JPH0526469B2 - - Google Patents
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- JPH0526469B2 JPH0526469B2 JP57502836A JP50283682A JPH0526469B2 JP H0526469 B2 JPH0526469 B2 JP H0526469B2 JP 57502836 A JP57502836 A JP 57502836A JP 50283682 A JP50283682 A JP 50283682A JP H0526469 B2 JPH0526469 B2 JP H0526469B2
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- insulin
- threonine
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- porcine
- trypsin
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
請求の範囲
１ トリプトシン様蛋白質分解酵素の存在下、水
中で、PH５〜９、温度50℃以下で式 （式中Ｒはヒドロキシル基またはスレオニンとは
異なるアミノ酸基であり、−Ａ−および−Ｂ−は
人インシユリンと同じアミノ酸配列を有するＡ−
鎖およびＢ−鎖を表わす）のインシユリン誘導体
とカルボキシル保護したそして場合によつてヒド
ロキシル保護したＬ−スレオニン誘導体を反応さ
せ、続いて所望によつて存在する保護基を除去す
ることによつて人インシユリンまたはそのＢ−30
エステルを製造する方法において、Ｌ−スレオニ
ン誘導体を反応混合物中に２〜約６モル／の濃
度で存在させることを特徴とする方法。
中で、PH５〜９、温度50℃以下で式 （式中Ｒはヒドロキシル基またはスレオニンとは
異なるアミノ酸基であり、−Ａ−および−Ｂ−は
人インシユリンと同じアミノ酸配列を有するＡ−
鎖およびＢ−鎖を表わす）のインシユリン誘導体
とカルボキシル保護したそして場合によつてヒド
ロキシル保護したＬ−スレオニン誘導体を反応さ
せ、続いて所望によつて存在する保護基を除去す
ることによつて人インシユリンまたはそのＢ−30
エステルを製造する方法において、Ｌ−スレオニ
ン誘導体を反応混合物中に２〜約６モル／の濃
度で存在させることを特徴とする方法。
２ Ｌ−スレオニン誘導体を３〜５モル／の濃
度で反応混合物中で使用する請求の範囲第１項記
載の方法。
度で反応混合物中で使用する請求の範囲第１項記
載の方法。
３ インシユリン誘導体として、豚インシユリン
より誘導されたデスアラニン−B30インシユリン
（DAI）を使用する請求の範囲第１項または第２
項記載の方法。
より誘導されたデスアラニン−B30インシユリン
（DAI）を使用する請求の範囲第１項または第２
項記載の方法。
４ Ｒがアラニンを表わす豚インシユリンをイン
シユリン誘導体として使用する請求の範囲第１項
または第２項記載の方法。
シユリン誘導体として使用する請求の範囲第１項
または第２項記載の方法。
５ Ｌ−スレオニン誘導体として、Ｌ−スレオニ
ンのメチル、エチルまたはｔ−ブチルエステルを
使用する請求の範囲第１項〜第４項の何れかに記
載の方法。
ンのメチル、エチルまたはｔ−ブチルエステルを
使用する請求の範囲第１項〜第４項の何れかに記
載の方法。
６ 蛋白質分解酵素として、トリプシンを使用す
る請求の範囲第１項〜第５項の何れかに記載の方
法。
る請求の範囲第１項〜第５項の何れかに記載の方
法。
技術分野
本発明は人インシユリンまたはそのＢ−30エス
テルの新規な製造法に関する。
テルの新規な製造法に関する。
背景技術
長年にわたり、各種のインシユリンがインシユ
リン依存糖尿病の治療に用いられて来た。人イン
シユリンで人間を治療するのが自然である、しか
しながら現実の要求量からみてそれは不可能であ
る。従つて実際的な理由から牛および豚インシユ
リンが使用されている。しかしながら程度に大小
の差はあれ、これらのインシユリンは人体に抗体
の形成を生ぜしめる、これは例えばそれ以上のイ
ンシユリン治療の効果の低下をもたらす。
リン依存糖尿病の治療に用いられて来た。人イン
シユリンで人間を治療するのが自然である、しか
しながら現実の要求量からみてそれは不可能であ
る。従つて実際的な理由から牛および豚インシユ
リンが使用されている。しかしながら程度に大小
の差はあれ、これらのインシユリンは人体に抗体
の形成を生ぜしめる、これは例えばそれ以上のイ
ンシユリン治療の効果の低下をもたらす。
この欠点は一部牛および／または豚インシユリ
ン中の「不純物」によつて、一部は本来異種のも
のであることによつて生ずるものと考えられる。
後者は、アミノ酸成分の組成中での幾つかの相違
で人インシユリン分子が動物インシユリン分子と
異なることでそれ自体明らかである。
ン中の「不純物」によつて、一部は本来異種のも
のであることによつて生ずるものと考えられる。
後者は、アミノ酸成分の組成中での幾つかの相違
で人インシユリン分子が動物インシユリン分子と
異なることでそれ自体明らかである。
最も新しい精製法の導入後、インシユリン製造
に関しては大きな改良が得られている、しかし人
体中での抗体の形成はなお生じうる。これは他の
動物インシユリンの代りに人インシユリンを使用
することによつて克服できると信ぜられる。
に関しては大きな改良が得られている、しかし人
体中での抗体の形成はなお生じうる。これは他の
動物インシユリンの代りに人インシユリンを使用
することによつて克服できると信ぜられる。
化学的に人インシユリンを製造することが知ら
れている、米国特許第3903068号およびホツペー
セイラーのZ.Physiol.Chem.第357巻第759〜767頁
