，N′−ｍ−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物；アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４
−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類；アミノ基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド
結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−
ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチ
ル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｏ−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリール
カルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使
用可能である。 上記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶液もし
くはPH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８
〜９の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近
で行なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ま
しくは３〜５時間で完結する。上記において用い
られる代表的緩衝液としては、次のものを例示で
きる。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ホウ酸
ナトリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を１〜６倍重量程度、
好ましくは１〜５倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を５〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望のATLA免疫抗原が収得さ
れる。 反応終了後得られる免疫抗原は常法に従い、例
えば透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容
易に単離精製できる。また該抗原は通常の凍結乾
燥法により保存できる。 斯くして得られるATLA免疫抗原は、通常蛋
白質１モルに対してペプチドが平均５〜20モル結
合したものであり、いずれも引き続き該抗原に対
して特異性の高い所望の本発明ATLA抗体を再
現性よく製造可能とするものである。特に上記蛋
白質に対するペプチドの結合モル比が１：８〜15
のものは、特異性が一層高く高力価、高感度の抗
体を作成し得るものであり好ましい。 上記で得られる免疫抗原による本発明の
ATLA抗体の作成は、以下の如くして行なわれ
る。即ち上記抗原を哺乳動物に投与し、生体内に
所望抗体を産生させ、これを採取することにより
実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる免疫抗原の所定量を生理食塩水で適
当濃度に希釈し、フロインドの補助液
（Complete Freund′ ｓ Adjuvanh）と混合して
懸濁液を調整し、これを哺乳動物体に投与すれば
よい。例えばウサギに上記懸濁液を皮内注射（抗
原の量として0.1〜５mg／回）し、以後２週間毎
に２〜10ケ月、好ましくは４〜６ケ月間投与し免
疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の
最終投与後、抗体が多量産出される時期、通常上
記最終投与の１〜２週間経過後、免疫化された動
物から採取し、これを遠心分離後、血清を分離す
ることにより行なわれる。上記によれば、用いる
免疫抗原の特殊性に基づいて、ATLA、ことに
p24に対して優れた特異性を有し、高力価、高感
度の抗体を収得できる。 かくして得られる本発明のATLA抗体は、例
えばこれをRIA法、EIA法等に利用してATLAの
定量を高精度をもつて可能とする。また該抗体
は、これを酵素または螢光物質で標識することに
よつてEIA法、フローレツセンスイムノアツセイ
（FIA）法等に使用できる。さらに該抗体は公知
の不溶化させる物質と反応させて不溶性抗体とす
ることもできる。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)で表わされるペプチドの製造例及びこれにより
