JPH0586183B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0586183B2 JPH0586183B2 JP20515486A JP20515486A JPH0586183B2 JP H0586183 B2 JPH0586183 B2 JP H0586183B2 JP 20515486 A JP20515486 A JP 20515486A JP 20515486 A JP20515486 A JP 20515486A JP H0586183 B2 JPH0586183 B2 JP H0586183B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus
- protein
- strain
- strains
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、新規なバチルス・spH023に関する
ものである。 従来、一般に蛋白質を微生物によつて生産させ
るという場合、微生物を培養し、微生物菌体を磨
砕後、蛋白質を抽出、精製することにより得てい
た。 また、一般に遺伝子組換えの微生物生産の宿主
としては、大腸菌が主に使用されているが、大腸
菌では、組換え遺伝子によつて合成されるペプチ
ドや蛋白質は細胞内にとどまり培地中に分泌生産
されないため、自づとその生産量は制限されてい
た。 しかし、細胞磨砕によりペプチド、蛋白質を抽
出精製することは、操作が煩雑になるなどの欠点
が指摘されている。 鵜高は、先に、遺伝子組換えにおける宿主菌と
して蛋白質を菌体外に分泌する微生物を求めて研
究した結果、蛋白質を多量に分泌生産する微生物
として、約1200株のなかからバチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）４株、新菌株バチルス・プロ
テイホーマンス（Bacillus proteiformans）１株
の５株を分離同定するに至つた。〔Agric.Biol.
Chem.、40(3)、523−528（1976）〕 また、一方、分泌宿主−ベクターとして枯草菌
も利用され、α−アミラーゼ、インターフエロン
など各種異種蛋白質を培地中に蓄積させることに
成功しているが、菌体内外の強いプロテアーゼに
より生産量が制限されたり、分解されたりして、
良好な結果は得られていない。 先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）DY−５
の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子をプラスミド
pUB110に組込んだpBAM101を保有するバチル
ス・ブレビス４７及び枯草菌を37℃、48時間培養
した時、バチルス・ブレビス４７では約
15000U／ml、枯草菌では3000U／ml程度のα−
アミラーゼをそれぞれ培地中に生産蓄積するのを
確認した。（J.Bacteriol.、164、(3)、1182−1187
（1985）〕。 ここに、全く同一のプラスミドを保有するバチ
ルス・ブレビス４７（後述）と枯草菌とでは、耐
熱性α−アミラーゼの生産においてバチルス・ブ
レビス４７の方が約５倍も生産効率のよいという
事実から蛋白質生産菌の有する蛋白質分泌能を用
いることにより異種遺伝子産物を効率良く分泌生
産させうることが判明した。 しかしながら、先に蛋白質を多量に菌体外に分
泌生産する細菌として分離同定したバチルス・ブ
レビス４７，１４４，４８１，８９９、バチル
ス・プロテイホーマンス４４４の５株は、いずれ
も培地中に牛血清アルブミン（以下BSAとい
う。）を添加して生育させるとBSAを分解し、更
にバチルス・ブレビス１４４，４８１，８９９、
及びバチルス・プロテイホーマンス４４４の４株
はカゼイン分解活性も有していることが確認され
た。従つて、これら蛋白質を多量に菌体外に分泌
生産する細菌を宿主として組換え遺伝子によつて
異種遺伝子産物を分泌生産させる時、効率良く分
泌生産されたペプチド、蛋白質が蛋白質分解酵素
によつて分解されると考えられた。 そこで、本発明者らは、蛋白質を著量分泌し、
かつ、蛋白質分解酵素を菌体外に全く生産しない
菌株が見い出されれば、遺伝子組換えにおける宿
主菌としてすぐれたものであるとの発想から、こ
のような菌株を求めて鋭意選別を行つたところ、
各種試料から分離した約100000株のなかから、菌
体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解酵
素を菌体外に生産しない株を単離することに成功
したのである。 ここに単離された株について、種の同定を行つ
たところ、バチルスに属すものと同定され、本発
明を完成するに到つた。 本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産する
が、蛋白質分解酵素を生産しないバチルス・
