JPH04217681A - 新規生理活性物質エチグアニンａ及びｂ、並びにそれらの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害活性
と抗腫瘍活性を有する新規な生理活性物質であるエチグ
アニンＡ物質あるいはエチグアニンＢ物質に関し、また
それら物質の製造方法に関する。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕微生物の
生産する抗腫瘍性物質に関しては既に多数の有用な化合
物が実用化されているが、これらは薬効及び副作用の点
では必ずしも満足できるものではなく、より有効な新規
抗腫瘍性物質の提供が待たれている。

ホスファチジルイノシトール代謝回転は種々のホルモン
、細胞増殖因子及びｒａｓ、ｓｒｃ等の癌遺伝子によっ
て惹起、活性化される細胞内情報伝達機構であり、この
活性化が細胞増殖や癌化に密接に関与していると考えら
れる〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２３１ 巻、４０７〜４１０頁（１９８６年）〕。

また、ホスファチジルイノシトール代謝産物であるホス
ファチジルイノシトール４，５−二リン酸の抗体を細胞
にマイクロインジェクションすることにより、細胞増殖
因子やホルモンによって引き起こされるＤＮＡ合成が阻
害され〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９巻、６
４０〜６４２頁（１９８８年）〕、更には癌遺伝子によ
って癌化した細胞に対してもホスファチジルイノシトー
ル４，５−二リン酸の抗体は癌形態を正常形態に戻し、
増殖も抑制する効果が観察された〔「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ザ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏ
ｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＵＳＡ）」８２
巻、９０５７〜９０６１頁（１９８８年）〕。ホスファ
チジルイノシトールキナーゼはホスファチジルイノシト
ール代謝回転に関与する酵素の一つであり、ホスファチ
ジルイノシトール４，５−二リン酸の再合成に必須かつ
律速と考えられる〔「実験医学」７巻、９号（増刊）９
２〜９７頁（１９８９年）〕。

それ故に、この酵素の阻害物質は、イノシトールリン脂
質代謝回転を介した細胞内シグナル伝達系を調節するこ
とによる新しいタイプの制癌活性を示すことが期待され
、更に細胞増殖機構を解明する道具としても有用である
。

従来のホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害物質と
しては、ケルセチン及びオロボールなどが知られている
が、どれもそれらの酵素阻害活性は特異的でなくてホス
ファチジルイノシトールキナーゼの生理的役割を十分に
解析することが困難である。

本発明は、更に強い特異的なホスファチジルイノシトー
ルキナーゼ阻害活性をもつ物質を提供することを目的と
するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは前記の目的を達成するために研究を行った
が、その結果、土壌より分離された放線菌で、ＭＩ６９
８−５０Ｆ１の菌株番号を付された菌株を培養し、その
得られた培養液中にはホスファチジルイノシトールキナ
ーゼを阻害する活性をもつ物質が産生されていることを
見出し、その酵素阻害活性をもつ２つの物質を単離する
ことに成功した。

先に、これら２つの物質を夫々に生理活性物質ＭＩ６９
８−５０Ｆ１　Ａと生理活性物質ＭＩ６９８−５０Ｆ１
　Ｂと名づけ、またこれら物質がホスファチジルイノシ
トールキナーゼ阻害活性を特異的に示し且つ抗腫瘍活性
をもつことを見出した（特願平２−２５００７５号）。

しかも、これら２つの物質は従来既知の物質に該当しな
い新規な物質であることを知見した。

今般、本発明者らは、これらＭＩ６９８−５０Ｆ１　Ａ
物質とＢ物質との化学構造を確定して後記の一般式（Ｉ
）によりこれら物質を表わせることを認め、そしてＭＩ
６９８−５０Ｆ１　Ｂ物質をエチグアニンＡと、またＭ
Ｉ６９８−５０Ｆ１　Ａ物質をエチグアニンＢと改称し
た。

