JPH04121199A - ポリエン系抗生物質の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ポリエン系抗生物質の発酵液などの中に、該
発酵液から分離した菌体に随伴して、又はポリエン系抗
生物質の粗沈澱物中に存在するポリエン系抗生物質を酸
アミド又は尿素などと塩基とを使用して水噸溶液化し、
ついでこの水性溶液から不溶物を分離することにより純
度の向上したポリエン系抗生物質の水性溶液を得るポリ
エン系抗生物質の精製法、及びこのようにして得られた
ポリエン系抗生物質の水性溶液を酸を使用して中和し、
ついで生成したポリエン系抗生物質の沈澱を分離するポ
リエン系抗生物質の精製分離法に関する。

（従来の技術） ポリエン系抗生物質は、水に難溶なため通常その発酵液
中では溶存状態で存在することがなく、固体状態で存在
する。そのためポリエン系抗生物質をその発酵液から分
離取得するには、発酵液に直接に、或は発酵液から分離
して得た菌体または適当な方法で得た粗沈澱物に有機溶
媒を添加してそこに存在する固体のポリエン系抗生物質
を可溶化した後、向流分配法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィー等（Ｊ、＾ｎｊｉｂｉｏ＋、、　３３．５９１
（１９８Ｇ））又はシリカゲルクロマトグラフィー等で
精製することによっている。このためＭｅＯＨＳＥｊＯ
Ｈ，プロパツール、ブタノール等の大量の有機溶剤を使
用する必要がある（特開昭６１−１８９２２４号公報、
米国特許第３７７３９２５号公報）。あるいはまた、水
溶液とするための可溶化はドデシル硫酸ナトリウム等の
界面活性剤を用いてなされている（特開昭５１−５１５
８７号公報）。

（発明が解決しようとする課題） ポリエン系抗生物質をその発酵液から分離取得する場合
、上記のように、大量の有機溶剤を使用しており、工業
的にこれを行う場合、火災、爆発などの危険を伴う。ま
た、方法も煩雑である。

方、ドデシル硫酸ナトリウム等の通常知られている界面
活性剤を使用する場合、ポリエン系抗生物質と界面活性
剤とを分離することが非常に困難で、効率的、安全、簡
単なポリエン系抗生物質の分離取得法の開発が望まれて
いる。

（課題を解決するための手段） 本発明者は上記問題点を解決すべく鋭意研究した結果、
ポリエン系抗生物質が酸アミド、酸アミド誘導体、尿素
及び／又は尿素誘導体と塩基とを併用することにより水
に可溶化され得ることを発見し、この発見に基き本発明
を完成した。

即ち、本発明は、ポリエン系抗生物質の発酵液若しくは
これよりポリエン系抗生物質を分離取得するための中間
処理液中に、該発酵液から分離した菌体に随伴して、又
はポリエン系抗生物質の粗沈澱物中に存在するポリエン
系抗生物質を酸アミド、その誘導体、尿素及び／又は尿
素誘導体と塩基とを使用して水性溶液化し、ついでこの
水性溶液から不溶物を分離することを特徴とするポリエ
ン系抗生物質の精製法、及びこのような方法により不溶
物を分離して得られたポリエン系抗生物質の水性溶液を
酸を使用して中和し、ついで生成したポリエン系抗生物
質の沈澱を分離することを特徴とするポリエン系抗生物
質の精製法に関する。

以下、本発明を逐次説明する。

ポリエン系抗生物質としては、例えば、オーレノマイシ
ン（Ａａｒｅｏ＋ｗｓｃｉｎ）　、レクチバレントマイ
シン（Ｒｅｃｔｉｗｔｒｅａｄｏｓ７ｃｉｎ）　、オー
レノマイシン（ＡｇｒｅＩｌｏＢｃｉｎ）　Ｂ、オーレ
ニン（Ａ＋ｒｅｎｉａ）　　　リモシジン（Ｒｉｍｏｃ
ｉｄｉｎ）　　　ヒリビン（Ｆｉｌｉｐｉｎ）　ｓアラ
０シジン（Ｅｖｒｏｃｉｄｉ口）＾＆Ｂ、ガンニバマイ
シン（Ｇｘｎｎｉｂａｍ７ｃｉｏｌ、ミコチシン（Ｍ７
ｃｏｔｉｃｉｎ）Ａ＆Ｂ、ラバマイシン（Ｒａｐａｍ７
ｃｉｎ）　　ロフラマイコシン（Ｒｏ１１ａｍ７ｅｏｃ
ｉｎ）、デルモスタチン（Ｄｅｒｍｏｓｔａｔｉｎ）ナ
イスタチン（Ｎ７ｓｊａｔｉｎ）、アンホテリシン（＾
ｍｐｈｏｊｅｒｉｃｉｎｌＢ　　ｓ　　パ　−　ト　リ
　シ　ン　（ＰａｒｆｒｉｃｉｎＪＡ＆Ｂ。