spH023である。 従来、バチルス属において、蛋白質を生産する
菌株は知られているが、周知の菌株はすべて蛋白
質分解酵素を生産するものであつて、本発明の、
菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解
酵素を菌体外に生産しないバチルス・spH023は
全く知られておらず、新規である。 本発明においては、蛋白質を5g／以上培地
中に分泌生産しかつBSA、カゼインのいずれの
蛋白質をも分解しない菌株を目標に選択分離され
た。 まず、土壌などの試料から分離された約100000
株の菌株をT2寒天平板培地（１％グルコース、
１％ペプトン、0.5％肉エキス、0.2％酵母エキ
ス、1.5寒天末、PH7.0）に接種し、平板培地上で
コロニー周辺が５％過塩素酸に白濁する細菌を選
択した。次に、ここに分離した細菌株をT2液体
培地（150ml容三角フラスコ、培地量10ml）で振
盪培養（30℃、48時間）し、その培養濾液中に
1.2g／以上の蛋白質を生産する菌株を80株得
た。 菌体外蛋白質の測定においては、培養液に等量
の0.2N NaOHを加え撹拌後10000rpm×５分遠
心分離処理して菌体を除き、上清に等量の10％ト
リクロル酢酸を加えて10分後3000rpm×10分間遠
心分離して沈殿を集め、1N NaOHで溶解した後
Lowry法〔J.Biol.Chem.193、265（1951）〕によつ
て定量し、蛋白質量は牛血清アルブミンとして換
算した。蛋白質高生産培地として第１表に示す培
地を選んだ。
ものである。 従来、一般に蛋白質を微生物によつて生産させ
るという場合、微生物を培養し、微生物菌体を磨
砕後、蛋白質を抽出、精製することにより得てい
た。 また、一般に遺伝子組換えの微生物生産の宿主
としては、大腸菌が主に使用されているが、大腸
菌では、組換え遺伝子によつて合成されるペプチ
ドや蛋白質は細胞内にとどまり培地中に分泌生産
されないため、自づとその生産量は制限されてい
た。 しかし、細胞磨砕によりペプチド、蛋白質を抽
出精製することは、操作が煩雑になるなどの欠点
が指摘されている。 鵜高は、先に、遺伝子組換えにおける宿主菌と
して蛋白質を菌体外に分泌する微生物を求めて研
究した結果、蛋白質を多量に分泌生産する微生物
として、約1200株のなかからバチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）４株、新菌株バチルス・プロ
テイホーマンス（Bacillus proteiformans）１株
の５株を分離同定するに至つた。〔Agric.Biol.
Chem.、40(3)、523−528（1976）〕 また、一方、分泌宿主−ベクターとして枯草菌
も利用され、α−アミラーゼ、インターフエロン
など各種異種蛋白質を培地中に蓄積させることに
成功しているが、菌体内外の強いプロテアーゼに
より生産量が制限されたり、分解されたりして、
良好な結果は得られていない。 先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）DY−５
の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子をプラスミド
pUB110に組込んだpBAM101を保有するバチル
ス・ブレビス４７及び枯草菌を37℃、48時間培養
した時、バチルス・ブレビス４７では約
15000U／ml、枯草菌では3000U／ml程度のα−
アミラーゼをそれぞれ培地中に生産蓄積するのを
確認した。（J.Bacteriol.、164、(3)、1182−1187
（1985）〕。 ここに、全く同一のプラスミドを保有するバチ
ルス・ブレビス４７（後述）と枯草菌とでは、耐
熱性α−アミラーゼの生産においてバチルス・ブ
レビス４７の方が約５倍も生産効率のよいという
事実から蛋白質生産菌の有する蛋白質分泌能を用
いることにより異種遺伝子産物を効率良く分泌生
産させうることが判明した。 しかしながら、先に蛋白質を多量に菌体外に分
泌生産する細菌として分離同定したバチルス・ブ
レビス４７，１４４，４８１，８９９、バチル
ス・プロテイホーマンス４４４の５株は、いずれ
も培地中に牛血清アルブミン（以下BSAとい
う。）を添加して生育させるとBSAを分解し、更
にバチルス・ブレビス１４４，４８１，８９９、
及びバチルス・プロテイホーマンス４４４の４株
はカゼイン分解活性も有していることが確認され
た。従つて、これら蛋白質を多量に菌体外に分泌
生産する細菌を宿主として組換え遺伝子によつて
異種遺伝子産物を分泌生産させる時、効率良く分
泌生産されたペプチド、蛋白質が蛋白質分解酵素
によつて分解されると考えられた。 そこで、本発明者らは、蛋白質を著量分泌し、
かつ、蛋白質分解酵素を菌体外に全く生産しない
菌株が見い出されれば、遺伝子組換えにおける宿
主菌としてすぐれたものであるとの発想から、こ
のような菌株を求めて鋭意選別を行つたところ、
各種試料から分離した約100000株のなかから、菌