それ故、第１の本発明によると、次の一般式表わされる
生理活性物質エチグアニンＡおよびエチグアニンＢ、あ
るいはそれらの酸付加塩が提供される。

エチグアニンＡまたはＢの酸付加塩の例には、塩酸、硫
酸、リン酸、等の製薬学的に許容できる無機酸、あるい
は酢酸、プロピオン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、
等の製薬学的に許容できる有機酸との付加塩がある。

エチグアニンＡおよびエチグアニンＢは下記の構造式を
有する。

エチグアニン（ｅｃｈｉｇｕａｎｉｎｅ）Ａエチグアニ
ン（ｅｃｈｉｇｕａｎｉｎｅ）ＢエチグアニンＡは下記
の理化学的性質を有する。

■分子式及び分子量： Ｃ１０Ｈ１３Ｏ２Ｎ７ 分子量＝２６３ ■融点と性状： ２１５〜２２０℃の融点をもつ塩基性の無色結晶性粉末
状物質 ■マススペクトル（ＦＡＢ）： ｍ／ｚ　２６４（Ｍ＋１） ■赤外吸収スペクトル（ＫＢｒに錠剤法）：添付図面の
第１図に示す。その主要吸収帯は次の通りである。

νｍａｘ、ｃｍ−１　３４３０〜３１３０ｂｒ、２３５
０、１７００ｓｈ、１６４０、１６００、１５１０、１
４２０、１３８０、１３６０、１３４０、１２２０、１
１６０、１０８０、８４０、７４０、６８０■紫外吸収
スペクトル：添付図面の第３図に示す。

〔Ｈ２Ｏ中〕：λｍａｘ、ｎｍ（ε）　２９６（８８０
０）、２５２ｓｈ（９３００）、２２７（１４７４０）
、２２０（１４７４０） 〔０．１Ｎ　ＨＣｌ中〕：λｍａｘ、ｎｍ（ε）　２８
１（７１６０）、２５０ｓｈ（１０４２０）、２１７（
１５２１０）〔０．１Ｎ　ＮａＯＨ中〕：λｍａｘ、ｎ
ｍ（ε）　２９２（７１６０）、２５６（９６３０） ■１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ｐｐｍ，多重度，重ＤＭ
ＳＯ中）：１６８．９ｓ、１６３．０ｓ、１６０．４ｓ
、１５３．０ｓ、１５２．６ｓ、１２２．９ｄ、１１４
．１ｓ、９５．８ｓ、３５．６ｔ、３２．９ｔ■１Ｈ−
ＮＭＲスペクトル（ｐｐｍ，重ＤＭＳＯ中）：１１．５
１（１Ｈ，ｓ　ｂｒ）、１０．４１（１Ｈ，ｔ）、９．
１２（４Ｈ，ｓ　ｂｒ）、７．２４（１Ｈ，ｓ）、６．
６２（２Ｈ，ｓ）、３．５８（２Ｈ，ｄｄ）、２．６２
（２Ｈ，ｔ） ■溶解性： 水、メタノール、ジメチルスルホキシド等に可溶である
が、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶剤
に不溶。

エチグアニンＢは下記の理化学的性質を有する。

■分子式及び分子量： Ｃ１０Ｈ１４Ｏ２Ｎ６ 分子量＝２５０ ■融点と性状： ＞２７０℃（分解）の融点をもつ塩基性の無色粉末状物
質 ■マススペクトル（ＦＡＢ）： ｍ／ｚ　２５１（Ｍ＋１） ■赤外吸収スペクトル（ＫＢｒに錠剤法）：添付図面の
第２図に示す。その主要吸収帯は次の通りである。

νｍａｘ、ｃｍ−１　３３７５、３１００、２３２０、
１６８０、１６４０、１５８０、１５００、１４００、
１３５０、１１４０、８２０、７４０、６８０■紫外吸
収スペクトル：添付図面の第４図に示す。

