JPH09508353A - 分子多様性の合成及びスクリーニング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多様な分子生成物を基体上で効率的に合成するための装置及び方法。親容器（２００）は、基体の懸濁液を含む。懸濁液は、アルゴンを用いて圧力がかけられ、そして、１以上の反応容器バンク中の複数の反応容器（２０１〜２０９）へと送られ、そこでモノマー付加反応が起こる。任意的に、基体はタグモノマーを用いてタグが付与されうる。ボルテックスモーター（３００）は、モノマー付加反応の間反応容器の内容物を撹拌して合成を高める。所望のモノマー及び／又はタグモノマーの付加反応の後、懸濁物は、アルゴンを用いて圧力がかけられそして混合のために親容器（２００）に戻される。その後、懸濁物は、アルゴンを用いて圧力がかけられ、そして、更なる合成のために反応容器（２０１〜２０９）中に再配分されうる。

Description

【発明の詳細な説明】 分子多様性の合成及びスクリーニング 関連出願 本出願は、米国特許出願シリアル番号第08/146886号明細書及び第08/149675号 明細書（これらは共に、1993年11月２日に出願された。）の一部係属出願であり 、これらは全ての目的のために引用することにより本明細書の一部を成す。 著作権に関する通知 本明細書及び請求の範囲の開示のある部分は、著作権による保護を受けるもの を含む。著作権の権利者は、特許商標庁のファイル及び記録に表れる特許書類又 は特許の開示のいずれかによる複製に対して異議を申さないが、それ以外のもの に対する全ての著作権は保有している。 発明の分野 本発明は、一般に、種々の分子の非常に大きなコレクションを合成するための 、及びこのようなコレクションから有用な及び所望の活性を有する化合物を同定 及び単離するための方法及び装置に関する。本発明はまた、所望の性質を有する 化合物の同定を容易にするためにこのようなコレクション中に同定タグを導入す ることに関する。 発明の背景 巨大分子リセプターに対するリガンドは、分子生物学又は合成化学の技術のい ずれかを通じて製造されたペプチドの多様なコレクションをスクリーニングする ことにより同定されうる。組み換えペプチドライブラリーは、変性のオリゴヌク レオチドを、フィラメント性のバクテリオファージのカプシド蛋白質及びＤＮＡ 結合蛋白質 Ｌａｃ Ｉ．をエンコードする遺伝子中に挿入することにより製造 された（Cwirlaら，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382；Scottと Smith，1990，Science 249:386-390；Devlinら，1990，Science 249:404-406；C ullら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869；及びＰＣＴ公開番号 WO 91/17271，WO 91/19818，WO 93/08278号公報、これらは各々、引用すること により本明細書の一部をなす。これらのランダムなライブラリーは、10⁹より多 くの種々のペプチドを含み得り、各々は、それをエンコードする遺伝物質に物理 的に連結された巨大な蛋白質の配列に融合されている。このようなライブラリー は、数回のアフィニティー精製により、レセプターとの相互作用について効率よ くスクリーニングされ、選択されたエクスポジション（exposition）又はディス プレイベクターがE.coli中で増幅され、そしてレセプター結合に関するペプチド 応答の同一性を明らかにするために個々のクローンのＤＮＡが配列決定される。 また、ＰＣＴ公開番号 WO 91/05058及び WO 92/02536号公報を参照。 ペプチド又は他の分子ライブラリーを製造するための化学的アプローチは、ち ょうど２０の遺伝的にコードされたアミノ酸を用いた合成に限定されない。天然 にないアミノ酸及び他の分子構築ブロックを含有するために、構築ブロックセッ トを拡大することにより、利用できる配列及び構造の多様性が、劇的に増加する 。合成分子ライブラリーを創造するために記述された戦略のいくつかにおいて、 反応生成物は空間的に分離され、そして個々のライブラリーメンバーの同一性が 、合成の性質によって明白に規定される。Geysenら，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；Geysenら，1986，Synthetic Peptides as Antigens；C iba Foundation Symposium 119，Porter，R．と Wheelan，J．編（Wiley，New Y ork）pp.131-146；Fodorら，1991，Science 251:767-773；米国特許第5143854号 明細書；及びＰＣＴ公開 WO 84/03564; 86/00991; 86/06487; 90/15070及び 92/ 10092 号公報参照（これらの各々、引用することにより本明細書の一部をなす） 。 ３千万より多くの可溶性ペプチドのライブラリーは、マルチペプチド合成の「 ティーバッグ」法により調製される。Houghten，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135;及び米国特許第4631211号明細書参照（これらは各々引用す ることにより、本明細書の一部を成す）。各ライブラリーが合成され、そして、 配列内の個々のアミノ酸が明確に規定されているところの変性のペプチド混合物 としてスクリーニングされる。スクリーニング（例えば、競 合結合アッセイ）及び再合成の反復操作が、これらの混合物を分画し、そしてラ イブラリー内の最も活性なペプチドを定義するために用いられる。Houghtenら， 1991，Nature 354:84-86; Pinilla ら，1992，Peptide Research 5:351-358; Bl ake，J．と Litzi-Davis，1992，Bioconjugate Chem. 3:510-513;及びＰＣＴ公 開 WO 92/09300公報参照（これらの各々は、引用することにより本明細書の一部 である）。 Furkaら，1988，Abstr. 14th Int. Congr. Biochem.，Prague，Czech．5:47（ また、Furkaら，1991，Int J.Peptide Protein Res. 37:487-493；及びSebestye nら，1993，Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:413-418参照）のスピリット合成方法 を用いて、ラムと共同研究者らは、直径１００〜２００μｍの樹脂ビーズに付着 された約10⁶のペプチドを含むライブラリーを調製した。Lam ら，1991，Nature 354 :82-84；Lam ら，1993，Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:419-424；及びＰＣＴ 公開 WO92/00091公報参照（これらは各々、引用することにより本明細書の一部 をなす）。ビーズライブラリーは、標識されたレセプターと共に温置されること によりスクリーニングされ、レセプターに結合したビーズは、視察により同定さ れ、そしてマイクロマニュピレーターを用いて選択される。各ビーズは、５０〜 ２００ｐｍｏｌの単一のペプチド配列を含有しており、該配列は、エドマン分解 又は質量スペクトル分析のいずれかにより、直接的に決定されうる。原則として 、 ビーズの容積を減少することにより、このアプローチを用いて大きな多様性のラ イブラリーが作製できる。しかしながら、ペプチド配列決定技術の感受性は、約 １ｐｍｏｌまでに限られ、このことは、直接ペプチド配列決定分析の範囲に明ら かな限界を定めている。更に、いずれの分析方法も、ライブラリー構築セットが 、Ｄ−或いは他の天然にないアミノ酸、又は他の化学構築ブロックを含むように 拡大された場合は、直接のそして一義的な配列分析は提供できない。 化学的に合成された分子及び天然の生成物の（例えば、微生物の発酵肉汁とし ての）コレクションの高処理量のスクリーニングは、伝統的には、新たな医薬の 開発をリードする化合物の検索において中心的な役割を果たしてきた。分子多様 性を作製する及び評価するための、化学とそれに付随する技術の組み合わせにお ける興味の大きな波は、薬剤の発見のこのパラダイムの発展における意味ある試 金石である。Paviaら，1993，Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:387-396参照（これ は引用することにより本明細書の一部をなす）。現在まで、ペプチド化学は、リ ガンド同定において、組み合わせられる方法の利用を開発するための根本の手段 であった。Jung & Beck-Sickinger，1992，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31:36 7-383参照（これは引用することにより本明細書の一部をなす）。このことは、 アミノ酸モノマー、関係する属の、高収率の固相カップリング化学及び組み換え ペプチドライブラリーを作製す るための生物学的アプローチを伴った共同作業の、大きなかつ構造的に多様な範 囲の有用性に帰せらるかもしれない。更に、多くの低分子量ペプチドの効力及び 特異的な生物活性は、これらの分子を、医薬発見のための開始点として魅力ある ものにする。Hirschmann，1991，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1278-1301及 びWiley と Rich，1993，Med. Res. Rev. 13:327-384参照（これらは各々、引用 することにより本明細書の一部を成す）。しかしながら、好ましくない薬力学特 性、例えば、劣等な経口での生物学的利用能及びインビボでの急なクリアランス は、薬剤としてのペプチド性化合物のより広範囲での開発を制限する。この理解 は、最近、ペプチド化学を越えた組み合わせの有機合成の概念を、ベンゾジアゼ ピンのような公知のファーマコフォア（Bunin & Ellman，1992，J. Amer. Chem. Soc. 114:10997-10998 参照、これは引用することにより本明細書の一部をなす ）、並びに、ポリマー分子、例えば、オリゴマー性Ｎ−置換グリシン（「ペプト イド）」及びオリゴカルバメートのライブラリーの作製へと広げることを研究者 に促した。Simonら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371；Zucker mannら，1992，J. Amer. Chem. Soc. 114:10646-10647；及びChoら，1993，Scie nce 261:1303-1305参照（これらは各々引用することにより本明細書の一部を成 す）。 有用な化合物を同定すること又はリード化合物の特性を改善することに対して 分子の巨大なライブラリーが有する 大きな価値にも拘わらず、このようなライブラリー、特には巨大ライブラリーの スクリーニングの困難性は、例えば、薬剤発見及び開発のコストを減少するよう なライブラリーへ衝撃的にアクセスすることを制限している。その結果、ライブ ラリーの各メンバーが化合物の同定を容易にするために独特の同定タグを付けて いる（ＰＣＴ公開 WO 93/06121参照、これは引用することにより本明細書の一部 をなす、また米国特許シリアル番号第946239号明細書（1992年９月16日出願）及 び第762522号明細書（1991年９月18日出願）参照、これらは引用することにより 本明細書の一部を成す）、分子のライブラリーを作製及びスクリーニングするた めの方法の開発が、非常に望まれている。その方法においては、化学合成方法、 典型的には樹脂ビーズ上での結合合成の製造物が、合成における各カップリング 又は他の生成物製造反応工程と同時の、ビーズへの同定タグの連結により、明確 に特定化される。各タグは、目的の反応工程中に何が起こったか、例えばどのア ミノ酸モノマーがペプチド合成反応の特定の工程においてカップリングされたか を特定する。いずれのビーズ上の化合物の構造又は同一性、例えば、ペプチド配 列も、該ビーズ上のタグのセットを読むことにより推論されうる。理想的には、 このようなタグは、多くの情報量を有して、非常に高い感受性での検出及び解読 に基づいて分析でき、そして合成において用いられる試薬に対して安定である。 オリゴヌクレオチド−エンコードされた化学合成の考えはまた、BrennerとLerne r， 1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5181-5183（これは引用することにより 本明細書の一部を成す）によって提案されている。 エンコード法は、直交的に差別をつけられたジアミンリンカーから始めて、並 列の組み合せ合成が、「結合」鎖及び「コード」鎖を含む可溶性キメラペプチド のライブラリーを作製するために用いられ得る。Kerrら，1993，J. Amer. Chem. Soc. 115:2529-2531（これは引用することにより本明細書の一部を成す）参照 。天然の又は天然にないアミノ酸モノマーの結合鎖へのカップリングは、「コー ド」鎖上の４つのＬ−アミノ酸からなるアミノ酸コードを構築することにより記 録される。化合物は、レセプター上のアフィニティー精製により、等モルのペプ チド混合物から選ばれ、そしてＨＰＬＣにより分析される。次いで、各精製され た分子のコード鎖の配列は、エドマン分解により決定されて、結合鎖の構造が明 らかとなる。類似のペプチド性のコード概要はまた、Nikolaievら，1993，Pepti deResearch 6:161-170によって最近報告された。 エドマン法の感度及び処理量の制約は、限定された多様性のライブラリーを分 析するための、エンコード法のこの観点の範囲を極端に制限するであろう。オリ ゴヌクレオチドタグの使用は、より大きな見込みを提供するが、オリゴヌクレオ チドのタグが付けられた分子ライブラリーを合成するための改善された方法が必 要とされている。更に、非常に大きなタグが付けられた分子ライブラリーの合成 及び スクリーニングのための他の方法論の必要性がまだ存在する。 複数の固体支持体、例えばビーズ上で多様な分子のコレクションを合成するこ とが望まれている場合は、更なる問題が提起されうる。その上で多様な分子製造 物が合成されるビーズの使用の例は、例えば、以下の出願の中に開示されており 、それらは、全ての目的において、引用することにより本明細書の一部を成す。 米国特許出願シリアル番号07/876792号明細書（1992年４月29日出願）、米国特 許出願シリアル番号第07/762522号明細書（1991年９月18日出願）及び米国特許 出願シリアル番号第07/946239号明細書（1992年９月16日出願）。 実質的な成功を得ている一方、上記の技術はまた、ある種の限定を受けている 。例えば、多様な生成物の合成がビーズ上で行われた場合、このようなビーズの 多くの手動操作が必要となる。例えば、米国特許出願シリアル番号第07/876792 号明細書（1992年４月29日出願）（これはすべての目的のために引用することに より本明細書の一部を成す）では、担体中でビーズのコレクションを懸濁し、ビ ーズを分け、ビーズの分けられたセット上でモノマーの付加反応を行い、このよ うにして合成されたビーズをときどき再分割し、そして選択的に再び組み合わせ 、再び組み合わせたビーズを混合し、そしてこの操作を繰り返す。大きな数のモ ノマーが含有されかつ反応が多くのモノマー付加工程を含む場合は、手操作が極 端に単調で退屈なものにな る。加えて、合成された多くの製造物の「集計」が、気力をそぐ作業となる。 上記より、非常に大きなタグが付けられた分子ライブラリーを合成及びスクリ ーニングするための改善された方法及び装置が望まれていることが判る。本発明 は、これらの及び他の要求を満たす。 発明の概要 本発明は、ライブラリー中の個々の分子に、特有の容易に解読される同定タグ が付けられているところの、分子ライブラリーを作製及びスクリーニングするた めの改善された方法を提供する。また、多様な分子生成物を迅速かつ効率的に合 成する装置及び方法が提供される。 一つの実施態様において、本発明は、エンコードされた合成化学ライブラリー を作製するための、組み合わせ化学プロセスの生成物にタグを付けるための方法 及び試薬を提供する。重要な実施態様において、本発明は、変更できかつ互換性 のある合成方法を通じて、微細なビーズ上でペプチド及びオリゴヌクレオチド合 成を行うための方法を提供する。この組み合わせ合成により製造された、大きな オリゴヌクレオチド−エンコードされた合成ペプチドライブラリーは、多くのビ ーズからなり、該ビーズの各々は、単一のペプチド（規定された配列を有してい る）の及び、その配列が人工的にかつ一義的に、関連するペプチドの構造をコー ドする一本鎖ＤＮＡタグの多くのコピー含む。ライブ ラリーは、フローサイトメトリーにより、蛍光標識された生物学的レセプターと の相互作用について効率的に調査されることができ、そして個々のビーズは、単 一のビーズをソートするためのＦＡＣＳ装置の能力を利用することにより選択さ れることができる。ソートされたビーズ上のＤＮＡタグは、ＰＣＲにより増幅さ れ、そしてエンコードされたペプチドリガンドの構造を決定するために配列決定 される。ライブラリーは、例えば、レセプター、例えば、抗ペプチドモノクロー ナル抗体に対する高い親和性（ナノモールレベルの）のリガンドを見つけるため に用いられ得る。 本発明の合成分子ライブラリーは、複数の固体支持体の各々の上で化合物を合 成すること（化合物は、固体支持体が異なれば異なる）により製造されることが できる。化合物は、以下の工程を含むプロセスにて合成される。（ａ）支持体を 複数の反応容器間で、確率論的方法により配分する工程、（ｂ）最初の化学構築 ブロックに各反応容器中の支持体をさらす工程、（ｃ）支持体をプールする工程 、（ｄ）支持体を確率論的方法により複数の反応容器間で配分する工程、（ｅ） 化学構築ブロックに、各反応容器中の支持体をさらす工程、及び（ｆ）工程（ａ ）〜（ｅ）を少なくとも１〜２０回繰り返す。典型的には、実質上等数の固体支 持体が、各反応容器中に配分される。この方法の一つの実施態様において、化学 構築ブロックが、アミノ酸のセットから選ばれ、そして得られた化合物はペプチ ドオリゴマーである。 特には、本発明は、このような方法に関連するカップリング化学におけるある 種の改善に関する。このような改善は、このような合成において、ビーズ、リン カー又は伸長するペプチド鎖のα−アミノ基からＦｍｏｃ保護基を除くために用 いられる化学に関する。好ましくは、このような除去は、５〜１５％、好ましく は１０％のピペリジンを用いた、５〜６０分間、好ましくは５〜１０分間の処理 によりもたらされるけれども、他の条件、例えば１５〜３０％のピペリジンで５ 〜３０分間も用いられ得る。他の改善は、ペプチドカップリング反応の活性化化 学に関し、そこでは、ある自動化された装置が、オリゴヌクレオチドのタグが付 けられたペプチドライブラリーの合成を行うために用いられた場合、本発明は、 試薬の供給ボトルを減らすために、ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵの単純な混合物を提供す る。 他の観点において、本発明は、タグが付与された分子ライブラリーを合成する 方法において、ライブラリー中の各分子が、共有結合的に固体支持体に付けられ 、そしてそれが、１以上の異なった化学的に不活性な炭化水素タグを用いてタグ が付与され、ここで、該タグは種々の炭化水素領域及び分子フックを含むところ の、分子ライブラリーの合成方法に関する。