リエノマイシン（Ｌｉｅｎｏｍ７ｃｉｎ）、キャンジシ
ジン（Ｃｚｎｄｉｃｉｄｉｎ）など（Ｓ、　Ｏｍｕｒｘ
、Ｍａｃ＋ｏｌｉｄ！＾ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｉ　　、　
Ａｃｉｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８４））ヤＶ−２
８−３８（特開昭６１−１８９２２４号公報）等ヲ挙ｉ
ｆることができる。そして、これらの抗生物質がそれぞ
れの抗生物質の生産菌を栄養培地に培養するいわゆる発
酵法によって製造されることは当業者に周知である。

本発明者の知見に係わるポリエン系抗生物質を水性溶媒
中において可溶化せしめ得るその溶解剤について説明す
る。

酸アミドとしては、ホルムアミド、アセトアミド、ニコ
チン酸アミドなどを挙げることができ、酸アミド誘導体
としては　１−メチルニコチン酸アミド、Ｎ−メチルニ
コチン酸アミドなどを挙げることができる。多数の酸ア
ミド及びその誘導体のうちから本発明の方法に有利に使
用できるものは単位溶解剤当りのポリエン系抗生物質の
溶解量、溶解剤入手の難易及びその価格等の見地から容
易に選択することができる。

尿素については特別の説明を必要としないであろう。尿
素誘導体としては、チオ尿素などを挙げることができる
。本発明の方法に有利に使用できる尿素誘導体は同様の
見地から容易に選択することができる。

塩基としては、ＮａＯＨ，ＫＯＨなどのアルカリ金属の
水酸化物、ＮＨ４ＯＨ等を挙げることができる。これら
はその水溶液の形態で使用するとよい。

本発明においてポリエン系抗生物質の水性溶液化は、次
のようにして行なう。

ポリエン系抗生物質の発酵液中に存在するポリエン系抗
生物質の水性溶液化は、ポリエン系抗生物質を溶解する
に足る量の溶解剤を単に発酵液に添加混合するだけでよ
い。そのような量としては、必要な全ての溶解剤（酸ア
ミド系及び／又は尿素系と塩基系）を添加後の濃度で表
わして、通常、例えば尿素及びニコチン酸アミドの場合
は１％（本明細書において、％は全で重量％を意味する
。）以上、好ましくは尿素では３〜６０％程度、ニコチ
ン酸アミドでは１〜２０％程度であり、Ｎ　ａ　ＯＨ１
Ｋ　ＯＨ１Ｎ　Ｈ４０Ｈ等の塩基の場合は０．０１Ｎ以
上、好ましくは０．０１〜０．５Ｎである。

さて、ポリエン系抗生物質の以上のような水性溶液化は
、発酵液中の水分を利用した水溶液化である。

しかしながら、本発明方法の実施においては、火災、爆
発等の危険性のない量のメタノール、エタノール等水可
溶性の且つポリエン系抗生物質を溶解する有機溶媒を併
用することもできる。このような量としては、有機溶媒
添加後の濃度で表わして６０％以下が適当である。有機
溶媒を使用することにより酸アミド系及び／又は尿素系
物質と塩基系物質とよりなる本発明の溶解剤の使用量を
節減することができる。なお、この場合、ポリエン系抗
生物質を溶解した溶媒は、発酵液由来の水分と有機溶媒
との混合溶媒である。

本発明の方法におけるポリエン系抗生物質の溶液化は、
前記のような水単独溶媒による溶液化の態様と水と有機
溶媒との混合溶媒による溶液化の態様とがあるので、両
態様を総称するものとじて水性溶液化なる表現を用いる
。

本発明の溶解剤及び所望により有機溶媒を加えてポリエ
ン系抗生物質を溶解せしめられたポリエン系抗生物質の
発酵液は、ついで遠心分離、濾過等の手段により菌体そ
の他の不溶物を除去する。

