JPH0787989A - β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の製造方法Info
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- JPH0787989A JPH0787989A JP3131068A JP13106891A JPH0787989A JP H0787989 A JPH0787989 A JP H0787989A JP 3131068 A JP3131068 A JP 3131068A JP 13106891 A JP13106891 A JP 13106891A JP H0787989 A JPH0787989 A JP H0787989A
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- C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
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- C07C229/24—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one carboxyl group bound to the carbon skeleton, e.g. aspartic acid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の新規製造法
を提供する。 【構成】 β−ヒドロキシ−α−アミノ酸類が、アルデ
ヒドとグリシンのセリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼ触媒縮合反応で得られる。ほとんどのアルデヒド
による主な生成物はＬ−エリトロジアステレオマーであ
る。例えばスクシンセミアルデヒドメチルエステルは、
この発明の方法で、グリシンと縮合して、Ｌ−エリトロ
α−アミノ−β−ヒドロキシアジピン酸モノメチルエス
テルを生成する。
を提供する。 【構成】 β−ヒドロキシ−α−アミノ酸類が、アルデ
ヒドとグリシンのセリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼ触媒縮合反応で得られる。ほとんどのアルデヒド
による主な生成物はＬ−エリトロジアステレオマーであ
る。例えばスクシンセミアルデヒドメチルエステルは、
この発明の方法で、グリシンと縮合して、Ｌ−エリトロ
α−アミノ−β−ヒドロキシアジピン酸モノメチルエス
テルを生成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、β−ヒドロキシ−α
−アミノ酸の製造方法に関する。詳しくは、実質的にＬ
−エリトロ形のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸類の酵素
による製造方法に関する。
−アミノ酸の製造方法に関する。詳しくは、実質的にＬ
−エリトロ形のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸類の酵素
による製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−ヒドロキシ−α−アミノ酸類には、
β−ラクタム抗生物質製造用の中間体としての用途を含
む多くの用途がある（例えば、Ｍattingly,Ｐ.Ｇ.；Ｍi
ller,Ｍ.Ｊ.，Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.，４６巻、１５５７頁、
１９８１年、およびＭiller,Ｍ.Ｊ.ら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.
Ｓoc.，１０２巻、７０２６頁、１９８０年参照）。β
−ヒドロキシ−α−アミノ酸の化学的製造方法は、いく
つも知られているが、ほとんどの方法が１つ以上の欠点
がある。これらの欠点には、汎用性の欠除、立体化学構
造の制御不良、およびキラル補助剤が必要なこと、また
は主としてトレオ（もしくはシン）異性体が生成するこ
とが含まれる。
β−ラクタム抗生物質製造用の中間体としての用途を含
む多くの用途がある（例えば、Ｍattingly,Ｐ.Ｇ.；Ｍi
ller,Ｍ.Ｊ.，Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.，４６巻、１５５７頁、
１９８１年、およびＭiller,Ｍ.Ｊ.ら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.
Ｓoc.，１０２巻、７０２６頁、１９８０年参照）。β
−ヒドロキシ−α−アミノ酸の化学的製造方法は、いく
つも知られているが、ほとんどの方法が１つ以上の欠点
がある。これらの欠点には、汎用性の欠除、立体化学構
造の制御不良、およびキラル補助剤が必要なこと、また
は主としてトレオ（もしくはシン）異性体が生成するこ
とが含まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】酵素法には、化学的方
法を越えるいくつかの顕著な利点がある。例えばこの方
法は、緩和な条件下、水性系で行なわれ、立体選択的な
場合が多い。この発明の方法で用いられる酵素は、アル
ドラーゼとして広く知られている。このアルドラーゼの
１つはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｓ
ＨＭＴ）である（Ｓchirch,Ｌ.，Ａdv.Ｅnzzmol.Ｒela
t.Ａreas Ｍol.Ｂiol.，５３巻、８３頁、１９８２年お
よびＳchirch,Ｌ.；Ｇross,Ｔ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２
４３巻、５６５１頁、１９６８年）。アルドラーゼ類の
天然の生物学的役割には、１炭素単位の、セリンへの転
移反応もしくはセリンからの転移反応、およびトレオニ
ンやアロートレオニンのようなβ−ヒドロキシ−α−ア
ミノ酸が逆アルドール開裂反応を行ってアルデヒドとグ
リセリンを生成する反応が含まれる。
法を越えるいくつかの顕著な利点がある。例えばこの方
法は、緩和な条件下、水性系で行なわれ、立体選択的な
場合が多い。この発明の方法で用いられる酵素は、アル
ドラーゼとして広く知られている。このアルドラーゼの
１つはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｓ
ＨＭＴ）である（Ｓchirch,Ｌ.，Ａdv.Ｅnzzmol.Ｒela
t.Ａreas Ｍol.Ｂiol.，５３巻、８３頁、１９８２年お
よびＳchirch,Ｌ.；Ｇross,Ｔ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，２
４３巻、５６５１頁、１９６８年）。アルドラーゼ類の
天然の生物学的役割には、１炭素単位の、セリンへの転
移反応もしくはセリンからの転移反応、およびトレオニ
ンやアロートレオニンのようなβ−ヒドロキシ−α−ア
ミノ酸が逆アルドール開裂反応を行ってアルデヒドとグ
リセリンを生成する反応が含まれる。
【０００４】アルドラーゼ類は、植物、細菌および動
物、例えばとうもろこし苗、やえなり（mung bean）苗
およびウサギの肝臓に広く含有されている。本発明の方
法は、ＳＨＭＴを用いて、緩和な条件下で、β−ラクタ
ム抗生物質の前駆物質であるβ−ヒドロキシ−α−アミ
ノ酸を生成させることからなる方法である。この発明の
方法は、正しいジアステレオマー形のβ−ラクタム抗生
物質を提供する望ましい形のＬ−エリトロ異性体形のβ
−ヒドロキシアミノ酸を多数の例で提供する。
物、例えばとうもろこし苗、やえなり（mung bean）苗
およびウサギの肝臓に広く含有されている。本発明の方
法は、ＳＨＭＴを用いて、緩和な条件下で、β−ラクタ
ム抗生物質の前駆物質であるβ−ヒドロキシ−α−アミ
ノ酸を生成させることからなる方法である。この発明の
方法は、正しいジアステレオマー形のβ−ラクタム抗生
物質を提供する望ましい形のＬ−エリトロ異性体形のβ
−ヒドロキシアミノ酸を多数の例で提供する。
【０００５】この発明は、約７〜約８のｐＨの水性培地
中約３０℃〜約５５℃の温度で、グリシンと、脂肪族ア
ルデヒド例えばアセトアルデヒドもしくはブタナール、
または芳香族アルデヒド例えば２−フルフラールとを、
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭ
Ｔ）と共にインキュベートすることからなるβ−ヒドロ
キシ−α−アミノ酸の酵素的製造法を提供するものであ
る。例えばスクシン（コハク酸）セミアルデヒドのエス
テルが、この方法でβ−ヒドロキシ−α−アミノアジピ
ン酸モノエステルに変換される。
中約３０℃〜約５５℃の温度で、グリシンと、脂肪族ア
ルデヒド例えばアセトアルデヒドもしくはブタナール、
または芳香族アルデヒド例えば２−フルフラールとを、
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭ
Ｔ）と共にインキュベートすることからなるβ−ヒドロ
キシ−α−アミノ酸の酵素的製造法を提供するものであ
る。例えばスクシン（コハク酸）セミアルデヒドのエス
テルが、この方法でβ−ヒドロキシ−α−アミノアジピ
ン酸モノエステルに変換される。
【０００６】本発明方法は、ｐＨが約５．５〜約９の水
性媒体中で、グリシンとアルデヒドＲＣＨＯを、セリン
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼとピリドキサール
５’−リン酸との存在下で混合することからなる、式
（１）：
性媒体中で、グリシンとアルデヒドＲＣＨＯを、セリン
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼとピリドキサール
５’−リン酸との存在下で混合することからなる、式
（１）：
【化４】 で表されるβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の製造方法を
提供するものである。この方法は約３０℃〜約５５℃の
温度、好ましくは約３７℃でおこなわれる。
提供するものである。この方法は約３０℃〜約５５℃の
温度、好ましくは約３７℃でおこなわれる。
【０００７】グリシンとアルデヒドＲＣＨＯの相対比率
は変えてもよいが、等モル量を使うと明らかに高収率の
生成物が得られる。酵素の使用量は、酵素の精製度と、
存在する不純物が酵素活性に与える効果によってきま
る。
は変えてもよいが、等モル量を使うと明らかに高収率の
生成物が得られる。酵素の使用量は、酵素の精製度と、
存在する不純物が酵素活性に与える効果によってきま
る。
【０００８】反応培地のｐＨは約５．５〜約９のｐＨに
緩衝され、ほとんどの基質に対しては、約７．０〜約
８．０のｐＨが好ましい。リン酸緩衝液が望ましいｐＨ
範囲を提供するのに適切である。
緩衝され、ほとんどの基質に対しては、約７．０〜約
８．０のｐＨが好ましい。リン酸緩衝液が望ましいｐＨ
範囲を提供するのに適切である。
【０００９】他の酵素反応と同様に、補因子が、与えら