好ましくは、このようなタグは、該 タグを該固体支持体につけている切断可能なリンカー、分子フック、及び該切断 可能なリンカーに該分子フックを連結している種々の長さの炭化水素鎖を含む。 該タグが式： （ここで、ｎは１〜１０又はそれ以上であり、Ｘは切断可能なリンカーでありそ してＲは、分子フックである） を含む実施態様が更に好ましい。このような分子フックは、好ましくは、ビオチ ン、高度会合ペプチドペアの補足物、及び保護された活性化しうる基、例えば、 光活性化できる基からなる群より選ばれる。好ましい切断可能なリンカーは、光 で切断可能なリンカーである。 また、このような化学的に不活性である炭化水素タグの存在を検出する方法が 提供される。該方法は、１以上の異なったタグを固体支持体から切断すること、 引き続き第二の固体支持体にタグを固定化することを含む。次いで、固定化され たタグは、オリゴヌクレオチド配列を用いて処理され、それによってオリゴヌク レオチド配列は、固定化されたタグに選択的に結合する。その後、オリゴヌクレ オチド配列は増幅され、そしてその存在が検出され、ここで、オリゴヌクレオチ ド配列の存在又は非存在は、タグの存在又は非存在の指標となる。 本発明の他の実施態様は、化学的に不活性な炭化水素タグを用いてタグが付与 されたタグ付き分子ライブラリー中の、固体支持体に付けられた合成された分子 について合成工程の順序を決定する方法を提供する。該方法は、該固体支持体上 の１以上の種々のタグの存在を個々に検出することを含み、該個々のタグの存在 又は非存在は、該分子の合成における特定の合成段階の出現の指標である。 他の観点において、本発明は、慣用のフローサイトメト リー装置で分離されるにはあまりに小さいビーズ上で、エンコードされた合成化 学ライブラリーを合成するための方法及び装置に関する。このような小さなビー ズは、得られるライブラリーサイズを、ビーズに基づくライブラリーについてか なり典型的な範囲である10⁹〜10¹³から、ビーズを用いないライブラリーについ て10¹⁸メンバーというサイズまで上げること可能とする。本発明はまた、このよ うなライブラリーのスクリーニング方法に関する。 本発明はまた、有用な化合物を同定するために、エンコードされた合成ライブ ラリーをスクリーニングする方法に関する。一つの重要な観点において、本発明 は、有用な活性を有する化合物を特徴付けしそして同定するために、天然の生成 物ライブラリーを作製し、タグを付与し、及びスクリーニングするための方法に 関する天然の生成物スクリーニングの分野にて重要な前進を提供する。 他の観点において、本発明は、本発明の分子ライブラリーからの化合物のプー ルを迅速かつ効率的に同定するための改善された方法に関する。この方法におい て、所望の特性（例えば、レセプターへの結合）を示すタグが付与された化合物 のプールからのオリゴヌクレオチドタグは、コンカテマー化されそして、単一の 配列決定反応において多くのタグを配列決定することを容易にするためにクロー ン化される。もしタグが付与された化合物がペプチドであり、そしてゲノムのコ ードに基づいたエンコード化機構が用いられた場合は、その時は、ペプチドの更 なる分析のた めに、コンカテマーからの個々のタグを、他の選択及び発現系、例えば、上記の 背景の章において記載した、プラスミド及びファージに基づく系へとサブクロー ン化できる。 他の実施態様において、本発明は、多様な分子生成物を迅速かつ効率的に合成 するための装置及び方法を提供する。本発明の特定の観点に従って、多様なポリ マーが、基体、例えばガラスビーズ上で合成される。任意的に、ビーズは、合成 反応の間に、分子タグで、同時にタグが付与されうる。単に例として、ビーズ上 で合成された分子はペプチドを含むことができ、一方、分子タグはオリゴヌクレ オチドを含みうる。もちろん、分子が、他の関連する分子に共通の基本的な「構 築ブロック」を有する限り、他の分子生成物もまた、本明細書中に記載の技術を 用いて合成されうる。例は、ベンゾジアザピン、プロスタグランジン及びベータ ターンミネティックスを含む。 本発明の一つの実施態様に従って、親の容器が、ビーズ懸濁物を混合するため に用いられる。混合されたビーズは、共通のマニホールドを通じて、別個の複数 の反応容器へと配分される。反応容器中において、ビーズは、種々の、選択され たモノマーにさらされ、モノマーは、それに連結されるべきビーズ上で、好まし くは共有結合的に反応する。任意的に、ビーズは、化学「タグ」にさらされ、タ グはまた、共有結合的に或いは他の様式にて、ビーズに連結する。その後、ビー ズはマニホールドを通って親容器に戻って再び一緒にされ、そして混合される。 混合された ビーズ懸濁物は、その後、複数の反応容器間で再び分けられ、そしてモノマー付 加、ビーズ混合及び再分配のプロセスが続けられる。プロセスは、その表面上で 形成された分子の多様なセットを持つビーズ又は他の基体のコレクションの形成 を結果する。 本発明の一つの観点に従って、本発明は、基体上で多様な分子を合成するため の装置及び方法を含む。基体は、親容器から、選択された反応容器へと配分され る。その後、試薬が反応容器中に導入され、分子の一部が合成される。次いで、 基体は、混合のために親容器へと移動させられる。その後、基体は、更なる合成 のために反応容器へと再配分される。サイクルは、所望の分子セットが合成され るまで続く。合成の間、シンセサイザー全体は、外部雰囲気からシールされてい る。 一般に、本発明は、ライブラリー中の個々の分子が特有の容易に解読される同 定タグを付されているところの分子ライブラリーを作製及びスクリーニングする ための装置及び改善された方法を提供する。 本発明の特徴及び利点の更なる理解は、以下の説明及び図を参照してなされる 。 図面の説明 図１は、本発明のシンセサイザーの概略図を示している。 図２は、試薬リザーバーの概略図を示している。 図３は、シンセサイザーに用いる３方バルブを示してい る。 図４は、シンセサイザーに用いる２方バルブを示している。 図６Ａは、試薬リザーバーの複数のグループを保持している回転可能な円盤コン ベヤーを有する、反応容器貯蔵場所の他の配置を示している。 図７は、下方のマニホールドバルブ、インジェクションバルブ、試薬リザーバー 及び反応容器間の相互連結を示している。 図８は、同心上にない撹拌機を示している。 図９は、反応容器貯蔵場所上方部分を示している。 図１０Ａ及び１０Ｂは、下方の反応容器ブラケットを示している。 図１１Ａ〜１１Ｄは、本発明の一つの観点に従った、実質上半透明なチューブ内 の液の存在を検出するために光学センサーを使用するための光学配列ブロックを 示している。 図１２は、本発明の一つの観点に従った反応容器を示している。 図１２Ａは、図１２の反応容器の周りの温度調節ジャケットを示している。 図１２Ｂは、図１２Ａのジャケット及び容器の断面図を示している。 図１２Ｃは、温度調節ジャケットを有する反応容器の他の実施態様を示している 。 図１２Ｄは、図１２Ｃのジャケットと容器の断面図を示し ている。 図１３は、親容器を示している。 図１４は、シンセサイザーの制御のための電子ハードウェアの簡略化した図を示 している。 図１５は、コントローラー回路の簡略化した図を示している。 図１６は、反応容器から全ての液を排出するために制御コンピューターによって なされる工程を示している。 図１７は、ボトムマニホールドから物質を取り除くために制御コンピューターに よってなされる工程を示している。 図１８は、親容器中の内容物をかきまわすために制御コンピューターによってな される工程を示している。 図１９Ａ〜１９Ｄは、親容器から反応容器へとビーズ懸濁物を再配分するために 制御コンピューターによってなされる工程を示している。 図２０は、加圧されたデリバリー系からの試薬を反応容器中に入れるために制御 コンピューターによってなされる工程を示してる。 図２１Ａ〜２１Ｄは、加圧されたデリバリー系からの試薬を反応容器中に入れる ために制御コンピューターによってなされる工程を概略図で説明している。 図２２は、反応容器中にアミノ酸モノマーを導入するために制御コンピューター によってなされる工程を示してる。 図２３Ａ〜２３Ｃは、反応容器中にアミノ酸モノマーを導入するために制御コン ピューターによってなされる工程を 概略図で説明している。 図２４は、混合のため、ビーズ懸濁物を、反応容器から親容器へと移すための制 御コンピューターによってなされる工程を示してる。 図２５は、制御ソフトウェアの主要なモジュール間のデータの流れを概略図で説 明している。 図２６は、コマンドインタプリタ構造を概略的に説明している。 図２７は、バルブデータにアクセスするために用いられる機構を概略的に説明し ている。 図２８は、センサーデータにアクセスするために用いられる機構を概略的に説明 している。 図２９は、微細なビーズ上で組み合せ化学ライブラリーを合成するための装置を 示している。装置は、化合物がそこで合成されうる反応部位の配列を有する合成 表面を持った固体基体に取り付けられた真空マニホールド又は磁器プレートから なる。仕切ブロックは、反応部位に対応するずらりと並んだ反応ウエル（well） からなり、そして各混合工程の後にライブラリーメンバーを分けるために用いら れる。装置はまた、タグが付けられた化学ライブラリーの合成を助けるために用 いられ得る。 図３０は、チアゾリジノンの安定性をモニターするための¹³Ｃ ＮＭＲの使用を 説明している。パネルＣは、支持体に結合した、環の２位及びリンカーのカルボ ニル基に対してα位にて¹³Ｃ原子により二重標識されているチアゾリジ ノンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している（標識された位置は、“＊”で示し た）。パネルＢは、９５％ＴＦＡで１時間処理した後の、支持体に結合した二重 標識されたチアゾリジノンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している。パネルＡは 、４０サイクルのＤＮＡ合成の後の、支持体に結合した二重標識されたチアゾリ ジノンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している。 図３１は更に、チアゾリジノンの安定性をモニターするための¹³Ｃ ＮＭＲの使 用を説明している。パネルＣは、支持体に結合した、環の２位及びリンカーのカ ルボニル基に対してα位にて¹³Ｃ原子により二重標識されているチアゾリジノン の¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している（標識された位置は、“＊”で示した） 。パネルＢは、ＰＢＳ緩衝液中で９０分間光分解した後の、支持体に結合した二 重標識されたチアゾリジノンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している。パネルＡ は、ＰＢＳ緩衝液中で３時間光分解した後の、支持体に結合した二重標識された チアゾリジノンの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを示している。 図３２は、支持体に結合したチアゾリジノンを、４０サイクルのＤＮＡ合成及び ＰＢＳ緩衝液中での３時間の光分解に付すことによって製造された反応混合物の ＨＰＬＣ微量分析を示している。 図３３は、制御コンピューター上に提供されたグラフィック ユーザー インタ ーフェイス（“ＧＵＩ”）を示している。示されている如く、ＧＵＩは、作業空 間１３０３を 伴う方形のウインドウ１３０１を含む。ウインドウの上部に、ユーザーコマンド チョイス１３０６〜１３１３を有するメニューバー１３０５がある。これらのコ マンドチョイスの各々は、シンセサイザーの操作を制御するための追加のサブメ ニューを含む。ユーザーは、マウスを用いて適当なコマンドチョイスを選択する ことにより、シンセサイザーをプログラムできる。 図３４は、ＧＵＩを描いており、マクロメニュー中のサブメニューオプションを 示している。 図３５は、マクロを実行するためのダイアログボックスを描いている。 図３６は、ＧＵＩを描いており、グループメニュー中のサブメニューオプション を示している。 図３７は、ＧＵＩを描いており、バリアブル（変数）メニュー中のサブメニュー オプションを示している。 図３８は、ＧＵＩを描いており、ダイアグノスティックス（診断）メニュー中の サブメニューオプションを示している。 図３９は、バルブダイアグノスティックススクリーンを描いている。 図４０は、センサーダイアグノスティックススクリーンを描いている。 図４１は、ＧＵＩを描いており、ファイルメニュー中のサブメニューオプション を示している。 図４２〜４４は、合成のセットアップに関係するダイアロ グボックスを示しており、ユーザーは、合成において用いるべき反応容器を選択 すること（図４２）、スタート、ループ及びエンドマクロを選択すること（図４ ３）、及び各反応容器にアミノ酸シンボル又はオリゴヌクレオチドコードを入れ ること（図４４）を可能にする。 図４５は、ＧＵＩを描いており、シンセシス（合成）メニュー中のサブメニュー オプションを示している。 図４６は、合成又はマクロ実行中のステータス表示を描いている。 図４７は、ユーザーアボート（中止）ダイアログボックスを描いている。 図４８は、ＧＵＩを描いており、エディットメニュー中のサブメニューオプショ ンを示している。 図４９は、ウインドウズ（商標）環境下での制御ソフトウエアの主要なモジュー ル間のデータの流れを概略図で説明している。 特定の実施態様の記述 本発明は、一般に、タグが付けられた化学ライブラリーを作製及びスクリーニ ングするための改善された方法に関する。本発明はまた、多様な分子のコレクシ ョン、例えば上記したタグが付けられた化学ライブラリーの合成において有用な 装置に関する。 改善された方法の価値を正しく認識するために、タグが付けられたライブラリ ーを作る及び使用するための基本的 な方法論ばかりでなく、種々の合成及びスクリーニング工程がどのように相互作 用しそして試薬の選択が達成された結果にどのように影響するかが理解されなけ ればならない。タグが付けられた化学ライブラリーは、しばしば、固体支持体上 で合成され、そして支持体及びリンカーの選択は成功にとって重要である。リン カーは、支持体をタグに付けそしてその支持体をライブラリーの分子に付け、又 は固体支持体がない実施態様においては、タグをライブラリーの分子に付けるた めに用いられ得る。化学構築ブロック、タグ及び合成方法に関する選択は、同様 に重要であり、また利用可能な固体支持体及びリンカーの性質によって影響され る。タグが付けられたライブラリーが意図されているところのアッセイ及び用途 はまた、これらの選択、並びに利用可能な器具の設置及び試薬に影響する。 本発明の装置及び方法は、主として、オリゴヌクレオチド及びペプチドの合成 に関して説明されるけれども、本発明はそれらに限定されない。本発明は、物質 、例えば、多糖類、リン脂質類、ポリウレタン類、ベンゾジアザピン類、プロス タグランジン類及びベータターン類似物及び他の物質の合成への適用が見いださ れよう。環状物質は、米国特許第5242974 号明細書（Holmes）に開示の如くにし て作られうる（これは引用することにより本明細書の一部を成す）。 多様な物質、例えば、オリゴヌクレオチド及びペプチドの使用及び合成は、以 下の係属中の出願中に更に詳細に開 示されており、これらは、全ての目的において、引用することにより本明細書の 一部を成す。米国特許出願シリアル番号第07/876792号明細書（1992年４月29日 出願）、米国特許出願シリアル番号第07/762522号明細書（1991年９月18日出願 ）及び米国特許出願シリアル番号第07/946239号明細書（1992年９月16日出願） 。 本発明の記述は、以下の大要によって示された如くに提供される。 大要 Ｉ．タグを付けた化学ライブラリーの合成の概観 II．固体支持体 Ａ．タイプ Ｂ．リンカー Ｃ．分子支持体 III.化学構築ブロック Ａ．オリゴマー及びモノマー Ｂ．他の構築ブロック IV．タグ Ｖ．合成方法 Ａ．オリゴヌクレオチドタグを付けたペプチドライブラリー Ｂ．オリゴヌクレオチドタグを付けたペプチドライブラリー合成のた めの改善された方法 Ｃ．小さな分子合成 Ｄ．可溶性ライブラリー作製のための方法 VI．アッセイ方法 Ａ．ビーズに基づいたライブラリーのためのスクリーニングアッセイ Ｂ．可溶性分子のスクリーニング Ｃ．天然生成物のライブラリーのスクリーニング VII．器具設置及び試薬 VIII.並列カップリング合成反応のための装置 実施例 大要の終了 上記の大要に加えて、以下の用語解説が本発明の記述を容易にするために提供 され、そして多くの略号及び言葉が、本発明を記述するために本明細書中で用い られる如くの示された一般的な意味を有すると定義される。 略号：ＨＢＴＵ、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＯＢｔ、１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール；ＨＡＴＵ、［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェー ト；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＣＡ、トリクロロ酢酸；ＤＩＥＡ、ジイソプ ロピルエチルアミン；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；Ｆｍｏｃ、９−フルオレ ニルメチルオキシカルボニル；ＤＭＴ、ジメトキシトリチル；Ｔｒｔ、トリチル ；Ｂｚ、ベン ゾイル；Ｐｍｃ、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル ；^tＢｏｃ、ターシャリー−ブチルオキシカルボニル；ＰＢＳ、リン酸塩緩衝化 生理食塩水；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ｍＡｂ、モノクローナル抗体。 相補的又は実質的に相補的：これらの言葉は、ある化合物の他の化合物への結 合能、例えば、リガンドがその相補性リセプターに結合する能力を意味する。典 型的には、これらの言葉は、核酸のヌクレオチド間の、例えば、二本鎖ＤＮＡ分 子の二本の鎖間での、又はオリゴヌクレオチドプライマーと配列決定される或い は増幅されるべき一般鎖核酸上のプライマー結合部位との間の塩基の対合の描写 と関連して用いられる。「相補的」ヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（又はＡと Ｕ）及びＣとＧであるが、当業者に公知の結合特性を有する広範囲の種々の合成 又は改変ヌクレオチドがある。「実質的相補性」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ鎖が、選 択的ハイブリダイゼーション条件下で相補性核酸にハイブリダイズする場合に存 在する。典型的には、ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレ オチドの範囲にわたって少なくとも約５５％の相補性が存在する場合に生じるが 、より選択的なハイブリダイゼーションは、相補性が６５％、７５％、９０％及 び１００％にまで増加した場合に生じる。Kanehisa，1984，Nucl. AcidsRes. 12 :203参照（これは引用することにより本明細書の一部を成す）。高い選択性のハ イブリダイゼーション条件 は、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」として知られており、以 下に定義してある。 エピトープ：この語は、抗体として知られているレセプターのサブクラスと相 互作用する領域によって輪郭づけされている抗原分子の一部を述べるために用い られる。 