このようにして、純度の向上したポリエン系抗生物質の
水溶液が得られる。

ポリエン系抗生物質の発酵液よりエリボリン系抗生物質
を分離取得するための中間処理液としては、例えば、ポ
リエン系抗生物質の発酵液を自己消化、ＥＤＴＡ−リゾ
チーム等の酵素処理による溶菌、超音波処理等の菌体の
破壊によって生成した液が挙げられるが、このような中
間処理液から不溶物を含まない純度の向上したポリエン
系抗生物質の水性溶液を得ることは、発酵液そのものを
本発明の方法により処理する場合に準じて行なえること
は当業者に自明であって、これ以上の説明は不要であろ
う。

ポリエン系抗生物質の発酵液中には、前記の如く、ポリ
エン系抗生物質は溶解せずに固体状態で存在している。

このような状態のポリエン系抗生物質を分離取得するた
めに、大量の有機溶剤を使用する従来法では、有機溶剤
の使用効率を向上させるためにポリエン系抗生物質を一
旦発酵液から遠心分離、濾過等により菌体と共に分離し
、ついで菌体に随伴したポリエン系抗生物質を有機溶媒
により抽出する。

本発明の方法では、例えば、同様にして発酵液から分離
したポリエン系抗生物質を随伴した菌体から、本発明の
溶解剤を使用してポリエン系抗生物質を溶液化する。こ
の場合、溶媒として水及び所望により有機溶媒を使用し
なければならないことはもちろんである。溶解剤及び溶
媒の使用量は、発酵液そのものを本発明の方法により処
理する場合を考慮して当業者であれば容易に定めること
ができる。ポリエン系抗生物質を溶解した後に菌体等の
不溶物を除去して純度の向上したポリエン系抗生物質の
水性溶液が得られる。

ポリエン系抗生物質の粗沈澱物としては、例えば、ポリ
エン系抗生物質の発酵液を遠心分離等で菌体を除去し、
通常行なわれて有機溶媒で抽出し、ついでこの抽出液の
減圧濃縮又は水添加によって得られるものが挙げられる
が、このような粗沈澱物から不溶物を含まない純度の向
上したポリエン系抗生物質の水性溶液を得ることは、ポ
リエン系抗生物質を随伴した菌体からポリエン系抗生物
質の水性溶液を得る場合に準じて行なえることは当業者
に自明であって、これ以上の説明は不要であろう。

上記のようにして得られる本発明の精製法による純度の
向上したポリエン系抗生物質の水性溶液から、例えば減
圧下に濃縮乾固してポリエン系抗生物質を回収すること
ができるが、単にこの溶液を中和してポリエン系抗生物
質を沈澱せしめ、ついでこの沈澱を分離することによっ
ても極めて容易に回収することができる。

中和はポリエン系抗生物質の水性溶液に酢酸、硫酸、塩
酸等の酸を加えることによって行なうことができる。酸
の添加量は溶液中に存在する塩基とほぼ当量以上である
が、１〜３倍当量が好ましい。酸添加中和によりポリエ
ン系抗生物質の沈澱が生成される。これを濾過や遠心分
離で回収し乾燥すれば目的のポリエン系抗生物質が得ら
れる。

必要に応じて、通常の分離精製方法により更に精製する
ことが出来、例えば「カプセル・バックＯＤＳカラム」
　（資生堂社製）やｒＬＲＰ−ＩＪ（ワットマン社製Ｃ
−１８逆相クロマトグラフイー用担体）等を用いる逆相
カラムクロマトグラフィ、ゲル濾過法、イオン交換クロ
マトグラフィー加水沈澱法、中和沈澱法等との組合わせ
で高純度に精製されたポリエン系抗生物質が製造できる
。

（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ グルコース　６％、バクトソイトン２％、酵母エキス０
２％、ポリペプトン０．３％、硫酸マグネシウム７水塩
０．０１％及び残りが水より成る培地２０１を加熱殺菌
して３０！容発酵槽に入れ、これにパートリシンＢを生
産するストレプトミセス・アレネ（Ｈｔｅｐｌｏｍ７ｃ
ｅｔ　５ｒｅｎ！ｅ）　Ａ　Ｊ　　９４６４（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１１０１４）を接種して２８℃で５日間培養した
。

このような培養後の培養液（発酵液）に直接尿素を３０
％の濃度になるように加え、ついで６ＮＮａＯＨ水溶液
を０．０２Ｎに成るように加えた。３０分間室温にて撹
拌後、濾過して菌体を除去し濾液として不溶物を含まな
いパートリシンＢの水溶液を１９１得た。

