JPH0461879B2 - - Google Patents

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JPH0461879B2
JPH0461879B2 JP59179913A JP17991384A JPH0461879B2 JP H0461879 B2 JPH0461879 B2 JP H0461879B2 JP 59179913 A JP59179913 A JP 59179913A JP 17991384 A JP17991384 A JP 17991384A JP H0461879 B2 JPH0461879 B2 JP H0461879B2
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JP
Japan
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peptide
antibody
glu
antigen
acid
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JP59179913A
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Mitsuaki Yoshida
Haruo Sugano
Fumio Shimizu
Nobuhiro Ikei
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GAN KENKYUKAI
OOTSUKA SEIYAKU KK
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GAN KENKYUKAI
OOTSUKA SEIYAKU KK
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Publication date
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野 本発明は、ヒト白血病ウイルス（Adult Ｔ−
cell Leukemia Virus：ATLV又はHuman Ｔ−
cell Leukemia Virus：HTLV）に関連する新
規なペプチドに関する。 発明の開示 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
はIUPAC、IUBの規定或いは当該分野における
慣用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。
またアミノ酸等に関して光学異性体があり得る場
合は、特に明記しなければＬ体を示すものとす
る。 Ser；セリン Glu；グルタミン酸 Lys；リジン His；ヒスチジン Arg；アルギニン Phe；フエニルアラニン Thr；スレオニン Val；バリン Cys；システイン Tyr；チロシン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ONP；ｐ−ニトロフエノキシ基 Bzl；ベンジル基 MBzl；ｐ−メトキシベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl2−Bzl；２，６−ジクロルベンジル基 Cl−Ｚ；２−クロルベンジルオキシカルボニル基 ヒト白血病ウイルスは、成人Ｔ細胞白血病
（ATL）より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである〔Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.、78、6476−6480 （1980）；同79、1653−1657 （1982）；同77、7415−7419 （1980）；同79、2031−2035 （1982）；同81、2534−2537 （1984）等参照〕。 本発明は、上記ウイルス関連蛋白（ウイルス関
連抗原）の精製、測定（検出）を可能とする、該
ウイルス関連蛋白に特異反応性を有する抗体を提
供すること、該抗体の製造のためのパプテンとな
り得る特定のウイルス関連ペプチドを提供するこ
と及びこれらを利用して上記ウイルス関連蛋白も
しくは抗体（該ウイルス感染者に認められる血清
抗体）を測定する技術を提供することを目的とす
る。 上記目的は、一般式 Ｒ−Ser−Glu−Lys−His−Phe −Arg−Glu−Thr−Glu−Val−OH (1) 〔式中Ｒは水素原子、Ｈ−Cys−基又はＨ−Tyr
−基を示す。〕 で表わされるヒト白血病ウイルス関連ペプチド及
びその塩により達成される。 本発明のペプチドは、入手容易な市販のアミノ
酸を利用して簡単な操作で容易に合成することが
できる。また本発明ペプチドをハプテンとして用
いて作成した免疫抗原からは、上記ウイルス関連
蛋白に特異反応性を有する抗体を、容易に大量に
しかも安定して収得することができる。該特異抗
体は、これを例えばアフイニテイークロマトグラ
フイー用担体と結合させて、該クロマトグラフに
利用する等によりウイルス関連蛋白の精製に用い
ることができ、また該ウイルス関連蛋白の各種免
疫測定法における特異抗体として使用できる。ま
た上記本発明ペプチドは、これに各種標識物質を
導入することにより、上記ウイルス関連蛋白に特
異的な標識抗原として使用できる。該特異抗体及
び標識抗原は、ヒト白血病ウイルス感染の診断、
ひいては、成人Ｔ細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リン
パ腫等の成熟Ｔ細胞白血病・リンパ腫ならびに関
連する疾患の診断、研究等に有用である。 以下本発明のペプチドの化学合成法につき詳述
する。 本発明ペプチドは、通常のペプチド合成法、具
体的には「ザ ペプチド（The Peptides）」第１
巻（1966年）〔Schro¨der and Luhke著、
Academic press、New York、USA〕或いは
「ペプチド合成」〔泉屋ら著、丸善株式会社
（1975）〕に記載される如き方法に従い、例えばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混酸無水物
法、DCC法、活性エステル法（ｐ−ニトロフエ
ニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