〔Ｈ２Ｏ中〕：λｍａｘ、ｎｍ（ε）　２９６（７０５
０）、２５４ｓｈ（７４００）、２２８ｓｈ（１１４０
０）、２２０（１２０００） 〔０．１Ｎ　ＨＣｌ中〕：λｍａｘ、ｎｍ（ε）　２８
０（５９００）、２５０ｓｈ（８６５０）、２１７（１
２６００）〔０．１Ｎ　ＮａＯＨ中〕：λｍａｘ、ｎｍ
（ε）　２９１（５７５０）、２５５（７８００）、２
２８ｓｈ（１２３００）■１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（
ｐｐｍ，多重度，重ＤＭＳＯ中）：１６３．０ｓ、１６
０．４ｓ、１５２．８ｓ、１５２．６ｓ、１２２．７ｓ
、１１４．３ｓ、９５．８ｓ、３７．１ｔ、３５．４ｔ
、２８．４ｔ■１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｐｐｍ，重Ｄ
ＭＳＯ中）：１０．２２（１Ｈ，ｔ）、８．４６（４Ｈ
，ｓ　ｂｒ）、７．２３（１Ｈ，ｓ）、６．３９（２Ｈ
，ｓ）、３．３３（２Ｈ，ｄｄ）、２．８２（２Ｈ，ｔ
）、１．７７（２Ｈ，ｍ） ■溶解性： 水、メタノール、ジメチルスルホキシド等に可溶である
が、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶剤
に不溶。

本発明による生理活性物質、エチグアニンＡ及びＢ物質
は、具体的には、前記のように土壌から分離された放線
菌でＭＩ６９８−５０Ｆ１の菌株番号を付された菌株を
培養することによって培養液中に同時に産生されるもの
であり、また前記の菌株はストレプトミセス属に属する
微生物であることが後記の通り認められた。そして、本
発明による生理活性物質エチグアニンＡは、ストレプト
ミセス属に属するエチグアニンＡ物質生産菌を培養する
ことによって生産できるものであり、また生理活性物質
エチグアニンＢは、ストレプトミセス属に属するエチグ
アニンＢ物質生産菌を培養することにより生産できると
認められる。

それ故、第２の本発明によると、ストレプトミセス属に
属する生理活性物質エチグアニンＡの生産菌を培養し、
その培養物から生理活性物質エチグアニンＡを採取する
か、あるいはストレプトミセス属に属する生理活性物質
エチグアニンＢの生産菌を培養し、その培養物から生理
活性物質エチグアニンＢを採取することを特徴とする生
理活性物質エチグアニンＡあるいは生理活性物質エチグ
アニンＢの製造法が提供される。

生理活性物質エチグアニンＡの生産菌の１例、また生理
活性物質エチグアニンＢの生産菌の１例には、昭和６３
年２月、微生物化学研究所において、滋賀県愛知郡百済
寺の土壌より分離された放線菌で、ＭＩ６９８−５０Ｆ
１の菌株番号が付された前記の菌株がある。但し、この
ＭＩ６９８−５０Ｆ１の菌株番号をもつ菌株を培養する
と、生理活性物質エチグアニンＡ及びＢが並行的に培養
物中に生産される。

次に、このＭＩ６９８−５０Ｆ１株の菌学的性状を記載
する。

１、形態 ＭＩ６９８−５０Ｆ１株は、顕微鏡下で分枝した基中菌
糸より、らせん形状を有する気菌糸を伸長し、輪生枝は
認められない。成熟した胞子鎖は、５０個以上の胞子の
連鎖を認め、胞子の大きさは０．５〜０．８×０．９〜
１．０ミクロン位である。胞子の表面は、とげ状の構造
を有する。

２、各種培地における生育状態 色の記載について〔　〕内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル（ＣｏｎｔａｉｎｅｒＣｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｍｅｒｉｃａのＣｏｌｏｒ　ｈｏｒ
ｍｏｎｙ　ｍａｎｕａｌ）を用いた。