同定タグ：最も一般的な意味では、この語は、それによって化学反応、例えば 、個々の固体支持体が該固体支持体上でのオリゴマーの合成において経験したモ ノマー付加反応を同定できる手段を提供する物理的属性を示すために用いられる 。この同定タグは、化学ライブラリーの合成において用いられた一連の反応中の ある工程を記録するのに役立つ。同定タグは、いずれかの認識できる特性（これ は、例えば、顕微鏡その他で区別できる形、サイズ、重量、色、光学密度等；示 差吸光度又は発光；化学的反応；磁気又は電気特性；又は要求された情報をエン コードできるいずれかの他の特有なマークを含む）を有することができ、そして 、一つの（或いはいくつかの）分子のレベルで解読できる。このような同定タグ の好ましい例は、オリゴヌクレオチドである。何故なら、オリゴヌクレオチドの ヌクレオチド配列は、確固とした形態でのエンコードされた情報であるからであ る。「同定タグ」は、固体支持体を合成において用いる又は用いないのいずれの 場合でも、合成されたオリゴマーに直接カップリング化されうる。この後者の態 様においては、同定タグは、概念的には、オリゴマー合成のための「支持体」と してもまた働くと見ること ができる。 リガンド：この語は、特定のリセプターによって、典型的には特定のレセプタ ーへの結合によって認識される分子を示すために用いられる。レセプターによっ て結合される又はリセプターと反応する試薬は、「リガンド」と呼ばれ、その語 は、その対となるレセプターとの関係においてのみ定義付けされた意味を有する 。「リガンド」なる語は、問題とされている物質がリセプターと結合する或いは 相互作用するということ以外の特定の分子の大きさ或いはその他の構造又は構成 の特徴を含意しない。また、「リガンド」は、リセプターが結合する自然のリガ ンド、又はアゴニスト或いはアンタゴニストとして作用しうる機能上の類似体の いずれとしても機能しうる。本発明によって調査されうるリガンドは、細胞膜レ セプターのアゴニスト類及びアンタゴニスト類、毒素類及び毒液類、ウイルスエ ピトープ類、ホルモン類、糖類、コファクター類、ペプチド類、酵素基質類、コ ファクター類、薬剤類（例えば、アヘン、ステロイド類等）及び蛋白質を含むが これらに限定されない。 モノマー：この語は、互に結合して他の分子又は分子のセット、例えば、オリ ゴマー又はポリマーのセットを形成しうる分子のセットの任意のメンバーを示す ために用いられる。本発明で有用なモノマーのセットは、ペプチド合成の例のた めには、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又は合成アミノ酸のセットを含むがこれに 限定されない。本明細書中 で用いられている「モノマー」は、オリゴマーの合成のための基本セットのいず れかのメンバーを意味する。例えば、Ｌ−アミノ酸のダイマーは、ポリペプチド の合成のために４００「モノマー」の基本セットを形成する。モノマーの種々の 基本セットは、ポリマーの合成において一連の工程にて用いられ得る。当業者は 、「モノマー」が単純に一つのタイプの「化学構築ブロック」であり、そしてい ずれのタイプの化学構築ブロックも、オリゴマー又は小さな有機分子或いは他の 分子のいずれを合成するかに拘わらず本発明の方法において用いられ得るという ことを理解するであろう。 オリゴマー又はポリマー：これらの語は、モノマーサブユニットの化学的又は 酵素的付加を含む方法によって形成される分子を示すために用いられる。このよ うなオリゴマーは、例えば、核酸、多糖、リン脂質及び、アルファ、ベータ或い はオメガアミノ酸のいずれかを有するペプチドの直線状、環状及び分岐状のポリ マー、ヘテロポリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ 尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロ キサン、ポリイミド、ポリアセテート又は他のポリマーを含み、それらは、この 開示を精読すれば当業者に容易に理解されるであろう。 ペプチド：この語は、モノマーが、アミド結合を通じて互いに結合しているア ルファアミノ酸であるところのオリゴマーを示すために用いられている。「ペプ チド」はま た、「ポリペプチド」をも意味しうる。本発明に関連して、アミノ酸は、Ｌ−光 学異性体又はＤ−光学異性体であり得るということが理解されるべきである。ペ プチドは、２より多くのアミノ酸モノマー長であるが、より頻繁には、５より大 きく１０までのアミノ酸モノマー長であり、そして２０アミノ酸より長い場合す らあり得る。だが、２０アミノ酸より長いペプチドは、より一般には、「ポリペ プチド」と呼ばれている。アミノ酸の標準の１文字略号を用いる（例えば、プロ リンにはＰ）。これらの略号は、Stryer，Biochemistry，第３版(1988)（これは 引用することにより本明細書の一部を成す）中に記載されている。 オリゴヌクレオチド：この語は、典型的には合成手段によって調製される、一 本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を示すために用いられる。本発明で用いられるオリゴ ヌクレオチドは、下記とは異なった長さのオリゴヌクレオチドがある環境におい ては適しているかもしれないが、通常は、長さで、５０〜１５０ヌクレオチド、 好ましくは８０〜１２０ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドタグ は、オリゴマーを合成するために用いられるモノマー−バイ−モノマー付加工程 と同等である、ヌクレオチド−バイ−ヌクレオチドで構築され得る。更に、非常 に短い、即ち２〜１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが、モノマーカップリ ング工程を同定するために、現存するオリゴヌクレオチドタグを延長するために 用いられ得る。適したオリゴヌクレオチドは、BeaucageとCarruthers，1981，Tetr. Lett. 22:1859-1862に記載されたホスホルアミダイト法によって、又はMa tteucciら，1981，J. Am. Chem. Soc. 103:3185に従ったトリエステル法（これ らは共に引用することにより本明細書の一部を成す）によって、又は他の方法に よって、例えば市販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いることに よって調製されうる。 作動可能に連結された：この語は、核酸の一つのセグメントと他のセグメント 間の機能的関係を意味する。例えば、もしプロモーターが、コード配列の転写を 引き起こす又はそれに明確に影響する場合は、プロモーター（又は、エンハンサ ー）は、コード配列に「作動可能に連結されている」。一般に、作動可能に連結 しているとは、連結されている核酸セグメント又は配列が、隣接しており、また ２つの蛋白質コード領域を連結しなければならない場合には、隣接しておりかつ リーディングフレーム中にあることを意味する。 並列カップリング：この句は、基体上の区別された点を分離するために、２つ の構築ブロック化合物を同時にカップリングすることを意味する。このような基 体は、これらの構築ブロックが付着されるところの区別された基を有する固体支 持体であることができ、又は各構築ブロックが独立に付く場合には２つの区別さ れた基を有するもう一つの化学化合物を構成することもできる。同時カップリン グは、新たな構築ブロック化合物を第一のカップリングされた構築ブロックに添 加する前のこのような区別された点 への２つの化合物のカップリングを意味する。従って、これに関連して用いられ る「同時」なる語は、２つの構築ブロックがまさに同時にカップリングされると いう意味に限定されない。 レセプター：この語は、所与のリガンドに対して特異的な親和性を有する分子 を意味する。レセプターは、天然にある又は合成の分子であり得る。レセプター は、それらの変更されていない自然の又は分離された状態にて、或いは他の種と の集合体として用いられ得る。レセプターは、共有結合的に又は非共有結合的に 他の物質につきうる。本発明の方法において用いられ得るレセプターの例は、抗 体、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体、特定の抗原決定基（例えば、ウイ ルス、細胞又は他の物質上の）と反応性の抗血清、ポリヌクレオチド、核酸、レ クチン、多糖、細胞、細胞膜及び細胞小器官を含むが、これらに限定されない。 レセプターはまた、「抗−リガンド」としても知られている。「リガンド−レセ プターペア」は、２つの分子、典型的には２つの巨大分子が、分子認識を通じて 結合し、複合体を形成するときに形成される。レセプターの他の例は、抗生物質 が必要とされる微生物の生存に必須である特定の輸送蛋白質又は酵素、いずれか の酵素の結合部位、抗体分子上のリガンド結合部位、核酸、Lernerら，1991，Sc ience 252:659（これは引用することにより本明細書の一部を成す）に記載の如 くの触媒作用を有するポリペプチド、及びホルモンレセプター、例えばインシュ リン及び成 長ホルモンのレセプターを含むがこれらに限定されない。 基体又は固体支持体：これらの語は、堅い又は半剛性の表面を有する物質を示 すために用いられる。このような物質は、好ましくは、小さなビーズ、球粒、デ ィスクの形態又は他の慣用の形態をとるが、他の形態も用いられ得る。いくつか の実施態様においては、基体の少なくとも一つの表面が実質的に平らでありうる 。おおよそ球状の形状が好ましい。 ストリンジェントハイブリダイゼーション条件：この句は、高い選択性のハイ ブリダイゼーション条件を意味し、該条件では、核酸は、結合した配列が完全に 又は大きく（即ち、８０％より大きく）相補性でありさえすれば、他の核酸（又 は、同じ核酸の他のセグメント）と共同して安定に結合したままでいる。このよ うな条件は、典型的には、約１Ｍより低い、例えば５００ｍＭより低い塩濃度を 含み、そしてしばしば２００ｍＭより低い塩濃度を含む。オリゴマーのためのハ イブリダイゼーション温度は、典型的には、２２℃より高く、例えば約３０℃よ り高く、そしてしばしば約３７℃を超える。より長いフラグメントが特異的ハイ ブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を要求する。 他のファクターもハイブリダイゼーションの厳重さに劇的に影響するので（この ようなファクターは、塩基組成、相補性鎖の長さ、有機溶媒の存在及び塩基のミ スマッチの程度を含む）、ファクターの組み合わせが、いずれか一つのファクタ ーのみの絶対的手 段より重要である。 合成：化合物は、インビトロでの化学的又は酵素的合成により製造された場合 に、「合成の」とされる。本発明の合成ライブラリーは、ウイルス又はプラスミ ドのベクター、例えば、バクテリア、酵母または他の生物宿主中で増殖されるこ とができるベクター中のライブラリーと対比されうる。 Ｉ．タグが付与された化学ライブラリー合成の概観 本発明は、一般に、タグが付与された化学ライブラリーを合成及びスクリーニ ングするための方法に関する。本質において、本発明の化学ライブラリーの各「 ブック」は、目的の化学物質又は分子、目的の化学物質又は分子又はその重要な 観点を同定するタグ、及び目的の化学物質或いは分子とタグとの間の連結からな る。一つの重要な実施態様において、目的の化学物質又は分子は、オリゴマー、 例えば、ペプチドであり、タグは、オリゴマー、例えば、核酸であり、そして、 連結は、固体支持体又は粒子であり、それらから、オリゴマー及びタグが、例え ば検出を容易にするために又は可溶性ライブラリー提供するために、任意的に切 断されうる。このようなライブラリーは、レセプターに結合する又はいくつかの 他の所望の特性を有する個々のオリゴマーを分離するためにスクリーニングされ うる。タグが付与された化学ライブラリーを製造するための一般の方法は、オリ ゴマーの巨大な、高度に多様なコレクションを製造することにより説明され、そ こでは、（ライブラ リーは、典型的には、重複した「ブック」を含むが、）各々の異なったライブラ リーメンバーは、他のライブラリーメンバーに対して特有のモノマー配列を有す るオリゴマーである。このようなライブラリー又はコレクションは、例えば、Ｘⁿ 個の異なった化合物を生じる、長さｎのオリゴマーに組み立てられたモノマー のセット中に、Ｘ個の異なったモノマーの全ての組み合せを含みうる。コレクシ ョンはまた、例えば、たった一つ又は少数の部位に、異なったモノマー単位を有 するオリゴマーを含みうる一方、全ての他の部位に同じ配列を含みうる。 このようなオリゴマーのコレクションを合成するための一般の方法は、典型的 には、ランダムな組み合せ（「確率論的」）アプローチ及び、モノマー単位の化 学的及び／又は酵素的組み立てを含む。一つのプロセスは、工程（ａ）複数の反 応容器中に複数の固体支持体を配分する工程、（ｂ）各々の異なった反応容器中 の異なった第一モノマー及びタグの組み合わせを用いて、各反応容器中の支持体 に、第一モノマー及び第一タグをカップリングする工程、（ｃ）支持体を集める 工程、（ｄ）支持体を複数の反応容器中に配分する工程、（ｅ）各々の異なった 反応容器中の異なった第二モノマー及び第二タグの組み合わせを用いて、第一モ ノマーに第二モノマーをカップリングさせ、そして固体支持体又は第一タグのい ずれかに第二タグをカップリングさせ、そして、任意的に、異なったタグ及び異 なったモノマーを用いてカップリング及び配分工程を、 １〜２０回或いはそれ以上繰り返す工程を含む。典型的には、実質的に同数の固 体支持体が、各反応容器に配分される。同じ化学構築ブロックを異なったカップ リング工程において用いることができること、及び同じ化学構築ブロックを単一 のカップリング工程の２以上のカップリング反応（反応容器）中で用いることが できるということを、当業者は理解するであろう。 方法をより容易に明視化するために、まず、３つの異なったモノマー、Ａ、Ｂ 及びＣのモノマーセットから組み立てられる、３つの残基の長さの全てのオリゴ マーのタグが付与されていないライブラリーの確率論的な合成を考えることがで きる。ビーズを３つに分けたものを、３つの反応容器に配分し、そしてモノマー Ａを、第一の反応容器中でビーズに連結し、Ｂを第二の容器中にて、そしてＣを 第三の容器中にて連結した。その後、全ての反応容器からのビーズを集めた。集 めたプールは、おおよそ同数の３つの異なったタイプのビーズを含んでおり、各 々のタイプは、ビーズに連結されたモノマーによって特徴づけられる。プールは 混合され、そいて、連結されるべき次のモノマーとして各々Ａ、Ｂ及びＣを含む 別個のモノマー反応容器に再び分配された。 このカップリング反応に続いて、各反応容器は、ポジション１にてすべての３ つの異なったモノマーを有し、かつポジション２にて各特定の第二の反応容器中 に含まれていたモノマーを有するビーズを有する。全てのビーズを再 び集め、各々が９の可能なダイマーの一つを持つビーズの混合物を製造する。こ のプールを再び、３つの反応容器へと分配し、そして３つの異なったモノマーに 連結して、３つのモノマーの全てのトリマー（３³＝２７）の完全なセットを製 造する。容易に認め得るように、十分に大きな数の合成ビーズの使用は、セット が、このランダムで確率論的な組み合せ合成の体系において用いられるモノマー の種々の組み合わせを完全に表すことを確実とするのに役立つ。 この完全にランダムなアプローチの改変もまた可能である。例えば、モノマー セットは、もしカップリング化学が利用できるなら、工程から工程へと拡大し又 は縮小することができ、又は、モノマーセットは、次の工程（例えば、第一工程 のアミノ酸、他の工程のヌクレオシド、他の工程の炭化水素）のために完全に変 更されうる。ペプチド合成のためのモノマー単位は、例えば、単一のアミノ酸又 はより大きなペプチド単位、或いはその両者を含みうる。一つの変更は、合成の ある工程において異なったモノマーセットの間で分配されるべき、固体支持体上 の種々の配列のいくつかのプールを形成することである。このアプローチによっ て、関係する又は関係しない配列を持つ異なった長さのオリゴマーを作ることが でき、そして、他の残基を変更する一方、いくつかのポジションにおいてある種 のモノマー残基を固定して、ある残基又は領域が多様性を提供するために変更さ れているオリゴマー骨格を構築できる。 タグが付与された化学ライブラリーの合成は、しばしば、このような組み合せ の合成工程を含む。しかしながら、同定タグは、各オリゴマーの同定を提示する ために容易に解読されうるので、タグが付与された化学ライブラリーは、タグが 付与されていないライブラリーより著しく大きい又は複雑であることができる。 事実、化合物の合成ライブラリーを合成するための本発明の方法は、複数工程の 合成によって製造された配列決定できない化合物の大きなコレクションのスクリ ーニングを可能とする。 特に、オリゴヌクレオチドタグ及びオリゴヌクレオチド暗号の使用は、組み合 せ合成を通じて製造されるつながった化合物、特にペプチドの広大なライブラリ ーの各メンバーの構造的な同一性を記録するための強力な機構を提供する。本方 法は、他の非ペプチド性の構造物の組み合せ集成体のエンコードに広く適用でき 、但し、並列合成スキームが直交性及び互換性を残すことを条件とする。組み合 せ合成の正味の結果は、単一の生成物を産出するために非常に高収率で、各々が 進行する反応順序についてのみ明白に定義される。この状況は、標準のペプチド 及びＤＮＡ合成化学によりほぼ得られ、そして得られる生成物の構造は、合成に 用いられる結合ブロック及び／又は連結反応の順序によって明確に特定化される 。 しかしながら、殆どの合成有機反応は、より特異性であり、変化しやすい収率 及び度々の多様な生成物（例えば、レジオ及びステレオ異性体構造）を与える。 固体支持体上 での組み合せライブラリー合成のためのこのような化学物質の使用は、ライブラ リー中の各ビーズ上に生成物の混合物を生じる。多くの一般の場合において、合 成の暗号は、関連する物体の化学構造をユニークには特定化できないかもしれな い。むしろ、暗号プロセスは、ライブラリーのメンバーがそれにより構築される 正確な合成方法（例えば、試薬、反応条件等）をエンコードするために、より正 確に考察されうる。ライブラリーは、「活性処方」を同定するためにスクリーニ ングされ、それは、その後、予備スケールにて再製造され、そして（必要なら） 生物活性成分を単離するために分画されうる。エンコードされたライブラリー技 術は、組み合せ化学の範囲及びその用途を、薬剤発見及び広範囲の種々の有用な 化合物の開発及び単離にまで広げるために、相当な潜在性を有する。タグが付与 された分子ライブラリーの合成のこの概観を以て、本発明の重要な観点、例えば ライブラリー合成における固体支持体の使用及び選択がより認識される。 II．固体支持体 Ａ．タイプ 典型的には、本発明のタグが付与された化学ライブラリーは、「固体支持体」 、例えば、ビーズ又は粒子のコレクションからなる。このような固体支持体は、 いずれの形でもよいが、好ましくはおおよそ球形である。支持体は、サイズ、形 又は組成において均一である必要はないが、支 持体は通常、そして好ましくは均一である。しかしながら、いくつかの実施態様 において、大きさが非常に均一な支体が特に好ましい。別の実施態様において、 ２つ以上の明白に異なった固体支持体の集団が、ある種の目的のために用いられ 得る。つまり、固体支持体が単一の粒子、又は２以上の連結された粒子からなり うる。 固体支持体は、多くの物質からなることができるが、多くの化学反応基のいず れかを結合するための誘導化及びオリゴマー又は他の分子合成の化学及びタグの 結合との適合性のための能力によって主として限定される。適した支持体物質は 、ガラス、ラテックス、著しく架橋されたポリスチレン又は類似のポリマー、金 又は他のコロイド性の物質粒子、及び当業者に公知の他の物質を含む。