エステル法、ジアノメチルエステル法等）、ウツ
ドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化還元法、DCC／アデイテイブ
（HONB、HOBt、HOSu）法等により製造でき
る。上記方法においては、固相合成法及び液相合
成法のいずれをも適用できる。通常本発明のペプ
チドは、上記した一般のポリペプチドの合成法に
従い、例えば末端アミノ酸に順次１個づつアミノ
酸を縮合させる所謂ステツプワイズ法により、又
は数個のフラグメントに分けてカツプリングさせ
ていく方法により製造される。 より詳細には例えば固相合成法を採用する場
合、Ｃ末端アミノ酸（アミノ酸を保護したもの）
をそのカルボキシル基によつて、まず不溶性担体
に結合させる。不溶性担体としては、反応性カル
ボキシル基と結合性を有するものであれば特に限
定はなく、例えばクロロメチル樹脂、ブロモメチ
ル樹脂等のハロゲノメチル樹脂やヒドロキシメチ
ル樹脂、フエノール樹脂、tert−アルキルオキシ
カルボニルヒドラジド化樹脂等を使用できる。次
いでアミノ保護基を除去した後、上記一般式(1)で
表わされるアミノ酸配列に従い順次アミノ基保護
アミノ酸を、その反応性アミノ基及び反応性カル
ボキシル基との縮合反応により結合させ、一段階
ずつ合成し、全配列を合成した後、ペプチドを不
溶性担体からはずすことにより本発明ペプチドを
収得することができる。 上記各種方法のおいて側鎖官能基を有する各ア
ミノ酸、例えばArg、Tyr、Glu、Thr、Lys、
His、Cys、Ser等は、その側鎖官能基を保護して
おくのが好ましく、これは通常の保護基により保
護され、反応終了後該保護基を脱離される。また
反応に関与する官能基は、通常活性化される。こ
れら各反応方法は公知であり、それらに用いられ
る試薬等も公知のものから適宜選択される。 アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、Boc、tert−アミルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、アダ
マンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチ
ル、フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフエニルス
ルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイル基等
が挙げられる。 カルボキシル基の保護基としては、例えばアル
キルエステル（メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、tert−ブチル等のアルキルエステル）、Bzlエ
ステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、MBzlエ
ステル、ｐ−クロロベンジルエステル、ベンズヒ
ドリルエステル、カルボベンゾキシヒドラジド、
tert−ブチルオキシカルボニルヒドラジド、トリ
チルヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。 Argのグアニジノ基の保護基としては、Tos、
ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アミルオキ
シカルボニル基等が挙げられる。 Ser及びThrの水酸基は、例えばエステル化又
はエーテル化によつて保護することができるが、
必ずしも保護する必要はない。このエステル化に
適する基としては、アセチル等の低級アルカノイ
ル基、ベンゾイル基のアロイル基、ベンゾイルオ
キシカルボニル、エチルオキシカルボニル等の炭
酸から誘導される基等が挙げられる。またエーテ
ル化に適する基としては、ベンジル、テトラヒド
ロピラニル、tert−ブチル基等を例示できる。 Tyrの水酸基の保護基としては、例えばBzl、
Cl2−Bzl、ベンジルオキシカルボニル、アセチ
ル、Tos基等が挙げられる。 Lysのアミノ基の保護基としては、ベンジルオ
キシカルボニル、Cl−Ｚ、Cl2−Bzl、Boc、Tos
基等が挙げられる。 Hisのイミノ基の保護基としては、Tos、Bzl
等が挙げられる。 Cysのチオール基の保護基としては、MBzl、
Bzl、ｐ−メチルベンジル基等が挙げられる。 Gluのカルボキシル基の保護は、ベンジルアル
コール、メタノール、エタノール、tert−ブタノ
ール等とのエステル化により行なわれる。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フエノール、ｐ−ニトロフエノール、Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）等
が挙げられる。 上記方法において反応性アミノ基と反応性カル
ボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反
応）は、溶媒の存在下に行ない得る。溶媒として
は、ペプチド結合形成に使用し得ることが知られ
ている各種のもの、例えば無水または含水のジメ
チルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）、ピリジン、クロロホルム、ジオキ
サン、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン
（THF）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、
ヘキサメチルリン酸トリアミド（HMPA）或い
はこれらの混合溶媒等を用い得る。両原料化合物
の使用割合は、特に限定はないが、通常一方に対
して他方を等モル量〜５倍モル量、好ましくは等
モル量〜1.5倍モル量とするのがよい。反応温度
はペプチド結合形成反応に使用される通常の範
囲、一般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約−
20℃〜約40℃の範囲から適宜選択される。反応時
間は一般に数分〜30時間程度である。 混合酸無水物法は、適当な溶媒中、塩基性化合
物の存在下、クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチ
ル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロ
ロ蟻酸イソブチル等のアルキルハロカルボン酸を
用いて行なわれる。塩基性化合物としては、例え
ばトリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジ
ン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、
１，５−ジアザビシクロ〔４、３、０〕ノネン−
５（DBN）、１，５−ジアザビシクロ〔５、４、
０〕ウンデセン−５（DBU）、１，４−ジアザビ
シクロ〔２、２、２〕オクタン（DABCO）等の
有機塩基や炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基
を使用できる。溶媒としては、混合酸無水物法に
慣用の各種溶媒、具体的には塩化メチレン、クロ
ロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水
素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族
炭化水素類、ジエチルエーテル、THF、ジメト
キシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エ
チル等のエステル類、DMF、DMSO、HMPA等
の非プロトン性極性溶媒等を使用できる。反応は
通常−20〜100℃、好ましくは−20〜50℃におい
て行なわれ、反応時間は一般に５分〜10時間、好
ましくは５〜２時間である。 またアジド化法は、まず活性化されたカルボキ
シル基、例えばメチルアルコール、エチルアルコ
ール、ベンジルアルコール等のアルコールで活性
化されたカルボキシル基に、ヒドラジン水分物を
適当な溶媒中にて反応させることにより行なわれ
る。溶媒としては例えばジオキサン、DMF、
DMSO又はこれらの混合溶媒等を使用できる。
ヒドラジン水分物の使用量は、活性化されたカル
ボキシル基に対して通常５〜20倍モル量、好まし
くは５〜10倍モル量とするのがよい。反応は通常
50℃以下、好ましくは−20〜30℃にて行なわれ
る。斯くしてカルボキシル基部分がヒドラジンで
置換された化合物（ヒドラジン誘導体）を製造し
得る。 カルボキシル基部分がアジドで置換された化合
物は、酸の存在下、適当な溶媒中、上記で得られ
るヒドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反応させる
ことにより製造される。酸としては通常塩酸を、
溶媒としてはジオキサン、DMF、DMSO又はこ
れらの混合溶媒等を、また亜硝酸化合物としては
亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イソアミル、塩化ニト
ロシル等を各々使用することができる。斯かる亜
硝酸化合物は、ヒドラジン誘導体に対して通常等
モル〜２倍モル量、好ましくは等モル〜1.5倍モ
ル量用いられる。反応は通常−20〜０℃、好まし
くは−20〜−10℃にて行なわれ、一般に５〜10分
程度で反応は終了する。 尚、ペプチド結合形成反応は、縮合剤例えばジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、カルボ
ジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテトラ
エチルピロホスフイン等の存在下に実施すること
もできる。 上記の各反応工程及び最終工程において、保護
基の脱離を要する場合、これは通常の脱離反応に
従つて行なわれる。該方法としては例えばパラジ
ウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素添加液
体アンモニア中金属ナトリウムによる還元等の還
元的方法、トリフルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化
水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸に
よるアシドリシス等を例示することができる。上
記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧１気
圧、０〜40℃にて行ない得る。触媒の使用量は通
常100mg〜１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜
48時間程度で反応を終了する。また上記アシドリ
シスは、無溶媒下、通常０〜30℃程度、好ましく
は０〜20℃程度で約15分〜１時間程度を要して行
なわれる。酸の使用量は原料化合物に対し通常５
〜10倍量程度とするのがよい。該アシドリシスに
おいてアミノ基の保護基のみを脱離する場合は、
酸としてトリフルオロ酢酸又は塩化水素酸を使用
するのが好ましい。更に上記液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元は、反応液がパーマネン
トブルーに30秒〜10分間程度呈色しているような
量の金属ナトリウムを用い、通常−40℃〜−70℃
程度にて行ない得る。 上記のようにして製造された一般式(1)のペプチ
ドは反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽
出、分配、カラムクロマトグラフイー等により単
離精製される。 かくして一般式(1)で表わされる本発明のヒト白
血病ウイルス関連ペプチドを得る。 かくして得られるペプチドは、これに125I、131I
等の放射性物質、パーオキシダーゼ（POX）、キ
モトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダー
ゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−Nase、
Ｐ−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グルコース
−６−フオスフエートデハイドロゲナーゼ、オル
ニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素試薬等を
導入することにより、ラジオイムノアツセイ
（RIA）法又はエンザイムノアツセイ（EIA）法
において用いられる標識抗原として利用できる。
上記放射性物質の導入は、通常の方法により実施
できる。例えば放射性ヨードは、クロラミンＴを
用いる酸化的ヨード化法〔W.M.Hunter and F.