れた基質の反応を触媒する際の酵素の効率のみならず酵
素の基質特異性に影響を与える場合がある。この発明の
方法におけるセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼに対して必須の補因子はピリドキサール ５’−リン
酸である。ＰＬＰ以外の、加えてもよい他の補因子は、
ある基質については、得られる生成物の収率に有利な効
果を与える。例えばテトラヒドロ葉酸は、基質をピルビ
ン酸アルデヒドに変換する際、酵素の活性を増大する。
またメタバナジン酸ナトリウムも同じアルデヒドの変換
反応の補因子として作用する。
れた基質の反応を触媒する際の酵素の効率のみならず酵
素の基質特異性に影響を与える場合がある。この発明の
方法におけるセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼに対して必須の補因子はピリドキサール ５’−リン
酸である。ＰＬＰ以外の、加えてもよい他の補因子は、
ある基質については、得られる生成物の収率に有利な効
果を与える。例えばテトラヒドロ葉酸は、基質をピルビ
ン酸アルデヒドに変換する際、酵素の活性を増大する。
またメタバナジン酸ナトリウムも同じアルデヒドの変換
反応の補因子として作用する。
【００１０】上記式１は、この発明の方法で提供される
βヒドロキシ−α−アミノ酸を内部塩の形態で示してあ
る。この塩形はこの発明の方法のｐＨで考えられる形態
であるが、下記式：
βヒドロキシ−α−アミノ酸を内部塩の形態で示してあ
る。この塩形はこの発明の方法のｐＨで考えられる形態
であるが、下記式：
【化５】 で表される非イオン形も他の条件下で存在する。
【００１１】この発明の方法で用いられるアルデヒドＲ
ＣＨＯは、直鎖もしくは、分枝鎖のアルキル、アルケニ
ルもしくはアルキニルのアルデヒド、または芳香族もし
くは複素環式のアルデヒドであってもよい。このアルデ
ヒドは置換基をもっていてもよく例えば、メトキシもし
くはエトキシのようなアルコキシ；カルボキシル基のＣ
1−Ｃ4 アルキルエステルのようなエステル化カルボキ
シル；シアノ；ヒドロキシ；ホルミルオキシ、アセトキ
シ、プロピオンオキシ、もしくはブチルオキシのような
アシル化ヒドロキシル；フッ素もしくは塩素のようなハ
ロゲン；またはトリフルオロメチルもしくはクロロメチ
ルのようなハロアルキルなどの置換基である。または脂
肪族アルデヒドはオキソ基を含有していてもよく、例え
ばＲＣＨＯは４−オキソペンタナールもしくはピルボア
ルデヒドなどのようなケトアルデヒドでもよい。芳香族
アルデヒドもしくは複素環式アルデヒドは、同様に、そ
の芳香環、複素環、またはアルキルもしくはアルケニル
の部分が置換されていてもよい。この発明の方法に用い
ることができる、アルキル、アルケニルおよびアルキニ
ルのアルデヒド類ＲＣＨＯは、アセトアルデヒド、プロ
ピオンアルデヒド，ブチルアルデヒド、バレルアルデヒ
ド、スクシンセミアルデヒドメチルエステル、スクシン
セミアルデヒドベンジルエステル、４−ヒドロキシバレ
ルアルデヒド、グルタルセミアルデヒドメチルエステ
ル、ピルボアルデヒド、Ｏ−ホルミル４−ヒドロキシバ
レルアルデヒド、３−フルオロバレルアルデヒド、５−
ロロバレルアルデヒド、２−ロロプロピオンアルデヒ
ド、プロパルギルアルデヒド、ならびに下記式：
ＣＨＯは、直鎖もしくは、分枝鎖のアルキル、アルケニ
ルもしくはアルキニルのアルデヒド、または芳香族もし
くは複素環式のアルデヒドであってもよい。このアルデ
ヒドは置換基をもっていてもよく例えば、メトキシもし
くはエトキシのようなアルコキシ；カルボキシル基のＣ
1−Ｃ4 アルキルエステルのようなエステル化カルボキ
シル；シアノ；ヒドロキシ；ホルミルオキシ、アセトキ
シ、プロピオンオキシ、もしくはブチルオキシのような
アシル化ヒドロキシル；フッ素もしくは塩素のようなハ
ロゲン；またはトリフルオロメチルもしくはクロロメチ
ルのようなハロアルキルなどの置換基である。または脂
肪族アルデヒドはオキソ基を含有していてもよく、例え
ばＲＣＨＯは４−オキソペンタナールもしくはピルボア
ルデヒドなどのようなケトアルデヒドでもよい。芳香族
アルデヒドもしくは複素環式アルデヒドは、同様に、そ
の芳香環、複素環、またはアルキルもしくはアルケニル
の部分が置換されていてもよい。この発明の方法に用い
ることができる、アルキル、アルケニルおよびアルキニ
ルのアルデヒド類ＲＣＨＯは、アセトアルデヒド、プロ
ピオンアルデヒド，ブチルアルデヒド、バレルアルデヒ
ド、スクシンセミアルデヒドメチルエステル、スクシン
セミアルデヒドベンジルエステル、４−ヒドロキシバレ
ルアルデヒド、グルタルセミアルデヒドメチルエステ
ル、ピルボアルデヒド、Ｏ−ホルミル４−ヒドロキシバ
レルアルデヒド、３−フルオロバレルアルデヒド、５−
ロロバレルアルデヒド、２−ロロプロピオンアルデヒ
ド、プロパルギルアルデヒド、ならびに下記式：
【化６】
【化７】 （式中、Ｒ’は水素またはＣ1−Ｃ4 アルキル）で表さ
れるアルケンアルデヒド類、例えば、アクロレイン、ク
ロトンアルデヒドおよび４−ペンテナールである。
れるアルケンアルデヒド類、例えば、アクロレイン、ク
ロトンアルデヒドおよび４−ペンテナールである。
【００１２】この発明の方法に用いられる芳香族と複素
環式アルデヒドのＲＣＨＯは、ベンズアルデヒド、トル
アルデヒド、アニスアルデヒド、ベラトリルアルデヒ
ド、フェニルアセトアルデヒド、３−フェニルプロピオ
ンアルデヒド、２−フェニルプロピオンアルデヒド、フ
ルフラール、２−（２−フリル）アセトアルデヒド、３
−フリルアクロレイン、３−フェニルアクロレイン、２
−チオフェンアルデヒド、３−（２−チエニル）アクロ
レイン、３−（メトキシフェニル）アクロレインなどの
芳香族アルデヒド類である。
環式アルデヒドのＲＣＨＯは、ベンズアルデヒド、トル
アルデヒド、アニスアルデヒド、ベラトリルアルデヒ
ド、フェニルアセトアルデヒド、３−フェニルプロピオ
ンアルデヒド、２−フェニルプロピオンアルデヒド、フ
ルフラール、２−（２−フリル）アセトアルデヒド、３
−フリルアクロレイン、３−フェニルアクロレイン、２
−チオフェンアルデヒド、３−（２−チエニル）アクロ
レイン、３−（メトキシフェニル）アクロレインなどの
芳香族アルデヒド類である。
【００１３】この発明の方法において、好ましくは、式
１のＲは、Ｃ2−Ｃ6 アルケニル、Ｃ2−Ｃ6 アルキニ
ル、エステル化カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルカノイルオ
キシ、またはアリールアルコキシで置換されたＣ1−Ｃ6
アルキルで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキル基である。本
願で用いるＣ2−Ｃ6 アルケニルという用語は、エテニ
ル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニ
ルのような直鎖および分枝鎖の非置換炭化水素鎖を意味
し；Ｃ2−Ｃ6 アルキニルという用語はエチニル、プロ
ピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキセニル基を意
味し、これらの基は分枝していてもよい；エステル化カ
ルボキシ基で置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
はエステル化カルボキシル基で置換された直鎖および分
枝鎖のアルキル基を意味し、そのエステル基はＣ1−Ｃ4
アルキル；フェニル；ベンジル；ｐ−メトキシベンジ
ル、メチルベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ジフェニル
メチルのような置換ベンジル；またはその他の通常のカ
ルボキル保護基である。このような基の例は、エトキシ
カルボニルメチル、２−（メトキシカルボニル）エチ
ル、３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）プロピル、３
−（ベンジルオキシカルボニル）ブチル、５−（４−メ
トキシベンジルオキシカルボニル）ヘキシルなどエステ
ル化カルボキシル基で置換されたアルキル基である。Ｃ
1−Ｃ4 アルコキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルとい
う用語は、メトキシメチル、２−エトキシエチル、４−
ｔ−ブチルオキシブチル、３−イソプロポキシペンチ
ル、２−エトキシヘキシルなどを意味し；フッ素もしく
は塩素で置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語は、
２−フルオロエチル、２−クロロエチル、４−クロロブ
チル、５−クロロペンチル、クロロメチル、フルオロメ
チル、３−クロロ−４−メチルペンチルなどの基を意味
し；シァンで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
は、シアノメチル、２−シアノエチル、４−シアノブチ
ル、３−シアノブチル、５−シアノヘキシルなどを意味
し；ヒドロキシルで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルとい
う用語は、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシメチル、
４−ヒドロキシブチル、３−ドロキシプロピル、３−ヒ
ドロキシヘキシルなどの基を示し；Ｃ 1−Ｃ4 アルカノ
イルオキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
は、２−アセトキシエチル、２−ホルミルオキシエチ
ル、３−アセトキシプロピル、４−プロピオンオキシブ
チルなどの基のような基を意味し；およびアリールアル
コシキで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語は、
ベンジルオキシメチル、ジフェルメトキシメチル、４−
ベンジルオキシブチル、２−（４−メトキシベンジルオ
キシ）エチル、３−ジフェニルメトキシプロピルなどの
基のような基を意味する。
１のＲは、Ｃ2−Ｃ6 アルケニル、Ｃ2−Ｃ6 アルキニ
ル、エステル化カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルカノイルオ
キシ、またはアリールアルコキシで置換されたＣ1−Ｃ6
アルキルで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキル基である。本
願で用いるＣ2−Ｃ6 アルケニルという用語は、エテニ
ル、プロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニ
ルのような直鎖および分枝鎖の非置換炭化水素鎖を意味
し；Ｃ2−Ｃ6 アルキニルという用語はエチニル、プロ
ピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキセニル基を意
味し、これらの基は分枝していてもよい；エステル化カ
ルボキシ基で置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
はエステル化カルボキシル基で置換された直鎖および分