特に記載 がなければ、このような固体支持体がそれにより誘導体化されうる化学反応基は 、各々の分子又はオリゴマーの固体状態での合成のために通常用いられるもので あり、従って、当業者に公知である。本明細書中で用いられる「固体支持体」な る語は、オリゴマー合成、及びいくつかの実施態様においてはタグの付着及び／ 又は合成に対して適した部位を有する粒子を包含する。本発明の合成オリゴマー ライブラリーの調製において有用な種々の固体支持体がある。固体支持体は、通 常、例えば、ペプチド及び核酸、及び既に列記した他のオリゴマーの固相合成の ために用いられ、従って、当業者に良く知られている。本発明の固体支持体は、 生細胞、ウイルス又はクローニングベクター、例えば ファージベクター又はプラスミドを包含しない。Ｍｏｎｏｂｅａｄｓ（商標）（ ファルマシア ファイン ケミカル ＡＢ、ウプサラ、スェーデンより市販され ている）又はそれらの同等物が、本発明の種々の観点のために、固体支持体とし て特に有用である。Ｍｏｎｏｂｅａｄｓ（商標）は、良好なサイズ均質性及び小 さなサイズ、即ち１０μｍを提供する。更に、これらのＭｏｎｏｂｅａｄｓ（商 標）は、有機又は無機の溶媒のいずれの中でも凝集せず、オリゴヌクレオチド及 びペプチド合成のために適した支持体を提供する。最後に、Ｍｏｎｏｂｅａｄｓ （商標）は、第一級アミンの非常に大きな負荷を提供する（１００ｎｍｏｌｅ／ ｍｇ）。 本発明の実施のために選ばれた特定の固体支持体の一つの重要な観点は、支持 体のサイズである。十分なる固体支持体及び効率のよいカップリングをもって、 所望により、ある種のオリゴマーの完全なセットが製造できる。一般に、固体支 持体のサイズは、１ｎｍ〜１００μｍであるが、１ｍｍのサイズまでのより大き い固体支持体もときどき用いられ得る。固体支持体の適したサイズは、（１）オ リゴマー合成部位及び同定タグの所望の付着部位の数、（２）合成されるべき異 なった化合物の数（及びスクリーニングが必要とされる各オリゴマーを運ぶ固体 支持体の数）、及び（３）用いられるべき特定のスクリーニング戦略（例えば、 蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ））における固体支持体の大きさの効果に依存 する。 特定の例として、直径１μｍの固体支持体が、本発明の方法において用いられ 得る。もし各反応容器が約０．２ｍＬの固体支持体を含み、そしてオリゴマーが ５０モノマーのセットから合成される（５０の並列反応）場合は、すると、全量 で１０ｍＬの固体支持体又は約１０¹³の固体支持体が要求される。もし、これら の５０モノマーを用いてヘキサマーを作ることが望まれた場合は、その時は、１ ．５×１０¹⁰を超える可能な配列があり、そして各特定の配列は、約１０³の固 体支持体上で表れうる。各ビーズの概算された能力は、通常用いられるペプチド 合成樹脂の能力に基づいて、ビーズ当たり約０．１ｐｇのペプチドである。次い で、この概算により、各固体支持体は、約１００ａｍｏｌ又は１０⁸オリゴマー 鎖を有する。 洗浄効率を改善するために、非孔性のビーズ又は典型的なペプチド合成よりも 低い孔性の他の固体支持体を用いることができ、しかし、本発明のある種の用途 において、かなり孔性のビーズ又は樹脂が良く作用しそしてしばしば好ましい。 非孔性の支持体は、低い密度の成長鎖を有するが、数オーダーでの能力の減少を 伴った場合でさえ、十分なオリゴマー密度が十分なスクリーニングのために製造 されうる。より低い孔性の支持体では、より大きい割合のオリゴマー部分が、ス クリーニングプロセスの間、レセプターへの結合のためにアクセスできる。また 、低い孔性の支持体は、ある反応から次への反応への繰越を減少 し、従って、優勢の（正しい）タグの解読の正確性を改善する。 上記した如く、他の実施態様は、互いに物理的に連結された２つの固体支持体 、例えばビーズの使用を含み、一つは、分子又はオリゴマーのための合成部位（ 又はリンカー）であり、そしてもう一つは、一つ又は複数の同定タグのための付 着部位（又はリンカー）である。この配置は、分子又はオリゴマーと同定タグの 、別々の「ゾーン」中への分離を可能とし、そして、付着のための大きく異なっ た化学反応基及び化学の使用を可能とする。固体支持体は、別々に誘導体化され 、次いで、全ての又は殆ど全ての合成固体支持体が、つながったタグ付着固体支 持体を有する条件下で連結される。固体支持体は、異なったサイズ、例えば、連 結されたいくつかの（又は多くの）より小さなタグ付着ビーズを伴う大きな合成 ビーズであり得る。一つの実施態様において、第一の固体支持体は、少なくとも 一つの付着されたアミノ酸を有し、そして第二の固体支持体は、少なくとも一つ の付着されたヌクレオチドを有する。 ２つのビーズを連結する方法は、オリゴマー合成化学によってなされる。最も 明らかなビーズの連結手段は、固体支持体の各々の種上で優勢な化学反応基と相 互作用する、ヘテロ二価官能性の架橋剤（例えば、Pierce ImmunoTechnology Ca talog and Handbook pp.E10-E18(1991)で参照されるような試薬）を用いている 。このような架橋剤は、以下の章で示すような種々の目的に役立つ。 Ｂ．リンカー 固体支持体に結合されるとき、オリゴマー及びそれに付随するタグは、通常、 １以上の分子リンカーによって支持体に付着される。リンカー分子は、付着に先 だって、各末端に適当な官能基を有し、一つの基は支持体への付着に適しており 、そしてもう一つの基はオリゴマー又はタグへの付着に適している。いくつかの 実施態様において、切断可能なリンカーは、アッセイ又は検出工程を容易にする ために用いられる。 多様な連結試薬の広い入手性が与えられると、同定タグを、目的のオリゴマー 又は他のライブラリー化合物のいずれか、又は固体支持体、又は前もって存在し ているタグに連結できる。例えば、同定タグは、オリゴマー中に取り込まれたモ ノマー、又は非オリゴマー性化合物中に取り込まれた構築ブロックに付着され得 る。ペプチドオリゴマーに関し、システイン残基の側鎖は、タグ付着のための便 利な部位を提供する。他の例において、タグは、少数のオリゴマー鎖を覆う（キ ャップする）ために付着されることさえでき、但し、所望のオリゴマーの正味の 合成量の減少が、容易に許容されうることを条件とする。固体支持体にオリゴマ ー（又は目的の他の化合物）を結合するリンカーに直接タグを付着できる。この 実施態様において、リンカーは、付着に先だって、同定タグの付着のために適し た第三の官能基を有する。 もちろん、所望の用途及び効果に応じて、広範囲の種々 のリンカーを結合することができる。例えば、カップリング又は結合効率等の特 性において、所望の効果を達成するために、疎水性、親水性、又は立体配置の容 積を与えるリンカーを選択できる。本発明の一つの観点において、分岐したリン カー、すなわちかさばった側鎖を有するリンカー、例えばリンカー Ｆｍｏｃ− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）が、硬さを与えるために、又はライブラリー中の固体支持体上 の分子間の間隔又はライブラリー中の分子とタグの間の分子の間隔を調節するた めに用いられる。 上記したように、切断可能なリンカーは、有用な効果のために用いられ得る。 本発明の好ましい光切断可能なリンカーは、６−ニトロベラトリルオキシカルボ ニル（ＮＶＯＣ）及び他のＮＶＯＣ関連リンカー化合物（ＰＣＴ公開番号第 WO 90/15070及び WO 92/10092号公報参照、また米国特許出願シリアル番号第971181 号明細書（1992年11月２日出願）参照、これらは引用することにより本明細書の 一部となる）を含む。他の実施態様において、リンカーは、１以上の制限部位を 有する核酸であり、従ってライブラリーメンバーの一部分（タグ、オリゴマー又 は目的の他の化合物、又はそれらの両者、或いは固体支持体）は、適した制限酵 素によって他から選択的に切断されうる。この新規な核酸リンカーは、本発明の 目的のために有用な効果で用いられることができる広範囲の種々のリンカーを例 証している。 Ｃ．分子支持体 上記した如く、本発明はまた、固体支持体がなく、そしてタグが、合成される オリゴマー又は他の分子に直接（典型的にはリンカーを通じて）付着される方法 により行われうる。或いは、オリゴマー又は他の分子及びその付随するタグは、 固体支持体上で合成されることができ、次いで、スクリーニング又は他の使用に 先だって固体支持体から切断されるうる又は除去されうる。このような方法は、 以下で更に十分に記載する。固体支持体が存在するか否かに拘わらず、ライブラ リーのサイズ及び組成は、合成の間に用いられたカップリング及び混合工程の数 、及びモノマー又は他の構築ブロックによって決定される。 III．化学構築ブロック Ａ．オリゴマー及びモノマー 本発明の広範囲の適用性は、多様なオリゴマー及びポリマーの巨大なライブラ リーを合成及びスクリーニングすることにより、恐らく、最も容易に理解される 。オリゴマーは、モノマーからなるポリマー性の化合物、例えば、生物ポリマー であり、オリゴマー中のモノマーの配列は、しばしば、重要な生物学的特性を特 定する。好ましい目的のオリゴマーは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ Ｎ−置換グリシン及びポリカルバメートを含む。上記した如く、本発明の目的 のために、モノマーは、互いに連結してオリゴマー又はポリマーを形成すること ができ るモノマーのセットの任意のメンバー、例えばアミノ酸、カルバメート、スルホ ン、スルホキシド、ヌクレオシド、炭化水素、尿素、ホスホネート、脂質、エス テル、上記の組み合わせ等である。従って、モノマーは、化学カップリングのた めに適当に活性化されうる又は酵素的カップリングのために許容されうるいずれ のタイプでもよい。 多くのモノマーのタイプからオリゴマーを組み立てる方法は、モノマー単位又 は構築ブロックの所与のセットのために、適当なカップリング化学を用いること を要求する。逐次的な様式において互いに付着されうる構築ブロックのいずれの セットも、モノマーセットとして作用しうる。付着は、化学的、酵素的或いは他 の手段により、又はこれらの手段のいずれかの組み合わせにより仲介されうる。 得られたオリゴマーは、直線状、環状、分枝状又は想定される種々の他の構造で あり得、これらは、当業者に明らかである。 Ｂ．他の構築ブロック 本発明は、本明細書中に、主としてアミノ酸の配列を含む分子の調製に関して 記載されているが、本発明は、他のオリゴマーの調製、及び成分毎の逐次的様式 により合成されうる化合物のセットに容易に適用することができ、このことは当 業者によって理解されるべきである。例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン 及びペプチジルホスホネート等の化合物は、本発明の方法を用いて調製されうる （米国特許出願シリアル番号第08/119700号明細書（1993年９月９日出願）参照 、これは、現在は放棄された米国特許出願シリアル番号第081577号明細書（1993 年６月21日出願）の一部係属出願であり、米国特許第5339115号明細書の一部係 属出願である、これらは各々引用することにより本明細書の一部である）。 一つの実施態様において、本発明の方法は、分枝状のポリマーのライブラリー を製造するために用いられ得る。多くの例において、直線状のポリマー、例えば 、ペプチドのライブラリーは、かなり有用である一方、３〜４より大きい残基で は、これらの直線状の分子の形は、長くかつ狭くなる。殆どの薬剤は、恐らく、 幾分は分子の高程度の柔軟性故に、このような長い形を有さない。分枝状の骨格 ポリマーは、公知の薬剤に類似の分子の形を結果しうる。従って、一つの実施態 様において、本発明は、他のモノマーがそこに付着され得る少なくとも３つの官 能基を有するモノマーの取り込みに関する。 しかしながら、もしこのようなモノマーが専ら用いられる場合は、その時は、 完全に分枝状の合成は、いつも、連結された最後のモノマーの（合成に用いられ た他のモノマーに対して）高い比率を結果する。もちろん、この比率を変えるた めに、異なった分枝しているモノマーの混合物を取り入れることができるが、そ の時は、目的の化合物の構造の同定がより困難になろう。即ち、分枝状のモノマ ー混合物がより複雑になればなるほど、タグは、合成された 特定の化合物についてより少ない情報しか提供できない。本発明の改善された方 法において、２つのモノマーの混合物が取り入れられ、各モノマー連結段階にて 、一つは分枝できるがもう一つはできない、そしてこのことは、多い情報を与え るタグを有した、形の大きな多様性を含むライブラリーを製造する。この場合に は、タグは、各カップリング工程にて存在するモノマーを特定化するが、それは 、モノマーが分枝できるかどうかということを特定しない。しかしながら、第一 のライブラリーから選択された化合物のセット中に含まれるそれらのモノマーの みを用いる単純な再合成は、それらの化合物の構造を容易に同定する。 IV．タグ 同定タグは、例えば、顕微鏡的に又は他の方法で、形、サイズ、重量、荷電又 は色において区別できる認識可能な特性を有する。この認識可能な特性は、タグ の光学的、化学的、電気的又は磁気的特性から、又はこれらの特性のいくつかの 組み合わせから生じうる。本質において、タグは、分子を標識し、そして一つの （或いは複数の）分子又は固体支持体のレベルにて、解読可能な情報をエンコー ドするために機能する。化学ライブラリーの各メンバーが受けた合成経路を追跡 するために同定タグを用いることによって、ライブラリー中の任意の化学物質の 構造（即ち、任意のオリゴマーのモノマー配列）を、同定タグを読むことによっ て演繹できる。 認識できる異なった大きさ、形或いは色の、又はバーコードで標識された小さ なビーズの如くの、顕微鏡的に同定可能なタグを構成できる。タグは、「機械的 に解読可能な」発光又は放射線標識でありうる。同定タグはまた、エンコード可 能な分子構造でありうる。情報は、分子のサイズ（ポリマーの長さ）又は組成中 にエンコードされうる。恐らく、後者のタイプの最もよい例は、核酸配列、即ち 、天然の或いは改変された塩基から組み立てられたＲＮＡ又はＤＮＡである。 化学ライブラリーの合成及びスクリーニングにおいてタグによって演じられる 役割を説明することは、例えば、オリゴマー合成において各ビーズに付着り付け られた、顕微鏡的に認識可能な文字と数字が組み合わされたタグの使用を考える ことである。例えば、タグ「Ａ１」は、ビーズが工程１にてＡモノマー反応に参 加したこと意味し、「Ｃ２」は、ビーズが工程２にてＣモノマー反応に参加した こと意味し、そして「Ｂ３」は、Ｂモノマーが工程３にて添加されたことを意味 する。３工程合成の終わりでは、ビーズは、付着り付けられた３つのタグ、例え ば、Ａ１、Ｃ２及びＢ３を有し、このことは、ビーズ上でのペプチド配列がＡＣ Ｂであることを示す。このスキームは、異なったモノマーの数と合成工程の数の 積（この例では９）に最大でも等しい、多数の異なった同定タグを要求する。も し、符号がＡ、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｃ−Ｂの工程順にて互いに付着された場合は、同定 タグの数は減少される。この場合 は、モノマーと同数のみの同定タグが要求され、そして同定タグは、どのモノマ ーが付加されたか及びどの付加工程においてかという記録が保存される方法にて 組み立てられる。 他の例において、タグは、種々の光でアドレスされる分子、例えば、蛍光性又 は燐光性の化合物からなり、そのスペクトル特性は、変化し得り（たとえば、光 退色）、そしてそれ故、情報を蓄えるために用いられ、このことは、ライブラリ ー中の各ビーズ又は他の固体支持体をマークするために用いられる。一つのこの ような方法において、ビーズは、種々のフロロフォアを取り込み、その各々は、 選択的に光退色され、そして蛍光又は減少した蛍光が利用できないようにされる 。各カップリング又は化学反応工程の間、ビーズは、１以上の特定のタイプのフ ロロフォアを光退色する（又はしない）ように照射され（されず）、従って、合 成されたオリゴマー中にモノマー同定が記録される。Science 255: 1213（1992 年３月６日）参照（これは引用することにより本明細書の一部である。） それ故、同定タグは、各モノマーカップリング、又は個々のライブラリーメン バー又は固体支持体が経験した他の反応工程を同定し、そして、各モノマーが付 加された又は他の化学反応が行われた合成シリーズの工程を記録する。タグは、 モノマー付加又は他の反応の直前、間又は後に、便宜なようにかつ同定タグのタ イプ、付着様式及びオリゴマー又は他の分子合成の化学と相容なように付着され う る。上記した如く、同定タグは、種々の機構を通じて、直接的に、連結分子を通 じて又はオリゴマーがその上で合成される固体支持体を通じて、オリゴマーと関 連させられ得る。後者の様式では、タグをもう一つの固体支持体に付けることが でき、そして該もう一つの固体支持体は、オリゴマーがその上で合成される固体 支持体に結合されうる。特定のモノマー付加又は他の化学反応工程を受ける固体 支持体が物理的に一緒になったとき、同定タグが付加され、そしてそのようにし て、一群として、即ち次のプール化工程に先だって、タグが付与されうる。 もちろんいくつかの場合において、オリゴマーのモノマー単位の少数のみが変 えられる場合は、オリゴマーのうちで変化するモノマーのみを同定することが必 要となり得り、例えば、ペプチド中の数種のアミノ酸のみを変化したい場合であ る。例えば、６〜１２アミノ酸長のペプチド中の３〜６のアミノ酸のみを変えた い、又は、５０アミノ酸長までのペプチド中の５という少ないアミノ酸を変えた い場合である。各固体支持体に、各配列中で変化されるアミノ酸のみを特定化す る同定タグを提供することによって、各ペプチドの配列を、唯一に同定すること ができ、これは、当業者によって容易に認識される。このような場合、全ての固 体支持体は、共通のモノマー単位を付加するために同じ反応容器中に残りうるが 、区別されるモノマー単位の付加のためには、異なった反応容器間に分配される 。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、特に好ましい 情報伝達同定タグである。オリゴヌクレオチドは、天然の、高密度の情報貯蔵媒 体である。モノマータイプの同定及び付加の工程、又は化学合成方法に関係する 他の情報は、短いオリゴヌクレオチド配列中に容易にエンコードされる。次に、 オリゴヌクレオチドは、広範囲の種々の固体支持体、オリゴマー、リンカー及び 他の分子への付着について容易に従う。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチ ド合成ビーズに対して容易に付着され得る。 オリゴヌクレオチドに基づいたコード体系の使用において、固有の顕著な利点 は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis，M.，Gelfand，D.，Sninsky，J．and White，T.，Academic Press，San Diego 1990)参照、また米国特許第4683202号及び第4965188号明細 書参照、これらは各々引用することにより本明細書の一部である）及び他の核酸 複製及び増幅技術を通じて標的の増幅が非常な高いレベルで達成できる能力であ る。殆ど通常に用いられるインビトロＤＮＡ増幅法はＰＣＲであるが、適した代 わりの増幅法は、例えば、核酸配列に基づいた増幅（Compton，1991，Nature 35 0:91-92、引用することにより本明細書の一部である）及び増幅アンチセンスＲ ＮＡ（Van Gelderら、1988，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 85:7652-7656、引用す ることにより本明細書の一部である）、及びセルフ−サステインド シークエン ス レプリケーション システム（３ＳＲ、Guatelliら，1990，Proc．