（1976年）参照。
れている、米国特許第3903068号およびホツペー
セイラーのZ.Physiol.Chem.第357巻第759〜767頁
（1976年）参照。
これらの方法はデスオクタペプチド−（B23〜
30）豚インシユリンを人インシユリン中の位置
B23〜30に相当する合成オクタペプチドと縮合さ
せることからなる。しかしながら第一の工程にお
いてアルカリ加水分解を行なつており、これは不
都合な副反応を伴う。第二工程では多くの副反応
を生ぜしめる不特定反応を含み、複雑な精製法を
必要としている。従つてこれらの方法は工業的規
模での使用に適していない。
30）豚インシユリンを人インシユリン中の位置
B23〜30に相当する合成オクタペプチドと縮合さ
せることからなる。しかしながら第一の工程にお
いてアルカリ加水分解を行なつており、これは不
都合な副反応を伴う。第二工程では多くの副反応
を生ぜしめる不特定反応を含み、複雑な精製法を
必要としている。従つてこれらの方法は工業的規
模での使用に適していない。
更に米国特許第3276961号にはスレオニンの存
在下に酵素例えばカルボキシペプチダーゼＡまた
はトリプシンの作用によつて他の動物インシユリ
ンから人インシユリンを製造する方法が記載され
ている。しかしながら、この既知の方法によつて
認めうる程度に人インシユリンを作ることは可能
であることは証明されていない。これは多分トリ
プシンおよびカルボキシペプチダーゼＡがリジル
−アラニンペプチド結合（B29〜30）のみなら
ず、作用条件下でインシユリン中の他の位置も加
水分解するという事実に起因している。トリプシ
ンはリジル−アラニン結合（B29〜30）よりもア
ルギニル−グリシンペプチド結合（B22〜23）を
選択的に加水分解する。しかしながらカルボキシ
ペプチダーゼＡはＡ鎖のＣ−末端でアスパラギン
も分解させることなしにＢ−鎖のＣ−末端でのア
ラニンを独占的に分解させることができない。後
に特定の条件、即ち重炭酸アンモニウムバツフア
ー溶液中での反応がアスパラギン放出を阻害する
ために必要であることが示された、ホツペーセイ
ラーのZ.Physiol.Chem.第359巻第799〜802頁
（1978年）参照。更にかなりのペプチド形成は、
加水分解反応の速度が作用条件下でペプチド合成
の速度より大であることから殆ど生じない。
在下に酵素例えばカルボキシペプチダーゼＡまた
はトリプシンの作用によつて他の動物インシユリ
ンから人インシユリンを製造する方法が記載され
ている。しかしながら、この既知の方法によつて
認めうる程度に人インシユリンを作ることは可能
であることは証明されていない。これは多分トリ
プシンおよびカルボキシペプチダーゼＡがリジル
−アラニンペプチド結合（B29〜30）のみなら
ず、作用条件下でインシユリン中の他の位置も加
水分解するという事実に起因している。トリプシ
ンはリジル−アラニン結合（B29〜30）よりもア
ルギニル−グリシンペプチド結合（B22〜23）を
選択的に加水分解する。しかしながらカルボキシ
ペプチダーゼＡはＡ鎖のＣ−末端でアスパラギン
も分解させることなしにＢ−鎖のＣ−末端でのア
ラニンを独占的に分解させることができない。後
に特定の条件、即ち重炭酸アンモニウムバツフア
ー溶液中での反応がアスパラギン放出を阻害する
ために必要であることが示された、ホツペーセイ
ラーのZ.Physiol.Chem.第359巻第799〜802頁
（1978年）参照。更にかなりのペプチド形成は、
加水分解反応の速度が作用条件下でペプチド合成
の速度より大であることから殆ど生じない。
後に酵素的接触法では反応媒体に有機溶媒を加
えることがペプチド結合合成の速度を増大し、加
水分解の速度を減ずることが知られるようになつ
た、インガルス等のBiotechn.Bioeng.第17巻第
1627頁（1975年）およびホマンドバーグ等の
Biochemistry第17巻第5220頁（1978年）参照。
反応媒体中での溶媒の濃度は高くすべきであり、
後の文献中には溶媒として１，４−ブダンジオー
ルを用いるとき、最良の結果が80％以上の上記溶
媒濃度で得られると述べている。
えることがペプチド結合合成の速度を増大し、加
水分解の速度を減ずることが知られるようになつ
た、インガルス等のBiotechn.Bioeng.第17巻第
1627頁（1975年）およびホマンドバーグ等の
Biochemistry第17巻第5220頁（1978年）参照。
反応媒体中での溶媒の濃度は高くすべきであり、
後の文献中には溶媒として１，４−ブダンジオー
ルを用いるとき、最良の結果が80％以上の上記溶
媒濃度で得られると述べている。
これを達成するに当り、50％より大なる濃度で
有機溶媒（DMF）を使用し、合成オクタペプチ
ド反応成分の過剰（10：１）を使用して人インシ
ユリンのB23〜30位に相当する合成オクタペプチ
ドでトリプトシン接触反応によつてデスオクタペ
プチド−（B23〜30）インシユリン（DOI）が成
功りに結合された、J.Am.Chem.Soc.第101巻第
751〜752頁（1979年）参照。結合は有意な収率で
進行するが、しかし全体を考えたとき、この方法
はなお高価であり、面どうなものである、何故な
らそれはDOIを形成するため豚インシユリンのト
リプシン接触消化を必要とし、更に必要なオクタ
ペプチドは複雑な合成で製造しなければならない
からである。
有機溶媒（DMF）を使用し、合成オクタペプチ
ド反応成分の過剰（10：１）を使用して人インシ
ユリンのB23〜30位に相当する合成オクタペプチ
ドでトリプトシン接触反応によつてデスオクタペ
プチド−（B23〜30）インシユリン（DOI）が成
功りに結合された、J.Am.Chem.Soc.第101巻第
751〜752頁（1979年）参照。結合は有意な収率で
進行するが、しかし全体を考えたとき、この方法