枝鎖のアルキル基を意味し、そのエステル基はＣ1−Ｃ4
アルキル；フェニル；ベンジル；ｐ−メトキシベンジ
ル、メチルベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ジフェニル
メチルのような置換ベンジル；またはその他の通常のカ
ルボキル保護基である。このような基の例は、エトキシ
カルボニルメチル、２−（メトキシカルボニル）エチ
ル、３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）プロピル、３
−（ベンジルオキシカルボニル）ブチル、５−（４−メ
トキシベンジルオキシカルボニル）ヘキシルなどエステ
ル化カルボキシル基で置換されたアルキル基である。Ｃ
1−Ｃ4 アルコキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルとい
う用語は、メトキシメチル、２−エトキシエチル、４−
ｔ−ブチルオキシブチル、３−イソプロポキシペンチ
ル、２−エトキシヘキシルなどを意味し；フッ素もしく
は塩素で置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語は、
２−フルオロエチル、２−クロロエチル、４−クロロブ
チル、５−クロロペンチル、クロロメチル、フルオロメ
チル、３−クロロ−４−メチルペンチルなどの基を意味
し；シァンで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
は、シアノメチル、２−シアノエチル、４−シアノブチ
ル、３−シアノブチル、５−シアノヘキシルなどを意味
し；ヒドロキシルで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルとい
う用語は、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシメチル、
４−ヒドロキシブチル、３−ドロキシプロピル、３−ヒ
ドロキシヘキシルなどの基を示し；Ｃ 1−Ｃ4 アルカノ
イルオキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語
は、２−アセトキシエチル、２−ホルミルオキシエチ
ル、３−アセトキシプロピル、４−プロピオンオキシブ
チルなどの基のような基を意味し；およびアリールアル
コシキで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルという用語は、
ベンジルオキシメチル、ジフェルメトキシメチル、４−
ベンジルオキシブチル、２−（４−メトキシベンジルオ
キシ）エチル、３−ジフェニルメトキシプロピルなどの
基のような基を意味する。
【００１４】この発明の方法で用いられる特に好ましい
アルデヒド類は、ＲがアルケンであるＲＣＨＯ、すなわ
ち前記定義の下記式：
アルデヒド類は、ＲがアルケンであるＲＣＨＯ、すなわ
ち前記定義の下記式：
【化８】 で表されるアルデヒド；またはＲがエステル化カルボキ
シル基もしくはＣ1−Ｃ4アルカノイルオキシ基で置換さ
れたＣ1−Ｃ4 アルキル基であるＲＣＨＯで表されるア
ルデヒドである。かような基の例は、２−（メトキシカ
ルボニル）エチル、２−（ベンヂルオキシカルボニル）
エチル、３−（エトキシカルボニル）プロピル、２−
（ホルミルオキシ）エチルおよび２−アセトキシエチル
である。
シル基もしくはＣ1−Ｃ4アルカノイルオキシ基で置換さ
れたＣ1−Ｃ4 アルキル基であるＲＣＨＯで表されるア
ルデヒドである。かような基の例は、２−（メトキシカ
ルボニル）エチル、２−（ベンヂルオキシカルボニル）
エチル、３−（エトキシカルボニル）プロピル、２−
（ホルミルオキシ）エチルおよび２−アセトキシエチル
である。
【００１５】この発明の方法に用いられるアルデヒド類
ＲＣＨＯは、すべて市販されているかもしくは通常の方
法で製造できる公知の化合物である。この発明の好まし
い方法では、Ｒが次のような基のアルデヒドＲＣＨＯが
使われる。すなわちＲが２−（エステル化カルボキシ）
エチル、２−シアノエチル、２−（エステル化カルボキ
シ）エチニル、２−（エステル化カルボキシ）−ビニ
ル、３−（エステル化カルボキシ）プロピル、２−ホル
ミルオキシエチル、２−アセトキシメチル、３−ホルミ
ルオキシプロピルもしくは３−アセトキシプロピルであ
り、ここでエステル化カルボキシル基のエステル部分は
Ｃ1−Ｃ4 アルキル、例えばメチル、エチルもしくはｔ
−ブチル；フェニル、ベンジル、ジフェニルメチル、ト
リチル、または置換ベンジル、例えは４−メトキシベン
ジルもしくは４−ニトロベンジルであるアルデヒドＲＣ
ＨＯである。この発明に用いられる特に好ましいアルデ
ヒドはスクシンセミアルデヒドエステルである。その外
の特に好ましいアルデヒドはグルタルセミアルデヒドの
エステルである。
ＲＣＨＯは、すべて市販されているかもしくは通常の方
法で製造できる公知の化合物である。この発明の好まし
い方法では、Ｒが次のような基のアルデヒドＲＣＨＯが
使われる。すなわちＲが２−（エステル化カルボキシ）
エチル、２−シアノエチル、２−（エステル化カルボキ
シ）エチニル、２−（エステル化カルボキシ）−ビニ
ル、３−（エステル化カルボキシ）プロピル、２−ホル
ミルオキシエチル、２−アセトキシメチル、３−ホルミ
ルオキシプロピルもしくは３−アセトキシプロピルであ
り、ここでエステル化カルボキシル基のエステル部分は
Ｃ1−Ｃ4 アルキル、例えばメチル、エチルもしくはｔ
−ブチル；フェニル、ベンジル、ジフェニルメチル、ト
リチル、または置換ベンジル、例えは４−メトキシベン
ジルもしくは４−ニトロベンジルであるアルデヒドＲＣ
ＨＯである。この発明に用いられる特に好ましいアルデ
ヒドはスクシンセミアルデヒドエステルである。その外
の特に好ましいアルデヒドはグルタルセミアルデヒドの
エステルである。
【００１６】下記の式はこの発明の方法で実施される反
応を示す式である。
応を示す式である。
【化９】 ＲＣＨＯ＋ＮＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ → Ｒ−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ(ＮＨ3 +)ＣＯＯ-
【００１７】既述したように、セリンヒドロキシメチル
トランスフェラーゼは、いくつもの出所から入手するこ
とができる。３つのこれら出所は、ウサギの肝臓（Ｌa
Ｖerne ＳehirchとＭerle Ｍason，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，
２３７巻、８行、１９６２年８月）、とうもろこし苗
（Ｍasuda,Ｔ.等、Ａgric Ｂoil.Ｃhem.，５０巻、２７
６３頁、１９８６年）およびやえなり苗（Ｒao,Ｄ.Ｎ.
とＲao,Ｎ.Ａ.，Ｐlant Ｐhysiol.，６９巻、１１頁、
１９８２年）である。
トランスフェラーゼは、いくつもの出所から入手するこ
とができる。３つのこれら出所は、ウサギの肝臓（Ｌa
Ｖerne ＳehirchとＭerle Ｍason，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，
２３７巻、８行、１９６２年８月）、とうもろこし苗
（Ｍasuda,Ｔ.等、Ａgric Ｂoil.Ｃhem.，５０巻、２７
６３頁、１９８６年）およびやえなり苗（Ｒao,Ｄ.Ｎ.
とＲao,Ｎ.Ａ.，Ｐlant Ｐhysiol.，６９巻、１１頁、
１９８２年）である。
【００１８】以下に示す表１に、この発明の方法で、２
つの出所由来のＳＨＭＴを用いてβ−ヒドロキシ−α−
アミノ酸に変換した代表的なアルデヒド基質を列挙す
る。表１の基質の変換は、基質とグリシンを、ＳＨＭＴ
とともに、この発明の方法の条件下でインキュベートす
ることによって実施した。使用した条件の多くはすべて
の基質に共通であり、以下に詳細に述べる。例外が起こ
った場合は、各例に記載してある。
つの出所由来のＳＨＭＴを用いてβ−ヒドロキシ−α−
アミノ酸に変換した代表的なアルデヒド基質を列挙す
る。表１の基質の変換は、基質とグリシンを、ＳＨＭＴ
とともに、この発明の方法の条件下でインキュベートす
ることによって実施した。使用した条件の多くはすべて
の基質に共通であり、以下に詳細に述べる。例外が起こ
った場合は、各例に記載してある。
【００１９】上記のインキュベーションは、約８０μＭ
の濃度のピリドキサール５’−リン酸を含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中で実施した。溶液はす
べて、最高の結果が得られるように、蒸留脱イオン水で
調製した。変換反応は、密閉した、ポリプロピレン製５
００μＬミクロ遠心分離バイアルびん内にて、約３７℃
で、定温水浴中で行った。これらのバイアルびんは、水
浴から出して分析用試料を取出す時以外は、光があたら
ないように保護した。すべての変換反応について、酵素
ブランクインキュベーションをＳＨＭＴインキュベーシ
ョンと平行して行った。インキュベーション混合物の全
体積は、一般に約２００μＬであった。ブランクの条件
は、酵素を含有していないことを除いてインキュベーシ
ョン混合物の条件と同一である。
の濃度のピリドキサール５’−リン酸を含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中で実施した。溶液はす
べて、最高の結果が得られるように、蒸留脱イオン水で
調製した。変換反応は、密閉した、ポリプロピレン製５
００μＬミクロ遠心分離バイアルびん内にて、約３７℃
で、定温水浴中で行った。これらのバイアルびんは、水
浴から出して分析用試料を取出す時以外は、光があたら
ないように保護した。すべての変換反応について、酵素
ブランクインキュベーションをＳＨＭＴインキュベーシ
ョンと平行して行った。インキュベーション混合物の全
体積は、一般に約２００μＬであった。ブランクの条件
は、酵素を含有していないことを除いてインキュベーシ
ョン混合物の条件と同一である。
【表１】 ＳＨＭＴに対するアルデヒド（ＲＣＨＯ）基質アルデヒド（ＲＣＨＯ）のＲ 酵素1)ウサギ肝臓 とうもろこし苗 −ＣＨ3 ＋ ＋ −ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3 ＋ ＮＤ −ＣＨ2ＣＨ3 ＮＤ ＋ −ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2ＣＨ3 ＋ ＋ −ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2(ＣＨ3)2 ＋ ＮＤ −ＣＯ2Ｈ − − −ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2ＣＨ3 ＋ ＋ −Ｃ(Ｏ)ＣＨ3 2) ＋ ＋ −ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨＯ ＋ ＮＤ Ｃ6Ｈ5 ＋ − −ＣＨ2ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5 ＮＤ ＋ ２−フリル ＋ ＋ ２−(２−フリル)エチル ＋ − １） ＋＝変換；−＝変換反応は検出できなかった；Ｎ
Ｄ＝未測定 ２） ウサギ肝臓ＳＨＭＴについてはＶＯ３を用い、と
