JPH035822B2

JPH035822B2 -

Info

Publication number: JPH035822B2
Application number: JP1058223A
Authority: JP
Inventors: Nobutaka Tani; Tsuneo Hayashi
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1991-01-28
Also published as: JPH01280469A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は血液中の有害成分を除去するための吸
着体に関する。さらに詳しくは血液あるいは血
漿、血清中からリポ蛋白、とくに極低密度リポ蛋
白（VLDL）および（または）低密度リポ蛋白
（LDL）を選択的に吸着除去するための吸着体に
関する。［従来の技術・発明が解決しようとする課題］血液中に存在するリポ蛋白のうちVLDL、
LDLはコレステロールを多く含み、動脈硬化の
原因となることが知られている。とりわけ家族性
高脂血症などの高脂血症、高コレステロール症に
おいては正常値の数倍のJLDLおよび（または）
LDL値を示し、冠動脈の硬化などをひきおこす。
これらの疾患の治療には食事療法、薬物療法が行
なわれているが効果に限度があり、副作用も懸念
されている。とくに家族性高脂血症に対しては
VLDL、LDLを多くんだ患者の血漿を分離した
のち、正常血漿またはアルブミンなどを成分とす
る補液と交換してVLDL値、LDL値を低下させ
る、いわゆる血漿交換療法が現在のところほぼ唯
一の効果的な治療法である。しかしながら血漿交換療法は周知のごとく、(1)
高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用いる必要が
ある。(2)肝炎ウイルスなどの感染の惧れがある、
(3)有害成分のみでなく有用成分も同時に除去して
しまう、すなわちリポ蛋白のばあい有用である高
密度リポ蛋白（HDL）も同時に除去してしまう
などの欠点を有する。叙上の欠点を解消する目的で膜による有害成分
の選択的除去が試みられているが、選択性の点で
満足できるものはいまだえられていない。また同じ目的で抗原、抗体などを固定した、い
わゆる免疫吸着体を用いる試みがなされており、
該方法は選択性の点ではほぼ満足できるものの、
用いる抗原、抗体の入手が困難かつ高価であると
いう欠点を有する。さらには、除去対象物質に特異的な親和性（ア
フイニテイー）を有する物質（以下、リガンドと
いう）を担体に固定した、いわゆるアフイニテイ
ークロマトグラフイーの原理による吸着体も試み
られている。該方法に用いられるリガンは抗原、
抗体などに比べれば入手しやすい物質が多いが、
生体に由来する物質が多いため体外循環治療に用
いるには滅菌操作などに対する安定性、価格、安
全性などの点で満足しうるものはほとんどない。［課題を解決するための手段］本発明者らは叙上のごとき欠点を克服すべくさ
らに鋭意研究を重ねた結果、特定の粘度と硫黄量
を有するデキストラン硫酸および（または）その
塩を水不溶性多孔体に共有結合を介して固定する
ことによつて、高効率でかつ安全に、しかも選択
性よくリポ蛋白を吸着除去しうる体外循環治療用
吸着体がえられることを見出し、本発明を完成す
るに至つた。すなわち、本発明は極限粘度（1M食塩水溶液
中、25℃で測定、以下同様）が0.12dl／ｇ以下で
かつ硫黄含量が15〜22重量％のデキストラン硫酸
および（または）その塩が水不溶性多孔体に式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子であ
る）で示される共有結合を介して固定されたカラ
ム体積１mlあたり0.2〜100mgである体外循環治療
用リポ蛋白吸着体に関する。［実施例・発明の効果］デキストラン硫酸および（または）その塩とは
ロイコノストツク・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）などにより生産
される多糖であるデキストランの硫酸エステルお
よび（または）その塩である。デキストラン硫酸および（または）その塩がカ
ルシウムなどの２価カチオンの存在下にリポ蛋白
と沈殿を形成することが知られており、通常該目
的には分子量が50万（極限粘度が約0.20dl／ｇ）
程度のデキストラン硫酸および（または）その塩
が使用される。しかしながら、比較例に示すよう
に叙上のごときデキストラン硫酸および（また
は）その塩を水不溶性多孔体に固定してもLDL
および（または）VLDLの吸着能力は低く、実用
に耐えない。本発明者らは種々検討を重ねた結
果、極限粘度が0.12dl／ｇ以下、より好ましくは
0.08dl／ｇ以下でかつ硫黄含量が15〜22重量％以
上のデキストラン硫酸および（または）その塩が
高いLDLおよび（または）VLDL吸着能力と選
択性を示すことを見出した。さらに驚くべきこと