はなお高価であり、面どうなものである、何故な
らそれはDOIを形成するため豚インシユリンのト
リプシン接触消化を必要とし、更に必要なオクタ
ペプチドは複雑な合成で製造しなければならない
からである。
更にNature第280巻第412〜413頁（1979年）お
よびBiochem.Biophys.Res.Com.第92巻第２号第
396〜402頁（1980年）には、人インシユリンの半
合成製造法が記載されている、これによれば豚イ
ンシユリンのアラニン−B30が触媒としてトリプ
シンまたはアクロモバクタープロテアーゼを使用
してスレオニンによつて交換される。この方法に
おいては豚インシユリンを先ずNH4HCO3の存在
下にカルボキシペプチダーゼまたはアクロモバク
タープロテアーゼで加水分解してデスアラニン−
B30インシユリン（DAI）を形成する。DAIの結
合を接触反応させるトリプシンまたはアクロモバ
クタープロテアーゼは、大過剰の保護されたスレ
オニン誘導体、即ち50：１〜100：１の比でのス
レオニンブチルエステル（Thr−OBut）および
高濃度の有機溶媒約60％のジメチルホルムアミド
とエタノールの混合物を使用して行つている。か
かる条件の下で、アルギニン（B22）−グリシン
（B23）結合の分解が大きく減少する。
よびBiochem.Biophys.Res.Com.第92巻第２号第
396〜402頁（1980年）には、人インシユリンの半
合成製造法が記載されている、これによれば豚イ
ンシユリンのアラニン−B30が触媒としてトリプ
シンまたはアクロモバクタープロテアーゼを使用
してスレオニンによつて交換される。この方法に
おいては豚インシユリンを先ずNH4HCO3の存在
下にカルボキシペプチダーゼまたはアクロモバク
タープロテアーゼで加水分解してデスアラニン−
B30インシユリン（DAI）を形成する。DAIの結
合を接触反応させるトリプシンまたはアクロモバ
クタープロテアーゼは、大過剰の保護されたスレ
オニン誘導体、即ち50：１〜100：１の比でのス
レオニンブチルエステル（Thr−OBut）および
高濃度の有機溶媒約60％のジメチルホルムアミド
とエタノールの混合物を使用して行つている。か
かる条件の下で、アルギニン（B22）−グリシン
（B23）結合の分解が大きく減少する。
上述した各記載から米国特許第3276961号から
知られている方法の欠点が高濃度の有機溶媒中で
行なう反応によつて克服されることが明らかであ
り、ひいては収率の増大が有機溶媒の大含有率に
関係しているという結果になる。しかしながら、
反応成分の一つを大過剰に存在させることがなお
重要な特長となつている。多くの提案された最も
好適な溶媒は突然変異的な疑いがもたれ、それら
はインシユリン生成物から完全に除去することが
困難なことから上記溶媒の使用はできる限り避け
るべきである。
知られている方法の欠点が高濃度の有機溶媒中で
行なう反応によつて克服されることが明らかであ
り、ひいては収率の増大が有機溶媒の大含有率に
関係しているという結果になる。しかしながら、
反応成分の一つを大過剰に存在させることがなお
重要な特長となつている。多くの提案された最も
好適な溶媒は突然変異的な疑いがもたれ、それら
はインシユリン生成物から完全に除去することが
困難なことから上記溶媒の使用はできる限り避け
るべきである。
発明の開示
本発明の目的は動物インシユリン、好ましくは
豚インシユリンまたはそのデスアラニン−B30誘
導体の人インシユリンへの、高収率でかつ有害な
有機溶媒を使用しないでの変換方法を提供するこ
とにある。
豚インシユリンまたはそのデスアラニン−B30誘
導体の人インシユリンへの、高収率でかつ有害な
有機溶媒を使用しないでの変換方法を提供するこ
とにある。
驚くべきことに、反応媒体中でスレオニン誘導
体のモル濃度を一定の高い価以上に保つとき、触
媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を用
いてインシユリン中のB30位にスレオニンを導入
することがなめらかに進行することを見出した。
体のモル濃度を一定の高い価以上に保つとき、触
媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を用
いてインシユリン中のB30位にスレオニンを導入
することがなめらかに進行することを見出した。
従つて本発明は人インシユリンまたはそのＢ−
30エステルを製造する方法に関し、この方法で
は、式 （式中Ｒはスレオニン基とは異なるアミノ酸基ま
たはヒドロキシル基であり、−Ａ−および−Ｂ−
は人インシユリンにおけるアミノ酸順序と同じア
ミノ酸を有する−Ａ−鎖および−Ｂ−鎖を表わ
す）のインシユリン誘導体とカルボキシおよび場
合によつてはヒドロキシル保護Ｌ−スレオニン誘
導体を、50℃以下の温度で、５〜９のPH値で水中
でトリプシンまたはトリプシン様酵素の存在下に
反応させ、続いて所望によつては存在する保護基
を除去することからなり、本発明の方法はＬ−ス
レオニン誘導体を２〜約６モル／の濃度で反応
混合物中に存在させることを特徴とする。上限は
個々のスレオニン誘導体によつて決る。
30エステルを製造する方法に関し、この方法で
は、式 （式中Ｒはスレオニン基とは異なるアミノ酸基ま
たはヒドロキシル基であり、−Ａ−および−Ｂ−
は人インシユリンにおけるアミノ酸順序と同じア
ミノ酸を有する−Ａ−鎖および−Ｂ−鎖を表わ
す）のインシユリン誘導体とカルボキシおよび場
合によつてはヒドロキシル保護Ｌ−スレオニン誘
導体を、50℃以下の温度で、５〜９のPH値で水中
でトリプシンまたはトリプシン様酵素の存在下に
反応させ、続いて所望によつては存在する保護基
を除去することからなり、本発明の方法はＬ−ス
レオニン誘導体を２〜約６モル／の濃度で反応