うもろこしＳＨＭＴについてはテトラヒドロ葉酸を用い
た。
Ｄ＝未測定 ２） ウサギ肝臓ＳＨＭＴについてはＶＯ３を用い、と
うもろこしＳＨＭＴについてはテトラヒドロ葉酸を用い
た。
【００２０】この発明の方法は、インキュベーション混
合物から、時々一部分を取出して、その試料の混合物中
に存在するすべての第一級アミン化合物をＨＰＬＣで分
離し、ｏ−フタルアルデヒドで誘導したイソインドール
類を蛍光検出することによって、β−ヒドロキシ−α−
アミノ酸の生成を監視することができる。その検定法
は、Ｊones,Ｂ.Ｎ.，Ｇilligan,Ｊ.Ｐ.，Ｊ.Ｃhrom.，
２６６巻、４７１頁、１９８３年；Ｊones,Ｂ.Ｎ.等、
Ｊ.Ｌiq.Ｃhrom，４巻、５６５頁、１９８１年；および
Ｓimons,Ｊr.,Ｓ.Ｓ.等、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，９８
巻、７０９８頁、１９７６年に記載されている。インキ
ュベーション混合物と酵素ブランクの両者をＨＰＣＬ分
析した結果、クロマトグラム上のどのピークが酵素生成
物であるかを帰属させることができた。
合物から、時々一部分を取出して、その試料の混合物中
に存在するすべての第一級アミン化合物をＨＰＬＣで分
離し、ｏ−フタルアルデヒドで誘導したイソインドール
類を蛍光検出することによって、β−ヒドロキシ−α−
アミノ酸の生成を監視することができる。その検定法
は、Ｊones,Ｂ.Ｎ.，Ｇilligan,Ｊ.Ｐ.，Ｊ.Ｃhrom.，
２６６巻、４７１頁、１９８３年；Ｊones,Ｂ.Ｎ.等、
Ｊ.Ｌiq.Ｃhrom，４巻、５６５頁、１９８１年；および
Ｓimons,Ｊr.,Ｓ.Ｓ.等、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，９８
巻、７０９８頁、１９７６年に記載されている。インキ
ュベーション混合物と酵素ブランクの両者をＨＰＣＬ分
析した結果、クロマトグラム上のどのピークが酵素生成
物であるかを帰属させることができた。
【００２１】この発明の方法は、ＰＬＰとその他の補因
子を含有するグリシンの緩衝溶液に、アルデヒドを添加
し、次に、得られた溶液を酵素の緩衝溶液と混合するこ
とにより行われる。あるいは、ＰＬＰを含有するグリシ
ンの緩衝溶液と酵素溶液を混合し、次にアルデヒドを添
加する。また、ＰＬＰ含有緩衝液の存在下、酵素溶液
を、アルデヒドとグリシンを含有する溶液に添加するこ
ともできる。
子を含有するグリシンの緩衝溶液に、アルデヒドを添加
し、次に、得られた溶液を酵素の緩衝溶液と混合するこ
とにより行われる。あるいは、ＰＬＰを含有するグリシ
ンの緩衝溶液と酵素溶液を混合し、次にアルデヒドを添
加する。また、ＰＬＰ含有緩衝液の存在下、酵素溶液
を、アルデヒドとグリシンを含有する溶液に添加するこ
ともできる。
【００２２】アルデヒドＲＣＨＯは、この発明の方法に
おいてその変換反応を起こすために、完全に溶解させる
必要はない。水性反応媒体に一部分しか溶解しないアル
デヒドでも酵素の基質として作用する。
おいてその変換反応を起こすために、完全に溶解させる
必要はない。水性反応媒体に一部分しか溶解しないアル
デヒドでも酵素の基質として作用する。
【００２３】アルデヒドＲＣＨＯが脂肪族アルデヒド
〔すなわちアルデヒド官能基のカルボニル基に結合して
いる炭素原子が飽和ＣＨ2である〕の場合のこの発明の
方法は、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸もしくはエステ
ルのＬ−エリトロジアステレオマーを優先的に与える。
しかしアルデヒド基質が芳香族（すなわちアルデヒド官
能基のカルボニル基に結合している炭素原子が芳香系の
一部である）場合、生成物は、トレオ形とエリトロ形の
両方がほぼ等しい量で得られる。例えばベンズアルデヒ
ドは、β−フェニルセリンのトレオ異性体とエリトロ異
性体の両方を生成する。
〔すなわちアルデヒド官能基のカルボニル基に結合して
いる炭素原子が飽和ＣＨ2である〕の場合のこの発明の
方法は、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸もしくはエステ
ルのＬ−エリトロジアステレオマーを優先的に与える。
しかしアルデヒド基質が芳香族（すなわちアルデヒド官
能基のカルボニル基に結合している炭素原子が芳香系の
一部である）場合、生成物は、トレオ形とエリトロ形の
両方がほぼ等しい量で得られる。例えばベンズアルデヒ
ドは、β−フェニルセリンのトレオ異性体とエリトロ異
性体の両方を生成する。
【００２４】この発明の方法で得られるβ−ヒドロキシ
−α−アミノ酸の例は、β−フェニルセリン、β−（２
−フリル）セリン、β−ヒドロキシ−α−アミノアジピ
ン酸、β−ヒドロキシ−α−アミノヘキサン酸、β−ヒ
ドロキシ−α−アミノ−ω−ホルミルオキシキサン酸、
β−ヒドロキシ−α−アミノ−γ−オキソ吉草酸、β−
ヒドロキシ−α−アミノ−γ−フェニル酪酸、β−ヒド
ロキシ−α−アミノヘプタン酸、β−ヒドロキシ−α−
アミノ−ω−（２−フリル）−ペンタン酸などのアミノ
酸である。
−α−アミノ酸の例は、β−フェニルセリン、β−（２
−フリル）セリン、β−ヒドロキシ−α−アミノアジピ
ン酸、β−ヒドロキシ−α−アミノヘキサン酸、β−ヒ
ドロキシ−α−アミノ−ω−ホルミルオキシキサン酸、
β−ヒドロキシ−α−アミノ−γ−オキソ吉草酸、β−
ヒドロキシ−α−アミノ−γ−フェニル酪酸、β−ヒド
ロキシ−α−アミノヘプタン酸、β−ヒドロキシ−α−
アミノ−ω−（２−フリル）−ペンタン酸などのアミノ
酸である。
【００２５】この発明の方法の好ましい態様では、スク
シンセミアルデヒドのエステル、例えばメチルエステル
もしくはイソプロピルエステルのごときＣ1−Ｃ4 アル
キルエステルは、ＰＬＰの存在下、リン酸緩衝液中、グ
リシンおよびＳＨＭＴとともにインキュベートすると、
β−ヒドロキシ−α−アミノアジピン酸のハーフエステ
ルがＬ−エリトロ異性体として得られる。この発明のそ
の他の好ましい態様では、グルタルセミアルデヒドのエ
ステル、例えばメチルエステルをＳＨＭＴと共にインキ
ュベートし、β−ヒドロキシ−α−アミノピメリン酸の
ハーフエステルを得る。
シンセミアルデヒドのエステル、例えばメチルエステル
もしくはイソプロピルエステルのごときＣ1−Ｃ4 アル
キルエステルは、ＰＬＰの存在下、リン酸緩衝液中、グ
リシンおよびＳＨＭＴとともにインキュベートすると、
β−ヒドロキシ−α−アミノアジピン酸のハーフエステ
ルがＬ−エリトロ異性体として得られる。この発明のそ
の他の好ましい態様では、グルタルセミアルデヒドのエ
ステル、例えばメチルエステルをＳＨＭＴと共にインキ
ュベートし、β−ヒドロキシ−α−アミノピメリン酸の
ハーフエステルを得る。
【００２６】この発明の上記２つの態様は下記反応式で
表される。
表される。
【化１０】 反応式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4 アルキル、フェニル、ベンジ
ル、ジフェニルメチル、４−メトキシベンジルまたは４
−ニトロベンジルおよびｎは２または３である。
ル、ジフェニルメチル、４−メトキシベンジルまたは４
−ニトロベンジルおよびｎは２または３である。
【００２７】さらにこの発明は、式：Ｒ1ＯＯＣ−ＣＨ2
−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＲ1’（式
中、Ｒ1は前記と同一、Ｒ1’は水素もしくはＲ1）で表
されるアミノ酸、β−ヒドロキシ−α−アミノアジピン
酸、そのモノＲ1エステルとジＲ1エステルおよび塩を提
供するものでる。このアミノ酸は、この発明の方法で
は、Ｌ−エリトロ形で得られる。その二酸の塩もしくは
モノエステルは通常の方法で生成させることができる。
このような塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩のよ
うなアルカリ金属塩；カルシウム塩のようなアルカリ土
類金属塩；ベンジルアミン、ジベンジルアミン、シクロ
ヘキシルアミン、ジシクロヘキルアミン、ならびにメチ
ルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、ジ−（n−
ブチル）アミン、エタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、ジプロパノールアミンのようなＣ1−Ｃ4 アルキル
の第一級アミンおよび第二級アミンで生成されるアンモ
ニウム塩とアミン塩などの塩がふくまれる。このような
塩は、二酸もしくはそのモノエステルの分離と精製に有
用であり、そのアミノ酸を貯蔵するのに用いる安定な形
態を提供する。またアミノ酸とそのエステルで生成され
る酸付加塩も提供される。このような塩は、アミノ酸の
酸性カルボン酸基より強い酸で形成される。このような
酸の例は塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、ならびにト
ルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスル
ホン酸およびｎ−ブタンスルホン酸のようなスルホン酸
類である。
−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＲ1’（式
中、Ｒ1は前記と同一、Ｒ1’は水素もしくはＲ1）で表
されるアミノ酸、β−ヒドロキシ−α−アミノアジピン
酸、そのモノＲ1エステルとジＲ1エステルおよび塩を提
供するものでる。このアミノ酸は、この発明の方法で
は、Ｌ−エリトロ形で得られる。その二酸の塩もしくは
モノエステルは通常の方法で生成させることができる。
このような塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩のよ
うなアルカリ金属塩；カルシウム塩のようなアルカリ土
類金属塩；ベンジルアミン、ジベンジルアミン、シクロ
ヘキシルアミン、ジシクロヘキルアミン、ならびにメチ
ルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、ジ−（n−
ブチル）アミン、エタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、ジプロパノールアミンのようなＣ1−Ｃ4 アルキル
の第一級アミンおよび第二級アミンで生成されるアンモ
ニウム塩とアミン塩などの塩がふくまれる。このような
塩は、二酸もしくはそのモノエステルの分離と精製に有
用であり、そのアミノ酸を貯蔵するのに用いる安定な形
態を提供する。またアミノ酸とそのエステルで生成され
る酸付加塩も提供される。このような塩は、アミノ酸の
酸性カルボン酸基より強い酸で形成される。このような
酸の例は塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、ならびにト
ルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスル
ホン酸およびｎ−ブタンスルホン酸のようなスルホン酸
類である。
【００２８】そのＲ1エステルとは、前記反応式に記載
したのと同じ意味のＲ1のモノエステルとジエステルを
意味する。このようなエステルの例は、モノメチル、モ