（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）無
色の発育上に明るい茶灰〔３ｄｃ，Ｎａｔｕｒａｌ〕〜
明るい灰〔２ｆｅ，Ｃｏｖｅｒｔ　Ｇｒａｙ〕の気菌糸
を着生する。

溶解性色素は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
） 無色からうす黄の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生
する。溶解性色素は認められない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５，２７℃培養） うす黄の発育上に白から明るい灰〔２ｆｅ，Ｃｏｖｅｒ
ｔＧｒａｙ〜明るい茶灰〔３ｇｅ，Ｂｅｉｇｅ〕の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（４）スターチ無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４，２７
℃培養） 無色からうす黄の発育上に、明るい灰〔２ｆｅ，Ｃｏｖ
ｅｒｔ　Ｇｒａｙ〜３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ　Ｇｒａｙ〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７，２７℃培養
）うす黄の発育上に、明るい茶灰〔３ｇｅ，Ｂｅｉｇｅ
〜３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ　Ｇｒａｙ〕〜明るい灰〔２ｆ
ｅ，Ｃｏｖｅｒｔ　Ｇｒａｙ〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素は認められない。

（６）栄養寒天培地（２７℃培養） うす黄だいだい〔２ｇｃ，Ｂａｍｂｏｏ〕の発育上に、
白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められな
い。

（７）イースト．麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２，２７
℃培養） うす色の発育上に明るい灰〔２ｉｈ，Ｄｋ　Ｃｏｖｅｒ
ｔＧｒａｙ〜２ｆｅ，Ｃｏｖｅｒｔ　Ｇｒａｙ〕の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３，２７℃
培養）うす黄の発育上に、明るい灰〔２ｆｅ，Ｃｏｖｅ
ｒｔＧｒａｙ〕〜明るい茶灰〔３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ　
Ｇｒａｙ〜３ｉｇ，Ｂｅｉｇｅ　Ｂｒｏｗｎ〕の気菌糸
を着生し、溶解性色素は認められない。

（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）うす
黄の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。

（１０）スターチ寒天培地（２７℃培養）無色の発育上
に明るい茶灰〔３ｆｅ，Ｓｉｌｖｅｒ　Ｇｒａｙ〕の気
菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められない。

（１１）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）無色の発
育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められな
い。

（１２）セルロース（２７℃培地） 培養後３週間観察したが生育を認めなかった。

（１３）ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、無色からうす黄
の発育上に白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は
認められない。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（
２７℃培養）では、うす黄〜うす黄だいだいの発育上に
白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素はほのかにだ
いだい味を帯びる。

（１４）脱脂牛乳（３７℃培養） うす黄からうす黄だいだいの発育を認めるが、気菌糸は
着生せず、溶解性色素も認められない。

３、生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・スターチ寒天培地（可溶性デンプン１．０％
、イースト．エキス０．２％、ひも寒天３．０％、ｐＨ
７．０）を用い、１４℃，２０℃，２４℃，２７℃，３
０℃，３７℃，５０℃の各温度で試験した結果、１４℃
，２０℃，２４℃，２７℃，３０℃の各温度で生育した
が、３７℃での生育はきわめて悪く、５０℃では生育し
なかった。

最適温度は２７℃〜３０℃付近と思われる。

（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） １５％単純ゼラチン培地においては、培養後１０日目頃
より液化を示し、その作用は中程度であり、又、グルコ
ース・ペプトン・ゼラチン培地では、培養後２０日頃よ
り液化を示し、その作用は弱い方である。

（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
およびスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養）いずれ
の培地でも、培養後２日目には、水解性を認め、その作
用は強い方である。

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 凝固なしに培養後、１０日目頃よりペプトン化が始まり
、その作用は弱い方である。

（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培
地７；いずれも２７℃培養）いずれの培地も陰性である
。