体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解酵
素を菌体外に生産しない株を単離することに成功
したのである。 ここに単離された株について、種の同定を行つ
たところ、バチルスに属すものと同定され、本発
明を完成するに到つた。 本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産する
が、蛋白質分解酵素を生産しないバチルス・
spH023である。 従来、バチルス属において、蛋白質を生産する
菌株は知られているが、周知の菌株はすべて蛋白
質分解酵素を生産するものであつて、本発明の、
菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解
酵素を菌体外に生産しないバチルス・spH023は
全く知られておらず、新規である。 本発明においては、蛋白質を5g／以上培地
中に分泌生産しかつBSA、カゼインのいずれの
蛋白質をも分解しない菌株を目標に選択分離され
た。 まず、土壌などの試料から分離された約100000
株の菌株をT2寒天平板培地（１％グルコース、
１％ペプトン、0.5％肉エキス、0.2％酵母エキ
ス、1.5寒天末、PH7.0）に接種し、平板培地上で
コロニー周辺が５％過塩素酸に白濁する細菌を選
択した。次に、ここに分離した細菌株をT2液体
培地（150ml容三角フラスコ、培地量10ml）で振
盪培養（30℃、48時間）し、その培養濾液中に
1.2g／以上の蛋白質を生産する菌株を80株得
た。 菌体外蛋白質の測定においては、培養液に等量
の0.2N NaOHを加え撹拌後10000rpm×５分遠
心分離処理して菌体を除き、上清に等量の10％ト
リクロル酢酸を加えて10分後3000rpm×10分間遠
心分離して沈殿を集め、1N NaOHで溶解した後
Lowry法〔J.Biol.Chem.193、265（1951）〕によつ
て定量し、蛋白質量は牛血清アルブミンとして換
算した。蛋白質高生産培地として第１表に示す培
地を選んだ。
【表】
【表】
これらの５種類のすべての培地の培地に、先に
得られた80株の菌を振盪培養し、いずれかの培地
で菌体外蛋白質を5g／以上生産する菌株を31
株選択した。 得られた31株について、次に示す、BSAの分
解性の測定及びミルクカゼインの分解性の測定を
行つた。 BSAの分解性の測定 T2培地を150ml用三角フラスコに10ml分注後オ
ートクレーブ殺菌し、無菌濾過したBSA
（SigmaA4503）溶液を最終濃度3.2mg／mlになる
ように添加し、１晩前培養した菌株を0.2ml接種
後37℃で200rpmにて振盪培養した。 培養24時間、48時間、72時間後にサンプリング
した培養濾液を10000rpm ５分間遠心分離した培
養上清625μに0.5M Tris−Cl（PH6.8）125μ、
10％SDS200μ、β−メルカプトエタノール50μ
を添加し撹拌後沸騰水中で３分間熱処理後0.05
％BPBと70％グリセロールを含む0.0625M Tris
−Cl（PH6.8）の0.1mlを加えSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）用の試料と
した。スラブSDS−PAGEは10％のアクリルアミ
ド濃度で行なつた。蛋白質の検出はクーマシブリ
リアントブルーによる染色により行なつた。培養
24時間、48時間、72時間すべてにおいてBSAを
分解しなかつた菌株を、BSAの分解性のない菌
株とした。 ミルクカゼインの分解性の測定 スキムミルク5g、2g、1gを各々50ml純水に懸
濁した液と寒天1gを純水50mlに溶かした液を
別々にオートクレーブで殺菌後両者を混合後シヤ
ーレに分注して、５％、２％、１％ミルク寒天平
板培地を作つた。平板培地に菌株を植菌後37℃に
て３日間培養しコロニーの周りが透明になるかど
うか観察した。５％、２％、１％ミルク寒天平板
培地のすべてに全く透明円をつくらない菌株をミ
ルクカゼインの分解性のない菌株とした。 以上の測定の結果、H023株をBSA及びミルク
カゼインをともに分解しないことから、蛋白質分
解酵素を菌体外に生産しない菌株として選定し
た。 H023株を、Bergey′s Manual Determinative
Bacteriology（第８版）及び、The Prokaryote
（Ａ Handbook on Habitats，Isolation and
Identification of Bacteria）によつて同定した
ところ、本菌株は、まず、好気性、グラム染色陽
性、桿菌、胞子を形成する点においてバチルス属
に属するものと認められた。 また、その他の、形態的性質、各培地における
生育状態、生理学的性質について、バチルス属の
従来知られている菌種と比較検討した結果、バチ
ルス属のどの菌種とも異つていた。また、本菌種
には、カゼイン、BSAを分解する能力もなかつ
た。 従つて、本菌種はバチルス属の新菌種として同