に、叙上のごとき沈殿法では10〜40mMの２価カ
チオンを必要とするのに対し、本発明の吸着体で
は２価カチオンの添加を必ずしも行なわなくとも
高い吸着能力と選択性を示すことを見出した。ま
たデキストラン硫酸および（または）その塩の毒
性は低いが、分子量がある程度以上大きくなると
毒性が増加することが知られており、この点から
も極限粘度が0.12dl／ｇ以下、より好ましくは
0.08dl／ｇ以下の比較的低分子量のデキストラン
硫酸および（または）その塩を用いることによつ
て、固定されたデキストラン硫酸および（また
は）その塩が万一脱離した際の危険を防止でき
る。さらには、デキストラン硫酸および（また
は）その塩は大部分がα−１，６−グリコシド結
合であるので高圧蒸気滅菌などの操作を施しても
変化が少ない。デキストラン硫酸および（または）その塩の分
子量の測定法には種々あるが、粘度測定によるの
が一般的である。しかしながら、デキストラン硫
酸および（または）その塩は高分子電解質である
ため溶液のイオン強度、PH、さらにデキストラン
硫酸および（または）その塩の硫黄含量（すなわ
ち、スルホン酸基の量）などによつて同じ分子量
のものでも粘度が異なる。本発明でいう極限粘度
とは、デキストラン硫酸および（または）その塩
をナトリウム塩とし、中性の1M食塩水溶液中、
25℃で測定したものである。本発明に用いるデキストラン硫酸および（また
は）その塩は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、塩と
してはナトリウム、カリウムなどの水溶性塩が好
ましい。本発明に用いる担体の水不溶性多孔体としては
つぎの性質を備えていることが好ましい。 (1) 機械的強度が比較的高く、カラムなどに充填
して、血液、血漿などの体液を流したばあいの
圧力損失が小さく、目詰りなどをおこさない。 (2) 充分な大きさの細孔が多数存在すること、す
なわち吸着除去対象物質が細孔内に侵入できる
ことが必要であり、球状蛋白質およびウイルス
を用いて測定した排除限界分子量が100万〜１
億の範囲である（ただし排除限界分子量とは細
孔内に侵入できない（排除される）分子のうち
最も小さい分子量をもつものの分子量をいう）。 (3) 表面に固定化反応に用いうる官能基または容
易に活性化しうる官能基、たとえばアミノ基、
カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール
基、酸無水物基、サクシニルイミド基、塩素
基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ基など
が存在する。 (4) 高圧蒸気滅菌などの滅菌操作による変化が少
ない。なお、(2)の球状蛋白質およびウイルスを用いて
測定した排除限界分子量（以下、排除限界分子量
という）に関しては、排除限界分子量100万未満
の担体を用いたばあいはVLDL、LDLの除去量
は小さく実用に耐えないが、排除限界分子量が
100万〜数百万とVLDL、LDLの分子量に近い担
体でもある程度実用に供しうるものがえられる。
一方、排除限界分子量が１億を超えると、リガン
ドの固定量が減少して結果的に吸着量が減り、ま
たゲルの強度も低下するため好ましくない。かか
る理由のため本発明に用いる水不溶性多孔体は排
除限界分子量が100万〜１億の範囲であることが
適当である。叙上のごとき性質を備えた水不溶性多孔体の代
表例としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重
合体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアク
リレート、架橋されたビニルエーテル−無水マレ
イン酸共重合体、架橋されたスチレン−無水マレ
イン酸共重合体、架橋ポリアミドなどの合成高分
子の多孔体や多孔質セルロースゲル、さらにはシ
リカゲル多孔質ガラス、多孔質アルミテ、多孔質
シリカアルミナ、多孔質ヒドロキシアパタイト、
多孔質ケイ酸カルシウム、多孔質ジルコニア、ゼ
オライトなどの無機多孔体があげられるが、これ
らに限定されるわけではない。また水不溶性多孔
体の表面は多糖類、合成高分子などでコーテイン
グされていてもよい。水不溶性多孔体の粒子径は一般的には小さい方
が吸着能力の点では好ましいが、粒子径があまり
に小さくなるとカラムに充填したばあいの圧力損
失が大きくなり好ましくなく、１〜5000μの範囲
であることが好ましい。また水不溶性多孔体は単
独で用いてもよいし２種類以上混合して用いても
よい。叙上の代表例の中でも多孔質セルロースゲルは
前記(1)〜(4)の性質を備えているばかりでなく、デ
キストラン硫酸および（または）その塩を効率よ
く固定することができるため本発明に最も適した
水不溶性多孔体のひとつである。デキストラン硫酸および（または）その塩を水
不溶性多孔体に固定する方法には種々あるが、体
外循環治療に用いるリガンドが脱離しないことが