得られるペプチドからの抗原及び該抗原からの抗
体の製造例を挙げるが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf¹…ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５） Rf²…ｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水 （15：３：10：12） ＜ペプチドの製造＞ 製造例 １ カリウムtert−ブトキシド5.88ミリ当量の
DMSO溶液14mlにBoc−Pro−OH1.42ｇを溶
解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団
法人蛋白質研究奨励会）５ｇを加えて、80℃で
30分反応させる。樹脂をDMSO、50％酢酸／
クロロホルム、塩化メチレンの順に、充分に洗
浄し、減圧乾燥して5.27ｇのBoc−Pro−樹脂
を得る。 一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.36ミリモル／ｇ樹脂であつた。 上記で得たBoc−Pro−樹脂４ｇをクロロ
ホルム30mlで３回洗浄後、50％トリフルオロ酢
酸（TFA）のクロロホルム溶液30mlに加え、
室温で20分間反応させる。樹脂をクロロホルム
30mlで１回、塩化メチレン30mlで５回、10％ト
リエチルアミンの塩化メチレン溶液30mlで３
回、次いで塩化メチレン30mlで６回それぞれ洗
浄してＨ−Pro−樹脂を得る。 Boc−Ala−OHの0.68ｇを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記Ｈ−Pro−樹脂を加え、
次いでDCCの0.74ｇを塩化メチレンに溶かした
溶液５mlを加え室温で２時間反応させる。樹脂
を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、Boc−Ala
−OHの0.68ｇ及び１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール0.55ｇの塩化メチレン溶液25mlに加
え、次いでDCCの0.74ｇを塩化メチレンに溶か
した溶液５mlを加えて再度同様に反応させる
（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Ala−Pro−樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Ala−Pro−樹
脂の脱Boc化を行ない、次いで下記アミノ酸を
順次縮合及び脱Boc反応に付す。 【表】 斯くして 樹脂の2.2ｇを得る。これにアニソール２ml、弗
化水素25mlおよびエタンジチオール0.5mlを加え、
−20℃で30分、次いで０℃で30分反応させた後、
得られるペプチドをセフアデツクスＧ−25（フア
ルマシア社、溶出液10％酢酸水溶液）CM−セフ
アデツクスＣ−25（フアルマシア社；溶出液、0.1
〜0.5M酢酸アンモニウム水溶液、濃度勾配、PH
＝４）次いでμ−ボンダパツクＣ−18（ウオータ
ーズ社）を用いたHPLC（溶出液；0.01％酢酸ア
ンモニウム水溶液；アセトニトリル＝70：30）に
て精製して、Ｈ−Pro−Val−Met−His−Pro−
His−Gly−Ala−Pro−OH〔以下「ペプチドＡ」
と呼ぶ〕341mgを得る。 Rf値： Rf¹＝0.03 Rf²＝0.27 元素分析値： （Ｈ−Pro−Val−Met−His−Pro−His−Gly
−Ala−Pro−OH・CH₃CO₂H・5H₂Oとし
て）： Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 48.38 7.11 16.67 分析値 48.12 7.28 16.39 製造例 ２ 製造例１で得た 樹脂1.1ｇ及びBoc−Tyr（２，６−ジクロロベン
ジル）−OHの1.06ｇを前記製造例１−と同様に
して二重カツプリング反応させる。次いで１−
と同様にして、脱保護基及び脱樹脂反応を行な
い、同様に精製して、Ｈ−Tyr−Pro−Val−
Met−His−Pro−His−Gly−Ala−Pro−OH〔以
下「ペプチドＢ」と呼ぶ〕183mgを得る。 Rf値： Rf¹＝0.04 Rf²＝0.29 元素分析値： （C₅₁H₇₂O₁₂N₁₄S・CH₃COOH・6H₂Oとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 50.03 6.96 15.40 分析値 49.68 7.07 15.92 ＜免疫抗原の製造＞ 製造例 １ ペプチドの合成製造例１で得たペプチドＡの５