混合物中に存在させることを特徴とする。上限は
個々のスレオニン誘導体によつて決る。
反応媒体中のスレオニン誘導体の濃度の意義は
現在まで明らかにされていない。水性媒体中での
トリプシン接触加水分解およびこれによる副生成
物形成は避けられないことおよび加水分解が水混
和性有機溶媒を50〜90％含有する媒体によつて抑
制されるだけであることが信ぜられていた。
現在まで明らかにされていない。水性媒体中での
トリプシン接触加水分解およびこれによる副生成
物形成は避けられないことおよび加水分解が水混
和性有機溶媒を50〜90％含有する媒体によつて抑
制されるだけであることが信ぜられていた。
この方法の原動力として、Ｌ−スレオニンとイ
ンシユリン化合物の間の高モル比例えば５：１〜
500：１を使用することが先に提案されていた。
ンシユリン化合物の間の高モル比例えば５：１〜
500：１を使用することが先に提案されていた。
特に水性反応において、反応混合物中では、Ｌ
−スレオニン誘導体およびインシユリンの間の大
きなモル比は重要性が少なく、インシユリン濃度
には殆ど無関係であるのに、反応混合物中のＬ−
スレオニン誘導体の高モル濃度が決定的に重要で
あることをここに見出した。
−スレオニン誘導体およびインシユリンの間の大
きなモル比は重要性が少なく、インシユリン濃度
には殆ど無関係であるのに、反応混合物中のＬ−
スレオニン誘導体の高モル濃度が決定的に重要で
あることをここに見出した。
２モル以上のＬ−スレオニン誘導体のモル濃度
がB29〜B30位でのインシユリンとアミノ酸の特
定反応を生ぜしめ、一方B22〜B23位の加水分解
を抑制する。更にそれはインシユリンの非常に大
きい溶解度を生ぜしめる。
がB29〜B30位でのインシユリンとアミノ酸の特
定反応を生ぜしめ、一方B22〜B23位の加水分解
を抑制する。更にそれはインシユリンの非常に大
きい溶解度を生ぜしめる。
Ｌ−スレオニン誘導体が上記高モル濃度で反応
媒体中に存在するとき、反応混合物に少量の水混
和性有機溶媒の更に添加によつて、特に利点は得
られない。本発明方法においては３〜５のモル濃
度で反応媒体中でＬ−スレオニン誘導体を使用す
る。５より大なるモル濃度は反応混合物の速度の
劇的な増大を生ぜしめる。本質的に２モル未満の
Ｌ−スレオニン誘導体のモル濃度は増大した副生
成物形成を生ぜしめ、インシユリンの低下した溶
解度を生ぜしめ、そしてそれに応じて低い収率を
生ぜしめる。
媒体中に存在するとき、反応混合物に少量の水混
和性有機溶媒の更に添加によつて、特に利点は得
られない。本発明方法においては３〜５のモル濃
度で反応媒体中でＬ−スレオニン誘導体を使用す
る。５より大なるモル濃度は反応混合物の速度の
劇的な増大を生ぜしめる。本質的に２モル未満の
Ｌ−スレオニン誘導体のモル濃度は増大した副生
成物形成を生ぜしめ、インシユリンの低下した溶
解度を生ぜしめ、そしてそれに応じて低い収率を
生ぜしめる。
インシユリン反応成分は上記式（）の豚イン
シユリンまたはその誘導体であることができる。
例えば豚インシユリンから誘導されたデスアラニ
ン−Ｂ（30）インシユリンを使用できる。
シユリンまたはその誘導体であることができる。
例えば豚インシユリンから誘導されたデスアラニ
ン−Ｂ（30）インシユリンを使用できる。
Ｌ−スレオニン反応成分は式
（） Thr−（R1）（R2）
（式中ThrはＬ−スレオニン基であり、R1は水素
またはヒドロキシル保護基であり、R2はカルボ
キシル保護基である）の保護されたＬ−スレオニ
ン誘導体が好ましい。好ましいＬ−スレオニン誘
導体はアルキルエステル例えばメチル、エチルま
たはｔ−ブチルエステルである。
またはヒドロキシル保護基であり、R2はカルボ
キシル保護基である）の保護されたＬ−スレオニ
ン誘導体が好ましい。好ましいＬ−スレオニン誘
導体はアルキルエステル例えばメチル、エチルま
たはｔ−ブチルエステルである。
Ｌ−スレオニン誘導体の可能な中和のためおよ
びPH値を規制するため、鉱酸または低級カルボン
酸例えば酢酸またはプロピオン酸を使用できる。
蛋白分解酵素はペプチド中のリジンカルボニル結
合を分解する特異性を有すべきであり、例えば各
種起源からのトリプシン、別のトリプシン誘導体
またはアクロモバクタープロテアーゼであること
ができる。
びPH値を規制するため、鉱酸または低級カルボン
酸例えば酢酸またはプロピオン酸を使用できる。
蛋白分解酵素はペプチド中のリジンカルボニル結
合を分解する特異性を有すべきであり、例えば各
種起源からのトリプシン、別のトリプシン誘導体
またはアクロモバクタープロテアーゼであること
ができる。
反応温度は０〜50℃であることができ、例えば
５〜20℃であることができる。
５〜20℃であることができる。
反応成分として保護されたＬ−スレオニンを使
用するとき、インシユリン生成物は保護基を含有
し、上記基は既知の方法で除去できる。
用するとき、インシユリン生成物は保護基を含有
し、上記基は既知の方法で除去できる。
発明を実施するための形態
本発明を下記実施例によつて更に示す。
実施例 １
200mgの豚インシユリンをＬ−スレオニンメチ
ルエステル、プロピオネートの3.7M水溶液１ml
に溶解した。この混合物に0.02Mの酢酸カルシウ
ムの40μ中の４mgの豚トリプシンの溶液を加え
た、PH値はプロピオン酸で6.3に再調整した。そ
の後溶液を20℃で５時間放置し、その後９mlの水
を加え、5N塩酸でPH値を３に調整して反応を停
止させた。
ルエステル、プロピオネートの3.7M水溶液１ml
に溶解した。この混合物に0.02Mの酢酸カルシウ
ムの40μ中の４mgの豚トリプシンの溶液を加え
た、PH値はプロピオン酸で6.3に再調整した。そ
の後溶液を20℃で５時間放置し、その後９mlの水
を加え、5N塩酸でPH値を３に調整して反応を停
止させた。