定された。 かくて、本菌種はバチルス・spH023と命名さ
れた。 バチルス・spH023はFERM−8893として微工
研に寄託されている。 次にバチルス・spH023の菌学的性質を示す。
得られた80株の菌を振盪培養し、いずれかの培地
で菌体外蛋白質を5g／以上生産する菌株を31
株選択した。 得られた31株について、次に示す、BSAの分
解性の測定及びミルクカゼインの分解性の測定を
行つた。 BSAの分解性の測定 T2培地を150ml用三角フラスコに10ml分注後オ
ートクレーブ殺菌し、無菌濾過したBSA
（SigmaA4503）溶液を最終濃度3.2mg／mlになる
ように添加し、１晩前培養した菌株を0.2ml接種
後37℃で200rpmにて振盪培養した。 培養24時間、48時間、72時間後にサンプリング
した培養濾液を10000rpm ５分間遠心分離した培
養上清625μに0.5M Tris−Cl（PH6.8）125μ、
10％SDS200μ、β−メルカプトエタノール50μ
を添加し撹拌後沸騰水中で３分間熱処理後0.05
％BPBと70％グリセロールを含む0.0625M Tris
−Cl（PH6.8）の0.1mlを加えSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）用の試料と
した。スラブSDS−PAGEは10％のアクリルアミ
ド濃度で行なつた。蛋白質の検出はクーマシブリ
リアントブルーによる染色により行なつた。培養
24時間、48時間、72時間すべてにおいてBSAを
分解しなかつた菌株を、BSAの分解性のない菌
株とした。 ミルクカゼインの分解性の測定 スキムミルク5g、2g、1gを各々50ml純水に懸
濁した液と寒天1gを純水50mlに溶かした液を
別々にオートクレーブで殺菌後両者を混合後シヤ
ーレに分注して、５％、２％、１％ミルク寒天平
板培地を作つた。平板培地に菌株を植菌後37℃に
て３日間培養しコロニーの周りが透明になるかど
うか観察した。５％、２％、１％ミルク寒天平板
培地のすべてに全く透明円をつくらない菌株をミ
ルクカゼインの分解性のない菌株とした。 以上の測定の結果、H023株をBSA及びミルク
カゼインをともに分解しないことから、蛋白質分
解酵素を菌体外に生産しない菌株として選定し
た。 H023株を、Bergey′s Manual Determinative
Bacteriology（第８版）及び、The Prokaryote
（Ａ Handbook on Habitats，Isolation and
Identification of Bacteria）によつて同定した
ところ、本菌株は、まず、好気性、グラム染色陽
性、桿菌、胞子を形成する点においてバチルス属
に属するものと認められた。 また、その他の、形態的性質、各培地における
生育状態、生理学的性質について、バチルス属の
従来知られている菌種と比較検討した結果、バチ
ルス属のどの菌種とも異つていた。また、本菌種
には、カゼイン、BSAを分解する能力もなかつ
た。 従つて、本菌種はバチルス属の新菌種として同
定された。 かくて、本菌種はバチルス・spH023と命名さ
れた。 バチルス・spH023はFERM−8893として微工
研に寄託されている。 次にバチルス・spH023の菌学的性質を示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
本発明の菌体外に著量の蛋白質を生産するが、
蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない菌株はバチ
ルス・spH023である。 本発明の新規バチルス・spH023を培養するこ
とにより著量生産した蛋白質の性質次第では、そ
れ自体食糧蛋白質やゲル化剤、膨化剤等の食品加
工素材または、ガラス様素材、紙、人工皮革等の
表面加工等の工業素材としての利用等産業上の有
用性が非常に高い。 また、本発明の新規spH023を遺伝子組換えの
宿主菌として利用した場合遺伝子組換えによる生
産物を効率良く菌体外に分泌することができ、そ
して遺伝子組換えによる生産物を分解することが
できないので、遺伝子組換えにおける宿主菌とし
てきわめてすぐれたものになるであろう。 この系は、医薬品、良質な食糧蛋白質やゲル化
剤、膨化剤等の食品加工素材、または、ガラス様
素材、紙、人工皮革等の表面加工等の工業素材な
どの生産手段としての活用が期待出来る。 以上の様に本発明の有用性は産業上極めて意義
深いものである。 以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 実施例 １ 前記第１表記載の1Y培地500mlを２容のジヤ
ーフアーメンターに分注し、常法により121℃20
分滅菌した後、冷却した。 別に、1Y培地５ml分注した試験管をオートク
レーブすることにより滅菌し、これにバチルス・
spH023を１白金耳接種し、37℃で14時間振盪培
養した。この前培養物５mlをジヤーフアーメンタ
