JPH0436300A - 変性ｌｄｌの吸着体およびそれを用いる変性ｌｄｌの除去装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は体液から有害な成分を吸着除去するための吸着
体およびそれを用いた除去装置に関する。さらに詳しく
は体液中より変性ＬＤＬを選択的に除去し、動脈硬化症
の諸症状などを軽減しまたはそれらの進行を食い止める
ための吸着体、およびそれを用いた変性ＬＤＬの除去装
置に関する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課題］動脈硬化
症発症の際の最も特徴的な病変はアテローマ性プラーク
（ａｔｈｅｒｏｉａｔｏｕｓ　ｐｌａｑｕｅ）の存在で
あり、その主要な細胞成分は、飽性細胞と呼ばれるエス
テル型コレステロールを大量に蓄積した細胞である。飽
性細胞の起源は血中の単球由来マクロファージがコレス
テロールを取り込んで形成されたと考えられている。こ
の飽性細胞は集って脂肪層（ｆａｔｔｙ　５ｔｒｅａｋ
）となり、さらにアテローマ性プラークを形成して、血
管の狭窄、閉塞へとつながり、心筋梗塞などの動脈硬化
性疾患の原因となる。飽性細胞中のコレステロールの起
源は血中のＬＤＬ由来と考えられている。

マクロファージは通常ＬＤＩ、を認識しこれを取り込む
ＬＤＬ受容体があまり発達しておらず、かわりに変性し
たＬＤＬ　、とくに陰性電荷の増した変性ＬＤＬ　、た
とえば酸化ＬＤＬ　、アセチル化ＬＤＬなどを取り込む
スカベンジャー受容体が存在すると考えられていた。最
近この受容体が精製されそのアミノ酸配列が報告された
。

これまで動脈硬化症を治療する方法としては薬剤を用い
た方法や外科的な方法かあったがいずれもＬＤＬの代謝
を阻害したり、狭窄した血管を押し広げたりするもので
あった。

本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意研究を重ねた結果
、体液中の有効成分をほとんど失うことなくまた変性し
ていないＬＤＩ、（以下、正常ＬＤＬという）を取り除
くことなく選択的に変性ＬＤＬを吸着しうる吸着体を見
いだし、本発明を完成するにいたった。

［課題を解決するための手段］ すなわち本発明は、 （１）水不溶性多孔質担体に、変性ＬＤＬに対して選択
的な親和性を有するペプチドを固定してなることを特徴
とする変性ＬＤＬを選択的に結合する吸着体、 （２流体の流入口および流出口を有する容器、前記容器
内に充填された、前記の変性ＬＤＬを選択的に結合する
吸着体、ならびに流体および該流体に含まれる成分は通
過できるが、前記吸着体は通過できないフィルターから
なる変性ＬＤＬの除去装置に関する。

［作用および実施例］ 本発明において体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リ
ンパ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、
ならびにその他の生体由来の液性成分をいう。

本発明において変性ＬＤＬとは、正常ＬＤＬか酸化ある
いはなんらかの化学的変化を受けた結果正常ＬＤＬとは
表面電荷、構造などの点で異なる性質ををする蛋白質を
いう。これらの蛋白質の代表例としては、アセチル化Ｌ
ＤＬ　、マレイル化ＬＤＬ　、酸化Ｉ、ＤＬなどがあげ
られる。

体内に存在する変性ＬＤＬの測定法は現在確立されてい
ないが、その存在は間違いないと考えられている。実験
的には化学的に調製される変性ＬＤＬ　、たとえばアセ
チル化ＬＤＬ　、マレイル化ＬＤＬ　、酸化ＬＤＬにつ
いては放射性同位体でラベルすることによって測定する
ことが可能である。

つまり化学的に変性させた放射性同位体標識ＬＤＬ量は
放射線強度の強弱によって測定可能であり、正常ＬＤＬ
と変性ＬＤＬの混合物中の変性ＬＤＬの存在比は全量の
ＬＤＬ　（変性ＬＤＬｆｆｉ、正常ＬＤＬ　量を合わせ
た量）を総コレステロール量として測定し、変性ＬＤＬ
　ｆｆｉを放射線強度から求めることによって測定可能
である。

本発明において水不溶性担体とは、変性ＬＤＬと親和性
を有するペプチドを固定化するための水に溶解しない性
質を有する物質をいう。本発明に用いる水不溶性担体は
、大きな径の連続した細孔を有するものが好ましい。す
なわち変性ＬＤＬは分子量が１００万もしくはそれ以上
の巨大分子であるために、これを効率よく吸着するため
には変性ＬＤＬが容易に多孔質体内に侵入しうることか
必要である。