（６）炭素源の利用（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） グルコース、フラクトース、イノシトール、ラフィノー
ス、Ｄ−マンニトール、ラクトースを利用して発育し、
Ｄ−キシロース、シュクロース、ラムノースは利用しな
い。Ｌ−アラビノースの利用の存否は明らかでない。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石池寒天、２７℃
培養） 培養後、５日目頃から発育、周辺のリンゴ酸石灰を溶解
する。その作用は中等度〜強い方である。

（８）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カリウム含有ペ
プトン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養）陰性である。

（９）セルロースの分解（濾紙片添加合成液、２７℃培
養） 生育しない。

以上の性状を要約すると、ＭＩ６９８−５０Ｆ１株は、
形態上で次の特徴がある。すなわち、胞子のうを認めず
、気菌糸はらせん形状を有し、輪生枝は認められない。

又、胞子の表面は、とげ状である。種々の培地で、発育
は無色からうす黄、あるいはうす黄だいだい、気菌糸は
明るい灰〜明する茶灰を呈し、溶解性色素は認められな
い。メラニン様色素の生成は、いずれの培地においても
陰性である。

澱粉水解性は強い方であり、蛋白分解力は、中等度から
弱い方である。

なお、この菌株の菌体に含まれる２，６−ジアミノピメ
リン酸は、ＬＬ型であり、上記の性状と考えあわせると
、ＭＩ６９８−５０Ｆ１株はストレプトミセス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することが明らかである。

これらの性状より、ＭＩ６９８−５０Ｆ１株に近縁の既
知菌種を検索すると、次の３種があげられる。すなわち
、ストレプトミセス・トヨカエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ，文献１「Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１８巻、１
７４頁、１９６８年；及び文献２：特公昭３２−３０４
９号公報、１９５７年）、ストレプトミセス・フアシキ
ュラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆａｓｉｃｕｌ
ａｔｕｓ，文献「ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ」１８巻、１０３頁、１９６８年）、及びス
トレプトミセス．ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ，文献「Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｇｙ」２２巻、３２３頁、１９７２年）で
ある。現在これらの種とＭＩ６９８−５０Ｆ１株とを実
地に比較検討中である。ついてはＭＩ６９８−５０Ｆ１
株をストレプトミセス．エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｓｐ．）ＭＩ６９８−５０Ｆ１とする。

なお、ＭＩ６９８−５０Ｆ１株を工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託申請し、平成２年６月２８日、微工研
菌寄第１１５６３号として受託された。

第２の本発明による方法において、生理活性物質エチグ
アニンＡ生産菌、あるいは生理活性物質エチグアニンＢ
生産菌の培養は、ストレプトミセス属に属する既知の菌
を培養する常用された培地と培養法で実施できる。

すなわち、本発明の方法で使用する培地は、本発明の生
理活性物質の生産菌が利用できる任意の栄養源を含有す
るものであればよい。例えば、炭素源としてグリセリン
、グルコース、マルトース、シユクロース、デキストリ
ン、でんぷん、油脂類などが使用できる。窒素源として
大豆粉、綿実油、肉エキス、ペプトン、乾燥酵母、酵母
エキス、コーンスティープリカーなどの有機物、並びに
硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、炭酸カルシウム、
塩化アンモニウムなどの無機塩が使用できる。

また、必要に応じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩、重
金属塩などの無機塩類を添加することもできる。発酵中
の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、
例えばシリコーン、大豆油などを滴宜添加することもで
きる。

培養法としては、一般に行われている抗生物質の生産の
方法と同様に、好気的液体深部培養法が最も適している
。培養温度は２０〜３０℃が適当であるが、２５〜３０
℃が好ましい。この方法での本発明の生理活性物質の生
産量は浸透培養、通気撹はん培養共に４〜８日間で最高
に達する。