高圧液体クロマトグラフ分析は75％の変換率を
示した。
示した。
反応混合物を1M酢酸でセフアデツクス（登録
商標）Ｇ−50スーパーフアインのカラム（2.6×
90cm）でゲル過した。人インシユリンエステル
および未反応豚インシユリンを含有する画分を凍
結乾燥した。収量：180mgの生成物混合物。
商標）Ｇ−50スーパーフアインのカラム（2.6×
90cm）でゲル過した。人インシユリンエステル
および未反応豚インシユリンを含有する画分を凍
結乾燥した。収量：180mgの生成物混合物。
その後生成物混合物は、塩酸で8.1にPHを調整
し、0.02Mのトリスおよび7Mの尿素からなるバ
ツフアーの75ml／時間で平衡させたDEAE−セル
ロース（ワツトマンDE−52）のカラム（５×２
cm）で４℃でイオン交換した。生成物を仕込んだ
後カラムを上記バツフアー溶液で2.5時間溶離し、
次いで１について0.0045モルの塩化ナトリウム
との混合物の形で上記バツフアーで２時間、そし
て最後に１について塩化ナトリウムの0.011モ
ルとの混合物の形で最初に述べたバツフアーで12
時間溶離した。
し、0.02Mのトリスおよび7Mの尿素からなるバ
ツフアーの75ml／時間で平衡させたDEAE−セル
ロース（ワツトマンDE−52）のカラム（５×２
cm）で４℃でイオン交換した。生成物を仕込んだ
後カラムを上記バツフアー溶液で2.5時間溶離し、
次いで１について0.0045モルの塩化ナトリウム
との混合物の形で上記バツフアーで２時間、そし
て最後に１について塩化ナトリウムの0.011モ
ルとの混合物の形で最初に述べたバツフアーで12
時間溶離した。
溶出液は二つの蛋白質系主画分を含有してい
た。最初に溶出された画分は高圧液体クロマトグ
ラフイで人インシユリンエステルとして同定され
た、その後溶出された画分は未反応豚インシユリ
ンであるとして同定された。
た。最初に溶出された画分は高圧液体クロマトグ
ラフイで人インシユリンエステルとして同定され
た、その後溶出された画分は未反応豚インシユリ
ンであるとして同定された。
最初に溶出された主画分を0.1M酢酸でセフア
デツクス（登録商標）Ｇ−25のカラムで脱塩し、
凍結乾燥して120mgの人インシユリンエチルエス
テルを得た。
デツクス（登録商標）Ｇ−25のカラムで脱塩し、
凍結乾燥して120mgの人インシユリンエチルエス
テルを得た。
分離した人インシユリンエチルエステルを50ml
の水に溶解し、PH値を0.1M水酸化ナトリウムで
9.5に調整した。溶液をPH値の抑制下72時間25℃
で放置し、その後インシユリンをそれ自体知られ
ている方法で結晶化し、アミノ酸分析および高圧
液体クロマトグラフイで同定した。
の水に溶解し、PH値を0.1M水酸化ナトリウムで
9.5に調整した。溶液をPH値の抑制下72時間25℃
で放置し、その後インシユリンをそれ自体知られ
ている方法で結晶化し、アミノ酸分析および高圧
液体クロマトグラフイで同定した。
実施例 ２
１ｇのＬ−スレオニンメチルエステルを１mlの
水に溶解し、その後100mgの豚インシユリンを加
え、混合物をインシユリンが溶解するまで撹拌し
た。10mgのトリプシンをその中に溶解し、混合物
を30分間常温で放置した。次に反応を1N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
水に溶解し、その後100mgの豚インシユリンを加
え、混合物をインシユリンが溶解するまで撹拌し
た。10mgのトリプシンをその中に溶解し、混合物
を30分間常温で放置した。次に反応を1N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフイでの分析は人インシ
ユリンメチルエステルの24％の収率を示した。
ユリンメチルエステルの24％の収率を示した。
実施例 ３
１ｇのＬ−スレオニンメチルエステルを１mlの
水に溶解した。100mgの豚インシユリンを加え、
短時間撹拌して溶液にした。この混合物中に10mg
のトリプシンを溶解し、５分後溶液のPH値を氷酢
酸450μを加えることによつて6.3に調整した。
その後混合物を常温で放置し、２時間後反応を
1N塩酸でPH値３に調整して停止した。
水に溶解した。100mgの豚インシユリンを加え、
短時間撹拌して溶液にした。この混合物中に10mg
のトリプシンを溶解し、５分後溶液のPH値を氷酢
酸450μを加えることによつて6.3に調整した。
その後混合物を常温で放置し、２時間後反応を
1N塩酸でPH値３に調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフイによる分析は31％の
人インシユリンメチルエステルの収率を示した。
人インシユリンメチルエステルの収率を示した。
実施例 ４
500mgの豚インシユリンを4MのＬ−スレオニン
メチルエステル、塩酸塩のPH値6.5の2.50mlに溶
解した。PH値を300μの5N塩酸で6.3に調整後、
100μの0.02M酢酸カルシウム中の10mgのトリプ
シンの溶液を加え、反応混合物を８℃で65時間放
置した。次に反応を25mlの水を加え、5N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
メチルエステル、塩酸塩のPH値6.5の2.50mlに溶
解した。PH値を300μの5N塩酸で6.3に調整後、
100μの0.02M酢酸カルシウム中の10mgのトリプ
シンの溶液を加え、反応混合物を８℃で65時間放
置した。次に反応を25mlの水を加え、5N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は43
％の変換率を示した。
％の変換率を示した。
実施例 ５
750μの10M酢酸中に200mgの豚インシユリン
を溶解し、それに１ｇのＬ−スレオニンメチルエ