C.Greenwood；Nature、194、495（1962）、
Biochem.J.89、144、（1963）参照〕等により行
なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカツプリング
法例えばエルランガー（B.F.Erlanger）らの方
法〔Acta.Endocrinol.Suppl.、168、206（1972）〕
及びカロール（M.H.Karol）らの方法〔Proc.
Natl.Acad.Sci.、USA.、57、713（1667）〕等の公
知の方法によつて行なうことができる。 以下、本発明ペプヂドをハプテンとして利用し
た免疫抗原の製造方法につき詳述する。 上記抗原は一般式(1)で表わされる本発明ペプチ
ドをハプテンとし、これをハプテン−担体結合試
薬の存在下に、適当な担体と反応させることによ
り製造される。上記においてハプテンに結合され
る担体としては、通常抗原の作成に当り慣用され
る高分子の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用
できる。該担体としては例えば馬血清アルブミ
ン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、
ヒト血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン等の
動物の血清アルブミン類；馬血清グロブリン、牛
血清グロブリン、ウサギ血清グロブリン、ヒト血
清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の
血清グロブリン類；馬チログロブリン、牛チログ
ロブリン、ウサキチログロブリン、ヒトチログロ
ブリン、ヒツジチログロブリン等の動物のチログ
ロブリン類；馬ヘモグロブリン、牛ヘモグロブリ
ン、ウサギヘモグロブリン、ヒトヘモグロブリ
ン、ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘモグロブ
リン類；キーホールリンペツトヘモシアニン
（KLH）等の動物のヘモシアニン類；回虫より抽
出された蛋白質（アスカーリス抽出物、特開昭56
−16414号公報、J.Immun.、111、260〜268
（1973）、J.Immun.、122、302〜308（1979）、J.
Immun.、98、893〜900（1967）及びAm.J.
Physiol.、199、575〜578（1960）に記載されたも
の又は之等を更に精製したもの）；ポリリジン、
ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合
体、リジン又はオルニチンを含む共重合体等を挙
げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはTyr、His、Trpを架橋結合させ
る、例えばビスジアゾタイズドベンジジン
（BDB）、ビスジアゾタイズド−３，3′−ジアニ
シジン（BDD）等のジアゾニウム化合物；アミ
ノ基とアミノ基とを架橋結合させる、例えばグリ
オキサール、マロンジアルデヒド、グルタールア
ルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒ
ド等の脂肪族ジアルデヒド類；チオール基とチオ
ール基とを架橋係合させる、例えばＮ、N′−ｏ
−フエニレンジマレイミド、Ｎ、N′−ｍ−フエ
ニレンジマレイミド等のジマレイミド化合物；ア
ミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
メタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（MBS）、４−（マレイミド
メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−
N′−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のマ
レイミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル類；アミノ基とカルボキシル基と
をアミド結合させる通常のペプチド結合形成反応
に用いられる試薬、例えばDCC、Ｎ−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチ
ル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリール
カルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使
用可能である。 上記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶液もし