重要であるので、リガンド結合の強固な共有結合
を介して水不溶性多孔体に固定されていることが
望ましい。固定化方法としては、ハロゲン化シアン法、エ
ピクロルヒドリン法、ビスエポキサイド法、ハロ
ゲン化トリアジン法などがあげられるが、結合が
強固でリガンドの脱離の危険性が少ないエピクロ
ルヒドリン法が最も本発明に適している。しかし
ながら、該エピクロルヒドリン法は反応性が低
く、とくにデキストラン硫酸および（または）そ
の塩を固定するばあいにはリガンドの官能基が水
酸基であるためさらに反応性が低く、通常の方法
では充分なリガンド固定量をうることは難しい。本発明者らは種々検討の結果、エピクロルヒド
リンで活性化されたエポキシ化水不溶性多孔体と
デキストラン硫酸および（または）その塩を反応
させる工程において、デキストラン硫酸および
（または）その塩の濃度（水不溶性多孔体（乾燥
重量）を除く全反応系重量に対する濃度、以下同
様）を３重量％以上、より好ましくは10重量％以
上に保つことによつて充分な量のデキストラン硫
酸および（または）その塩が固定されることを見
出した。デキストラン硫酸および（または）その
塩の固定化量については、有意なリポ蛋白吸着量
をうるにはカラム体積１mlあたり0.2mg以上が好
ましく、また経済性を考慮すると100mg以下が望
ましい。また、多孔質セルロースゲルを用いると他の水
不溶性多孔体に比べ、同じ条件でもデキストラン
硫酸および（または）その塩の固定量が多く、好
都合である。エピクロルヒドリンにより活性化さた水不溶性
多孔体とデキストラン硫酸および（または）その
塩との反応でえられる吸着体は、デキストラン硫
酸および（または）その塩が式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子）で
示される結合を介して水不溶性多孔体に固定され
ている。なお、固定化反応終了後、未反応のデキストラ
ン硫酸および（または）その塩は回収して精製な
どの工程を経て再使用することもできる。デキストラン硫酸を固定したのち、未反応の活
性基（エピクロルヒドリンを用いたばあいはエポ
キシ基）はモノエタノールアミンなどで封止して
おくのが望ましい。本発明による吸着体を体外循環治療に用いるに
は種々の方法があるが、入口と出口に体液成分
（血球、蛋白質など）は通過するが吸着体は通過
できないフイルター、メツシユなどを装着したカ
ラムに充填し、該カラムを体外循環回路に組み込
み、血液、血漿などの体液をカラムに通して行な
う方法が代表的である。つぎに実施例をあげて本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はかかる実施例のみに限定され
るわけではない。比較例１セルロフアインＡ−３（チツソ(株)製の多孔質セ
ルロースゲル、排除限界分子量50000000、粒子径
45〜105μm）10mlに20％、NaOH4ｇ、ヘプタン
12ｇおよびノニオン系界面活性剤トウイーン
（Tween）20を１滴加え、40℃で２時間撹拌後エ
ピクロルヒドリン５ｇを加えて２時間撹拌した。
静置後上澄みを捨て、ゲルを水洗濾過してエポキ
シ化セルロースゲルをえた。つぎにLDL沈殿用として市販されている極限
粘度0.20dl／ｇ、平均重合度（原料デキストラン
の平均重合度、以下平均重合度という）3500、硫
黄含量17.7重量％のデキストラン硫酸ナトリウム
0.5ｇを水２mlに溶解し、これに叙上のごとくし
てえられたエポキシ化セルロースゲル２mlを加
え、PH12に調整した（デキストラン硫酸ナトリウ
ムの濃度は約10重量％）。これを40℃で16時間振
盪後ゲルを別し、2M食塩水、0.5M食塩水、水
で洗浄し、デキストラン硫酸ナトリウムが固定化
されたセルロースゲルをえた。未反応のエポキシ
基はモノエタノールアミンを用いて封止した。固
定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量はカラ
ム体積１mlあたり4.2mgであつた。比較例２デキストラン硫酸ナトリウムを極限粘度0.124
dl／ｇ、平均重合度140、硫黄含量5.7重量％のも
のにかえたほかは比較例１と同様にしてデキスト
ラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル
をえた。固定されたデキストラン硫酸ナトリウム
の量はカラム体積１mlあたり2.5mgであつた。実施例１デキストラン硫酸ナトリウムとして (1) 極限粘度0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄
含量17.7重量％ (2) 極限粘度0.055dl／ｇ、平均重合度40、硫黄
含量19重量％ (3) 極限粘度0.083dl／ｇ、平均重合度140、硫黄
含量19.2重量％ (4) 極限粘度0.118dl／ｇ、平均重合度270、硫黄
含量17.7重量％の４種類を用い、比較例１と同様にしてデキスト
ラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲル
をた。固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの
量はカラム体積１mlあたりそれぞれ2.0mg、1.5
mg、4.0mg、4.3mgであつた。実施例２架橋ポリアクリレートゲルであるトヨパール
HW65（東洋曹達(株)製、排除限界分子量5000000、
粒子径50〜100μm）10mlに飽和NaOH水溶液６
ml、エピクロルヒドリン15mlを加え、撹拌しなが
ら50℃で２時間反応させたのち、ゲルをアルコー
ル、水で洗浄してエポキシ化されたゲルをえた。えられたゲル２mlに極限粘度0.55dl／ｇ、平均
重合度40、硫黄含量19重量％のデキストラン硫酸
ナトリウム0.5ｇおよび水２mlを加えた（デキス
トラン硫酸ナトリウムの濃度は約13重量％）。つ
いでPH12に調整し、40℃で16時間振盪し、ゲルを
別し、2M食塩水、0.5M食塩水、水で洗浄して
デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルを
えた。未反応のエポキシ基はモノエタノールアミ
ンを用いて封止した。固定されたデキストラン硫
酸ナトリウムの量はカラム体積１mlあたり0.4mg
であつた。実施例３極限粘度0.55dl／ｇ、平均重合度40、硫黄含量
19重量％のデキストラン硫酸ナトリウムを用い、
固定化反応におけるデキストラン硫酸ナトリウム
の濃度を2.5重量％にかえたほかは比較例１と同
様にしてデキストラン硫酸ナトリウムが固定され
たゲルを得た。固定されたデキストラン硫酸ナト
リウムの量はカラム体積１mlあたり0.15mgであつ
た。試験例比較例１〜２、実施例１〜３でえられたデキス
トラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルのそれぞ
れ１mlをカラムに充填し、高脂血症患者の血漿
（総コレステロール濃度300dl／ｇ）６mlを流し、
吸着されたLDLの量を総コレステロールを指標
として測定した（用いた血漿中のコレステロール
はほとんどがLDLに由来するため）。結果を第１表に示す。

【表】実施例４実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度
0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄含量17.7重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したもの
を生理食塩水中に分散させた状態で120℃20分間
高圧蒸気滅菌を施し、実施例３と同様にして
LDLの吸着量を測定したところ、該滅菌操作に
よる吸着量の減少はわずかであつた。実施例５実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度
0.027dl／ｇ、平均重合度12、硫黄含量17.7重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したもの
１mlをカラムに充填し、これに正常ヒト血漿
（LDLコレステロールとHDLコレステロールの比
が約１：１）６mlを通しところ、LDLは大幅に
減少したが、HDLはほとんど吸着されなかつた。実施例６実施例５で用いた吸着体１mlをカラムに充填
し、これにVLDL、LDL、HDLを含む正常ウサ
ギの血漿６mlを通し、カラム通過前後での血漿中
のリポ蛋白をポリアクリルアミドゲルを用いたデ
イスク電気泳動法で調べた。第１図はその結果を
示すチヤートである。第１図中、曲線ＡおよびＢ
はそれぞれカラム通過前、通過後の電気泳動の結
果であり、縦軸は570nmにおける吸光度、↑はそ
れぞれVLDL、LDL、HDLのバンドが出現した
位置を示す。第１図に示すごとく、VLDL、LDLは吸着さ
れたが、HDLはほとんど吸着されなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリアクリルアミドゲルを用いたデイ
スク電気泳動の結果を示すチヤートである。

Claims

【特許請求の範囲】１極限粘度が0.12dl／ｇ以下でかつ硫黄含量が
15〜22重量％であるデキストラン硫酸および（ま
たは）その塩が水不溶性多孔体に式：（式中、O^Aはデキストラン硫酸および（または）
その塩の水酸基に由来する酸素原子、O^Bは水不
溶性多孔体の表面水酸基に由来する酸素原子であ
る）で示される共有結合を介して固定された量が
カラム体積１mlあたり0.2〜100mgである体外循環
治療用リポ蛋白吸着体。２水不溶性多孔体の排除限界分子量が100万〜
１億の範囲である特許請求の範囲第１項記載の吸
着体。３水不溶性多孔体が多孔質セルロースゲルであ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の吸着
体。