細孔径の測定方法には種々あり、水銀圧入法がもっとも
よく用いられているが、親水性多孔質のばあいには適用
が難かしい。これにがゎる細孔径の目安として排除限界
分子量がよく用いられ、親水性多孔質体、疎水性多孔質
体のいずれにも適用できる。排除限界分子量とは成書（
たとえば波多野博之、花卉俊彦著、実験高速液体クロマ
トグラフィー、化学同人）などに述べられているごとく
、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入で
きない（排除される）分子のうちもっとも小さい分子量
をもつものの分子量をいう。

排除限界分子量は、一般に球状蛋白質、デキストラン、
ポリエチレングリコールなどについてよく調べられてい
るが、本発明に用いる担体のばあい、ＬＤＬにもっとも
類似していると思われる球状タンパク質を用いてえられ
た値を用いるのが適当である。

本発明に用いる水不溶性多孔質物質の好ましい排除限界
分子量は４０万以上１億以下である。

水不溶性担体の多孔構造については、表面多孔性よりも
全多孔性が好ましく、吸着容量が大きいという点から空
孔容積が２０％以上であることが望ましい。水不溶性多
孔質担体の形状は、粒状、球状、繊維状、膜状、ホロー
ファイバー状など任意の形状を選ぶことができる。

粒子状の水不溶性多孔質物質を用いるばあい、その粒子
径が１通未満では吸着容量が小さいので、１通以上５０
００１！ｍ以下であるのが好ましい。

本発明に用いる水不溶性多孔質担体は有機性、無機性い
ずれであってもよいが、目的とする変性ＬＤＬ以外の体
液成分の吸着（いわゆる非特異吸着）の少ないものが好
ましい。親水性であるほうが非特異吸着がすくないので
水不溶性多孔質物質は疎水性であるよりも、親水性であ
るほうが好ましい。

さらに、担体表面には、リガンドとして用いるペプチド
の固定化反応に用いうる官能基が存在していると好都合
である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、ア
ミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、
シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サ
クシニルイミド基、酸無水物基、トレシル基なとが挙げ
られる。

本発明に用いる水不溶性多孔質担体の代表例としては、
アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなどの
軟質多孔質体、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの
無機多孔質体、ポリメチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、スチレン、ジビニルベンゼン共重合体など
の合成高分子および（または）セルロースなどの天然高
分子を原料とする多孔質ポリマーハードゲルなどがあげ
られるが、これらに限定されるわけではない。

本発明の吸着体を体外循環治療に用いる際には、血液、
血漿のごとき高粘性流体を高速で流す必要があるために
、圧密化を引き起こさない充分な機械強度を有する硬質
水不溶性多孔質物質を用いるのが好ましい。すなわち硬
質多孔体とは後記参考例に示すごとく、水不溶性多孔質
担体を円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流通し
たばあいの圧力損失と流量との関係が、すくなくとも　
０　、３ｋｇ　／　ｃｄまで直線関係にあるものをいう
。

本発明の吸着体に用いるペプチドは、そのアミノ酸配列
中に下記のアミノ酸配列のすべてまたはその一部を含む
ものであればいがなるものも使用しうる。

−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−に−Ｇ−Ｄ−Ｒ−
Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｐ−Ｇ
−Ｌ−１−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−に−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｇ−
１−８−Ｇ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｐ−Ｇ−Ｐ
−Ｍ−Ｇ−に−Ｔ−Ｇ−に−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｑ−
に−Ｇ−Ｑ−に−Ｇ−Ｅ−に−Ｇ−Ｓ−Ｇ−８−Ｍ−Ｑ
−Ｒ−Ｑ−３本明細書中でアミノ酸配列を構成する記号
はそれぞれ次のアミノ酸残基を示す。

Ｇニゲリシン残基 ＰＡＬ−プロリン残基 ＥＥＬ−グルタミン酸残基 に：Ｌ−リジン残基 ＤＳＬ−アスパラギン酸残基 Ｒ：Ｌ−アルギニン残基 Ｑ：Ｌ−グルタミン残基 ＮＩＬ−アスパラギン残基 ＩＬＬ−イソロイシン残基 Ｆ：Ｌ−フェニルアラニン残基 Ｌ：Ｌ−ロイシン残基 置一トレオニン残基 ５ＱＬ−セリン残基 ｖ：Ｌ−バリン残基 ＭＡＬ−メチオニン残基 また、アミノ酸配列をＮ末端のアミノ酸が左側に位置し
、Ｃ末端のアミノ酸が右側に位置するように記述する。