ノエチル、ジメチル、ジエチル、ｔ−ブチル、ジ−ｔ−
ブチル、ベンジル、４−メトキシベンジルおよびジベン
ジルのエステルである。
したのと同じ意味のＲ1のモノエステルとジエステルを
意味する。このようなエステルの例は、モノメチル、モ
ノエチル、ジメチル、ジエチル、ｔ−ブチル、ジ−ｔ−
ブチル、ベンジル、４−メトキシベンジルおよびジベン
ジルのエステルである。
【００２９】この発明の方法で提供されるβ−ヒドロキ
シ−α−アミノ酸は、重要なβ−ラクタム化合物を製造
するための有用な中間体である。生成物は、公知の抗生
物質化合物を製造するのに有用なβ−ラクタム化合物
に、公知の方法で変換される。例えば、得られたβ−ヒ
ドロキシ−α−アミノ酸は、下記反応式に示すように、
ヒドロオキサム酸エステル誘導体に変換され、次に、こ
の誘導体は環化され３−アミノ−４−置換β−ラクタム
化合物を生成する。
シ−α−アミノ酸は、重要なβ−ラクタム化合物を製造
するための有用な中間体である。生成物は、公知の抗生
物質化合物を製造するのに有用なβ−ラクタム化合物
に、公知の方法で変換される。例えば、得られたβ−ヒ
ドロキシ−α−アミノ酸は、下記反応式に示すように、
ヒドロオキサム酸エステル誘導体に変換され、次に、こ
の誘導体は環化され３−アミノ−４−置換β−ラクタム
化合物を生成する。
【化１１】 式中、Ｒは式１について先に定義したのと同じ意味であ
り、Ｒ2はアルキル、アルカノイルもしくはアラルキル
基である。ヒドロオキサム酸エステルの形成とヒドロオ
キサム酸エステルの環化によるβ−ラクタムの形成は、
Ｍiller,Ｍ.Ｊ.，Ａccts.Ｃhem.Ｒes.，１９巻、４９
頁、１９８６年；Ｒajendra,Ｇ.とＭiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔe
trahedron Ｌett.，２８巻、６２５７頁、１９８７年；
およびＫolasa,Ｔ.とＭiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔetrahedron Ｌ
ett.，２８巻、１８６１頁、１９８７年に記載されてい
る方法で行う。
り、Ｒ2はアルキル、アルカノイルもしくはアラルキル
基である。ヒドロオキサム酸エステルの形成とヒドロオ
キサム酸エステルの環化によるβ−ラクタムの形成は、
Ｍiller,Ｍ.Ｊ.，Ａccts.Ｃhem.Ｒes.，１９巻、４９
頁、１９８６年；Ｒajendra,Ｇ.とＭiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔe
trahedron Ｌett.，２８巻、６２５７頁、１９８７年；
およびＫolasa,Ｔ.とＭiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔetrahedron Ｌ
ett.，２８巻、１８６１頁、１９８７年に記載されてい
る方法で行う。
【００３０】あるいは、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸
は、Ｍiller,Ｍ.Ｊ.の米国特許第４,５９５,５３２号に
記載されているようにＮ−（置換メチル）アゼチジノン
類に変換することができる。さらに、この発明の方法の
アミノ酸生成物は、Ｍiller,Ｍ.Ｊ.の米国特許第４,８
２０,８１５号に記載されているＮ−（ホスホノメチル
メチル）アゼチジノン類にも変換することができる。
は、Ｍiller,Ｍ.Ｊ.の米国特許第４,５９５,５３２号に
記載されているようにＮ−（置換メチル）アゼチジノン
類に変換することができる。さらに、この発明の方法の
アミノ酸生成物は、Ｍiller,Ｍ.Ｊ.の米国特許第４,８
２０,８１５号に記載されているＮ−（ホスホノメチル
メチル）アゼチジノン類にも変換することができる。
【００３１】以下の製造法と実施例によって、さらにこ
の発明の方法を説明するが、これらはこの発明を限定す
るものではない。
の発明の方法を説明するが、これらはこの発明を限定す
るものではない。
【００３２】とうもろこし苗からのセリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼの製造 以下の手順はすべて４℃で実施した。洗浄した５〜７日
齢のとうもろこし苗を、１ｍＭのエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム、１ｍＭジチオトレイトー
ルおよび１２５μＭのピリドキサール ５’−リン酸を
含有する１００ｍＭの一水素リン酸カリウム中、ワーリ
ングブレンダーで均質化した。得られた混合物には１l
当たり約９６０ｇの苗が含有されていた。得られたホモ
ジネートをチーズクロスで濾過し、濾液を硫酸アンモニ
ウム沈澱法に付した。硫酸アンモニウム３５〜５０％飽
和度で沈澱させ、４０分間、１３，８００ｘｇで遠心分
離して得たタンパク質を、１２５μＭのピリドキサール
５’−リン酸と１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０μＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。得られた溶液
を、ＥＤＴＡを含有しない同じ緩衝液に対して透析し
て、５〜１５ｍｇタンパク質／ｍｌの濃度に濃縮した。
得られたタンパク質のアルドラーゼ活性の検定法は、Ｌ
−アロ−トレオニンのアルドラーゼで触媒された逆アル
ドール縮合反応と、生成したアセトアルデヒドの酵母ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によるＮＡＤＨ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）依
存性還元反応との組合せ役系で構成された検定法であ
る。比活性は、平均値が１ｍｇのタンパク質当たり７８
ミリ単位であった。酵素活性の１単位は、１００ｍＭリ
ン酸緩液（ｐＨ７．５）中、ＡＤＨ、１２０ｍＭ Ｌ−
アロ−トレオニン、１２５μＭ ＰＬＰおよび１２０μ
Ｍ ＮＡＤＨの存在下室温にて、１分間で１光学密度単
位（３４０ｎｍにおける）の変化を起こさせるのに必要
な酵素量と定義する。
チルトランスフェラーゼの製造 以下の手順はすべて４℃で実施した。洗浄した５〜７日
齢のとうもろこし苗を、１ｍＭのエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム、１ｍＭジチオトレイトー
ルおよび１２５μＭのピリドキサール ５’−リン酸を
含有する１００ｍＭの一水素リン酸カリウム中、ワーリ
ングブレンダーで均質化した。得られた混合物には１l
当たり約９６０ｇの苗が含有されていた。得られたホモ
ジネートをチーズクロスで濾過し、濾液を硫酸アンモニ
ウム沈澱法に付した。硫酸アンモニウム３５〜５０％飽
和度で沈澱させ、４０分間、１３，８００ｘｇで遠心分
離して得たタンパク質を、１２５μＭのピリドキサール
５’−リン酸と１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０μＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。得られた溶液
を、ＥＤＴＡを含有しない同じ緩衝液に対して透析し
て、５〜１５ｍｇタンパク質／ｍｌの濃度に濃縮した。
得られたタンパク質のアルドラーゼ活性の検定法は、Ｌ
−アロ−トレオニンのアルドラーゼで触媒された逆アル
ドール縮合反応と、生成したアセトアルデヒドの酵母ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によるＮＡＤＨ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）依
存性還元反応との組合せ役系で構成された検定法であ
る。比活性は、平均値が１ｍｇのタンパク質当たり７８
ミリ単位であった。酵素活性の１単位は、１００ｍＭリ
ン酸緩液（ｐＨ７．５）中、ＡＤＨ、１２０ｍＭ Ｌ−
アロ−トレオニン、１２５μＭ ＰＬＰおよび１２０μ
Ｍ ＮＡＤＨの存在下室温にて、１分間で１光学密度単
位（３４０ｎｍにおける）の変化を起こさせるのに必要
な酵素量と定義する。
【００３３】ＳＨＭＴは製造して使用しない場合は、凍
結乾燥された形態かまたは１０％のグリセリンと共に凍
結された形態で保存される。
結乾燥された形態かまたは１０％のグリセリンと共に凍
結された形態で保存される。
【００３４】以下の実施例において、特にことわらなけ
れば、緩衝系は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３）であり、約８０μＭの濃度のピリドキサール
５’−リン酸（ＰＬＰ）を含有させた。溶液はすべて、
蒸留・脱イオン水で作製した。
れば、緩衝系は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３）であり、約８０μＭの濃度のピリドキサール
５’−リン酸（ＰＬＰ）を含有させた。溶液はすべて、
蒸留・脱イオン水で作製した。
【００３５】酵素によるインキュベーションは、密閉し
た、ポリプロピレン製５００μｌミクロ遠心分離バイア
ルびんに入れ、定温水溶中、３７℃で行った。
た、ポリプロピレン製５００μｌミクロ遠心分離バイア
ルびんに入れ、定温水溶中、３７℃で行った。
【００３６】実施例によって示された保持時間は、ＨＰ
ＬＣ分析によって時々わずかに変動するが、これは、カ
ラムの平衡化、緩衝液などのような因子がわずかに変動
するためである。
ＬＣ分析によって時々わずかに変動するが、これは、カ
ラムの平衡化、緩衝液などのような因子がわずかに変動
するためである。
【００３７】以下の実施例で使用されるＳＨＭＴは、
Ｌ．Ｓchirchの前記の方法によってウサギの肝臓から得
たものである。
Ｌ．Ｓchirchの前記の方法によってウサギの肝臓から得
たものである。
【００３８】実施例１ トレオニンの製造 グリシンの溶液（３４ｍＭ）をＰＬＰ含有リン酸緩衝液
で調製し、十分に新しく蒸溜したアセトアルデヒドをそ
の濃度が３４ｍＭになるまで添加した。酵素溶液を添加
し、各基質の濃度を１７ｍＭにした。
で調製し、十分に新しく蒸溜したアセトアルデヒドをそ
の濃度が３４ｍＭになるまで添加した。酵素溶液を添加
し、各基質の濃度を１７ｍＭにした。
【００３９】２００μｌの標準リン酸緩衝液によるＳＨ
ＭＴ（０．１ｍｇ）の溶液を２ｍｌのガラスバイアルび
んに入れた。同じ体積の基質溶液を添加し、バイアルび
んをゴム製セプタムと銅線で密閉してアセトアルデヒド
の損失を最小限にした。このバイアルびんの溶液と酵素
のブランク溶液を３７℃でインキュベートした。
ＭＴ（０．１ｍｇ）の溶液を２ｍｌのガラスバイアルび
んに入れた。同じ体積の基質溶液を添加し、バイアルび
んをゴム製セプタムと銅線で密閉してアセトアルデヒド
の損失を最小限にした。このバイアルびんの溶液と酵素
のブランク溶液を３７℃でインキュベートした。
【００４０】インキュベート試験液の一部（１０μｌづ
つ）を、５０μｌのマイクロリットルシリンジを使って
１．０、２．０、３．０、４．０および２０．５時間の
インキュベージヨン時間毎に採取してＨＰＬＣで分析し
た。
つ）を、５０μｌのマイクロリットルシリンジを使って