くはPH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８
〜９の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近
で行なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ま
しくは２〜５時間で完結する。上記において用い
られる代表的緩衝液としては、次のものを例示で
きる。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を１〜６倍重量程度、
好ましくは１〜５倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を１〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の免疫抗原が収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。 上記の如くして得られる免疫抗原を用いて抗体
を製造する方法は、上記抗原を哺乳動物に投与
し、生体内に所望抗体を産生させ、これを採取す
ることにより実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Adjuvant）と混合して懸濁液を調整
し、これを哺乳動物に投与すればよい。例えばウ
サギに上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として
0.1〜５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月、
好ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる免疫抗原に対して
優れた特異性を有する抗体を収得でき、これは
RIA法、EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス
関連蛋白の定量に用い得る。 実施例 以下本発明を更に詳しく説明するため、本発明
ペプチドの製造例、該ペプチドからの免疫抗原の
製造例及び該抗原からの抗体の製造例を挙げる
が、本発明はこれらに限定されない。尚、各製造
例におけるRf値はシリカゲル上の薄層クロマト
グラフイーにて下記混合溶媒を用いて測定したも
のである。 Rf1…ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水
（１：１：１：１） Rf2…ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水
（30：20：６：24）の上層 ＜ペプチドの製造＞ 製造例 １ カリウムtert−ブトキシド350ミリ当量の
DMSO溶液16.8mlにBoc−Val−OHの1.41ｇを
溶解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財
団法人蛋白質研究奨励会、２％ジヒニルベンゼ
ン、メツシユ200〜400）５ｇを加えて、80℃で
30分間反応させる。樹脂をDMSO、エタノー
ル、50％酢酸、水、エタノール及び塩化メチレ
ンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥してBoc−
Val−樹脂5.3ｇを得る。 一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.29ｍmol／ｇ樹脂であつた。 上記で得たBoc−Val−樹脂2.0ｇをクロロ
ホルム30mlで３回洗浄後、50％トリフルオロ酢
酸（TFA）のクロロホルム溶液30mlに加え、
室温で20分間反応させる。樹脂をクロロホルム
30mlで１回、塩化メチレン30mlで５回、10％ト
リエチルアミンの塩化メチレン溶液30mlで３
回、次いで塩化メチレン30mlで６回それぞれ洗
浄してＨ−Val−樹脂を得る。 Boc−Glu（OBzl）−OHの0.49ｇを塩化メチ
レンに溶かした溶液25mlを上記Ｈ−Val−樹脂
に加え、次いでDCCの0.30ｇを塩化メチレンに
溶かした溶液５mlを加え、室温で２時間反応さ
せる。樹脂を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、
Boc−Glu（OBzl）−OHの0.49ｇ及び１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール88mgの塩化メチレン
25mlに加え、次いでDCCの0.30ｇを塩化メチレ
ンに溶かした溶液５mlを加えて再度同様に反応
させる（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メ
チレンで充分に洗浄してBoc−Glu（BOzl）−