このようなアミノ酸配列を有するペプチドの合成方法と
しては固相合成法、液相合成法、遺伝子組み替えによる
方法などがあげられるか、固相合成法による方法では自
動合成装置が市販されており簡便にペプチドが合成でき
る。

本発明の吸着体に固定される、変性ＬＤＬに親和性を有
するペプチドは１種類であってもよいし、２種類以上で
あってもよい。

本発明の吸着体に固定される、変性ＬＤＬに親和性を有
するペプチドは前記アミノ酸配列のすべてまたはその一
部を含むものであって、その分子量は約５００以上約１
万以下であるのか望ましい。これはアミノ酸配列として
はアミノ酸残基約５個以上約１００個以下のアミノ酸配
列に相当する。分子量が約５００以下の低分子量のペプ
チドのばあいは変性ＬＤＬとの親和性が低く十分な吸着
量かえられないことが多く、分子量か約１万以上のペプ
チドを用いたばあいにはこれを固定化した吸着体を滅菌
するときに、ペプチドが漏出する可能性が高くなること
など安全性の面での問題が大きくなることか考えられる
。

本発明の吸着体は、水不溶性担体に変性ＬＤＬと親和性
を有するペプチドが固定されてなることを特徴とするも
のである。ペプチドを水不溶性多孔質担体に固定する方
法としては、公知の種々の方法を特別な制限なしに用い
ることができる。すなオ〕ち物理的吸着による方法、イ
オン結合による方法、共有結合により固定する方法など
がある。しかしながら吸着体の保存性ならびに安定性の
ためにはペプチドが脱離溶出しないことが重要であるの
で、担体からのペプチドの脱離溶出を極力抑えるために
強固な固定が可能な共有結合法により固定化することが
望ましい。

代表的な導入方法としては、 （１）活性化した水不溶性多孔質担体とペプチドを直接
反応させることによって水不溶性多孔質担体にペプチド
を固定させる方法、 （２）ペプチドと水不溶性多孔質担体を２官能性の架橋
剤を用いて結合させ固定させる方法、（３）ペプチドと
水不溶性多孔質担体を縮合剤を用いて結合せさる方法、 などがあげられる。

（１）の方法、すなわち活性化した水不溶性多孔質担体
とペプチドを直接反応させることによって水不溶性多孔
質担体にペプチドを固定させる方法としては、水酸基を
有する担体を塩基性溶媒中でエピクロルヒドリンによっ
てエポキシ化しこれにペプチドのアミノ基またはカルボ
キシル基を反応させて固定する方法や、市販の活性化担
体（トレンル化担体、ＣＮＢｒ活性化担体など）とペプ
チドとを反応させて固定する方法などがあるが、これら
に限定されるわけではない。（２）の方法、すなわちペ
プチドと水不溶性多孔質担体を２官能性の架橋剤を用い
て結合させ固定させる方法としては、官能基としてアミ
ノ基をもつ担体とペプチドの存在化にグルタルアルデヒ
ドを加えて担体とペプチドを架橋する方法などがあるが
、これらに限定されるわけではない。

（３）の方法、すなわちペプチドと水不溶性多孔質担体
を縮合剤を用いて結合させる方法としては、担体が有す
るアミノ基またはカルボキシル基にジシクロへキシルカ
ルボジイミドの存在下でペプチドのカルボキシル基また
はアミノ基を縮合させる方法があるが、これに限定され
るわけではない。

本発明の吸着体を治療に用いるには種々の方法がある。

最も簡便な方法としては患者の血液を体外に導出して血
液バックに貯め、これに本発明の吸着体を混合して変性
ＬＤＬを除去後、フィルターを通して吸着体を除去し、
血液を患者に戻す方法がある。この方法は、複雑な装置
を必要としないが、１回の処理量が少なく治療に時間を
要し、操作が煩雑になるという欠点を有する。

別の方法は本発明の吸着体をカラムに充填し、体外循環
回路に組み込みオンラインで吸着除去を行うものである
。すなわち流体の流入口および流出口を有する容器、前
記容器内に充填された前記吸着体、ならびに流体および
該流体に含まれる成分は通過できるが、前記吸着体は通
過できないフィルターからなる変性ＬＤＬの除去装置に
体液を通液する方法が簡便で好ましい。