mg及びアスカーリス抽出蛋白25mgを0.05Mリン酸
塩緩衝液（PH＝7.0）3.0mlに加え、この溶液に２
％グルタルアルデヒド溶液0.2mlを滴下し、室温
で３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留
水で４℃で透析し、凍結乾燥して、免疫抗原29mg
を得る。以下この抗原を「抗原」と言う。 抗原はアスカーリス１モルに対してペプチド
Ａが平均10モル結合したものである。尚このペプ
チドＡとアスカーリスとの結合率は、得られる抗
原を更にセフアデツクスＧ−50（溶出液：生理
食塩水、検出：OD280nm、流出速度：３ml／時
間、分取量：１mlづつ）でゲル過した際、未反
応のアスカーリス及びペプチドＡの存在は認めら
れないことより、該ゲル過によつてアスカーリ
スに結合したペプチドＡのフラクシヨンと他の生
成体（ペプチドＡの２量体）のフラクシヨンとを
分離し、ペプチド２量体の標準濃度の検量線を作
成して、上記２量体の量を求め、これを出発原料
として用いたペプチドＡの量から差し引いた値が
すべてアスカーリスに結合しているとして求めた
ものである。以下の抗原の製造例においても同様
とする。 製造例 ２ ペプチドA5mg及びアスカーリス抽出蛋白25mg
を蒸留水3.0mlに加え、この溶液にジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）200mgを加え、室温
で３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留
水で４℃下に透析し、凍結乾燥して、免疫抗原28
mgを得る。以下この抗原を「抗原」と言う。抗
原はアスカーリス１モルに対してペプチドＡが
平均12モル結合したものである。 製造例 ３ アスカーリス抽出蛋白の代りに、KLH（シグマ
社）を使用して、前記製造例１と同様にして免疫
抗原を得る。以下この抗原を「抗原」と言う。
抗原はKLH1モルに対してペプチドＡが平均10
モル結合したものである。 製造例 ４ アスカーリス抽出蛋白の代りに、KLH（シグマ
社）を使用して、前記製造例２と同様にして免疫
抗原を得る。以下この抗原を「抗原」と言う。
抗原はKLH1モルに対してペプチドＡが平均９
モル結合したものである。 製造例 ５ アスカーリス抽出蛋白の代りにBSAを、また
ペプチドＡの代りにペプチドＢをそれぞれ使用し
て、前記製造例２と同様にして免疫抗原を得る。
以下この抗原を「抗原」と言う。得られた抗原
はBSA1モルに対してペプチドＢが平均15モル
結合したものである。 ＜抗体の製造＞ 製造例 １ 抗原の製造例１で得た抗原の100μｇを1.5
mlの生理食塩水に溶解後、これにフロインドの
補助液1.5mlを加えて調整した懸濁液を３羽の
兎（2.5〜3.0Kg）に皮下投与し、２週間毎に９
回同量投与する。最後の抗原投与後、採血し、
遠心分離して抗血清（本発明ATLA抗体）を
得る。各兎に対し、抗体、抗体及び抗体
とする。 また、前記抗原の製造例２で得た抗原を用
いて上記の抗体製造例と同様にして６羽の兎
（2.5〜3.0Kg）から本発明のATLA抗体を得る。
各兎に対し、抗体，抗体，抗体，抗体
、抗体及び抗体とする。 同様に、前記抗原の製造例３，４及び５で得
た抗原，抗原，抗原を用いて上記の抗
体製造例と同様にして本発明のATLA抗体を
得る。得られる抗体をそれぞれ抗体，抗体XI
及び抗体XIIとする。 ＜標識ペプチドの製造＞ ペプチドの製造例２で得たペプチドＢをクロラ
ミンＴを用いる方法で以下の通り標識化する。 即ち上記ペプチド5μｇの0.5モルリン酸塩緩衝
液（PH7.5）10μにNa〔¹²⁵〕（carrier free N.
E.N.）１ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩衝
液20μを加え、つぎにクロラミンT20μの0.5
モルリン酸塩緩衝液20μを加える。室温で25秒
間撹拌してメタ重亜硫酸ナトリウム（Na₂S₂O₅）
100μｇの0.5Mリン酸塩緩衝液20μを加えること
で反応を終わらせる。次いで反応液に10％の冷沃
化ナトリウム水溶液10μを加え、反応混合物を
セフアデツクスＧ−25のカラム（1.0〜50cm）に
かけ（溶出液0.1％BSA及び0.01％NaN₃を含む
0.2モルアンモニウムアセテート緩衝液、PH5.5）、
¹²⁵で標識されたペプチドＢを得る。 該標識ペプチドの放射活性は、255μCi／μｇ
であつた。 Γ 力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10，10²，
10³，10⁴，10⁵……倍に希釈し、これらのそれぞ
れ100μに、¹²⁵標識ペプチド（上記で得られる