Val−樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Glu（OBzl）−
Val−樹脂の脱Boc化を行ない、次いで上記ア
ミノ酸、側鎖官能基保護アミノ酸又はカルボキ
シル基の活性化されたアミノ酸を順次縮合及び
脱Boc反応に付す。 Boc−Thr（Bzl）−OH 0.45ｇ Boc−Glu（BOzl）−OH 0.49ｇ Boc−Arg（Tos）−OH 0.62ｇ Boc−Phe−OH 0.39ｇ Boc−His（Tos）−OH） 0.59ｇ Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.58ｇ Boc−Glu（OBzl）−OH 0.49ｇ Boc−Ser（Bzl）−OH 0.45ｇ かくしてＨ−Ser（Bzl）−Glu（OBzl）−Lys（Cl
−Ｚ）−His（Tos）−Phe−Arg（Tos）−Glu
（OBzl）−Thr（Bzl）−Glu（OBzl）−Val−樹脂の
2.9ｇを得る。このうち0.50ｇをアニソール1.5ml、
メチルエチルスルフアイド0.25ml及び弗化水素10
mlに溶かし、−20℃で30分間、次いで０℃で30分
間インキユベーシヨンさせた後、過剰の弗化水素
を減圧留去し、残渣を10％酢酸にて抽出しエーテ
ルにて洗浄する。水層を凍結乾燥し、次にセフア
デツクスＧ−25（フアルマシア社、溶出液10％酢
酸）によるゲル過、更にHPLC（溶出液；Ａ液
として５％の１／1000N−HCl／CH3CNBを、
Ｂ液として50％の１／1000N−HCl／CH3CNを
用いたＡ／Ｂ＝85／15からＡ／Ｂ＝50／50までの
リニアグラジエント；ODS−120T、7.8×300mm、
東洋曹達株式会社製）によつて精製して目的ペプ
チド（Ｈ−Ser−Glu−Lys−His−Phe−Arg−
Glu−Thr−Glu−Val−OH）の85mgを得る。以
下このペプチドを「ペプチドＡ」と呼ぶ。 Rf値： Rf1＝0.58 Rf2＝0.08 HPLCにおける保持時間 上記HPLCにおけるＡ液及びＢ液を０〜５分は
Ａ／Ｂ＝90／10で、また５〜25分はＡ／Ｂ＝90／
10〜10／90までグラジエントさせ、ODS−120T
カラム（4.6×250mm、流速１mm分）を用いて測定
した保持時間は、7.65分であつた。 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Ser(1) 0.91 Glu(3) 3.05 Lys(1) 1.06 His(1) 0.95 Phe(1) 1.03 Arg(1) 0.90 Thr(1) 0.95 Val(1) 1.01 尚上記アミノ酸分析値は、6N−塩酸による加
水分解後に測定した結果であり、以下の各例にお
いても同様である。 製造例 ２ 製造例１で得たＨ−Ser（Bzl）−Glu（OBzl）−
Lys（Cl−Ｚ）−His（Tos）−Phe−Arg（Tos）−
Glu（OBzl）−Thr（Bzl）−Glu（OBzl）−Val−樹
脂の500mgに、製造例１と同様にして、Boc−Cys
（MBzl）−OHの123mgを反応させ、次いで同様に
して保護基及び樹脂の脱離及び精製を行なつて、
目的ペプチド（Ｈ−Cys−Ser−Glu−Lrs−His
−Phe−Arg−Glu−Thr−Glu−Val−OH）の70
mgを得た。以下このペプチドを「ペプチドＢ」と
呼ぶ。 Rf値： Rf1＝0.62 Rf2＝0.12 HPLCにおける保持時間 ペプチドの製造例１のと同一条件下に測定し
た保持時間は、13.81分であつた。 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Cys(1) 測定できず Ser(1) 0.95 Glu(3) 3.11 Lys(1) 1.04 His(1) 0.96 Phe(1) 1.05 Arg(1) 0.88 Thr(1) 0.98 Val(1) 1.00 製造例 ３ 製造例２においてBoc−Cys（MBzl）−OHの代
りに、Boc−Tyr（Cl2−Bzl）−OHの123mgを用
い、同様にして目的ペプチド（Ｈ−Tyr−Ser−
Glu−Lys−His−Phe−Arg−Glu−Thr−Glu−
Val−OH）の75mgを得る。以下このペプチドを
「ペプチドＣ」とする。 Rf値： Rf1＝0.62 Rf2＝0.12 HPLCにおける保持時間 ペプチドの製造例１のと同一条件下に測定し
た保持時間は、12.29分であつた。 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Tyr(1) 1.02 Ser(1) 0.92 Glu(3) 3.08 Lys(1) 1.06 His(1) 0.95 Phe(1) 1.06 Arg(1) 0.91 Thr(1) 0.97 Val(1) 1.02 ＜免疫抗原の製造＞ 製造例 １ アスカーリス抽出蛋白2.5mgの0.1Mホウ酸塩