１．０、２．０、３．０、４．０および２０．５時間の
インキュベージヨン時間毎に採取してＨＰＬＣで分析し
た。
【００４１】得られたクロマトグラムは、２１．９分の
保持時間のＬ−エリトロ異性体の大きなピークと、トレ
オ異性体の小さなピークを示した。生成したアミノ酸の
同一性は、市販の標準のトレオニン異性体と同時に注入
することによって確認した。
保持時間のＬ−エリトロ異性体の大きなピークと、トレ
オ異性体の小さなピークを示した。生成したアミノ酸の
同一性は、市販の標準のトレオニン異性体と同時に注入
することによって確認した。
【００４２】実施例２ α−アミノ−β−ヒドロキシカプロン酸 グリシン（２５．５ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ）とｎ−
ブタナール（２５．３ｍｇ、０．３５１mmol）とを標準
リン酸緩衝液に溶解して、これらの２つの基質がそれぞ
れ３４ｍＭと３５ｍＭの濃度の基質溶液を調製した。
ブタナール（２５．３ｍｇ、０．３５１mmol）とを標準
リン酸緩衝液に溶解して、これらの２つの基質がそれぞ
れ３４ｍＭと３５ｍＭの濃度の基質溶液を調製した。
【００４３】１００μｌの緩衝液によるＳＨＭＴ（０．
１ｍｇ）の溶液をポリプロピレン製０．５ｍｌのバイア
ルびんに入れた。酵素を含有していない別の緩衝液１０
０μｌを別のバイアルびん中に入れ、１００μｌの基質
溶液を各バイアルびんに添加した。１．０、３．０、
７．２５および２１時間のインキュベーション時間毎に
上記酵素溶液とブランク溶液から一部を採取してＨＰＬ
Ｃによって分析した。２つの生成物のピークがクロマト
グラムに認められた。すなわち２５．７分の大きなピー
クと２４．３分の小さなピークである。これらのピーク
は、標準のラセミ体生成物のピークと一致した。その標
準物質は、グリシンの銅錯体に対してアルドール反応を
行ってラセミ体を製造した（Ｓ.Ａkabari等、Ａrchives
of Ｂiochemistry and Ｂiophysics、８３巻１頁、１
９５９年、およびＪ.Ｐ.ＧreensteinとＭ.Ｗinity，
“Ｃhemistry of Ａmino Ａcids”，Ｊohn Ｗiley ＆
Ｓons，Ｎew Ｙork，３巻、２２４９−２２５０頁、１
９６１年参照）。
１ｍｇ）の溶液をポリプロピレン製０．５ｍｌのバイア
ルびんに入れた。酵素を含有していない別の緩衝液１０
０μｌを別のバイアルびん中に入れ、１００μｌの基質
溶液を各バイアルびんに添加した。１．０、３．０、
７．２５および２１時間のインキュベーション時間毎に
上記酵素溶液とブランク溶液から一部を採取してＨＰＬ
Ｃによって分析した。２つの生成物のピークがクロマト
グラムに認められた。すなわち２５．７分の大きなピー
クと２４．３分の小さなピークである。これらのピーク
は、標準のラセミ体生成物のピークと一致した。その標
準物質は、グリシンの銅錯体に対してアルドール反応を
行ってラセミ体を製造した（Ｓ.Ａkabari等、Ａrchives
of Ｂiochemistry and Ｂiophysics、８３巻１頁、１
９５９年、およびＪ.Ｐ.ＧreensteinとＭ.Ｗinity，
“Ｃhemistry of Ａmino Ａcids”，Ｊohn Ｗiley ＆
Ｓons，Ｎew Ｙork，３巻、２２４９−２２５０頁、１
９６１年参照）。
【００４４】実施例３ α−アミノ−β−ヒドロキシアジピン酸モノメチルエス
テル グリシン（１３．３ｇ、０．１７７mmol）とスクシンセ
ミアルデヒドメチルエステル（２０ｍｇ、０．１７２mm
ol）を、それぞれ、５．０ｍｌの緩衝液に溶解して３５
ｍＭと３４ｍＭの濃度にした。この実験に用いたアルデ
ヒドはＤＭＳＯを含有していなかったが、このアルデヒ
ドを用いて行った上記のインキュベーションではこの不
純物が含有されていた（この不純物は、ＣＨ2＝ＣＨ−
ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯ−ＣＨ3をオゾン分解し次にジメ
チルスルホキシドで後処理してこのアルデヒドを合成し
たときに残留したものである）。
テル グリシン（１３．３ｇ、０．１７７mmol）とスクシンセ
ミアルデヒドメチルエステル（２０ｍｇ、０．１７２mm
ol）を、それぞれ、５．０ｍｌの緩衝液に溶解して３５
ｍＭと３４ｍＭの濃度にした。この実験に用いたアルデ
ヒドはＤＭＳＯを含有していなかったが、このアルデヒ
ドを用いて行った上記のインキュベーションではこの不
純物が含有されていた（この不純物は、ＣＨ2＝ＣＨ−
ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯ−ＣＨ3をオゾン分解し次にジメ
チルスルホキシドで後処理してこのアルデヒドを合成し
たときに残留したものである）。
【００４５】１００μｌの緩衝液によるＳＨＭＴ（０．
１ｍｇ）の溶液に、１００μｌの基質混合物を添加し
た。０．５、１．０、２．０、３．０および２４時間の
インキュベーション時間毎に反応混合液の一部を採取し
た。生成物の大きなピーク（Ｌ−エリトロ形）が２２．
５分のtRに認められ、２時間で最大値に到達した。
１ｍｇ）の溶液に、１００μｌの基質混合物を添加し
た。０．５、１．０、２．０、３．０および２４時間の
インキュベーション時間毎に反応混合液の一部を採取し
た。生成物の大きなピーク（Ｌ−エリトロ形）が２２．
５分のtRに認められ、２時間で最大値に到達した。
【００４６】ＨＰＬＣによる分析で最初の２時間で、約
８分の保持時間に小さな新しいピークが現れた。２４時
間の期間に、このピークは強度が増大したが、一方出発
物質のグリシンと中間体のα−アミノ−β−ヒドロキシ
アジピン酸メチルエステルにに対応するピークの強度は
減少した。２４時間後、上記の新しいピークとグリシン
と上記エステルのピークの比率は３８：４７：１５であ
った。新しいピークに対応する化合物の構造は、別個に
合成し、標準生成物と酵素で生成させたものとを同時注
入することによって、Ｌ−エリトロ−α−アミノ−β−
ヒドロキシアジピン酸（Ｒ＝ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ2Ｈ）
と決定した。標準物質の化学合成は、スクシンセミアル
デヒドメチルエステルを、キラルキサジンのホウ素エノ
ラートとアルドール縮合させ（Ｒeno,Ｄ.Ｓ.；Ｌotz,
Ｂ.Ｔ.；Ｍiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔetrahedran Ｌett.，３１
巻、８２７頁、１９９０年）、次に脱保護と加水分解を
行うことよって実施して所望の化合物を得た。
８分の保持時間に小さな新しいピークが現れた。２４時
間の期間に、このピークは強度が増大したが、一方出発
物質のグリシンと中間体のα−アミノ−β−ヒドロキシ
アジピン酸メチルエステルにに対応するピークの強度は
減少した。２４時間後、上記の新しいピークとグリシン
と上記エステルのピークの比率は３８：４７：１５であ
った。新しいピークに対応する化合物の構造は、別個に
合成し、標準生成物と酵素で生成させたものとを同時注
入することによって、Ｌ−エリトロ−α−アミノ−β−
ヒドロキシアジピン酸（Ｒ＝ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ2Ｈ）
と決定した。標準物質の化学合成は、スクシンセミアル
デヒドメチルエステルを、キラルキサジンのホウ素エノ
ラートとアルドール縮合させ（Ｒeno,Ｄ.Ｓ.；Ｌotz,
Ｂ.Ｔ.；Ｍiller,Ｍ.Ｊ.，Ｔetrahedran Ｌett.，３１
巻、８２７頁、１９９０年）、次に脱保護と加水分解を
行うことよって実施して所望の化合物を得た。
【００４７】酵素合成中のこの原アミノ酸の生成は、最
初に生成したアミノ酸モノメチルエステルの加水分解に
よって起こる。この生成物は、イオン化したカルボン酸
基が付加しているので、酵素による可逆アルドール縮合
反応に対する基質ではない。したがって新規のアミノ酸
生成物（Ｌ−エリトロ−α−アミノ−β−ヒドロキシア
ジピン酸）が蓄積する。この生成物は、ジカルボン酸ア
ミノ酸生成物として、反応混合物からイオン交換クロマ
トグラフィによって精製することができる。（Ｇreenst
ein,Ｊ.Ｐ.とＷinitz,Ｍ.，“Ｃhemistry of the Ａmin
o Ａcids”、２巻、１４５２−１４６１頁、１９６１
年、Ｗiley、Ｎew Ｙork、Ｎ.Ｙ.）
初に生成したアミノ酸モノメチルエステルの加水分解に
よって起こる。この生成物は、イオン化したカルボン酸
基が付加しているので、酵素による可逆アルドール縮合
反応に対する基質ではない。したがって新規のアミノ酸
生成物（Ｌ−エリトロ−α−アミノ−β−ヒドロキシア
ジピン酸）が蓄積する。この生成物は、ジカルボン酸ア
ミノ酸生成物として、反応混合物からイオン交換クロマ
トグラフィによって精製することができる。（Ｇreenst
ein,Ｊ.Ｐ.とＷinitz,Ｍ.，“Ｃhemistry of the Ａmin
o Ａcids”、２巻、１４５２−１４６１頁、１９６１
年、Ｗiley、Ｎew Ｙork、Ｎ.Ｙ.）
【００４８】実施例４ α−アミノ−β−ヒドロキシアジピン酸モノイソプロピ
ルエステル グリシン（２６．１ｍｇ、０．３４８mmol）を１０．０
ｍｌの緩衝液に溶解し、スクシンセミアルデヒドイソプ
ロピルエステル３４ｍｇ（その製造時に持ち込まれた不
純物のＤＭＳＯを含有している）を添加した。インキュ
ベーション時にＤＭＳＯが存在しても、酵素もしくはそ
の反応に有害な影響は全く与えない。緩衝液中のアルデ
ヒドの濃度は、存在するＤＭＳＯを計算した後、１８ミ
リモルの濃度であった。インキュベーション混合物中の
グリシンとアルデヒドの最初の濃度はそれぞれ１７．４
ｍＭと９ｍＭであった。
ルエステル グリシン（２６．１ｍｇ、０．３４８mmol）を１０．０
ｍｌの緩衝液に溶解し、スクシンセミアルデヒドイソプ
ロピルエステル３４ｍｇ（その製造時に持ち込まれた不
純物のＤＭＳＯを含有している）を添加した。インキュ
ベーション時にＤＭＳＯが存在しても、酵素もしくはそ
の反応に有害な影響は全く与えない。緩衝液中のアルデ
ヒドの濃度は、存在するＤＭＳＯを計算した後、１８ミ
リモルの濃度であった。インキュベーション混合物中の
グリシンとアルデヒドの最初の濃度はそれぞれ１７．４
ｍＭと９ｍＭであった。
【００４９】基質の混合物（１００μｌ）を、ＳＨＭＴ
（０．１ｍｇ）の１００μｌの緩衝液による溶液と酵素
ブランク液とに添加した。インキュベーション時間の
０．５、１．０、２．０、４．０、６．０、１７．２
５、２５および５２時間毎に反応液の一部を採取し、Ｈ
ＰＬＣで試験した。主要生成物のピーク（Ｌ−エリトロ
形）が０．５時間以内にＴR２５分に現れ、２〜４時間
で最大になった。
（０．１ｍｇ）の１００μｌの緩衝液による溶液と酵素
ブランク液とに添加した。インキュベーション時間の
０．５、１．０、２．０、４．０、６．０、１７．２
５、２５および５２時間毎に反応液の一部を採取し、Ｈ
ＰＬＣで試験した。主要生成物のピーク（Ｌ−エリトロ
形）が０．５時間以内にＴR２５分に現れ、２〜４時間
で最大になった。
【００５０】実施例５ α−アミノ−β−ヒドロキシピメリン酸モノメチルエス
テル このインキュベーションに用いたグルタルセミアルデヒ