ステルを加えて、200mgの豚インシユリンを含有
するＬ−スレオニンメチルエステルアセテートの
5M溶液1.5mlを作つた。２mgの豚トリプシンを加
え、PH値6.3を有する透明反応混合物を20℃で放
置した。反応は90時間後、15mlの水を加え、5N
塩酸でPH値を３に調整することによつて停止させ
た。
を溶解し、それに１ｇのＬ−スレオニンメチルエ
ステルを加えて、200mgの豚インシユリンを含有
するＬ−スレオニンメチルエステルアセテートの
5M溶液1.5mlを作つた。２mgの豚トリプシンを加
え、PH値6.3を有する透明反応混合物を20℃で放
置した。反応は90時間後、15mlの水を加え、5N
塩酸でPH値を３に調整することによつて停止させ
た。
反応混合物の高圧液体クロマトグラフイ分析は
85％の変換率を示した。
85％の変換率を示した。
実施例 ６
２ｇの亜鉛不含豚インシユリンを200mlの0.2M
重炭酸アンモニウム中に溶解し、アンモニア水で
PH値8.4に調整した。固体トリス数粒子によつて
４mlの水に20mgのカルボキシペプチダーゼＡを溶
解し、インシユリン溶液に加え、これを次いで20
℃で2.5時間放置した。溶液をスピン凍結し、凍
結乾燥した。
重炭酸アンモニウム中に溶解し、アンモニア水で
PH値8.4に調整した。固体トリス数粒子によつて
４mlの水に20mgのカルボキシペプチダーゼＡを溶
解し、インシユリン溶液に加え、これを次いで20
℃で2.5時間放置した。溶液をスピン凍結し、凍
結乾燥した。
凍結乾燥した粉末を80mlの1M酢酸に溶解し、
同じ媒体で、セフアデツクス（登録商標）Ｇ−50
スーパーフアインで充填したカラム（５×90cm）
でゲル過した。インシユリン含有画分を凍結乾
燥した。これによつて1800mgのデス−（B30−ア
ラニン）豚インシユリンを得た。
同じ媒体で、セフアデツクス（登録商標）Ｇ−50
スーパーフアインで充填したカラム（５×90cm）
でゲル過した。インシユリン含有画分を凍結乾
燥した。これによつて1800mgのデス−（B30−ア
ラニン）豚インシユリンを得た。
実施例 ７
3.2MのＬ−スレオニンメチルエステルアセテ
ート475μ中100mgのデス−（B30−アラニン）豚
インシユリンの溶液を、200μの水および75μ
の氷酢酸の混合物中に実施例６で作つた100mgの
デス−（B30−アラニン）豚インシユリンを溶解
し、次いで200mgのＬ−スレオニンメチルエステ
ルを加えて作つた。氷酢酸でPH値を6.5に調整し
た後、１mgの豚インシユリンを加えた。混合物を
２時間常温で放置し、その後５mlの水を加え、
5N塩酸を加えてPH値を３に規制して反応を停止
させた。
ート475μ中100mgのデス−（B30−アラニン）豚
インシユリンの溶液を、200μの水および75μ
の氷酢酸の混合物中に実施例６で作つた100mgの
デス−（B30−アラニン）豚インシユリンを溶解
し、次いで200mgのＬ−スレオニンメチルエステ
ルを加えて作つた。氷酢酸でPH値を6.5に調整し
た後、１mgの豚インシユリンを加えた。混合物を
２時間常温で放置し、その後５mlの水を加え、
5N塩酸を加えてPH値を３に規制して反応を停止
させた。
高圧液体クロマトグラフ分析は78％の変換率を
示した。
示した。
純粋の人インシユリンメチルエステルの処理お
よびその人インシユリンへの変換は実施例１の方
法に従つて行なうことができた。
よびその人インシユリンへの変換は実施例１の方
法に従つて行なうことができた。
実施例 ８
１ｇのＬ−スレオニンメチルエステルを１mlの
水に溶解し、実施例６によつて作つた200mgのデ
スアラニン（Ｂ−30）豚インシユリンをこの溶液
に加えた。溶液のPH値を450μの氷酢酸で6.3に
調整した。10mgのトリプシンを加え、溶液を常温
で放置した。20分後反応を1N塩酸でPH値を３に
調整して停止した。
水に溶解し、実施例６によつて作つた200mgのデ
スアラニン（Ｂ−30）豚インシユリンをこの溶液
に加えた。溶液のPH値を450μの氷酢酸で6.3に
調整した。10mgのトリプシンを加え、溶液を常温
で放置した。20分後反応を1N塩酸でPH値を３に
調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフ分析は73％の人インシ
ユリンメチルエステルの収率を示した。
ユリンメチルエステルの収率を示した。
実施例 ９
２ｇのＬ−スレオニンメチルエステルを２mlの
水に溶解し、この溶液に実施例６で作つた400mg
のデスアラニン（Ｂ−30）豚インシユリンを加え
た。溶液のPH値を900μの氷酢酸で6.2に調整し
た。20mgのホルミル化トリプシンを加え、溶液を
２時間常温で放置した。その後反応を1N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
水に溶解し、この溶液に実施例６で作つた400mg
のデスアラニン（Ｂ−30）豚インシユリンを加え
た。溶液のPH値を900μの氷酢酸で6.2に調整し
た。20mgのホルミル化トリプシンを加え、溶液を
２時間常温で放置した。その後反応を1N塩酸で
PH値を３に調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフ分析が69％の人インシ
ユリンメチルエステルの収率を示した。
ユリンメチルエステルの収率を示した。
実施例 10
2.5MのＬ−スレオニンメチルエステルアセテ
ート中の200mgのデス−（Ｂ−30アラニン）豚イン
シユリンを含有する反応混合物を、400μの水
および180μの氷酢酸の混合物中に実施例６に
より作つた200mgのデス−（Ｂ−30アラニン）豚イ
ンシユリンを溶解し、次いで460mgのＬ−スレオ
ニンメチルエステルを加えて作つた。透明溶液
に、300μの水中の２mgの豚トリプシンの溶液