濾液にＮａＯＨに当量の６Ｎ塩酸を加え、５℃で４時間
放置してパートリシンＢを沈澱させ、遠心分離で沈澱物
を回収した。該沈澱に水５１を加え洗浄後、ＭｅＯＨ５
１，次いで水２１で再度洗浄した後凍結乾燥した。その
結果、３５ｇのパートリシンＢが得られた。

得られたパートリシンＢの理化学的性質は第１表に示す
通りであった。

第１表 分子量：　　（ＦＡＢＭＳによる測定値）　１１１２薄
層クロマトグラフィー：　（ワットマン社製ＰＬＫＣ１
８Ｆ　ＴＬＣプレート、展開溶剤：ＣＨＣＨ３ＣＮ５Ｏ
０１Ｈ４０Ａ　ｃ　（ｐＨ９，０）　＝４５　：　５５
（Ｖ／Ｖ％）における）Ｒ７値０．３４（単一スポット
）ＨＰＬＣ：　　（カラム：山村化学研究所型ＭＭＣＡ
Ｍ３１２、φ　４．５Ｘ　　１５０ｍ＋、溶離液：　Ｃ
Ｈ３ＣＮ５０ｍＭＮ　Ｈ４０Ａ　（（＋’８　５．５）
　＝４５　：　５５’Ｖ／Ｖ％）流速・　ｌｌＲ１２７
ｍ１ｎにおける）保持時間８分て単一ピークを与える。

紫外線吸収スペクトル（Ｕ　Ｖｍａ！（ε））　：　　
４００（１１７５５８）、　３７（１００４２５）、　
３５８（７３３９２）及び赤外線吸収スペクトルがパー
トリシンＢ　（１，＾ｎｔｉｂｉｏｌｉｃ＋３５、　９
９７．　　（１９ｇ２）　）と良く一致する。

本実施例で得られたパートリシンＢは強い抗真菌活性を
示し、カンヂダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１に対
する最小生育阻止濃度は０．０４１１９／〆であった。

実施例２ 実施例１と同様な方法で得た発酵液に１０％の濃度にな
るようにニコチン酸アミドを加え、更に０．０１Ｎにな
るよう５Ｎ　　ＫＯＨ水溶液を加えた。

室温で３０分間撹拌後濾過して菌体を除去し、Ｆ液を１
９Ｉ！得た。

得られたＰ液に、ＫＯＨと当量の酢酸を加え、遠心分離
により粗パートリシンＢを回収した。水洗後、凍結乾燥
して３７ｇの精製パートリシンＢが得られた。

このハートリシンＢの理化学的性質と並びに抗真菌活性
は実施例１に示した結果と同様であった。

実施例３ 実施例１と同様な方法で得たパートリシンＢ生産菌を含
有する発酵液を東洋濾紙ＮｃＬ２で吸引濾過して菌体２
００ｇ　（湿菌体重量）を得た。これに１％のニコチン
酸アミドと０．０−ＩＮのＮａＯＨとを含む５０％Ｍ　
ｅ　ＯＨ水溶液１０！を加え、室温で３０分間撹拌後濾
過して菌体を除去した。

得られた濾液１２７に０．０１Ｎになるように６Ｎ塩酸
を加え、遠心分離してパートリシンＢを回収した。

水洗いして凍結乾燥品とした結果３７ｇのパートリシン
Ｂが得られた。このパートリシンＢの理化学的性質、抗
真菌活性は実施例１の結果と一致した。

実施例４ 実施例１と同様にして得た発酵液に３％の尿素と０．０
３ＮのＮＨ４ＯＨとを含む５０％ＥｔＯＨ水溶液１０Ａ
’を加え、実施例１と同操作でパートリシンＢを３４ｇ
得た。

このものは実施例１と同様な理化学的性質と抗真菌活性
を示した。

実施例５ 実施例３におけると同様な方法で分離して得たパートリ
シンＢ生産菌の培養菌体に第２表に示した各種溶媒を添
加し、抽出操作を行い、実施例１におけると同様の方法
でパートリシンＢを単離、洗浄、凍結乾燥した結果、第
２表に示した量でパトリシンＢが取得された。