第１図に本発明の変性ＬＤＬの除去装置の一実施例の概
略断面図を示す。第１図においてｆｌ）は本発明の吸着
体（８）を充填する容器であり、該容器は筒状本体（２
）、流入口（６）を有する蓋部材（４）と、流出口（力
を有する蓋部材（４）とからなり、蓋部材（４）は本体
（２）に液洩れ防止用のバッキング（５）を介在させて
取外し可能に取付けられている。筒状本体（２）の両端
の蓋部材の内側には流体および該流体に含まれる成分は
通過できるが、本発明の吸着体（８）は通過できないフ
ィルターまたはメツシュ（３）が装着されている。流入
側のフィルターは装着を省略することもできる。

変性ＬＤＬを含んだ体液′は流入口（６）から容器（１
）内に入り、フィルター（３）を通過し吸着体（８）と
接触する。ここで変性ＬＤＬのみが吸着体（８）に吸着
され、変性ＬＤＬが除かれた体液は流出口側のフィルタ
ー（３）を通って流出口（７）から容器（１）の外に出
る。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するか、
本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

［参考例］ 両端に孔径１５Ａ／ＩＴＩのフィルターを装着したガラ
ス製カラム（内径９關、カラム長１５０ａ＋ｍ）にアガ
ロースゲルであるバイオゲルＡ５ｍ　（商品名、バイオ
ラド社製、粒径５０から　１００メツシユ）、合成ポリ
マ〜よりなるゲルであるトヨバールＨＷ６５　（商品名
、東洋曹達工業■製、粒径５０〜１００、ｉａ）、また
は多孔質セルロースゲルであるセルロファインＣＣ７０
０ｍ　　（商品名、チッソ昧製、粒径４５〜１０（ｌＪ
Ｘｒｌ）をそれぞれ均一に充填し、ベリスタルティック
ボンブによりカラム内に水を流通し、流量と圧力損失Δ
Ｐとの関係を求めた。

その結果を第２図に示す。第２図では流量を表わすのに
流速（ｅ−／分）を用いた。同図より明らかなように軟
質ゲルであるアガロースゲルは一定の流量以上では圧密
化をおこし、圧力を増加させても流量が増加しないのに
対し、トヨパール、セルロファインなどの硬質ゲルは圧
力の増加にほぼ比例して流量か増加する。したがって本
発明の吸着装置を使用するばあいには、担体として硬質
ゲルの使用が好ましい。

製造例１ 多孔質セルロースゲルであるＣＫゲルＡ−３（商品名、
チッソ■製、球状蛋白質の排除限界分子口５０００万、
粒径４５〜１１０５ａ＞１００ｍｌに２Ｄ９ｏＮａ０１
１４０ｇ１ヘプタン　１２０ｇおよびノニオン系界面活
性剤トウィーン２０（商品名：花王アトラス■製）を１
０滴加えた。４０℃で２時間攪拌後、エピクロルヒドリ
ン５０ｇを加えて２時間攪拌し、ゲルを水洗濾過し、エ
ポキシ基か導入されたセルロースゲル（以下、エポキシ
化ゲルという）をえた。

製造例２ 式　　１１−１１；−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−に
−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−ＱＮ−Ｇ−１−Ｐ−Ｇ
−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−１−Ｇ−Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−に−Ｇ−
Ｄ−Ｒ−Ｇ−１−８−Ｇ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｆ
−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−に−Ｔ−Ｇ−に−Ｐ−Ｇ−ＬＮ
−Ｇ−Ｑ−に−Ｇ−Ｑ−に−Ｇ−Ｅ−に−Ｇ−３−Ｇ−
９−Ｍ−Ｑ−Ｒ−Ｑ−３−０１１で示されるペプチドａ
を、ペプチド自動合成装置（アブライドバイオシステム
ズ社製モデル４３１Ａ）を用いて固相合成法により合成
した。自動合成によりえられた樹脂をトリフルオロメタ
ンスルホン酸を用いて常法にしたかって処理し、ペプチ
ドａの粗製物１．０ｇをえた。

えられた粗製物を液体クロマトグラフィーにより分取、
精製して目的とするペプチドａの精製物８０■をえた。

製造例３ 式　　Ｈ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−に−Ｇ−
Ｄ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｇ−Ｐ
−Ｐ−Ｇ−Ｌ−１−Ｇ−Ｔ”−Ｐ−Ｇ−Ｌ−に−Ｇ−Ｄ
−Ｒ−Ｇ−１−８−Ｇ−Ｌ−Ｐ−ＯＨで示されるペプチ
ドｂを製造例２と同様にして合成し、ペプチドｂの粗製
物０．８ｇをえた。