を加えた。PH値6.3を有する混合物を25℃で２時
間放置した。その後反応を10mlの水を加え、5N
塩酸でPH値３に調整して停止した。
ート中の200mgのデス−（Ｂ−30アラニン）豚イン
シユリンを含有する反応混合物を、400μの水
および180μの氷酢酸の混合物中に実施例６に
より作つた200mgのデス−（Ｂ−30アラニン）豚イ
ンシユリンを溶解し、次いで460mgのＬ−スレオ
ニンメチルエステルを加えて作つた。透明溶液
に、300μの水中の２mgの豚トリプシンの溶液
を加えた。PH値6.3を有する混合物を25℃で２時
間放置した。その後反応を10mlの水を加え、5N
塩酸でPH値３に調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフ分析は64％の変換率を
示した。
示した。
実施例 11
実施例６で作つた100mgのデス−B30−アラニ
ン豚インシユリンを160μの水、40μの無水エ
タノールおよび75μの氷酢酸の混合物に溶解
し、その後200mgのＬ−スレオニンメチルエステ
ルを加えた。PH6.5を有する透明溶液に、5.1mgの
豚トリプシンを加えた。混合物を常温で２時間放
置し、その後反応を５mlの水を加え、5N塩酸で
PH値３に調整して停止した。
ン豚インシユリンを160μの水、40μの無水エ
タノールおよび75μの氷酢酸の混合物に溶解
し、その後200mgのＬ−スレオニンメチルエステ
ルを加えた。PH6.5を有する透明溶液に、5.1mgの
豚トリプシンを加えた。混合物を常温で２時間放
置し、その後反応を５mlの水を加え、5N塩酸で
PH値３に調整して停止した。
高圧液体クロマトグラフ分析は80％の収率を示
した。
した。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK254582 | 1982-06-07 | ||
| DK2545/82 | 1982-06-07 | ||
| DK2546/82 | 1982-06-07 | ||
| DK254682 | 1982-06-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58501455A JPS58501455A (ja) | 1983-09-01 |
| JPH0526469B2 true JPH0526469B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=26066590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57502836A Granted JPS58501455A (ja) | 1981-09-15 | 1982-09-14 | 人インシユリンまたはそのｂ−３０エステルの製造法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4601979A (ja) |
| EP (1) | EP0088117B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58501455A (ja) |
| AU (1) | AU551174B2 (ja) |
| CA (1) | CA1174623A (ja) |
| DK (1) | DK149457C (ja) |
| ES (1) | ES8400772A1 (ja) |
| FI (1) | FI78119C (ja) |
| IT (1) | IT1189353B (ja) |
| NO (1) | NO156052C (ja) |
| WO (1) | WO1983001074A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK182483A (da) * | 1982-04-23 | 1983-10-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Fremgangsmaade til semi-syntese af humant insulin og alkalisk protease til anvendelse derved |
| EP0294851A3 (de) * | 1987-06-12 | 1990-05-09 | Berlin-Chemie Ag | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten |
| US5130236A (en) * | 1989-12-07 | 1992-07-14 | Eli Lilly And Company | Process for producing des(64,65)-proinsulin |
| JP2001521006A (ja) | 1997-10-24 | 2001-11-06 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 不溶性インシュリン組成物 |
| US6531448B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
| US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
| US7396903B2 (en) * | 2001-11-19 | 2008-07-08 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing insulin compounds |
| DE60236014D1 (de) | 2001-11-19 | 2010-05-27 | Novo Nordisk As | Verfahren zur herstellung von insulinverbindungen |