緩衝液（PH7.5）１mlに、MBSB0.44mgのDMF
溶液10μを加え、20分間撹拌後、ジクロルメ
タンにて過剰のMBSを除去し、0.1Mリン酸塩
緩衝液（PH7.2）に溶解したペプチドＢの３mg
を加えて20分間撹拌して、エルマン法によりペ
プチドＢが完全に反応したことを確認した。そ
の後反応混合物を３日間蒸留水で４℃で透析
し、凍結乾燥して、免疫抗原5.4mgを得る。以
下この抗原を「抗原Ｂ」と言う。 製造例 ２ ペプチドＡの３mg及びアスカーリス抽出蛋白６
mgを、0.1Mリン酸緩衝液（PH＝7.2）3.0mlに加
え、この溶液に0.1％グルタールアルデヒド0.46
ml（4176μmol）を加え、室温で２時間撹拌する。
この後反応混合物を３日間蒸留水で４℃で透析
し、凍結乾燥して、免疫抗原6.3mgを得る。以下
この抗原を「抗原Ａ」と言う。 製造例 ３ ペプチドＣの５mg及びアスカーリス抽出蛋白10
mgを、0.13M塩化ナトリウムを含む0.16Mホウ酸
緩衝液（PH＝9.0）５mlに加え、この溶液にBDB
溶液3.35mgを加えて４℃で２時間撹拌する。上記
BDB溶液は0.2N塩酸20ml及びDMF3mlの混合溶
媒にベンジジン83.25mgを加え、氷冷下に撹拌し、
これに亜硝酸ナトリウム87.03mgの蒸留水２ml溶
液を徐々に加え、30分間撹拌することにより調整
した。その後反応混合物を３日間蒸留水で４℃下
に透析し、凍結乾燥して、免疫抗原13.0mgを得
る。以下この抗原を「抗原Ｃ」と言う。 ＜抗体の製造＞ 製造例 １ 免疫抗原の製造例１で得た抗原Ｂの500μｇを
1.5mlの生理食塩水に溶解後、これにフロインド
の補助液1.5mlを加えて調整した懸濁液を、３羽
のウサギ（New−Zealand white rabbits、2.5〜
3.0Kg）に下記免疫スケジユールに示す手順で、
一回の抗原接種量を500μｇ／bodyとして皮下投
与し、更にその後１ケ月毎に３回、最初に投与し
た量と同量を投与する。最終投与後７日経過して
のち試験動物から全採血し、これを遠心分離して
抗血清（抗体）を得る。 各ウサギより得られた抗体を各ウサギ毎に「抗
体Ｂ−１」、「抗体Ｂ−２」及び「抗体Ｂ−３」と
する。
【表】
【表】 製造例 ２ 免疫抗原の製造例２及び３で得た抗原Ａ及びＣ
のそれぞれを用いて、前記抗体の製造例１と同様
の免疫スケジユールに従い免疫し、抗原の第５回
接種後に全採血し、以後同様にして目的抗体を得
る。 抗原Ａを用いて得られた抗体を「抗体Ａ」及び
抗原Ｃを用いて得られた抗体を「抗体Ｃ」と表示
する。 Γ標識ペプチドの製造 ペプチドの製造例３で得たペプチドＣをク
ロラミンＴを用いる方法で以下の通り標識化
する。 即ち上記ペプチド5μｇの0.5モルリン酸塩
緩衝液（PH7.5）10μにNa〔125I〕（Carrier
free N.E.N.）１ミリキユーリーの0.5モルリ
ン酸塩緩衝液20μを加え、つぎにクロラミ
ンT20μの0.5モルリン酸塩緩衝液20μを
加える。室温で25秒間撹拌してメタ重亜硫酸
ナトリウム（Na2S2O5）100μｇの0.5Mリン
酸塩緩衝液20μを加えて反応を終わらせ
る。次いで反応液に10％冷沃化ナトリウム水
溶液10μを加え、反応混合物をセフアデツ
クスＧ−10のカラム（1.0〜30cm、溶出液；
0.1％ゼラチン、0.15M−NaCl及び0.02％
NaN3を含む0.1モルリン酸塩緩衝液、PH7.4）
で精製して125Iで標識されたペプチドＣを得
る。 該標識ペプチドの放射活性は、1.598×
103μCi／μｇであつた。 Γ力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で段階的に
希釈し、これらの各々100μに、125I標識ペプ
チド（上記で得られる標識ペプチドを約
9500cpmになるように希釈したもの）0.1ml及
び0.05モルリン酸塩緩衝液（PH＝7.4）〔0.25％
BSA、10ｍＭ EDTA及び0.02％NaN3を含
む〕0.2mlを加え、４℃で24時間インキユベー
トし、生成した抗体と125I標識ペプチドとの結
合体を、テキストラン−活性炭法及び遠心分離
法（４℃、30分間、3000rpm）により未反応
（結合しない）125I標識ペプチドから分離し、そ
の放射線をカウントし、各希釈濃度における抗
体の125I標識ペプチドとの結合率（％）を測定
する。縦軸に抗体の125I標識ペプチドとの結合
率（Ｂ／Ｔ％）及び横軸に抗体の希釈倍率をと
り、各々の濃度において結合率をプロツトす
る。 抗体Ｂ−１〜Ｂ−３に関して得られた結果を
第１図に示す。図において１は抗体Ｂ−１を、
２は抗体Ｂ−２を、また３は抗体Ｂ−３をそれ
ぞれ示す。 また上記試験において結合が50％となる抗体
の希釈倍率即ち抗体の力価を求めた結果を下記
第１表に示す。
【表】 Γ抗体のヒト白血病ウイルス関連蛋白に対する特
異性試験 HTLV産生細胞株HUT−102〔Proc.Natl.