ドメチルエステルは、ＤＭＳＯを約１：１の重量比で含
有していた。このＤＭＳＯは、１−メトキシシクロペン
テンのオゾン分解によって前記アルデヒドを製造した際
に仕上げ処理にＤＭＳＯを用いたために生じた副生成物
である（Ｃline,Ｄ.Ｌ.Ｊ.，Ｒussel,Ｃ.Ｇ.，Ｔetrahe
dron、３６巻、１３９９頁、１９８０年）。グリシン
（２５．６ｍｇ、０．３４１mmol）とアルデヒド／ＤＭ
ＳＯ混合物（６６．７ｍｇ）を１０．０ｍｌの緩衝液に
溶解し、グリシンとアルデヒドの濃度をそれぞれ３１．
４ｍＭおよび約２５ｍＭにして基質溶液を調製した。
テル このインキュベーションに用いたグルタルセミアルデヒ
ドメチルエステルは、ＤＭＳＯを約１：１の重量比で含
有していた。このＤＭＳＯは、１−メトキシシクロペン
テンのオゾン分解によって前記アルデヒドを製造した際
に仕上げ処理にＤＭＳＯを用いたために生じた副生成物
である（Ｃline,Ｄ.Ｌ.Ｊ.，Ｒussel,Ｃ.Ｇ.，Ｔetrahe
dron、３６巻、１３９９頁、１９８０年）。グリシン
（２５．６ｍｇ、０．３４１mmol）とアルデヒド／ＤＭ
ＳＯ混合物（６６．７ｍｇ）を１０．０ｍｌの緩衝液に
溶解し、グリシンとアルデヒドの濃度をそれぞれ３１．
４ｍＭおよび約２５ｍＭにして基質溶液を調製した。
【００５１】酵素溶液は、１００μｌではなくて４０μ
ｌの緩衝液に溶解した０．１ｍｇのＳＨＭＴで構成され
ている。上記の基質溶液（４０μｌ）を、上記酵素溶液
とブランク溶液に添加し、通常どおりにインキュベート
した。インキュベート液の一部（１０μｌづつ）を０．
５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０および１
７．０の時間経過毎に採取した。ＨＰＬＣ分析の結果、
３０分間までに、所望の生成物に対応する２３．７分に
酵素によって生成したピークが現れ、積分した結果その
収率は約２０％であった。酵素で生成した第２の小さい
ピークが２２．３分の保持時間に現れたが、これは少量
のトレオ異性体に対応するものであろう。
ｌの緩衝液に溶解した０．１ｍｇのＳＨＭＴで構成され
ている。上記の基質溶液（４０μｌ）を、上記酵素溶液
とブランク溶液に添加し、通常どおりにインキュベート
した。インキュベート液の一部（１０μｌづつ）を０．
５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０および１
７．０の時間経過毎に採取した。ＨＰＬＣ分析の結果、
３０分間までに、所望の生成物に対応する２３．７分に
酵素によって生成したピークが現れ、積分した結果その
収率は約２０％であった。酵素で生成した第２の小さい
ピークが２２．３分の保持時間に現れたが、これは少量
のトレオ異性体に対応するものであろう。
【００５２】実施例６ α−アミノ−β−ヒドロキシ−γ−オキソ吉草酸 グリシン（２５．５ｍｇ、０．３４０mmol）とピルボア
ルデヒド（６１．１ｍｇ含有の４０重量％溶液、０．３
２７mmolピルボアルデヒド）を、１０ｍｌ緩衝液（ｐＨ
７．２）に溶解し、３４ｍＭ（グリシン）と３２．７ｍ
Ｍ（ピルボアルデヒド）の濃度の原液を製造した。メタ
バナジン酸ナトリウム（Ａldrich社製９０％純度の化合
物１．５ｍｇ）を添加した。約３０分後に、この化合物
は溶解し１．１１ｍＭの濃度になった。上記の基質溶液
８０μｌを、酵素溶液（８０μｌ中０．１ｍｇのＳＨＭ
Ｔを含有）に添加した。反応液の一部（１０μｌづつ）
を、０．５、１．０、２．０、３．０、５．０、２９お
よび５３時間のインキュベーション時間毎に取り出し
た。
ルデヒド（６１．１ｍｇ含有の４０重量％溶液、０．３
２７mmolピルボアルデヒド）を、１０ｍｌ緩衝液（ｐＨ
７．２）に溶解し、３４ｍＭ（グリシン）と３２．７ｍ
Ｍ（ピルボアルデヒド）の濃度の原液を製造した。メタ
バナジン酸ナトリウム（Ａldrich社製９０％純度の化合
物１．５ｍｇ）を添加した。約３０分後に、この化合物
は溶解し１．１１ｍＭの濃度になった。上記の基質溶液
８０μｌを、酵素溶液（８０μｌ中０．１ｍｇのＳＨＭ
Ｔを含有）に添加した。反応液の一部（１０μｌづつ）
を、０．５、１．０、２．０、３．０、５．０、２９お
よび５３時間のインキュベーション時間毎に取り出し
た。
【００５３】ＨＰＬＣでアミノ酸を分析した結果、保持
時間が、８．５分の新しいアミノ酸が現れた。これが所
望のアミノ酸であることを確認するために、標準のラセ
ミ物質を銅グリシナート法で製造した。したがって、
４．２３ｇの銅（ＩＩＩ）グリシナート（２００mmol）
を９ＭＮａＯＨ水溶液１０ｍｌに溶解した。ピルボアル
デヒド（４０重量％水溶液１６．２ｍｌ、アルデヒドの
７．０ｇ、９．７１ｍｍｏｌに相当する）を添加した。
５．２５時間後、生成した褐色溶液に、３ＭＮＨ４０Ｈ
（４０ｍｌ）を添加し、溶媒を蒸発して褐色油状物を得
た。この油状物をＤｏｗｅｘ−５０のカラム（+ＮＨ
4形）を通過させ、水で溶離して、半精製アミノ酸を得
た。
時間が、８．５分の新しいアミノ酸が現れた。これが所
望のアミノ酸であることを確認するために、標準のラセ
ミ物質を銅グリシナート法で製造した。したがって、
４．２３ｇの銅（ＩＩＩ）グリシナート（２００mmol）
を９ＭＮａＯＨ水溶液１０ｍｌに溶解した。ピルボアル
デヒド（４０重量％水溶液１６．２ｍｌ、アルデヒドの
７．０ｇ、９．７１ｍｍｏｌに相当する）を添加した。
５．２５時間後、生成した褐色溶液に、３ＭＮＨ４０Ｈ
（４０ｍｌ）を添加し、溶媒を蒸発して褐色油状物を得
た。この油状物をＤｏｗｅｘ−５０のカラム（+ＮＨ
4形）を通過させ、水で溶離して、半精製アミノ酸を得
た。
【００５４】実施例７ α−アミノ−β−ヒドロキシ−６−ホルミルオキシヘキ
サン酸 このインキュベーションに用いたアルデヒドにも、ジヒ
ドロピランをオゾン分解し次いでＤＭＳＯで後処理する
ことによってアルデヒドを製造したことからかなりの量
のＤＭＳＯが残留していた。１０．０ｍｌの緩衝液に、
０−ホルミル４−ヒドロキシブタナール（３９．５ｍ
ｇ、約０．２０mmol、ＤＭＳＯを考慮した）とグリシン
（２５．５ｍｇ、０．３４０mol）を添加した。
サン酸 このインキュベーションに用いたアルデヒドにも、ジヒ
ドロピランをオゾン分解し次いでＤＭＳＯで後処理する
ことによってアルデヒドを製造したことからかなりの量
のＤＭＳＯが残留していた。１０．０ｍｌの緩衝液に、
０−ホルミル４−ヒドロキシブタナール（３９．５ｍ
ｇ、約０．２０mmol、ＤＭＳＯを考慮した）とグリシン
（２５．５ｍｇ、０．３４０mol）を添加した。
【００５５】上記の基質溶液（４０μｌ）を、酵素溶液
（４０μｌ中０．１ｍｇのＳＨＭＴを含有）とブランク
溶液に添加した。インキュベーション混合物中の２つの
基質の濃度は１７ｍＭ（グリシン）と１０ｍＭ（アルデ
ヒド）であった。上記混合物の一部（１０μｌづつ）
を、インキュベーション時間の０．５、１．０、２．
０、３．０、７．０および２４時間毎に採取した。
（４０μｌ中０．１ｍｇのＳＨＭＴを含有）とブランク
溶液に添加した。インキュベーション混合物中の２つの
基質の濃度は１７ｍＭ（グリシン）と１０ｍＭ（アルデ
ヒド）であった。上記混合物の一部（１０μｌづつ）
を、インキュベーション時間の０．５、１．０、２．
０、３．０、７．０および２４時間毎に採取した。
【００５６】０．５時間のインキュベーション時間で最
初に採取した混合物から、アミノ酸分析の結果２つの新
しいアミノ酸が認められた。グリシンのピークのすぐ
後、保持時間１５．６分に小さなピークが現れた。もう
一つのピークは保持時間２２．５分の明確な大きなピー
クであった。３時間までに、予想されたアミノ酸に対す
る２２．５分におけるピークがグリシンの約１０％の最
大値に到達し、ついで徐々に減少し、一方１５．６分に
おけるピークはわずかに強度を増大した。１５．６分で
溶出するアミノ酸は、反応媒体中のギ酸エステルが徐々
に加水分解して生成した生成物である。その構造はα−
アミノ−β−ヒドロキシ−６−ヒドロキシヘキサン酸に
一致している。
初に採取した混合物から、アミノ酸分析の結果２つの新
しいアミノ酸が認められた。グリシンのピークのすぐ
後、保持時間１５．６分に小さなピークが現れた。もう
一つのピークは保持時間２２．５分の明確な大きなピー
クであった。３時間までに、予想されたアミノ酸に対す
る２２．５分におけるピークがグリシンの約１０％の最
大値に到達し、ついで徐々に減少し、一方１５．６分に
おけるピークはわずかに強度を増大した。１５．６分で
溶出するアミノ酸は、反応媒体中のギ酸エステルが徐々
に加水分解して生成した生成物である。その構造はα−
アミノ−β−ヒドロキシ−６−ヒドロキシヘキサン酸に
一致している。
【００５７】実施例８ β−フェニルセリン 使用した緩衝液のＰＬＰの濃度は、８０μＭの代わりに
１６０μＭとした。ベンズアルデヒドを使用直前に蒸留
した。緩衝溶液は、基質を添加する前に窒素をバブリン
グさせて脱酸素を行った。この操作は、ベンズアルデヒ
ドが溶液中で酸化するのを最小限にするためである。
１６０μＭとした。ベンズアルデヒドを使用直前に蒸留
した。緩衝溶液は、基質を添加する前に窒素をバブリン
グさせて脱酸素を行った。この操作は、ベンズアルデヒ
ドが溶液中で酸化するのを最小限にするためである。
【００５８】１０．０ｍｌの緩衝液に、グリシン（２
５．４ｍｇ、０．３３８mmol）とベンズアルデヒド（３
５μｌ、０．３４４mmol）を溶解した。この溶液（１０
０μｌ）をＳＨＭＴ溶液（０．１ｍｇ酵素）１００μｌ
に添加した。溶液の一部を、１．０、５．２５および
７．０時間のインキュベーション時間毎に採取した。
５．４ｍｇ、０．３３８mmol）とベンズアルデヒド（３
５μｌ、０．３４４mmol）を溶解した。この溶液（１０
０μｌ）をＳＨＭＴ溶液（０．１ｍｇ酵素）１００μｌ
に添加した。溶液の一部を、１．０、５．２５および
７．０時間のインキュベーション時間毎に採取した。
【００５９】２つの生成物のピークがクロマトグラムに
認められた。即ち、２４．８分における大きい方のピー
クと２３．７分における小さいほうのピークである。こ
の実験で得た生成物の混合物を、市販されている標準の
ラセミ体のβ−フェニルセリンと比較した。また標準の
トレオβ−フェニルセリンと同時注入することによって
比較したところ、早い方（小さい方）のピークは、遅い
方のピークに対して増大した。これらの結果は、酵素が
芳香族アミノ酸の鏡像異性体の両方の対を生成している
が、エリトロ異性体の方が優先することを示している。
認められた。即ち、２４．８分における大きい方のピー
クと２３．７分における小さいほうのピークである。こ
の実験で得た生成物の混合物を、市販されている標準の
ラセミ体のβ−フェニルセリンと比較した。また標準の
トレオβ−フェニルセリンと同時注入することによって
比較したところ、早い方（小さい方）のピークは、遅い
方のピークに対して増大した。これらの結果は、酵素が
芳香族アミノ酸の鏡像異性体の両方の対を生成している
が、エリトロ異性体の方が優先することを示している。
【００６０】実施例９ α−アミノ−β−ヒドロキシ−β−（２−フリル）プロ
ピオン酸 この実施例で用いた２−フルフラールは、炭酸ナトリウ
ム上での２回の蒸留（但し２回目の蒸留は窒素雰囲気下
で行った。）によって調製した。蒸留したアルデヒド
は、脱水し、窒素雰囲気下におき、光から保護して、使