Natl．Ac ad．Sci. USA 87:1874-1878、引用することにより本明細書の一部である）を含む。ほんの 小さな量（高い選択性及び効率の方法をもってすれば、単一のコピーでも十分で ある）のＤＮＡテンプレートが、ＰＣＲに要求され、顕微鏡的な直径の固体支持 体を用いて、巨大なライブラリーを得ることができる。 核酸タグの使用は、他の束縛されたライブラリー技術を通じて入手できる多様 性をはるかに超える合成ライブラリーの構築及びスクリーニングを容易にする。 更に、これらのライブラリーは、管理しうる量のビーズ物質を用い、そしてそれ 故、生物試薬の実験的な量を用いてレセプター結合についてアッセイされうる。 本発明の改善された方法は、オリゴヌクレオチドタグを用いたＥＳＬライブラリ ーの加工における制限的な工程・・・増幅、鎖分離及び個々のビーズからのタグ の配列決定に関係する。方法は、少なくとも１オーダーだけ配列決定効率を増加 し、そして、タグの連鎖工程の取り込みに関係し、そこでは、典型的には、ライ ブラリーメンバーの選択されたセットから典型的に増幅された多くの異なったタ グが、オリゴヌクレオチドタグのクローニング又は配列決定に先だって互いに連 結される。 方法の一つの実施態様において、増幅されたタグは、連鎖され、そして、その 後、慣用の配列決定ベクター中で１０〜２０（又はそれ以上）のタグの直線状の 配列としてクローン化される。好ましくは、適した制限部位は、オリ ゴヌクレオチドタグの「コーディング領域」（情報内容を持つ配列）に隣接して 設置され、一群のビーズ上でのタグの増幅後に、制限部位は切断され、そしてフ ラグメントは連結されて連鎖を形成する。その後、連鎖は、適当な配列決定ベク ター中にクローン化される。その後、各テンプレートが、例えば５００〜８００ 塩基の全体を二方向に配列決定するために用いられ、テンプレート当たり少なく とも１０より多いタグの同定が可能とされる。このアプローチはまた、ＦＡＣＳ を用いて個々のビーズの単離を避けるという選択を提供する。ビーズ及びタグが 付与された化合物は、プール中に分類され、タグのプールは増幅され、連鎖され 、そして配列決定のためにクローン化される。更に、個々のビーズを取り扱うた めの要求は軽減されているので、ライブラリー構築及びスクリーニングのために 、１μｍより小さいビーズ（典型的には、この大きさは、慣用のＦＡＣＳ分析の ためには小さすぎる）が使用できる。選択は、便利には、アフィニティー精製法 （パニング（panning）、マグネチックビーズ等）によって成し遂げられ、そし てビーズの富化されたプールは、次いで、上記の如く増幅されそしてクローン化 される。 オリゴヌクレオチドの同定タグは、（オリゴマー合成のための）対応するモノ マーカップリングまたは他の化学反応工程の前、間又は後に、一塩基づつ組み立 てられる。オリゴヌクレオチドタグの一塩基ごとの合成の場合は、各工程のタグ は、単一のヌクレオチドであるか又は多くも非常 に少数のヌクレオチド（即ち、２〜５ヌクレオチドのブロック）である。ブロッ クごとの逐次的なアプローチにおいては、２〜５から１０又はそれ以上の塩基の ヌクレオチドのエンコードされたセット（「コドン」）が、保護されかつ活性化 されたブロックとして加えられる。各ブロックは、モノマータイプ又は他の情報 を運び、そしてあるタグブロックの次への付加の順序は、モノマー付加又は他の 反応の順序を表す。或いは、ブロックは、オリゴマー合成又は他の反応工程数、 並びにモノマータイプ又は他の構築ブロック情報をエンコードしうる。この計略 は、オリゴマーを用いて並列で成長させたオリゴヌクレオチド鎖の直線状の配列 中に工程の順序を保存する。並列合成段階（例えば、オリゴヌクレオチド及びペ プチド）の化学的相容性を保存するために、標準の合成化学を改変することがで き、本発明の重要な観点は、以下に更に詳細に議論する。 増幅プライマー部位、モノマー特異的情報及び反応順情報を含有する、５０〜 １５０塩基（ヌクレオチド）長の保護された（又は保護されていない）オリゴヌ クレオチドが、各工程にて付着り付けられうる。一連のオリゴマー合成（モノマ ーカップリング）又は他の化学合成工程の最後に、ライブラリー中の各オリゴマ ー配列又は他の化学物質と関連したオリゴヌクレオチド同定タグの異なったｎの エンコードされたセットがある。リガンド活性を用いてオリゴマーを同定した後 、関連したオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにより増幅され、そしてオリゴマー又 は他の化合物 の同定を解読するために配列決定される。 以下でより完全に議論するように、オリゴヌクレオチド同定タグ中で用いられ る塩基の選択は、オリゴマー合成の化学又はタグが露出される他の化学反応条件 によって指示される。例えば、強酸の使用は核酸を脱プリン（depurinate）する 。従って、強酸の使用を要求する化学物質を用いる場合は、ピリミジンＣ及びＴ のみからなるオリゴヌクレオチド及びバイナリーコードの使用が、重要であると 証明できる。同様の様式にて、強酸に対するプリンヌクレオチドの不安定性は、 プリンヌクレオシド類似体アナログ、例えば、７−デアザ−２’−デオキシアデ ノシン及び７−デアザ−２’−デオキシグアノシン（Barrら，1986，BioTechniq ues 4:428-432及びScheit，Nucleotide Analogs: Synthesis and Biological Fu nction pp.64-65(John Wiley and Sons，New York)参照、これらは共に引用する ことにより本明細書の一部である）の使用を通じて克服されうる。これらの又は 他の類似体の使用は、バイナリーなエンコードスキームとは反対に、四要素又は 他の使用を可能とする。従って、好ましい実施態様においては、同定タグは、約 ５０〜１５０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、オリゴマーライブ ラリーを組み立てるために用いられるカップリング条件下で分解しない、ピリミ ジン又は、ピリミジン及びプリン類似体、又はいずれかのタイプのヌクレオシド からなる。オリゴヌクレオチド同定タグは、５’及び３’増幅部位を含み、任意 的に、ＤＮＡ配列決定 プライマー部位を含むことができ、それらは、オリゴマー合成の各工程に特異的 であり得る。 オリゴヌクレオチドを用いる組み合せ合成手順をエンコードすることは、巨大 なライブラリーから分離される微量のリガンドの直接の構造分析において出会う 曖昧さ及び感度という主要な限界に向けられた機構を提供する。情報貯蔵のため のＤＮＡの有する高い能力は、ライブラリーの構築の正確な詳細を保管するため に活用されうる。以下の実施例１において、３つの塩基（c⁷dＡ、dＣ、Ｔ）を含 む２つの隣接するヌクレオチドの「コドン」構造が、３²＝９までのアミノ酸構 築ブロックを取り込む合成をエンコードでき、用いられた（たったの７の構築ブ ロックがこのライブラリーの合成において用いられた）。もし、c⁷dＧがまた、 コーディングテンプレート中に含まれる場合は、その時は、１０００の異なった モノマーを用いる組み合せ合成が、わずか５つのヌクレオチドの「コドン」サイ ズ（４⁵＝１０２４）を用いて提供されうる。 情報は、オリゴヌクレオチドの配列或いはそれについて他のポリマー性又はオ リゴマー性のタグの配列よりは、又はそれに加えて長さにおいてエンコードされ うる。もし、オリゴマーに対する各特定のモノマー付加を表すために、長さのみ が用いられる場合は、そのときは、オリゴマーの同定が、例えば、上記の如くオ リゴヌクレオチドタグを増幅し、そして種々のサイズ分離技術（ポリアクリルア ミドゲル又はキャピラリーゲル電気泳動を含む）を通じてタグを同定することに より、解読されうる。オリゴマー合成の所与の工程又は各異なった化学反応工程 で付加される各異なったモノマーは、独特の長さのヌクレオチドタグによって表 される。オリゴヌクレオチドタグは、増幅部位、例えば、ＰＣＲプライミング配 列を含み、該配列は、オリゴマー又は他の化学合成における所与の工程数を特徴 付けるように設計される。その後、配列中のいずれかの所与の場所におけるオリ ゴマー組成の決定は、合成における該工程のためのＰＣＲプライミング配列特徴 を用いたタグの増幅、及び本技術分野で公知の技術、例えば、（標準としてタグ を付与するオリゴヌクレオチドを用いた）ゲル又はキャピラリー電気泳動を用い た増幅生成物のサイズでの分離を含む。この実施態様は、リード配列に関する化 合物のライブラリーを作ることを望む場合に特に有用である。類似である部位が 合成される工程の間にタグのみが必要である。 長さに加えて、オリゴマー配列情報はまた、オリゴヌク レオチドタグを含む塩基配列中にエンコードされうる。このタイプの暗号は、異 なったオリゴヌクレオチドタグを各カップリング工程で付着する実施態様におい てばかりでなく、前もって存在するオリゴヌクレオチドタグを各カップリング工 程にて延長する実施態様においても価値がある。例えば、以下に記すように、各 々が７つ（又はそれ以上）の領域を有する、約１００塩基（又はそれより幾分長 いもの）までのオリゴヌクレオチドを使用しうる。 領域１は、３’−ＰＣＲプライマー部位（２０から２５塩基）である。この部 位は、ＰＣＲによる増幅をプライムするために、他のＰＣＲ部位と（オリゴヌク レオチドの５’末端において）連結されて用いられる。他の増幅法もまた、用い られ得る。 領域２は、「工程特異的」ＤＮＡ配列決定プライマー部位（１５〜２０塩基） である。この部位は、合成シリーズにおける特定の番号が与えられた工程に対し て特異的である。特定の工程にてすべてのビーズに付加された全てのオリゴヌク レオチドは、通常、この配列を共通に有する。各番号が与えられた工程は、該工 程を表す非常に特異的なプライマー部位を有する。 領域３は、スペーサー（２０〜３０塩基）である。種々の長さの、好ましくは ２０〜３０塩基長のスペーサーは、モノマーエンコーディング又は同定領域を通 じて良好な「読みとり」を与えるべく、配列決定プライマー部位から十分離して コード部位を置く。 領域４は、モノマー同定領域（８塩基）である。この例示的な実施態様におい て、８ビットの記号列中の各塩基は、１ビットのバイナリーコードを表し、そこ では、例えば、Ｔ＝０及びＣ＝１である。工程特異的な同定タグの各セットは、 ８個の位置の夫々において、１（Ｃ）又は０（Ｔ）を有する８塩基からなる。こ れらは、異なった場所での、「オン」又は「オフ」にセットされるスイッチとし て考えられる。各モノマータイプは、これらの「スイッチ」の１〜８の混合物に よってエンコードされる。 領域５は、工程数情報領域（４塩基プラス領域区別のための両側における２塩 基）である。この短い長さ中の４ビットは、工程数をエンコードする。これは、 配列決定プライマーのためには冗長であるが、適当なプライマーが用いられてい ること及び正しい工程が解読されていることを確認するために用いられうる。 領域６は、モノマー同定領域（８塩基）の繰り返しである。この領域は、領域 ４と同じ情報を持ち、そしてモノマー同定を確認するために用いられる。この第 二のモノマーエンコーディング領域を設定することはまた、良好な配列決定の「 読みとり」を獲得する蓋然性を増加する。 領域７は、５’−ＰＣＲプライマー部位（２０又は２５塩基）である。この部 位は、配列増幅のために、第二のＰＣＲプライマーをアニーリングするための部 位として働く。これらの特徴の７つ全て（そのいくつかは任意的である）を有す るオリゴヌクレオチドの長さは、通常、７５〜 １２５塩基である。 ８ビット形式は、２５６の異なったモノマータイプをエンコードできる。エン コードされうる工程数は、手元にあるオリゴヌクレオチドの工程特異的セットの 数（セット当たり８）によって決定される。１０セット（８０オリゴヌクレオチ ド）を用いて、１０単位長までのオリゴヌクレオチド中に組み立てられた２５６ の異なったモノマーをエンコードできる（従って、２５６¹⁰＝１．２×１０²⁴ま でのオリゴマー配列のためのエンコード能力が提供される）。コードされた同定 タグは、各モノマーが特異的なバイナリー数を割り当てられる（例えば、Ａｌａ ＝00000001、Ｇｌｙ＝00000110等）ように用いられ得る。適したオリゴヌクレオ チドは、正しいバイナリーコードを与えるために組合わされる。 オリゴヌクレオチドタグ同定を容易とするために、種々の選択肢がある。例え ば、配列決定又はハイブリダイゼーションによってビーズから直接にタグを読む ことができる。また、タグ同定を容易にするために、オリゴヌクレオチドタグを 増幅できる。単一の固体支持体又はオリゴマーによって運ばれるオリゴヌクレオ チド同定タグは、クローニングによりインビボで、又は例えばＰＣＲによりイン ビトロで増幅されうる。もし、検出の限界が、１００分子のオーダーであれば、 その時は、ビーズ上での各オリゴヌクレオチドタグの少なくとも１００或いはそ れ以上のコピーが要求される。タグのコピー、つまり、一本鎖のオリゴヌ クレオチド、二本鎖の核酸、又は一本鎖及び二本鎖の核酸の混合物のいずれかが 、種々の方法のいずれか（その内のいくつかは以下に記す）により製造され、そ して増幅された物質が配列決定される。別個でかつ区別されるオリゴヌクレオチ ドタグが、（各工程にて存在するタグを延長するのではなく）、各モノマー付加 工程にて加えられる本発明の実施態様において、全てのタグを一度に増幅でき、 そしてその後、（各タイプのタグのために異なった配列決定プライマーを用いる ）オリゴマー合成工程があれば、増幅された物質を多くの別々の配列決定反応に 分けることができる。この実施態様において、また、プライマー配列を適当に選 択することにより、各タグを他のタグとは別に増幅できるようにタグを設計でき る。配列決定反応が行われ、そして標準配列決定ゲル上を泳動され、オリゴマー 配列が、得られた配列情報中に明らかにされたコードから導き出される。 他の戦略は、通常のＰＣＲプライマー及び通常の配列決定プライマー（配列決 定プライマーは、ＰＣＲプライマー部位と完全に又は部分的にオーバーラップし ていてもよい）を用い、そしてビーズからのオリゴヌクレオチド中の各工程特異 的な配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーション することによって工程を同定することである。単一のセットの配列決定反応は、 単一のビーズからの全ての増幅されたオリゴヌクレオチド上で成され、そして反 応生成物は、ゲル上で単一セットの レーン中で泳動される。その後、反応生成物は、適当なハイブリダイゼーション 膜に転写され、そして単一の工程特異的プローブにハイブリダイズされる（Mani atisら、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，NY(1980)参照、 これは引用することにより本明細書の一部である）。得られた信号の検出後、プ ローブは膜から洗浄されそして他の工程特異的プローブがハイブリダイズされる 。ヨーロッパ特許出願公開第237362号公報及びＰＣＴ公開第 89/11548号公報（ これらは各々引用することにより本明細書の一部である）に記載の方法を用いる こともできる。 並列ハイブリダイゼーションは、連続したハイブリダイゼーションの代わりを 提供する。配列決定反応物は、ペプチド合成工程の数と等しい数に等分され、そ して、配列決定ゲル上にて、各々について１つの別々のセットのレーン中で泳動 される。反応生成物を適当な膜へ移した後に、膜は切られて、レーンのセットを 分離する。その後、各レーンセットは、複数の工程特異的なオリゴヌクレオチド プローブの一つにハイブリダイズされる（Plex Luminescent Kits Product Cata log, Bedford，MA，1990中の「ユニプレックス ＤＮＡ シークエンシング」及 び「マルチプレックス ＤＮＡ シークエンシング」参照）。 上記した如く、単一合成固体支持体（又は、タグを運ぶ取り付けられたビーズ 、又は「ウェル」中の溶液中の）は、各オリゴヌクレオチドタグの２、３百のコ ピーを含む のみである。これらのタグは、例えば、ＰＣＲ又は当業者に公知の他の手段によ って増幅され、正確に配列決定されるのに十分なＤＮＡを提供しうる。オリゴマ ーを解読する能力は、利用可能なオリゴヌクレオチド同定タグの数、利用可能な タグから達成されうる増幅レベル、及びＤＮＡを増幅した配列決定の正確性に依 存する。 もしオリゴヌクレオチド同定タグのＰＣＲ増幅が用いられる場合は、「ＰＣＲ 生成物汚染」と遭遇しうり、それは、あるＰＣＲ反応の生成物が同じＰＣＲプラ イマー結合部位を有する他のタグを増幅するように設計された次のＰＣＲ反応混 合物を汚染するによって起こる。生成物配列中に不安定性を導入し、そして前の 反応から持ち込まれた潜在的な汚染物を破壊するように、次の反応を処理するこ とによってこの問題を防止できる。この戦略の特定の例は（そのための市販キッ トがＰＥＣＩ and Life Technologyによって販売されている）、ｄＵＭＰを生 成物中に導入する。各々の新しいＰＣＲ反応物をウラシル−Ｎ−グリコシダーゼ を用いて処理することは、存在しうるｄＵ含有ＤＮＡを分解し、汚染物の増幅を 防ぐ。ｄＵを含有しない（ｄＴのみ）テンプレートＤＮＡは影響されない。もち ろん、グリコシダーゼは、増幅が始まる前に除かれ又は不活性化される。 ペプチド合成のために上記したタグのいくつかは、ピリミジンのみを含むとい う普通でない特徴を有する。このことは、ウラシルグリコシダーゼ戦略（Perkin Elmer Cetus Instruments(PECI)Catalog，Alameda(1991)、これは引用することにより本明細 書の一部である）が製造された鎖（それらは、Ｔ（又はＵ）を含む）の半分のみ に作用する。しかしながら、ｄＵＭＰを、相補的な、プリンのみの鎖中に導入す ることはできないので、プリン鎖は、酸脱プリン化及び骨格のアルカリ仲介され る切断に対して、非常に敏感である。これらの処理の組み合わせは、生成物汚染 の問題を大きく減少しうる。汚染の持ち込みを防ぐ他のアプローチは、制限部位 （ＥａｒＩは、ポリピリミジンタグのために用いられ得る）の、オリゴヌクレオ チドタグへの導入、及びタグで汚染されることが疑われる増幅反応に先立つ対応 する制限酵素での消化を含む。もし増幅されるべきタグが酵素によって切断され ない場合にのみ、この方法が実施され、一般に一本鎖のオリゴヌクレオチドタグ の場合である。 増幅されたＤＮＡの配列決定のために、通常、一本鎖のテンプレートを製造す ることが望まれる。この製造は、いくつかの手段のいずれかによって達成されう る。一つのこのような手段は、非対称ＰＣＲであり、そこでは、過剰な一つのプ ライマーが、一つの鎖を、他より１０〜１００倍高いレベルまで増幅するために 用いられる（例えば、米国特許第5066584号明細書、これは引用することにより 本明細書の一部である）。一本鎖のテンプレートを提供するための他の手段は、 プライマーの一つをビオチン化し、そして固定化したストレプトアビジンへの吸 着によって、 得られた鎖を精製又は除去することである（Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991，これらは引用することにより本明細書の一部である）。ま た他の手段は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからのＲＮＡ転写物（鎖の一つ のみを表現する）の製造及び逆転写酵素を用いた転写物の配列決定を含む（Somm erら，25章，PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications, 前掲、こ れは引用することにより本明細書の一部である）。