A cad.Sci.USA.、77、7415−7419（1980）〕
を、35Sシステインで16時間代謝的に標識し、
細胞をRIPA緩衝液（150ｍＭ−NaCl、１％
トリトン×100、１％デオキシコレート、0.1
％SDSを含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液、PH
7.2）で可溶化し、遠心分離して細胞抽出液
を得た。 5μｇ蛋白量の該抽出液を、(a)ATL患者血
清2μ、(b)正常成人血清2μ、(c)抗体Ｂ−
１の3μ又は(d)正常ウサギ血清3μの各々
と反応させ、得られた免疫沈降物を、14％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に付し解析し
た。 結果を第２図に示す。図においてレーン番
号におけるａ〜ｄは、用いた上記各試料に対
応するものであり、数値はキロダルトン
（kd）で示したサイズマーカーを示す。 第２図より抗体Ｂ−１（レーンｃ）は、
40kdのヒト白血病ウイルス関連蛋白を沈降
させることが判る。また該蛋白はATL患者
血清（レーンａ）によつて沈降するが、正常
成人血清（レーンｂ）及び正常ウサギ血清
（レーンｄ）とは反応しない。 抗体Ｂ−１を用いた上記試験において、
2μｇのペプチドＢ（レーンｂ）、20μｇのペプ
チドＢ（レーンｃ）及び100μｇのペプチドＢ
（レーンｄ）の各々の存在下に同一試験（但
し12％ポリアクリルアミドゲルを使用した。）
を繰返した。結果を第３図に示す。図におい
てレーン番号は上記の通り（尚レーンａはペ
プチドＢ無添加を示す）であり、数値は試験
に同じである。 第３図より、試験（第２図）に見られる
抗体Ｂ−１と40kb蛋白との反応特異性が、
ペプチドＢの競合効果により確認された。 下記各細胞又は正常成人リンパ球を用い
て、放射ラベルを行なうことなく、前記試験
と同様にして細胞抽出液を調製した。各細
胞抽出液のそれぞれ10μｇ蛋白量を用い、こ
れらと抗体Ｂ−１との反応性を、125I標識ロ
バ抗ウサギＩｇ抗体を用いたウエスタンブロ
ツテイング解析法〔Proc.Natl.A cad.Sci.
USA.、76、3116−3120（1979）及び同76、
4350−4354（1979）〕に従い試験した。 結果を第４図に示す。図においてレーン番号
は、以下の各細胞を用いた場合を示し、数値は試
験に同じである。 レーン番号 ａ；正常成人リンパ球 ｂ；HUT−102 ｃ；MT−２〔Nature、294、770−771（1981）〕 ｄ；TARL〔J.Exp.Med.、159、1105−1116
（1984）〕 ｅ；HAYAI ｆ：Molt 4F〔J.Nat.Cancer Inst.、49、891
（1972）〕 ｇ；HL60〔Nature、270、347−349（1977）〕 ｈ；CEM〔Cancer、19、1725−1742〔1966）〕 但しレーン番号ｂ〜ｅに示す細胞は、HTLV
感染細胞株であり、レーン番号ｆ〜ｈに示す細胞
はHTLV非感染細胞株である。 第４図により、抗体Ｂ−１は、ヒト白血病ウイ
ルス関連蛋白に特異反応性を有することが判る。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明ペプチドを利用して得られる抗
体の各種希釈倍率での標識ペプチドとの結合率を
示すグラフであり、第２〜４図はそれぞれ上記抗
体がヒト白血病ウイルス関連蛋白と特異反応性を
有することを明らかにする電気泳動による解析結
果を示す図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｒ−Ser−Glu−Lys−His−Phe −Arg−Glu−Thr−Glu−Val−OH 〔式中Ｒは水素原子、Ｈ−Cys−基又はＨ−Tyr
    −基を示す。〕 で表わされるヒト白血病ウイルス関連ペプチド及
    びその塩。
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