用するまで貯蔵した。
ピオン酸 この実施例で用いた２−フルフラールは、炭酸ナトリウ
ム上での２回の蒸留（但し２回目の蒸留は窒素雰囲気下
で行った。）によって調製した。蒸留したアルデヒド
は、脱水し、窒素雰囲気下におき、光から保護して、使
用するまで貯蔵した。
【００６１】グリシン（１４．０ｍｇ、０．１８６mmo
l）とフルアルデヒド（１５．５μｌ、０．１８７mmo
l）を緩衝液（１０．０ｍｌ）に溶解して基質溶液を調
製した。この溶液３６０μｌを酵素溶液（４０μｌ中
０．２ｍｇのＳＨＭＴを含有している）に添加して各基
質の濃度を１７ｍＭにした。試料の一部（１０μｌづ
つ）を１．０、２．０、４．０、５．０、１８、２４、
７２および１１４時間毎に採取した。ＨＰＬＣで測定し
たところ、１時間以内に２つの新しいアミノ酸が生成し
ていた。一方の異性体に対応する大きい方のピークは保
持時間が２１〜２２分で、他方の（トレオ形）異性体に
対応する小さい方のピーク（大きい方のピークの５０％
より小さい）は保持時間が１９〜２０分であった。
l）とフルアルデヒド（１５．５μｌ、０．１８７mmo
l）を緩衝液（１０．０ｍｌ）に溶解して基質溶液を調
製した。この溶液３６０μｌを酵素溶液（４０μｌ中
０．２ｍｇのＳＨＭＴを含有している）に添加して各基
質の濃度を１７ｍＭにした。試料の一部（１０μｌづ
つ）を１．０、２．０、４．０、５．０、１８、２４、
７２および１１４時間毎に採取した。ＨＰＬＣで測定し
たところ、１時間以内に２つの新しいアミノ酸が生成し
ていた。一方の異性体に対応する大きい方のピークは保
持時間が２１〜２２分で、他方の（トレオ形）異性体に
対応する小さい方のピーク（大きい方のピークの５０％
より小さい）は保持時間が１９〜２０分であった。
【００６２】実施例１０ α−アミノ−β−ヒドロキシ−δ−（２−フリル）吉草
酸 グリシン（２５．５ｍｇ、０．３４０mmol）とアルデヒ
ド（４６．３ｍｇ、０．３７３mmol）を１０．０ｍｌの
緩衝液に溶解することによって基質溶液を作製した。ア
ルデヒド（液体）は溶解するのに約１５分かかった。
酸 グリシン（２５．５ｍｇ、０．３４０mmol）とアルデヒ
ド（４６．３ｍｇ、０．３７３mmol）を１０．０ｍｌの
緩衝液に溶解することによって基質溶液を作製した。ア
ルデヒド（液体）は溶解するのに約１５分かかった。
【００６３】得られた基質溶液（１００μｌ）を酵素溶
液（１００μｌの緩衝液中０．１ｍｇのＳＨＭＴを含
有）に添加し、３７℃でインキュベートした。０．５
５、１．０、２．０、４．２５、８．０および２１時間
毎に試料液の一部採取した。ＨＰＬＣ分析で保持時間２
１．３分のピークが０．５時間以内に現れたが、これは
グリシンがアルドール生成物に約３％変換したことを示
す。
液（１００μｌの緩衝液中０．１ｍｇのＳＨＭＴを含
有）に添加し、３７℃でインキュベートした。０．５
５、１．０、２．０、４．２５、８．０および２１時間
毎に試料液の一部採取した。ＨＰＬＣ分析で保持時間２
１．３分のピークが０．５時間以内に現れたが、これは
グリシンがアルドール生成物に約３％変換したことを示
す。
【００６４】実施例１１ プロパルギルアルデヒドを用い前記実施例に記載したイ
ンキュベーション法に従ってα−アミノ酸−β−ヒドロ
キシヘキシン（５）酸が得られる。
ンキュベーション法に従ってα−アミノ酸−β−ヒドロ
キシヘキシン（５）酸が得られる。
【００６５】実施例１２ 前記実施例に記載したインキュベーション条件下でアリ
ルアルデヒドを用いてα−アミノ−β−ヒドロキシヘキ
セン（５）酸が得られる。
ルアルデヒドを用いてα−アミノ−β−ヒドロキシヘキ
セン（５）酸が得られる。
【００６６】実施例１３ 前記実施例に記載した方法と条件にしたがってアクロレ
インを用いて、α−アミノ−β−ヒドロキシ−ペンテン
（４）酸が生成される。
インを用いて、α−アミノ−β−ヒドロキシ−ペンテン
（４）酸が生成される。
【００６７】実施例１４ β−シアノプロピオンアルデヒドを用いて、前記実施例
の条件下でα−アミノ−β−ヒドロキシ−δ−シアノ吉
草酸が生成される。
の条件下でα−アミノ−β−ヒドロキシ−δ−シアノ吉
草酸が生成される。
Claims (10)
- 【請求項１】 式：ＲＣＨＯ（式中、Ｒは下記定義と同
一）で示されるアルデヒド、およびグリシンを、ピリド
キサール ５'−リン酸の存在下、セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼと、約５．５〜約９のpＨの水溶
液中で約３０℃〜５５℃の温度で混合することからなる
以下の式（１）： 【化１】 （式中、Ｒは、Ｃ2−Ｃ6 アルケニル；Ｃ2−Ｃ6 アルキ
ニル；エステル化カルボキシル基、Ｃ1−Ｃ4 アルコキ
シ、フッ素、塩基、臭素、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ1−
Ｃ4 アルカノイルオキシ、フェニル、フリル、もしくは
ベンジルオキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキル；フェ
ニル；またはフリル）で表されるβ−ヒドロキシ−α−
アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２】 ＲがＣ2−Ｃ6 アルケニル；Ｃ2−Ｃ6 ア
ルキニル；またはエステル化カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4 ア
ルカノイルオキシ、もしくはアリールアルコキシで置換
されたアルキルで置換されＣ1−Ｃ6 アルキルである請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 Ｒがエステル化カルボキシもしくはＣ1
−Ｃ4 アルカノイルオキシで置換されたＣ1−Ｃ4 アル
キルである請求項１記載の方法。 - 【請求項４】アルデヒドＲＣＨＯが、以下の式： 【化２】 （式中、Ｒ1はＣ1−Ｃ4 アルキル、ベンジル、ジフェニ
ルメチル、４−メトキシベンジルまたは４−ニトロベン
ジルであり、ｎは２または３である）で表される請求項
１記載の方法。 - 【請求項５】 アルデヒドＲＣＨＯがスクシンセミアル
デヒドメチルエステルである請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 アルデヒドＲＣＨＯがグルタルセミアル
デヒドメチルエステルである請求項４ 記載の方法。 - 【請求項７】 Ｒがエステル化カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4
アルカノイルオキシ、フェニル、フリルもしくはベンジ
ルオキシで置換されたＣ1−Ｃ6 アルキルである請求項
１記載の方法。 - 【請求項８】 β−ヒドロキシ−α−アミノ酸がＬ−エ
リトロジアステレオマーである請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−エリトロジアステレオマー形の下記
式： 【化３】 （式中、Ｒ1とＲ1’は独立して、水素またはＣ1−Ｃ4
アルキル、ベンジル、４−メチルベンジル、４−ニトロ
ベンジルまたはジフェニルメチル）で表される化合物、
およびそのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アン
モニウム塩およびアミン塩；ならびにＲ1とＲ1’がとも
に水素の場合の酸付加塩。 - 【請求項１０】 Ｒ1がＣ1−Ｃ4 アルキルである請求項
９記載の化合物。
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=24123416
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| DE (1) | DE69124143T2 (ja) |
| DK (1) | DK0460883T3 (ja) |
| ES (1) | ES2099135T3 (ja) |
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| GR (1) | GR3022558T3 (ja) |
| HU (1) | HU212925B (ja) |
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| IL (1) | IL98312A0 (ja) |
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| JP4032441B2 (ja) * | 1995-08-30 | 2008-01-16 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
| CN1062603C (zh) * | 1996-01-31 | 2001-02-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 酶法生产d－对羟基苯甘氨酸的膜反应方法 |
| CA2234412C (en) * | 1997-06-09 | 2008-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing optically active compound |
| JP4456876B2 (ja) | 2002-04-26 | 2010-04-28 | 中国石油化工股▲分▼有限公司 | ダウンフロー接触分解反応器およびその応用 |
| DE102007020246B4 (de) | 2007-04-24 | 2012-12-27 | Schott Ag | Metallkolloidgefärbte oder farblose Glaskeramik und in eine metallkolloidgefärbte oder farblose Glaskeramik umwandelbares farbloses Glas |
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| CN114657221A (zh) * | 2020-12-22 | 2022-06-24 | 安徽华恒生物科技股份有限公司 | 一种d-泛酸的制备方法 |
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- 1991-05-30 NZ NZ238342A patent/NZ238342A/en unknown
- 1991-05-30 IL IL98312A patent/IL98312A0/xx unknown
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- 1991-05-31 FI FI912626A patent/FI912626A7/fi not_active Application Discontinuation
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- 1991-06-03 ZA ZA914201A patent/ZA914201B/xx unknown
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