もしタグがピリミジンヌクレ オチドのみからなる場合は、その時は、全てのプリン鎖は、酸／塩基処理によっ て除去され、配列決定のためにピリミジン鎖を残すことができる。 各工程特異的なオリゴヌクレオチドのために別個の配列決定プライマーを用い ることは、各工程特異的プライマーのために、別個の、慣用の配列決定反応を要 求する。異なった標識がされたプライマーの使用は、単一の固体支持体からの同 定タグが単一の反応で配列決定され、そしてゲル上で単一のレーンセットで泳動 されることを可能とする（もしポリピリミジンのみが用いられた場合は２レーン 、もし４つの異なる塩基が用いられたなら４レーン）。現在、この目的に適した 区別できるフルオロフォアで標識されたプライマーが市販されている（ABIカタ ログ、これは引用することにより本明細書の一部である）。現在市販されている 化学ルミネセンス標識のセットがまた用いられ得る（Bronsteinら，BioTechniqu es 8:310-314(1990)、 これは引用することにより本明細書の一部である）。 増幅された生成物は、容易に配列決定又はさもなければ同定されて、ビーズ上 の又はさもなければオリゴヌクレオチドタグに付着されたペプチド又は他の分子 の同定を解読する。この目的のために、種々の配列決定法（これは、配列特異的 プローブハイブリダイゼーションによる配列決定を含む）のいずれかが用いられ 得る。本発明において用いられ得るＤＮＡ配列決定酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡポリ メラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（又はクレノウフラグメント） 、Ｔ７ポリメラーゼ、シークエナーゼ（商標）及びシークエナーゼII（商標）（ 改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素 （ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、ＲＳＶ等からのもの、USB Enzymes for DNA Sequencing, U.S．Biochemical Corp，1991，Cleveland OH参照、これは引用することにより 本明細書の一部である）を含む。オリゴヌクレオチドタグの配列はまた、高い忠 実性のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によって同定されうる。この目的のた め、オリゴヌクレオチドを用いる非常に大きなスケールの固定化ポリマー合成が 有用であり得る（ＰＣＴ特許公開第92/10587号及び第92/10588号公報参照、これ らは引用することにより本明細書の一部である）。 タグの選択は、タグがオリゴヌクレオチド又は他の分子構造物のいずれであっ ても、ライブラリーを構成する分子の性質及び前の章で記載したようなそれらの 分子が合成さ れる方法に依存する。 合成化学が、上記のオリゴヌクレオチドタグと非相容性の試薬及び反応条件の 使用を含む場合には、代わりのタグ付与方法を用いることが望まれるかもしれな い。従って、本発明のタグが付与された分子ライブラリーを合成する方法はまた 、種々の方法、例えばクロマトグラフィー的方法によって別個に解決できる、化 学的に不活性な炭化水素タグ付与分子を用いることを構想とする。 分子ライブラリー中でのこのような不活性な炭化水素タグの使用は報告されて いる。Michael H.J．Ohlmeyerら，Proc．Nat′l．Acad．Sci. 90:10922-26(1993 年12月)、及びＰＣＴ出願番号 WO 94/08051参照、これらは共に、全ての目的の ために、引用することにより本明細書の一部である）。 記載されたタグは、本明細書中に記載のバイナリーコード機構を用いる。特に 、バイナリーコードは、合成において付加されるべき、各化学構築ブロック、例 えば、アミノ酸に割り当てられている。コードの長さは、付加されるべき構築ブ ロックの全数に依存しうる。例えば、たった７つの全構築ブロックが付加される 場合は、３ビットのバイナリーコードが用いられ得る。このことは、７つの別個 の特異的なコード、００１〜１１１が、７つの構築ブロックの一つに割り当てら れる、たとえば、リジン＝００１とすることを可能とする。構築ブロックの数が より大きい場合は、本明細書中に記載の如く、より大きなコード、例え ば、８ビットのバイナリーコードが用いられ得る。 クロマトグラフィー的方法を用いると各々が他と異なった溶離又は分離パター ンを有する多くのタグが調製される。もし、特定のタグが存在する場合は、それ は、所与の合成された分子のための最終タグコードの各場所にて「１」を表す。 従って、分子が４つの構築ブロックを有しそして３つのビットコード系にてコー ドされる場合は、１２の可能なコードディジットが存在し、各々の構築ブロック は３ビットを有する。合成の各工程に関し、分子がその上で合成されるべき固体 支持体は、タグが付与されて、付加された構築ブロックばかりでなくそれが付加 された工程をも示す。例えば、１番又は「Ｔ１］のタグの存在は、第一工程で付 加された構築ブロックについて、バイナリータグコードの第一の場所に「１」が 存在していることを示している。同様に、Ｔ７の存在は、全コードの第７番の場 所に「１」が存在していることを示し、このことはまた、３ディジットコードに おいて、第三の付加された構築ブロックの最初の場所に対応する。従って、コー ド１１１が割り当てられた構築ブロックは、もし場所１にて付加されたならば、 タグＴ１、Ｔ２及びＴ３の存在によってエンコードされる。或いは、もし工程２ にて付加されたならば、同じ構築ブロックが、Ｔ４、Ｔ５及びＴ６の存在によっ てエンコードされる。 Ohlmeyerによって報告された特定の炭化水素タグは、以下の構造を有する （ここで、ｎは１〜１０である） 炭化水素鎖の種々の長さ及び種々のハロゲン化基は、クロマトグラフィー的方法 、特に電子捕獲ガスクロマトグラフィーによってタグの物理的分離及び分析を可 能とする。 しかしながら、これらの炭化水素タグの検出は、検出方法の感度によって限定 される。従って、タグの検出を保証するため、より大きな量のタグが用いられな ければならない。このことは、より大きなサイズのビーズを要求し、従って、合 成されうる全ライブラリーのサイズを減少し、また固体支持体へのタグの最大の カップリングを保証するための増加した時間を増大する。最後に、より大きな分 子がスクリーニングされる場合は、より多くの炭化水素タグが固体支持体に付加 される。たとえば、非常に多くのタグ を有する大きな合成化合物のための、固体支持体上への大きな量の炭化水素の結 合は、固体支持体上の化合物の連続する合成及び／又はスクリーニングにおいて 悪影響を有するようである。これは、立体の、疎水性又はイオン性相互作用のた めである。 これらの炭化水素タグに関連する、検出能、タグの付与化時間及び合成の妨害 の問題は、本発明の方法を用いて回避されうる。特に、本発明は、一つの実施態 様において、炭化水素タグを用いたタグを付与する方法を提供し、そこでは、こ のようなタグは、Ohlmeyerらに記載された検出可能なエレクトフォアの代わりに 「分子フック」を有する。この「分子フック」は、本明細書中では、増幅可能で 、検出可能な基の付着を可能とするタグ上の官能基として定義され、従って、固 体支持体上のより小さい量のタグの検出を可能とする。フックは、一般に、増幅 可能で、検出可能な基と共有結合的な連結を形成する又は該基の一部に高親和性 を有する、安定な官能基又は分子を含む。このようなフックの例は、例えば、ス トレプトアビジンが連結された増幅可能で検出可能な基がそれに結合されうるビ オチン又は高会合ペプチドのある補体を含む。このような高会合ペプチドは、一 般に、各々が他と高親和性を有するペプチドの相補性ペアを含む。従って、一つ の補体は、このようなペアの一つのペプチドを示す。高会合ペプチドは、一般に 、米国特許出願シリアル番号第08/321933号明細書（1994年10月12日出願）に記 載されており、これは米国特 許出願シリアル番号第08/067387号明細書（1993年５月24日出願）の一部継続出 願であり、これらは引用することにより本明細書の一部である。或いは、このフ ックは、保護された活性化可能な基を含み、その基は、増幅可能で検出可能な基 をタグに共有結合的に付着するために活性化されうる。光保護され活性化された 基は、特に、この用途に有用である。活性化された基は、一般に、本技術分野に て良く知られており、そして、カルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、チオール 等の基を含む。これらの基は、光に不安定な保護基、例えばＰＣＴ出願 WO 93/2 2680号公報（これは引用することにより本明細書の一部である）に記載されたも のを用いて保護されうる。得られた基は、光で活性化できる。 上記に加えて、分子フックは、多官能性の基を含みうる。例えば、分子フック は、２つの別個のものへ連結されうる２以上の異なった官能基を含みうる。これ は、例えば、検出目的で他の固体支持体、例えばマイクロタイタープレート中の 反応ウェルにタグを再連結することが望まれる場合でありうる。第一の官能基は 、固体支持体上に相補性基を選択的に結合するために用いられうる。いったん連 結されると、第二の官能基は、増幅可能な検出可能な基の選択的な連結のために 用いられ得る。このようなフックは、一般に、本明細書中に記載された官能基、 又は他のこのような基に選択的に結合されうる他の基の組み合わせを含みうる。 例として、このようなフックは、炭化水素タグ に直交的に連結された、ビオチン及びジゴキンの両者を含みうる。いったん分離 されると、これらのタグは、タグ上の官能基の一つ、例えば、抗ジゴキン抗体と 結合しうる基でコートされた固体支持体、例えばマイクロタイターウェルと接触 させられ、そしてそれに結合される。繰り返された洗浄工程の後、固体支持体は 、第二の官能基、例えば、前記した如くのオリゴヌクレオチドに連結されたスト レプトアビジンに結合しうる基に連結されたオリゴヌクレオチドと接触させられ る。その後、結合されたオリゴヌクレオチドは、前記したようにして検出される 。本発明の炭化水素タグの合成は、本技術分野において良く知られた方法によっ て行われうる。例えば、March，Advanced Organic Chemistry(Jhon Wiley & Son s，第３版，1985)、Larock，Comprehensive Organic Transformations(VCH Publ ishers，1989)参照。 本発明の不活性な炭化水素タグは、炭化水素タグのより感度の高い検出を提供 するので、固体支持体上の特定のタグの量は、その検出性に影響することなく減 少されうる。更に、固体支持体上のタグの量を減少することにより、支持体にタ グを連結するために要求される時間が減少されうる。 本発明で有用なタグは、一般に、種々の炭化水素領域及び分子フックを含む。 特には、このようなタグは、タグを固体支持体に付着する切断可能なリンカー、 記載した分子フック、及び分子フックをリンカーに連結する種々の長さ の炭化水素鎖を含む。種々のタグは、それらの物理的分離及び検出を可能とする ために、種々の長さの炭化水素鎖、又は種々の分子フックを有する。 以下の一般構造を有するタグが好ましい： （ここで、ｎは１〜１０又はそれ以上であり、Ｘは切断可能なリンカーであり、 そしてＲは、分子フックである）。好ましい分子フックは、例えば、ビオチン、 高会合ペプチド、及び活性化可能な基例えば光で活性化可能な基、又はそれらの 組み合わせを含む。 本発明で有用な切断可能なリンカーの例は、例えば、米国特許出願シリアル番 号第 08/265090号明細書（1994年６月23日出願）に記載された光で切断可能なリ ンカーを含み、これは、全ての目的のために、引用することにより本明細書の一 部である。このような光で切断可能なリンカーの例は、以下の構造を有するもの を含む： 合成及びタグの付与に続いて、タグが、例えば、リンカーの光分解によって、 固体支持体から除かれる。その後、タグは、タグの分離パターンを保つ方法、例 えば、フラクションコレクションを用いたＨＰＬＣ、又は他のクロマトグラフィ ー法例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動を用いて、互いに分離される。タ グは一般に通常の手段、たとえば、吸収等では検出できない量で存在するので、 それらは、引き続く検出及びそれらの分離パターンとの対比を可能とする方法に て分離されなければならない。一例として、固体支持体から切断されたタグは、 ＨＰＬＣカラム上で分離され、そしてフラクションコレクター中に回収される。 タグが、以下の更なる詳細な記載のようにして最終的に検出された場合は、タグ の存在を示すフラクションは、タグの付与／合成において用いられた全てのタグ に関して、公知の溶出プロファイル又は分離パターンに対して対比される。 分離されたタグは、次いで、それらの分離パターンに従って固定化される。こ のような固定化は、個々のフラクションをスポットする、ゲルを用いた分離のた めにブロットする、又は反応ウェル、即ちマイクロタイタープレート上に固定化 する様式をとりうる。 いったん固定化されると、タグは、増幅可能で、検出可能な基に「フック」さ れうる。増幅可能な／検出可能な基は、一般に、増幅されうる、又は増幅されう る信号を生じる化合物又は構造を含む。特に有用な増幅可能で、検出可 能な基は、オリゴヌクレオチド配列である。増幅可能で検出可能な基のフック化 は、種々の形式をとりうる。例えば、フックがビオチン基を含む場合は、オリゴ ヌクレオチドは、ビオチンにしっかりと結合するストレプトアビジンに連結され うる。或いは、ストレプトアビジンは、中間工程にて添加され、次いでビオチン 化オリゴヌクレオチドの添加が行われうる。他の実施態様において、タグは、高 会合ペプチドの補体を含みうる。この場合は、オリゴヌクレオチドは、該ペプチ ドに対する他の補体に連結して、タグにしっかりと結合しうる。また、他の実施 態様においては、タグが、光に不安定な保護基、例えば、ＰＣＴ出願第 WO 93/2 2680号公報（これは既に引用して本明細書の一部となっている）に記載の保護基 によって保護される活性化された基を含む場合は、この基は、例えば、光に不安 定な基の光分解によって活性化され、その後、オリゴヌクレオチドは本技術分野 で良く知られた方法によりタグに連結されうる。この場合に、もし光に不安定な 保護基が用いられる場合は、種々の光分解特性を有する光に不安定な保護基を、 光で切断可能なリンカーから選択することが望まれうる。これは、分子フックを 活性化することなしに、固体支持体からタグを選択的に切断することを可能とす る。 いったんオリゴヌクレオチド配列がタグにフックされると、オリゴヌクレオチ ド配列は、本明細書中に記載のＰＣＲ技術を用いて増幅されうる。固定化がブロ ッティング形式である場合は、増幅は、局所的濃度を保持しかつ増 幅されたオリゴヌクレオチドの拡散を避け、その結果、その検出及び分離パター ンとの対比を可能とするように行われなければならない。このことは、増幅反応 を、例えば、ブロットのゲル上掛け中で行うことにより達成されうる。 フックされたオリゴヌクレオチド、そして従ってタグの検出は、標識を増幅さ れたオリゴヌクレオチド中に導入することにより、又はこのような配列が公知で ある場合は増幅されたオリゴヌクレオチド配列を調べることによって成されうる 。タグの検出は、タグのための公知の分離パターンと相関づけられる。次いで、 そのように同定されたタグは、合成された分子のための全タグコード中に編入さ れる。単に例示目的のために、もし、ＨＰＬＣ分離、フック化、増幅及びプロー ビングに続いて、画分＃１７が、タグの存在を示す場合は、このことは、画分＃ １７中に分離すると知られているタグと相関づけられる。もし、例えば、このタ グが＃５の場合は、そのときは、特定の支持体上で合成された分子について、「 １」が全バイナリーコードの場所＃５に割り当てられてうる。本明細書中に記載 されたコード機構は例示のためであり、そして当業者は、種々のコード機構が、 本発明の方法に適用しうるということを認識するであろう。 当業者はまた、合成された分子の配列を示すコードが個々のタグの単一のポリ マー配列中に含まれるということは要求されないということを認識するであろう 。その代わ りに、コードは、固体支持体上の個々の異なったタグの存在又は非存在によって 具現化されうる。これらのタグは、潜在的に、互いに連続的に連結されうるけれ ども、当業者は、支持体に個々に付着された各々の異なったタグを有することの 利点を認識するであろう。特に、たった一つのカップリング化学が、任意の又は 全てのタグ付加工程に要求されうる。更に、異なった反応性基を有するタグのた めの保護／脱保護反応の複雑なプロトコルが、避けられ得る。 Ｖ．合成方法 本発明の方法は、多様な化合物を製造するために、逐次的に行なわれる合成化 学反応の任意のセットに適用されうる。本発明は、典型的には、化学構築ブロッ ク、より典型的にはモノマー構築ブロックを用いて説明されるけれども、本発明 の一般的性質が理解されるべきである。大多数の合成化学反応は、典型的なモノ マーカップリング反応とかなり異なって進められ、典型的な有機化学反応は、種 々の収率を与え、そして複数の生成物、たとえば、レジオ及びステレオ異性体構 造物をもたらす。本発明は、化学反応のこのようなシリーズの有用な生成物を同 定するために用いられ得る。なぜなら、タグが、反応生成物の構造を明確に特定 化する代わりに、化合物の合成のプロトコルをエンコードするように本発明の方 法を行えるからである。 しかしながら、議論を単純化するために、本発明を、モノマーカップリング工 程のシリーズとして最も判りやすく示した。本発明の方法の種々のカップリング 反応は、別々の時刻に、別々の反応容器中で行われうるので、非常に異なったカ ップリング性質を有する構築ブロック、例えばモノマーでさえ、ライブラリー中 の目的の化合物を組み立てるために用いられ得る。本発明は、固体支持体を、構 築ブロック及び同定タグに、同時に又は逐次に（構築ブロック次いでタグ、又は タグ次いで構築ブロックのいずれかにて）曝すことにより行われ、逐次的アプロ ーチは、カップリング化学に関して更に一つ追加の柔軟性を与えうる。とにかく 、カップリング反応を行うための好ましい配置は、多様なカップリング反応が並 列で行われる配置である。 カップリング工程の各並列のシリーズを行った後に、ライブラリーのオリゴマ ー又は他の化合物がその上で合成される固体支持体をプールし、そして、次のカ ップリング工程のために、個々の容器への再配分に先だって混合される。この混 合する工程は、別個の固体支持体上に、ライブラリーの各々の別個のメンバーを 有する化合物の巨大なライブラリーを製造することである。もし各々の合成工程 が、高いカップリング効率を有する場合は、その時は、単一の固体支持体上の実 質的に全ての化合物が、同じ構造を有するか、又はもし、化合物がオリゴマーで あるならば、同じモノマー配列を有する。該構造及び配列は、合成の 最後の、任意の所与の固体支持体のための合成経路（モノマータイプ及び配列、 又は他の構築ブロックカップリング反応）によって決定される。オリゴマーの最 大の長さは、典型的には、約２０未満であり、通常は、３〜１５モノマー長であ るが、いくつかの場合には、８〜１２モノマー（残基）の長さが好ましい。 本発明と共に用いるのに適した多数のタグ及び構築ブロックが与えられると、 それによって本発明の化学ライブラリーを調製できるところの多くの化学方法が 存在する。しかしながら、各カップリング工程は、タグ又はオリゴマーのいずれ でも、許容できないレベルの欲しない反応を製造せず、また支持体上に既に存在 するタグ又はオリゴマーを破壊しないことが保証されなければならない。