このようにして生産された本発明の２つの生理活性物質
エチグアニンＡ及びＢが蓄積された培養物が得られる。

培養物中では本発明の生理活性物質は共に主として培養
物上清中に存在する。

この培養物中から本発明の生理活性物質を単離するには
、合目的的な任意の方法が利用可能である。その一つの
方法は、培養ろ液を適当な吸着剤、例えば多孔性の吸着
樹脂ダイアイオンＨＰ−２０あるいは適当なイオン交換
樹脂に吸着させ、適当な溶媒にて溶出させることによっ
て本発明の２つの生理活性物質を得ることができる。更
に、この２つの生理活性物質は適当な向流分配法により
それぞれ単独に分離することができる。

次に、本発明による生理活性物質エチグアニンＡ及びＢ
がホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害活性をもつ
ことを試験例１により、また腫瘍細胞の増殖抑制作用を
もち、従って抗腫瘍活性をもつことを試験例２により例
証する。

試験例１ 生理活性物質エチグアニンＡ及びＢのホスファチジルイ
ノシトールキナーゼ阻害活性。

ホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害活性の測定は
以下の如く行なった〔「プロシーデイングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ．オ
ブ．ザ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆＴｈｅ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＵＳＡ）、８１巻、２１１７〜２１
２１頁（１９８４年）〕。酵素のホスファチジルイノシ
トールキナーゼはヒト扁平上皮癌細胞であるＡ４３１細
胞の膜画分を粗精製することにより調製した〔「ザ・バ
イオケミカル・ジャーナル（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）」１６８巻、１８７〜１９４
頁（１９７７年）〕。

調製された酵素、基質のホスファチジルイノシトール、
〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ、そして該生理活性物質を２０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）中で２０℃、２０分間反
応を行なわせた。クロロホルム−メタノール−１Ｎ塩酸
混液を加えることにより反応を停止させ、反応液を遠心
分離後、下層のクロロホルム層をシリカゲルのミニカラ
ム（１ｍｌ）に吸着させた。その後、クロロホルム−メ
タノール−４Ｎアンモニア水混液でリン酸化された放射
性のホスファチジルイノシトール−リン酸を溶出させ、
その放射性活性を測定することによりホスファチジルイ
ノシトールキナーゼ阻害活性とした。

その結果、エチグアニンＡ及びＢのホスファチジルイノ
シトールキナーゼの５０％阻害濃度はそれぞれ４７ｎｇ
／ｍｌと９６ｎｇ／ｍｌであることが認められた。

試験例２ 生理活性物質エチグアニンＡ及びＢの癌細胞増殖抑制活
性。

マウス白血病細胞Ｌ１２１０細胞を５×１０４個／ｍｌ
となるように１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ　１６４０
培地に浮遊させ、種々の濃度の本発明生理活性物質と共
に３７℃で２日間培養した後、細胞増殖抑制活性を測定
した。

その結果、エチグアニンＡは１００μｇ／ｍｌの濃度で
Ｌ１２１０細胞の増殖を６０％抑制した。エチグアニン
Ｂは１００μｇ／ｍｌの濃度で２０％抑制し、エチグア
ニンＡの５０％増殖抑制濃度は８７．５μｇ／ｍｌであ
ることが認められた。

次に実施例により本発明の生理活性物質エチグアニンＡ
及びＢの製造を更に詳細に説明する。

実施例１　生理活性物質エチグアニンＡ及びＢの製造 グリセロール２．０％、デキストリン２．０％、ソイペ
プトン１．０％、酵母エキス０．３％、（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４、０．２％、ＣａＣＯ２、０．２％、シリコンオイ
ル１滴を含む液体培地を三角フラスコに１１０ｍｌずつ
分注し、常法により１２０℃で２０分間滅菌し、これに
寒天斜面培地に培養したストレプトミセス・エスピーＭ
Ｉ６９８−５０Ｆ１（微工研菌寄第１１５６３号）を接
種し、２８℃で９６時間回転振盪培養（１８０回転毎分
）して種母培養液を得た。

この種母培養液２ｍｌを三角フラスコに入れたグリセロ
ール２．０％、大豆粉１．５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．１
％、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ　０．０００５％、シリコン
オイル１滴を含む液体培地１１０ｍｌ（ＫＨ２ＰＯ４で
ｐＨ６．２に調整）に接種し、２８℃で毎分１８０回転
で８日間回転振盪培養させた。