| US7589233B2 (en) * | 2003-07-29 | 2009-09-15 | Signature R&D Holdings, Llc | L-Threonine derivatives of high therapeutic index |
| US8173840B2 (en) * | 2003-07-29 | 2012-05-08 | Signature R&D Holdings, Llc | Compounds with high therapeutic index |
| CN105849273B (zh) * | 2013-12-23 | 2020-01-14 | 拜康研究有限公司 | 人胰岛素甲酯的生产方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
| FI70597C (fi) * | 1979-04-06 | 1986-09-24 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider |
| NO153061C (no) * | 1979-04-13 | 1986-01-08 | Shionogi & Co | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin |
| JPS55138392A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
| JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
| JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| IE50892B1 (en) * | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
-
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- 1982-09-14 AU AU89539/82A patent/AU551174B2/en not_active Ceased
- 1982-09-14 WO PCT/DK1982/000082 patent/WO1983001074A1/en not_active Ceased
- 1982-09-14 IT IT8249114A patent/IT1189353B/it active
- 1982-09-14 EP EP82902901A patent/EP0088117B1/en not_active Expired
- 1982-09-14 CA CA000411405A patent/CA1174623A/en not_active Expired
- 1982-09-14 US US06/491,325 patent/US4601979A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-09-14 JP JP57502836A patent/JPS58501455A/ja active Granted
- 1982-09-15 ES ES82515713A patent/ES8400772A1/es not_active Expired
-
1983
- 1983-04-06 FI FI831157A patent/FI78119C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-05-13 DK DK213983A patent/DK149457C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-05-13 NO NO83831730A patent/NO156052C/no unknown
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| IT8249114A1 (it) | 1984-03-14 |
| FI831157L (fi) | 1983-04-06 |
| NO831730L (no) | 1983-05-13 |
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| IT8249114A0 (it) | 1982-09-14 |
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| EP0088117B1 (en) | 1986-09-24 |
| DK213983D0 (da) | 1983-05-13 |
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| DK213983A (da) | 1983-05-13 |
| ES8400772A1 (es) | 1983-11-01 |
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| IT1189353B (it) | 1988-02-04 |
| US4601979A (en) | 1986-07-22 |
| WO1983001074A1 (en) | 1983-03-31 |
| CA1174623A (en) | 1984-09-18 |
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| AU8953982A (en) | 1983-04-08 |
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