一つの 実施態様において、所望の反応のみが、２つの異なった又は「直交した」タイプ の保護基を用いて保護されたタグ及びオリゴマー付着のために、化学的反応性基 を有する固体支持体を用いることによって起こることが保証される。固体支持体 は、第一の脱保護試薬又は活性化剤に曝され、第一のタイプの保護基が、例えば 、オリゴマー合成部位として機能する化学的反応性基から除かれる。第一モノマ ーを用いた反応の後、そして任意的なブロック化工程の後、固体支持体は、第二 のタイプの保護基を除去する第二の活性化剤に曝されて、例えば、同定タグ付着 部位として機能する化学的反応性基を曝す。その後、タグは連結され、そしてこ れらの工程が、典型的には１〜約２０回繰り返され る。 Ａ．オリゴヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラリー 一つの重要な実施態様において、本発明は、多様なペプチドの巨大なライブラ リーの合成に関する。多くの他の化合物及びオリゴマーが、方法（Gait，Oligon ucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press，Oxford(1984); Frie senとDanishefsky，11989，J. Amer. Chem. Soc. 111:6656; 及びPaulsen，1986 ，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25:212参照、これらは引用することにより本明 細書の一部である）によって作られる一方、ペプチドの固体状態での合成技術は 特に重要であり良く知られており（Merrifield，1963，J. Am. Chem. Soc. 85:2 149-2154参照、これは引用することにより本明細書の一部である）、そしてペプ チドライブラリーは種々の目的にとって非常に有用である。Merrifield法におい ては、アミノ酸は、不溶性ポリマーで作られた支持体に共有結合的に結合される 。アルファ−アミノ保護基を有する他のアミノ酸は、共有結合的に結合されたア ミノ酸と反応してジペプチドを形成する。保護基が除かれ、そしてアルファ保護 基を有する第三のアミノ酸がジペプチドに付加される。この手順は、所望の長さ 及び配列のペプチドが得られるまで続けられる。当業者に公知の保護基は、疑似 カップリングを防ぐために（The Peptides, Vols．1&3(eds．Gross，E.，and J ．Meinhofer，Academic Press，Orlando(1979& 1981)参照、これらは引用することにより本明細書の一部である）、又はカップ リングを制御するために用いられ得る。光に不安定で、塩基に不安定で、かつ酸 に不安定な保護基、及びそれらの組み合わせがすべて、本発明の種々の目的のた めに用いられ得る。 更に、アミノ酸のＬ及びＤ体が、本明細書中に記載のペプチド合成において用 いられ得る。Ｄアミノ酸を用いることは、米国特許出願シリアル番号第 08/3094 51号明細書（1994年９月21日出願、これは引用することにより本明細書の一部で ある）に記載の「レトロ−インベルソ ペプチド（retro-inverso peptides）」 の合成において有用である。このようなレトロ−インベルソペプチドは、同じア ミノ酸配列を含むが、Ｌ−アミノ酸を用いて合成されたペプチドからの逆の立体 化学を有する。 本発明が、ペプチドライブラリーを製造及びスクリーニングするために用いら れた場合は、選択されたタグは、核酸である。ペプチド合成のための種々の互換 性の化学及びオリゴヌクレオチド同定タグの順次の付着による一連の連続工程が 存在する。しかしながら、ペプチド合成の間、オリゴヌクレオチドタグの完全性 を維持するために、合成されたタグ又はオリゴマーの分解を避けるべく、種々の 組み合わせの保護基及び／又は合成ヌクレオチドを用いることが必要かもしれな い。一般に、ポリピリミジンオリゴヌクレオチドタグは、天然のプリンヌクレオ チドを含有するオリゴヌクレオチドタグとは異なり、典型的なペプチド合成 条件下で比較的安定であるが、ポリピリミジンヌクレオチドタグは、幾分かは、 ＰＣＲによる増幅で処理しがたいかもしれない。所望の増幅効率を達成するため に、プリン塩基、又は類似体、例えば、７−デアザ−デオキシアデノシン及び７ −デアザ−デオキシグアノシン（これらは、ペプチドカップリング（及び脱保護 ）条件に耐える能力について試験された）をタグ中に取り込む必要があるかもし れない。本発明の目的のために、タグは任意的に、１０〜９０％、より好ましく は３５〜５０％、最も好ましくは３３〜３５％のプリン又はプリンアナログヌク レオチドを含みうる。オリゴヌクレオチドタグは、精製、ハイブリダイゼーショ ン、増幅又は検出を容易にするために、任意的に、ビオチン又は他の記録基を取 り込みうる（Pierce Immuno Technology Catalog and Handbook, 1991参照、こ れは引用することにより本明細書の一部である）。 従って、本発明のオリゴヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラリー を製造するために用いられる化学の選択において、（１）適した官能基を有する 固体支持体の選択、（２）アミノ酸カップリング化学の選択、（３）オリゴヌク レオチドタグカップリング化学の選択、（４）種々のタグ、モノマー及びオリゴ マーのための保護基の選択、及び（５）脱保護の選択、そしていくつかの実施態 様においては（タグ又はペプチドのいずれかのための）切断化学の選択な成され なければならない。当業者は、いくつかの適用が、その他と同じ結果を与えない のと同様に、上 記選択の全てが全ての場合に成される必要はないということを認識している。た とえば、１以上の保護基は、全ての適用には要求されないかもしれない。しかし ながら、一般の場合には、これらの選択の各々が重要である。 カップリング化学及びオリゴヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラ リーの合成のための保護基の選択に関する要素を考えるために、市販のＦｍｏｃ で保護されたアミノ酸は標準のMerrifield化学を用いて連結され、そしてオリゴ ヌクレオチドタグは標準ホスホラミダイト化学を用いて連結されるという合成を 考える。手順は、以下の工程を有するとして考察されうる、（１）ビーズに付着 されたリンカー又はペプチドからのアミノ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去工程、（２ ）Ｆｍｏｃ保護された（側鎖も同様に保護されうる）アミノ酸を工程（１）で製 造された遊離のアミノ酸にカップリングする工程、（３）未反応の遊離のアミノ 酸の任意的なキャッピング工程、（４）ヌクレオチドタグが付着されるべきビー ズ又はタグ上のヒドロキシル基からのＤＭＴ保護基の除去工程、（５）５’−Ｄ ＭＴ保護基、並びにビーズのホスフェート及び環外アミン上の保護基とヌクレオ チドホスホラミダイトをカップリングする工程、（６）任意的に、任意の未反応 の遊離のヒドロキシル基をキャッピングする工程、（７）オリゴヌクレオチドタ グのリンの酸化工程、及び（８）ペプチド及びオリゴヌクレオチドタグの脱保護 工程。これらの各工程を、以下で議論する。 （１）ビーズに付着されたリンカー又はペプチドからのアミノ末端Ｆｍｏｃ保 護基の除去は、その次のアミノ酸モノマーの付着の前に要求される。典型的には 、ＤＭＦ中の３０％ピペリジンを用いた、約１時間の処理が、この脱保護（工程 ８もまた参照）を達成するために用いられるが、本発明の一つの観点は、オリゴ ヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラリーの合成のためのピペリジン の減少した濃度又は減少した脱保護時間の使用に関する。ピペリジンは、メチル トリエステルで保護されたオリゴヌクレオチドタグの脱保護を起こすことができ 、そしてＯ−メチルホスフェート保護基は、ピペリジン切断を受けやすいとして 知られた標準のベータ−シアノエチル基より大きい塩基安定性を有する。好まし い本発明のＦｍｏｃ脱保護条件は、５〜１５％好ましくは１０％のピペリジンで 、５〜６０分間好ましくは１０〜２０分間、及び１５〜３０％のピペリジンで１ ５〜３０分間である。Ｆｍｏｃ除去をもたらす他の公知の処理は、ＤＢＵ（1,8- ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク−７−エン）を用いた処理（例えば、５％ＤＢ Ｕで５分間）である。しかしながら、Palomら，Tetr. Lett. 34:2195-2198（こ れは引用することにより本明細書の一部である）による報告は、このような処理 が、チミジンのＮ−３でのメチル化を結果しうると示唆している。ＤＢＵで仲介 されるＦｍｏｃ除去は、いくつかの用途において有効であり得るが、塩基改変の 可能性も認識されている。 （２）Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を、ビーズ又はペプチド上の遊離のアミノ 基にカップリングすることは、標準ＢＯＰカップリング化学（The Peptides、前 掲、参照）を用いて達成されうる。典型的には、１：１のＤＭＦ／ＤＣＭからな る溶液中のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸の混合物（１１０ｍＭ）、ＨＢＴＵ（１ ００ｍＭ）、ＨＯＢｔ（１００ｍＭ）及びＤＩＥＡ（３００ｍＭ）の混合物が、 アミノ酸カップリングを果たすために用いられる。他の活性化化学が、この例で 適用されることができ、例えば、ＨＡＴＵを用いたＨＢＴＵ／ＨＯＢｔの置換で ある。しかしながら、本発明の一つの実施態様において、反応混合物は、３：１ のＤＭＦ／ＤＣＭからなる溶液中の５５ｍＭのＦｍｏｃ保護されたアミノ酸、５ ０ｍＭ ＨＢＴＵ及び１５０ｍＭ ＤＩＥＡからなり、この実施態様は、試薬デ リバリ−ボトルが限定されうる装置を用いた使用にとって好ましい。側鎖は、同 様に保護されることができ、Ｆｍｏｃ／^tＢｕ保護が、構築ブロックの市販入手 性の故に、殆どの目的にとって好ましい。側鎖保護を有した他の有用なアミノ酸 構築ブロックは、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａ ｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（Ｏ^tＢｕ）、Ｇｌｕ（Ｏ^tＢｕ）及びＬｙｓ（^tＢｏｃ ）、及び光に不安定な保護基によって提供される側鎖保護を有するアミノ酸を含 む。 （３）未反応の遊離のアミノ基の任意的なキャッピングは、無水酢酸及び１− メチルイミダゾールを用いた処理、 又は本技術分野において知られている他の方法によって達成されうる。 （４）ヌクレオチドタグがそれに付着されるべきビーズ又はタグ上のヒドロキ シル基からのＤＭＴ保護基の除去は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、即ちＣＨ₂Ｃ ｌ₂中の１％ＴＣＡを用いた処理によって達成されうる。もし、ホスフェート及 びヌクレオチド（即ち、デオキシシチジン、７−デアザ−デオキシアデノシン及 び７−デアザ−デオキシグアノシン）の環外アミン上で酸不安定な保護基を用い る場合は、その時は、それらの基は、５’−Ｏ−脱トリチル化において用いられ るＴＣＡ（典型的には１〜３％）に十分に強い耐性であるべきである。 （５）ホスフェート酸素上の並びにオリゴヌクレオチドタグの塩基の環外アミ ン上の保護基の必要性について考慮しなければならないけれども、５’−ＤＭＴ 保護基とヌクレオチドホスホルアミダイトをカップリングすることは、標準ホス ホルアミダイト化学を用いて達成されうる。核酸に関する光で不安定な保護基に ついては、ＰＣＴ特許公開第 WO 92/100092号公報、及びBaldwinら，1990，Tetr . Lett. 46:6879-6884参照（これらは引用することにより本明細書の一部である ）。上記した如く、適したホスフェート保護基は、Ｏ−メチル及びベータ−シア ノエチル基を含むが、Ｏ−アリル及び／又はＮ−アリルオキシカルボニル基（即 ち、３−（アリルＮ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトの取り込みに よる）もまた、それぞれ、ホ スフェート酸素及びヌクレオチド塩基の環外アミンを保護するために用いられ得 る（Hayakawaら，1990，J. Amer. Chem. Soc.112:1691-1696参照、これらは引用 することにより本明細書の一部である）。アリル基保護基は、トリス（ジベンジ リデンアセトン）ジパラジウム−クロロホルム錯体、トリフェニルホスフィン及 びｎ−ブチルアミン／ギ酸を含有するＴＨＦを用い、次いでＴＨＦ洗浄、水性Ｎ ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートナトリウム洗浄及び水洗浄を行うことにより 除かれうる。ホスホルアミダイトカップリングは、試薬、たとえば、１Ｈ−テト ラゾール、４−ニトロフェニルテトラゾール、ピリジニウムヒドロクロリド／イ ミダゾールを用いて仲介される。後者のホスホルアミダイト活性化剤は、ペプチ ド又はオリゴヌクレオチド上の、窒素での疑似の反応が低いレベルにて起こる代 価を払って、選択的５’−Ｏ−亜リン酸化をもたらす（GryaznovとLetsinger,19 92，Nucleic Acids Research 20:1879-1882参照、これは引用することにより本 明細書の一部である）。 （６）未反応の遊離のヒドロキシル基の任意的なキャッピングは、無水酢酸及 び１−メチルテトラゾールでの処理により、又は無水酢酸／ルチジン／ＤＭＡＰ での処理により達成されうる。 （７）オリゴヌクレオチドタグのリンの酸化は、ヨウ素及びピリジンでの処理 により、又はＩ₂、コリジン、Ｈ₂Ｏ中のＭｅＣＮでの処理により達成されうる。 或いは、リン での酸化のために穏和な酸化剤、^tＢｕＯＯＨ を用いることにより、アミノ酸 、即ち、メチオニン、トリプトファン及びヒスチジンの酸化を最少にできる（Ha yakawaら，1990，Tert. Lett. 27:4191-4194参照、これは引用することにより本 明細書の一部である）。 ペプチド及びオリゴヌクレオチドタグの脱保護は、ジクロロメタン中の１％Ｔ ＣＡを用い、次いでチオフェノール／ＮＥｔ₃／ジオキサン（１：２：２）を用 い、次いでエチレンジアミン／ＥｔＯＨ（１：１）を用い、５５℃にて行う逐次 処理にて達成されて、タグから保護基が除かれ、そして次いで、トリフロロ酢酸 （９５：５ＴＦＡ／水、カチオンスカベンジャー併用）が、酸に不安定なアミノ 酸保護基を除くために用いられる。強酸（例えば、ＴＦＡ）に対するプリンヌク レオチドの不安定性は、プリンヌクレオチドアナログのホスホルアミダイト、７ −デアザ−２’−デオキシアデノシン及び７−デアザ−２’−デオキシグアノシ ンを用いることにより回避されうる（Barrら，1986，BioTechniques 4:28-432、 及びScheit，Nucleotide Analogs: Synthetic and Biological Function pp.64- 65(John Wiley and Sons，New York)参照、これらは共に引用することにより本 明細書の一部である）。 次の章は、オリゴヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラリーの合成 のための一つの好ましい実施態様を説明する。 Ｂ．オリゴヌクレオチドタグが付与されたペプチドライブラリーの改善された合 成方法 実際的なビーズに基づいたオリゴヌクレオチドエンコードされたペプチドライ ブラリーの確立は、いくつかの重要な技術の基準を満すことを要求する。これら は、（ｉ）ペプチド及びオリゴヌクレオチドの並列での組立のための相互に相容 性である化学の開発、（ii）適当な物理的特徴を有するビーズ物質の選択、（ii i）標的レセプターに結合するリガンドを担う小さなビーズの簡単な単離、及び （iv）例えば、ＰＣＲ増幅及び単一ビーズからのテンプレートタグＤＮＡの配列 決定による単一ビーズからのタグの成功した解読を含む。本発明は、このような ライブラリーの改善された合成方法を提供することであり、そしてこの章及び実 施例１中で説明されている如く、このことは、直径１０μｍのポリスチレンビー ズ上で、組み合せペプチド合成をエンコードするために、一本鎖オリゴヌクレオ チドタグをどのように用いるかを示した。 この改善された方法においては、ペプチド及びヌクレオチドは、並列で組み立 てられ、各ビーズが、単一のペプチド配列及び独特のオリゴヌクレオチド同定タ グの両者の多数のコピーを担うように合成を変える。オリゴヌクレオチドは、共 通の５’及び３’−ＰＣＲプライミング部位を共有し、それ故、ビーズは、ＰＣ Ｒのためにテンプレートとして働きうる。その方法を説明するために、約８．２ × １０⁵のヘプタ−ペプチドのエンコードされた合成ライブラリーが作られ、抗ダ イノルフィンＢモノクローナル抗体Ｄ３２．３９（Cullら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869、これは引用することにより本明細書の一部であ る）への結合について、抗体に強く結合する個々のビーズを選択すべく蛍光活性 化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）装置を用いてスクリーニングされる。選び出し たビーズ上でのオリゴヌクレオチドタグのＰＣＲ増幅の後、ペプチドリガンドの 同定を決定するために、ＤＮＡは、以下により詳しく記載されるように、配列決 定される。 本発明の方法の一つの重要な観点（これは、以下の実施例１中に更に詳細に記 載されている）は、ペプチド及びタグの合成のために選択された個体支持体であ る。固体支持体、即ち直径１０μｍのビーズは、マクロ孔性のスチレン−ジビニ ルベンゼンコポリマーから形作られ、そしてドデシルアミンリンカーを用いて誘 導体化されたものであるのが好ましい。これらのビーズに装填されたアミノ基は 、Ｆｍｏｃ−グリシンを用いた徹底的なアシル化、それに続くＦｍｏｃ基のピペ リジン切断及び遊離されたピペリジン−ジベンゾフルベン付加物の分光光度的定 量（ｅ₃₀₂＝7800 l mol^-1cm^-1）によって、約１００μモル／ｇであると概算さ れた。５×１０⁹ビーズ／ｇを用いると、これは、約２０ｆｍｏｌ／ビーズの最 大ペプチド荷重に相応する。適当に保護されたアミノ酸とオメガヒドロキシ酸の 混 合物を用いたビーズのアシル化は、そこからペプチド及びヌクレオチド鎖がそれ ぞれ延長されうる、直交的に異なったアミノ及びヒドロキシル基を提供する。ビ ーズ当たりのオリゴヌクレオチドに対するペプチドの平均化学量論量は、開始の ビーズに連結されているアミノ及びヒドロキシル酸の比を変えることにより制御 される（下記参照）。標準Ｆｍｏｃ化学を用いた、トリフロロ酢酸で切断可能な クノールリンカー（Bernatowiczら，1989，Tetr. Let. 30:4645-4648、これは引 用することにより本明細書の一部である）を備えたこれらのビーズ上のテストペ プチド合成（５量体〜１２量体）は、高い精度で進行すると判り、該高い精度は 、粗製の切断されたペプチドカルボキサミドのＨＰＬＣ分析による測定では、慣 用のペプチド合成樹脂上で行われる合成とは区別されない。 並列の合成戦略は、互いに直交しており、そしてポリマー鎖の各々が第二鎖の 合成及び脱保護において用いられる試薬に対して安定である、アミノ酸及びヌク レオチド構築ブロック上の一セットの保護基の使用を要求する。