第２表 （１）Ｈ２Ｏ （２）０．０１Ｎ　　　Ｎａ０Ｈ （３１０，０１Ｎ　　　ＫＯＨ （４）　０．０１Ｎ　　ＮＨ４０Ｈ （５）　１０％ニコチン酸アミ （６）　３０％尿素 （７）ＭｅＯＨ （８）　５０％Ｍ　ｅ　ＯＨ （９）ＥｔＯＨ （１０）プロパノール ド 十〇 １Ｎ ＭｅＯＨ 〈 （１４１３０％尿素十〇 ２Ｎ 　ＯＨ （１５）３０％尿素十〇 ２Ｎ ＮＨＯＨ （１６）５０％プロパツール＋ ン酸アミド＋０．０２Ｎ ２％ニコチ ＭｅＯＨ 因みに、第２表中、（１１）〜（１７）が本発明に係わ
るものである。

実施例６ 実施例１で得たパートリシンＢのうち２０．を分取し、
これをＩＥの１％のニコチン酸アミドと１）、０１Ｎの
ＮａＯＨとを含む５０％Ｍ　ｅ　ＯＨ水溶液に溶解し、
４００Ｗの高圧水銀灯を用いて３０分間光を照射した。

パートリシンＢに光を当てるとポリエンがシス型からト
ランス型に変化してＵＶＰ−Ａと名づけられたポリエン
系抗生物質に変化する（特願平１−１０６１６７）。

光照射液に０．０１Ｎになるように６Ｎ塩酸を加え遠心
分離して、ＵＶＰ−Ａを回収した。水洗後凍結乾燥して
１７ｇのＵＶＰ−Ａを得た。

このようにして得られたＵＶＰ−Ａは黄色粉末で、分子
量は１１１２　（ＦＡＢＭＳによる測定値）で、元素分
析値は、Ｃ，６２，９％、Ｈ，７，７％、Ｎ。

２．６％であった。ＵＶｍａｘ（ε）　　は、４０４　
（１５０３１１０）３８０（１３０７００）　、　３６
１（８２９０Ｇ）１？既知のＵＶＰ−Ａ＜７）物性と一
致した。このＵＶＰ−Ａはカンデラ・アルビカンスＡＴ
ＣＣ１［１２３１に対する最小生育阻止濃度が０．００
５埒／ｄであった。

実施例７ ハートリシン生産菌ストレプトミセス・オーレオファシ
ェンス（Ｓｊｒｅｐｅｊｍ７ｃｅｓ　５ｕｒｅｏｆａｃ
ｉｅｎｓ）Ｎ　ＲＲＬ　３８７８を実施例１におけると
同様の方法で培養して発酵液２０ｍ’を得た。

これにプロパツール２０１を加え、さらに１％となるよ
うにニコチン酸アミド及び０．０２Ｎの濃度になるよう
にＮａＯＨ水溶液を加え、４時間撹拌した。

その後濾過により菌体を分離し、ＮａＯＨと当量の塩酸
を加えてパートリシンを沈澱させた。水洗後凍結乾燥し
て５００■のパートリシンを得た。

実施例８ キャンジシジン生産菌ストレプトミセス・グリセウス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍ７ｃｅｓ　ｇ＋１ａｅｕｓ）ＡＴ　Ｃ
Ｃ１１７４６（前掲Ｓ、　Ｏｍｕｒａ）を実施例１にお
けると同様の方法で培養して発酵液を得た。

この発酵液に３０％となるように尿素を及び０．０３Ｎ
になるようにＮａＯＨ水溶液を加えた。撹拌後、濾過し
て菌体を分離し、得られた濾液にＮａＯＨと当量の塩酸
を加えてキャンジシジンを沈澱させた。

水洗後凍結乾燥して２ｇのキャンジシジンを得た。

（発明の効果） 本発明によれば、ポリエン系抗生物質を大量の有機溶剤
を使用することなく、しかも簡単にかつ効率的にその発
酵液から分離できる。これにより、工業スケールでのポ
リエン系抗生物質の生産が安全に行い得るところとなっ
た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリエン系抗生物質の発酵液若しくはこれよりポ
   リエン系抗生物質を分離取得するための中間処理液中に
   、該発酵液から分離した菌体に随伴して、又はポリエン
   系抗生物質の粗沈澱物中に存在するポリエン系抗生物質
   を酸アミド、その誘導体、尿素及び／又は尿素誘導体と
   塩基とを使用して水性溶液化し、ついでこの水性溶液か
   ら不溶物を分離することを特徴とするポリエン系抗生物
   質の精製法。
2. （２）請求項１記載の方法により不溶物を分離して得ら
   れたポリエン系抗生物質の水性溶液を酸を使用して中和
   し、ついで生成したポリエン系抗生物質の沈澱を分離す
   ることを特徴とするポリエン系抗生物質の精製分離法。