この培養液３６ｌを瀘過して、２７ｌの培養上清を得た
。この培養上清を３ｌのダイアイオンＨＰ−２０カラム
に吸着させ、９ｌの水でカラムを水洗後、５０％メタノ
ール水９ｌにて溶出させた。この溶出液を減圧下で濃縮
、乾固後、水１ｌを加え、シラナイザート（ｓｉｌａｎ
ｉｓｉｅｒｔ　Ａｒｔ．７７１９　メルク社製）を水に
懸濁して充填したカラム（３００ｍｌ）に吸着させ、水
洗後３０％メタノール水１ｌで溶出させた。

この溶出画分を濃縮後、ＣＭ−セファデックスＣ−２５
（Ｎａ型）を水に懸濁して充填したカラム（２００ｍｌ
）に吸着させ、０．４Ｍ食塩水から１．０Ｍ食塩水への
濃度勾配溶出を行なった。次に、脱塩のため、ダイアイ
オンＣＨＰ−２０（４０ｍｌ）に吸着させ、水１００ｍ
ｌで洗浄後、０．００５Ｎ塩酸−５０％メタノール水１
００ｍｌで溶出した。

この溶出液にアンバーライトＩＲ−４５（ＯＨ型）を適
量加えて中和し、イオン交換樹脂を瀘過して除去後、減
圧下で濃縮乾固して、本発明の２つの生理活性物質を含
む画分（７３ｍｇ）を得た。更に、この画分を遠心分配
クロマトグラフ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｎｇａｌｐａｒｔｉ
ｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ：ＣＰＣ三鬼社
製）により分離精製した。溶媒系として酢酸エチル−１
−ブタノール−水混合溶媒（混合比４：７：１０）の下
層を固定相に、上層を移動相に用い単離精製してエチグ
アニンＢ物質を６．７ｍｇと、エチグアニンＡ物質を２
８．６ｍｇとそれぞれ得た。

〔発明の効果〕

本発明のエチグアニンＡ及びエチグアニンＢ物質はヒト
癌細胞由来のホスファチジルイノシトールキナーゼ活性
を非常に強く阻害し、細胞情報伝達系に関連した新しい
タイプの抗腫瘍物質して期待される優れた新規物質であ
る。更に、ホスファチジルイノシトール代謝回転を介し
た細胞内シグナル情報伝達系を解明する上において、よ
り重要な試薬になり得る可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は、本発明の生理活性物質エチグアニン
Ａ及びＢの赤外吸収スペクトルをそれぞれ示し、第３図
、第４図はそれぞれ本発明の生理活性物質エチグアニン
Ａ及びＢの紫外吸収スペクトルを示す。 第３図なしい第４図中、 実線−は、中性水溶液中で測定したスペクトルを示し、 大破線−−−は、塩基性水溶液中で測定したスペクトル
を示し、 破線−−−−は、酸性水溶液中で測定したスペクトルを
示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の一般式（Ｉ） 表わされる生理活性物質エチグアニンＡおよびエチグア
   ニンＢ、あるいはそれらの酸付加塩。
2. 【請求項２】 合物としてエチグアニンＡである請求項１に記載の化合
   物。
3. 【請求項３】一般式（Ｉ）においてＲが基−ＣＨ２−Ｎ
   Ｈ２である化合物としてエチグアニンＢである請求項１
   に記載の化合物。
4. 【請求項４】ストレプトミセス属に属する請求項１記載
   の生理活性物質エチグアニンＡの生産菌または請求項１
   記載の生理活性物質エチグアニンＢの生産菌を培養し、
   その培養物から生理活性物質エチグアニンＡまたは生理
   活性物質エチグアニンＢを採取することを特徴とする生
   理活性物質エチグアニンＡまたはエチグアニンＢの製造
   法。