ーに接種し、37℃48時間通気量0.5／分、回転
数400rpmで培養した。培養終了後、培養物に等
量の0.2NNaOHを加え撹拌後10000rpm×５分遠
心分離処理して菌体を除き、上清100mlに等量の
10％トリクロル酢酸を加え10分後3000rpm×10分
間遠心分離して沈澱を集めた。５％トリクロル酢
酸で洗浄し、遠心分離にて沈澱を集め1N NaOH
で溶解した後Lowry法によつて定量した。蛋白
質量は牛血清アルブミンに換算して示した。 その結果、菌体外に生産された蛋白質量は
7g／であつた。
蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない菌株はバチ
ルス・spH023である。 本発明の新規バチルス・spH023を培養するこ
とにより著量生産した蛋白質の性質次第では、そ
れ自体食糧蛋白質やゲル化剤、膨化剤等の食品加
工素材または、ガラス様素材、紙、人工皮革等の
表面加工等の工業素材としての利用等産業上の有
用性が非常に高い。 また、本発明の新規spH023を遺伝子組換えの
宿主菌として利用した場合遺伝子組換えによる生
産物を効率良く菌体外に分泌することができ、そ
して遺伝子組換えによる生産物を分解することが
できないので、遺伝子組換えにおける宿主菌とし
てきわめてすぐれたものになるであろう。 この系は、医薬品、良質な食糧蛋白質やゲル化
剤、膨化剤等の食品加工素材、または、ガラス様
素材、紙、人工皮革等の表面加工等の工業素材な
どの生産手段としての活用が期待出来る。 以上の様に本発明の有用性は産業上極めて意義
深いものである。 以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 実施例 １ 前記第１表記載の1Y培地500mlを２容のジヤ
ーフアーメンターに分注し、常法により121℃20
分滅菌した後、冷却した。 別に、1Y培地５ml分注した試験管をオートク
レーブすることにより滅菌し、これにバチルス・
spH023を１白金耳接種し、37℃で14時間振盪培
養した。この前培養物５mlをジヤーフアーメンタ
ーに接種し、37℃48時間通気量0.5／分、回転
数400rpmで培養した。培養終了後、培養物に等
量の0.2NNaOHを加え撹拌後10000rpm×５分遠
心分離処理して菌体を除き、上清100mlに等量の
10％トリクロル酢酸を加え10分後3000rpm×10分
間遠心分離して沈澱を集めた。５％トリクロル酢
酸で洗浄し、遠心分離にて沈澱を集め1N NaOH
で溶解した後Lowry法によつて定量した。蛋白
質量は牛血清アルブミンに換算して示した。 その結果、菌体外に生産された蛋白質量は
7g／であつた。
Claims (1)
- １ 菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質
分解酵素を菌体外に生産しないバチルス・
spH023。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20515486A JPS6363375A (ja) | 1986-09-02 | 1986-09-02 | 新規バチルス・ｓｐＨ０２３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20515486A JPS6363375A (ja) | 1986-09-02 | 1986-09-02 | 新規バチルス・ｓｐＨ０２３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6363375A JPS6363375A (ja) | 1988-03-19 |
| JPH0586183B2 true JPH0586183B2 (ja) | 1993-12-10 |
Family
ID=16502312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20515486A Granted JPS6363375A (ja) | 1986-09-02 | 1986-09-02 | 新規バチルス・ｓｐＨ０２３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6363375A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101962401B (zh) * | 2010-09-01 | 2012-06-13 | 浙江大学 | 一种多肽菌素及其制备与应用 |
-
1986
- 1986-09-02 JP JP20515486A patent/JPS6363375A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6363375A (ja) | 1988-03-19 |
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