えられた粗製物を液体クロマトグラフィーにより分取、
精製して目的とするペプチドｂの精製物５０■をえた。

実施例１ 製造例１でえられたエポキシ化ゲル１　ｍｌに、製造例
２でえられたペプチドａｌＯｍｇを２　ｍｌの水に溶解
してｐＨｌ０に調製した溶液を加え、常温で２４時間振
盪し、ペプチドａが固定されたセルロースゲルをえた。

実施例２ 製造例１でえられたエポキシ化ゲル１　ｍｌに、製造例
３でえられたペプチドｂｌＯｍｇを２　ｍｌの水に溶解
してｐＨ１０に調製した溶液を加え、常温で２４時間振
盪し、ペプチドｂが固定されたセルロースゲルをえた。

実施例３ 実施例１．２でえられたペプチドａおよびペプチドｂを
固定化した吸着体、および製造例１で用いた担体（比較
用）を生理的食塩水で洗浄したのち、各吸着体および担
体１．Ｏｍｌずつをポリプロピレン製マイクロチューブ
（容量　７　ｍｌ　）にとり、変性ＬＤＬの生理食塩水
溶液を、または正常ＬＤＬの生理食塩水溶液を４．Ｏｍ
ｌずつ加え、３７度で２時間振盪した。この吸着操作終
了後、遠心分離してゲルを沈降させ、採取した上清中の
変性ＬＤＬ　：ｌまたは正常ＬＤＬ　ｉｔの変化を総コ
レステロールｍ　？ｌ１１１定キット（警ＡＫＯ）を用
いて測定した。第１表にその結果を示す。

第１表における変化率は次式で示されるものである。

変性ＬＤＬＪａ度変化率（２）− （吸着操作後の総コレステロール濃度／原溶液の総コレ
ステロール濃度）　Ｘ　　１００正常ＬＤＬ濃度変化率
（％）− （吸着操作後の総コレステロール濃度／原溶液の総コレ
ステロール濃度）　Ｘ　　１００第１表から水不溶性多
孔質担体にペプチドａおよびペプチドｂを固定してなる
吸着体は、変性ＬＤＬを吸着しているのがわかる。そし
て、正常ＬＤＬの量の変化が少ないことは変性ＬＤＬが
選択的に吸着されていることを示す。

［以下余白コ 部 表 ［発明の効果］ 本発明の特定のアミノ酸配列のペプチドを担体に固定し
た吸着体は変性ＬＤＬを選択的に吸着するので、体液中
の他の成分をほとんど損うことなく変性ＬＤＬをとり除
くことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の変性ＬＤＬの除去装置の一実施例を示
す概略断面図、第２図は３種類の担体をそれぞれカラム
に充填し、カラム内に水を通したときの流速と圧力損失
ΔＰとの関係を示すグラフである。 （図面の主要符号） （１）：容　器 （３）：フィルタ （６）二流入口 （７）　、流出口 （８）：吸着体

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　水不溶性多孔質担体に下記のアミノ酸配列のすべて
   またはその一部を含むペプチドが固定されてなることを
   特徴とする変性ＬＤＬを選択的に結合する吸着体。 【遺伝子配列があります。】 （ここで上記アミノ酸配列を構成する記号はそれぞれ次
   のアミノ酸残基を示す。 Ｇ：グリシン残基 Ｐ：Ｌ−プロリン残基 Ｅ：Ｌ−グルタミン酸残基 Ｋ：Ｌ−リジン残基 Ｄ：Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｒ：Ｌ−アルギニン残基 Ｑ：Ｌ−グルタミン残基 Ｎ：Ｌ−アスパラギン残基 Ｉ：Ｌ−イソロイシン残基 Ｆ：Ｌ−フェニルアラニン残基 Ｌ：Ｌ−ロイシン残基 Ｔ：Ｌ−トレオニン残基 Ｓ：Ｌ−セリン残基 Ｖ：Ｌ−バリン残基 Ｍ：Ｌ−メチオニン残基 また、アミノ酸配列をＮ末端のアミノ酸が 左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸が右側に位置するよう
   に記述する。） ２　流体の流入口および流出口を有する容器、前記容器
   内に充填された、請求項１記載の変性ＬＤＬを選択的に
   結合する吸着体、ならびに流体および該流体に含まれる
   成分は通過できるが、前記吸着体は通過できないフィル
   ターからなる変性ＬＤＬの除去装置。