標識ペプチドを約9500cpmになるように希釈した
もの）0.1ml及び0.05モルリン酸塩緩衝液（PH＝
7.4）〔0.25％BSA、10ｍＡ EDTA及び0.02％
NaN₃を含む〕0.2mlを加え、４℃で24時間インキ
ユベートし、生成した抗体と¹²⁵標識抗原との
結合体を、デキストラン−活性炭法及び遠心分離
法（４℃、30分間、3000rpm）により未反応（結
合しない）¹²⁵標識ペプチドから分離し、その放
射線をカウントし、各希釈濃度における抗体の
¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）を測定する。
縦軸に抗体の¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）
及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、各々の濃度に
おいて結合率をプロツトする。結合率が50％とな
る抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を求める。抗体
〜XIIについて得られた結果を下記第１表に示
す。 【表】 Γ 抗体のATLA特異性試験 供試試料として各種濃度のペプチドＡ及び下記
ATLAサンプルを使用する。ATLA陽性サンプ
ル：ATLA陽性細胞株YAM〔Science，217.p737
〜739（1982）〕の培養細胞５×10⁹個に生理食塩
水30mlを加えてホモジナイズし、次いで１時間
遠心分離（105000×ｇ）して上清を採取し、
PBSで蛋白量を10mg／ml（この蛋白量は、大
塚アツセイ研究所製の総蛋白定量試薬である
「トネイン−TP」を用いた発色法により測定し
た）に調整する（以下これを「YAM上清」と
する）。 ATLA陰性サンプル：ATLA陰性細胞株である
CCRF−CEM〔Immunol.Ccmmun.，９(8)，
p731〜734（1980）〕及びBALL−１〔Nature，
London，267，843〜844（1977）〕を上記と同様
に処理して得た上清を用いる（以下これらをそ
れぞれ「CEM上清」及び「BALL上清」とす
る）。 また標準希釈剤として0.25％BSA、５ミリモル
EDTA及び0.02％のNaN₃を含む0.05モルリン酸
塩緩衝液（PH7.4）を使用する。 各々の試験管に、標準希釈剤0.2ml、供試試料
0.1ml、抗体の製造例１で得た抗体（最終力価
に相当、即ち50000倍希釈となるように希釈した
もの）0.1ml及び¹²⁵標識ペプチド（上記で得ら
れる標識ペプチドを約10000cpmになるように希
釈したもの）0.1mlを入れ、４℃で72時間インキ
ユベーシヨンした後、ノーマルブタ血清
（normal porcine serum）の0.1mlを加え、次い
でデキストランで被膜した活性炭の懸濁液0.5ml
を加え、４℃で30分間放置し、次に４℃、
3000rpmの条件下に30分間遠心分離を行ない、抗
体と¹²⁵標識ペプチドとの結合体(B)を、未反応
（結合しない）¹²⁵標識ペプチド(F)から分離し、
その放射線をカウントし、各供試試料を濃度及び
希釈率における(B)の百分率を求める。得られる結
果を第１図及び第２図に示す。 各図中縦軸は結合％（Ｂ／Bo×100；但し、
Boは供試試料濃度を０とした時の(B)の百分率）
を、横軸は供試試料濃度（ペプチドＡの濃度、
YAM上清、CEM上清及びBALL上清の蛋白濃
度）を示す。また第１図において曲線(イ)はペプチ
ドＡを示し、第２図において曲線(ロ)はYAM上清
を、曲線(ハ)はCEM上清を、曲線(ニ)はBALL上清
を夫々示す。第１図はペプチドＡと抗体の親和
性の高さを示し、第２図は抗体のATLAに対す
る選択性の高さを示している。また第２図より本
発明抗体はATLA陰性細胞由来の蛋白に対して
交互にみられないことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はペプチドＡと本発明の抗体との親和性
を示す曲線である。第２図は、ATLAに対する
本発明抗体の反応性（特異性）を示す曲線であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｒ−Pro−Val−Met−His−Pro−His−Gly−
   Ala−Pro−OH 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Tyr基を示す。〕 で表わされるヒト白血病ウイルス関連ペプチドお
   よびその誘導体から選ばれた化合物と担体との複
   合体からなる免疫抗原を哺乳動物体に投与し、生
   成する抗体を採取することを特徴とするATLA
   抗体の製造法。