原則として、種 々の保護／脱保護機構が用いられ得る（上記したように）けれども、ペプチド構 築ブロック上のＦｍｏｃ／^tＢｕ保護が好ましい。なぜなら、広範囲の市販の天 然の及び非天然のアミノ酸がこの方法にて保護されるからである。しかしながら 、^tＢｕに基づいたペプチド側鎖保護基は、除去のために強酸（典型的には、ト リフルオロ酢酸）での処理、２’−デオキシアデノシン（ｄＡ）又は ２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）のいずれかを含有するオリゴヌクレオチドの 迅速な脱プリン化(depurination)をもたらしうる条件（Capon，1969，Chem. Rev . 69:407-409、これら引用することにより本明細書の一部である）を要求する。 この問題は、テンプレートオリゴヌクレオチドタグ中の、ｄＡの代わりに７−デ アザ−２’−デオキシアデノシン（ｃ⁷ｄＡ）を用いることによって、回避され る。デアザプリンヌクレオシドのグリコシド結合は、酸触媒加水分解に対して耐 性であり（Scheit，1980，Nucleotide Analogs: Synthesis and Biological Fun ction (John Wiley and Sons，New York)pp.64-65参照、これは引用することによ り本明細書の一部である）、そしてこれらのモノマーを含むオリゴヌクレオチド は、ＰＣＲにおいて用いられる温度安定性のポリマーによって、正確に複製され る（McConlogueら，1988，Nucl. Acid.,Res. 16:9869、及びBarrら，1986，BioT echniques 4:28-432参照、これらは引用することにより本明細書の一部である） 。酸耐性グアノシンアナログはまた、テンプレートＤＮＡ中に取り込まれうる。 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル２’−デオキシヌクレオシド３’−（Ｏ−メチ ル−Ｎ．Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトは、全ての並列合成にて用 いられた。ＤＮＡ合成プロトコルにおいて、ヌクレオチドホスファイト中間体を ホスホトリエステルに転化するために用いる試薬（Ｉ₂／コリジン／アセトニト リル）は、容易に酸化され る残基、Ｔｒｐ及びＭｅｔのいずれか、又は他の保護されたアミノ酸のいずれか に悪影響するとは見い出されなかった。成長しているオリゴヌクレオチド鎖から の５’−Ｏ−ＤＭＴ基の完全な除去は、ジクロロメタン中の１％トリクロロ酢酸 （ＴＣＡ）を用いて約４０秒で達成されたが、一方、チロシノの^tＢｕエーテル 誘導体を除くＦｍｏｃ／^tＢｕ化学で慣用的に用いられる全ての酸に不安定な側 鎖保護基は、１％ＴＣＡで１時間の処理に対して不活性である。Ｆｍｏｃ−Ｔｙ ｒ（Ｏ−Ｂｚ）は、チロシン含有ペプチドの合成における適した代りを証明し、 Ｏ−ベンゾイルエステルは、ペプチド合成においてアルファ−Ｎ−Ｆｍｏｃ保護 基に除去のために用いられたＴＣＡ及びピペリジンの両者に対して抵抗する。ア ルファアミノ酸残基の定量的な脱保護は、ピペリジン／ＤＭＦ（１０％ ｖ／ｖ ）を用いた５〜１０分間の処理を要求し、そしてまた、保護されたポリヌクレオ チドホスホトリエステルの部分的脱メチル化を結果した（t_1/2 約４５分）。対 照実験は、得られたホスホジエステル種の、引き続くヌクレオチド鎖延長の間の 、異常なホスファイト化が、最終のオリゴヌクレオチド脱保護工程によって逆転 されることを示している（Lehmannら，1989，Nucl. Acids Res. 17:2379-2390参 照、これは引用することにより本明細書の一部である）。並列合成の完成におい ては、ＤＮＡは、チオフェノレートによる処理（ホスフェート Ｏ−脱メチル化 ）次いでエタノール性エチレンジアミン’による処理（保護されたシチ ジン及び７−デアザ−アデニン残基の脱ベンゾイル化）によって完全に脱保護化 される。これらの穏和な、無水のアミノリシス条件は、標準条件下でＴＦＡを用 いて脱ブロックされた保護されたペプチド配列に悪影響しない（Jubyら，1991，Tetr. Lett. 3:79-882参照、これは引用することにより本明細書の一部である） 。 オピオイドペプチドダイノルフィンＢのカルボキシ末端領域（ＹＧＧＦＬＲＲ ＱＦＫＶＶＴ）（配列番号１）は、抗ダイノルフィンＢモノクローナル抗体Ｄ３ ２．３９のエピトープを表すことは既に示されている（Cullら参照、前掲）。可 溶性ヘプタペプチド、ＲＱＦＫＶＶＴ（配列番号２）は、高親和性（Ｋｄは、約 １ｎＭ）にてＤ３２．３９に結合する。このペプチドの及び６９塩基オリゴデオ キシヌクレオチドの並列合成は、酸で切断可能なＦｍｏｃ保護されたカルボキサ ミド（Ｋｎｏｒｒ）リンカーを担う直交的に区別されたビーズ上にて成された。 最初の２０ヌクレオチドの付加の後、ビーズは、ピペリジン／ＤＭＦで処理され 、そして最初のペプチド残基（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（^tＢｕ）−ＯＨ）は遊離のア ミンに連結した。その後、ビーズを２サイクルのホスホルアミダイト化学及び次 のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ）のカップリングに付した。この手順を、 ヘプタペプチド配列及びヌクレオチドコード領域が完全に作られるまで繰り返し 、その後、ＤＮＡは、更に３５ヌクレオチド延ばされて、ＰＣＲのためのスペー サー領域及び５’−プライミング部位を提供する。 ビーズは最後に、完全なオリゴヌクレオチド及びその後、ペプチド脱保護条件に 曝され、そして切断されたペプチドを含有するＴＦＡ上澄み液を逆相ＨＰＬＣに よって分析した。ＨＰＬＣの結果は、並行含成からの粗製ペプチドが単一の主要 な成分（真正のＲＱＦＫＶＶＴ（配列番号２）とともに溶出）からなること、そ してこの粗製の生成物は、オリゴヌクレオチド化学が生じない対照のみペプチド 合成にて生じるものから著しく異なっていないことを示した。 Ｔ、ｄＣ及びｃ⁷ｄＡを含有するテンプレートＤＮＡの並列合成化学に対する 安定性を、標準のプリンヌクレオチドｄＡを含有するアナログ標的と比較した。 ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ サイトメーターの単一ビーズクローニング能力を用 いて、２つの合成からの個々の脱保護されたビーズを、マイクロフュージチュー ブ中に分類し、そして４５サイクルのＰＣＲを通じて増幅されたオリゴヌクレオ チドテンプレートにつないだ。予期されたサイズ及び配列の「きれいな」増幅生 成物が、デアザプリンを含むテンプレートのみから得られた。従って、このオリ ゴヌクレオチドの完全性は、並列ペプチド合成の過程を通じて維持され、単一の ビーズからのテンプレートが容易に増幅されそして配列決定されうるということ が示された。 １０μｍのビーズに付着された８２３５４３（７⁷）の異なったヘプタペプチ ドを含むように設計されたエンコードされたライブラリーは、７つのアミノ酸構 築ブロック、 Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ及びＴｈｒを用いた組み 合せ合成により構築された。アルファ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ターシャリーブ チル）−オキシベンゾトリアゾール（保護されたスレオニン）及びスクシニミジ ル４−Ｏ−ＤＭＴ−オキシブチレート残基が、最初に、全てのビーズに連結され て、この合成のための直交的に区別されたアミノ酸及びヒドロキシル基を提供し た。平均して、各ビーズは、ＤＮＡタグの分子当たり、２０分子の単一のペプチ ド配列を担う。各アミノ酸付加は、特徴的なジヌクレオチド単位を構築すること によってエンコードされ、そして７サイクルのペプチドカップリングの後、ビー ズは集められ、そしてＤＮＡ合成が完成した。３５ｍｇの全ビーズ重量（１．７ ５×１０⁸個のビーズ）からの開始は、各ペプチド配列がライブラリー中の約２ ００の異なったビーズ上に出現することを保証した。ライブラリーを均等に分け たものの一つのペプチドのミクロ配列決定分析は、７アミノ酸が、変性したヘプ タペプチド混合物の各位置間に、確率論的に分配されたということを確認した（ Ｌ−バリン及びＤ−バリンは、エドマン分解法では区別されないということを注 意すべきである）。 対照ビーズ及びビーズライブラリーへのモノクローナル抗体Ｄ３２．３９の結 合は、フローサイトメトリーにより分析した。ポジティブな対照配列ＲＱＦＫＶ ＶＴ（配列番号２）及び６９マーのオリゴヌクレオチドタグを運ぶビーズは、抗 体により強く染色されたが、一方、ブランクの ビーズは染色されなかった。対照的に、エンコードされたライブラリーの少ない 画分のみがＤ３２．３９に結合した。１０⁵の事象（イベント）の分析はバック グランドより上に染色された、ライブラリーの約２％を示した。重要なことに、 Ｄ３２．３９へのこの結合は、可溶性のＲＱＦＫＶＶＴペプチド（配列番号２） を用いたモノクローナル抗体の予備温置によって完全にブロックされるので、組 み合わせ部位に特異的である。ポジティブ対照ビーズと比べて蛍光強度を有する ライブラリーからの個々のビーズは、ＰＣＲによるタグ増幅のためにマイクロフ ュージチューブ中に分けられた（集団の上位０．１７％中の蛍光を有するビーズ が集められた）。増幅反応は、前の増幅からの可溶性生成物の持ち込みを防止す るために、ｄＵＴＰ及びウラシルＤＮＡグリコシダーゼを含んだ（Longoら，199 0，Gene 93:125-128参照、これは引用することにより本明細書の一部である）。 ヌクレオチド配列が１２の分類されたビーズから得られた。演繹されたペプチド 配列を表１に示す。バックグランドを著しく超えない蛍光を有する単一のビーズ から得られた代表的なペプチド配列もまた比較のために表にした。 表１のデータは、Ｄ３２．３９の好ましい認識配列が、ダイノルフィンＢの６ アミノ酸フラグメントＲＱＦＫＶＶに局在されているということを示す以前の研 究（Cullら、前掲参照）と一致する。正に荷電した残基アルギニン及びリジンは 、エピトープの第一及び第四の位置に強く好まれ、そしてフェニルアラニンは、 この主題の第三の残基として専ら表れる。第二の位置では、グルタミンが、この ライブラリーの好ましい残基であり、一方、脂肪族のｂ−分岐したアミノ酸バリ ン（Ｌ−エナンチオマーのみ）及びスレオニンは、明らかに第５及び第６残基と して好ましい。Ｄ−バリンは、一致する主題の外の位置にて最も許容されるよう である。選択されたペブチドの親和性の範囲（Ｋｄ 約０．３〜１４００ｎＭ） は、結合アッセイ：標識された第二抗体を用いた二価の一次抗体検出の設計を仮 定して、予期されなかった。結合価の操作（たとえば、直接標識された一価のレ セプターを用いることによる）及び洗浄条件の厳重性は、最も高い親和性のリガ ンドのみを単離する能力を改善する。 ３．小さな分子合成 前記した如く、主として、ペプチド及び他の大きなポリマーライブラリーの合 成に関して記したけれども、本発明の種々の観点は、他の化学合成にも同様に適 用できる。特に、本発明の装置及び方法は、多くの合成プロトコル、例えば、小 さな分子合成において、種々の化学合成工程を行 うために用いられ得る。装置は、特定の分子のための合成プロトコルに適合した 試薬を選択的に添加するための、化学合成計画にて用いられ得る。 更に、異なった合成プロトコルが、上記したペプチド合成と同様に並列で行わ れることができ、そこでは、異なった試薬が異なった工程にて加えられて、固体 支持体上に小さな分子の多様なライブラリーを製造する。これらの多様なライブ ラリーは、本明細書中で記した方法により、所望の特徴についてスクリーニング されうる。更に、このような小さな分子の多様なライブラリーが望まれる場合は 、ライブラリーは、分子のライブラリーの各々の別々のメンバーの合成に関与す る合成工程をエンコードするようにタグが付与されうる。 固体支持体上でのこのような小さな分子の合成の例は、たとえば、チアゾリジ ノン、メタチアゾリジノン、及びそれらの誘導体を含み、それらは、本明細書中 の実施例２、及び米国特許出願シリアル番号 08/265090号明細書（1994年６月23 日出願）（これは引用することにより本明細書の一部である）に記してある。 Ｄ．可溶性ライブラリーの製造方法 いくつかの用途にとっては、「ビーズフリーの」又は「可溶性の」分子ライブ ラリーが望まれる。可溶性分子は、タグが付与された及びタグが付与されていな いものの両者とも、種々の目的（化合物の活性の測定（第VI.B章参 照、下記）及びタグの増幅を含む）のために有用である。タグが付与された及び タグが付与されていな可溶性の分子ライブラリーを製造する、及び固体支持体上 で合成されたタグが付与された及びタグが付与されていない化合物を可溶化する ための種々の方法がある。典型的には、切断可能なリンカーがこのような方法に て用いられる。 たとえば、そしてII.B章で記したように、切断可能なリンカーが、タグが付与 された又はタグが付与されていない分子をビーズ又は他の固体支持体から切断す るために用いられることができ、従って、目的の分子が可溶化される。可溶性の タグが付与された分子を製造するために、切断可能なリンカーが、ビーズ又は他 の固体支持体に付着され、少なくとも二つの官能性基（その一つは、目的の分子 を合成するためのもので、他の一つはタグを合成するためのものである）を有す るであろう。このようにして、分子及びタグが共通のリンカーに付着されて合成 され、次に、それは固体支持体に結合される。いったん分子及びタグが合成され ると、リンカーは切断されて可溶性のタグが付与された分子を提供する。 単一の、平面の固体支持体が、ライブラリーを合成するために用いられること ができ、そしてメンバーは、スクリーニングに先立ち、非常に大きなスケールの 固定化ポリマー合成（ＶＬＳＩＰＳ（商標））技術を用いて、固体支持体から切 断されうる。米国特許第5143854号明細書及びＰＣＴ特許公開第 92/19982号公報 参照（これらは引用す ることにより本明細書の一部である）。一つの実施態様において、オリゴヌクレ オチドの配列が、ＶＬＳＩＰＳ（商標）上に合成され、そして各オリゴヌクレオ チドは、切断可能なリンカーによって、例えばジスルフィド結合でその小片に連 結される（米国特許出願シリアル番号第874849号明細書（1992年４月24日出願） 参照、これは引用することにより本明細書の一部である）。オリゴヌクレオチド タグは、タグが付与されされるべき分子（これは典型的にはオリゴマー及び好ま しくはペプチドである）の付着のために、遊離の官能基、たとえばアミンを有す る。タグは、任意的に、ピリミジン塩基、又はピリミジン及びプリンアナログ塩 基のみを含みうる。タグはまた、増幅のための結合部位、即ち、ＰＣＲプライマ ー部位、任意的に配列決定プライマー部位、及びタグが付与されるべきオリゴマ ーのモノマー配列を特有にコードする短い部分を含む。その後、オリゴマーが合 成される、即ち、タグ上の遊離の末端アミノ基又はタグに連結されたリンカーか ら、各オリゴマーがタグに連結されるようにしてオリゴマーが合成される。タグ が付与されたオリゴマーのコレクションは、リンカーを切断することにより小片 から解放することができ、可溶性のタグが付与されたオリゴマーを製造すること ができる。 他の利点は、可溶性の分子ライブラリーを製造することにより認識されうる。 いずれのビーズに基づいたライブラリーにおいても、ビーズのサーイズ（量）は 、組み立てられ うるライブラリーの大きさに実質的な限定を負わせる。例えば、数グラムのビー ズが、１０⁹の、異なったタグが付与された分子を含有するライブラリーを組み 立てるために要求されうる。本発明は、はるかにより巨大なライブラリーをより 実用的に得ることを可能とする、タグが付与された分子ライブラリーを合成する ための改善された方法を提供する。この改善された方法は、ある手段を提供し、 それによって、化合物は、混合工程に先だって固体支持体から解放されるが、各 カップリング工程に先だって固体支持体に付着される。 この方法において、タグが付与された分子は、可逆的な手段によって固体支持 体上に固定化され、方法の各混合工程の間、支持体からタグが付与された分子を 解放できる。一つの実施態様において、この可逆的結合は、限外ろ過膜（適した 膜としては、Millipore Catalogue中の「Commercial Compatibility Chart」参 照、これは、合成方法において用いられる種々の溶媒及び化学物質に対して不活 性な膜を示している）によって提供される。約２０００〜１００００ダルトンの 分子量カットオフを有する膜（例えば、Amicon YM5膜）が、殆どのライブラリー のために適している。カップリング工程の間、ライブラリーの分子は、膜によっ て保持され、一方、カップリング試薬及び他の試薬は、真空吸引により膜を通じ て引出される。真空は、分子が混合工程の間混合されるように解放される。 方法の他の実施態様において、可逆的な共有結合連結は、カップリング工程の 間、タグが付与された分子を支持体に付着するために用いいられる。適した可逆 的化学連結は、（１）たとえば、チオール化されたタグが付与された分子及びＮ −ヒドロキシスクシニミジル支持体によって提供される、スルホエステル連結（ この連結は、ＮＨ₂ＯＨ濃度によって制御されうる）、及び（２）たとえば、チ オール化されたタグが付与された分子及び２−ピリジルジスルフィド支持体（例 えば、Sigmaから出ているチオールセファロース）によって提供されるジスルフ ィド連結（この連結は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）濃度によって制御されう る）を含む。 VI．アッセイ法 リガンド開発のための大きな組み合せライブラリーの利用は、強力なそして親 和性に敏感なアッセイ方法論の利用性に著しく依存する。本発明は、エンコード された合成分子ライブラリーと共に用いるための多くの新規なアッセイを提供し 、それは、広範囲の種々の用途を有する。例として、このようなライブラリーは 、レセプターに結合するリガンド、たとえば、蛋白質に結合するペプチド及び核 酸、治療的な標的レセプターに結合する薬剤、及び抗体によって認識される（天 然の及び合成の）エピトープを同定するため、並びに、医療、農業及び医療診断 用途にて種々の化合物を同定するためにアッセイにおいて用いられ得 る。これらの多様な用途が与えられると、広範囲の種々のアッセイ方法が本発明 に関係してある。２つの重要なタイプのアッセイは（いくつかはオーバーラップ しているが）、ビーズに基づいたアッセイ及び可溶性分子のアッセイを含む。 しかしながら、一般に、このようなアッセイは、典型的には以下の工程を含む 。ライブラリーは、ライブラリー中の各々の異なった分子が目的のレセプターに 対する結合能力についてアッセイされることによってスクリーニングされる。レ セプターは、合成分子のライブラリーと接触されて、レセプターと、アッセイ条 件下でレセプターに結合できるライブラリー中のいずれかの分子との間の結合さ れたメンバーを形成する。結合された分子は、次いで、該分子に関連するタグを 調査することにより同定される。一つの実施態様において、結合条件下でライブ ラリーがそれに曝されるところのレセプターは、レセプターの混合物であり、そ の各々は、レセプタータイプを特定化する同定タグと関連しており、従って、２ のタグが、結合アッセイの後に調査される。 Ａ．ビーズに基づいたライブラリーのスクリーニングアッセイ 特定のビーズがレセプタースクリーニングにおいて単離される場合は、ビーズ は、無限希釈、マイクロマニュピレーション、又は好ましくはフローサイトメト リーを含む 多くの手段によって、個々に分離されうる。束縛されたリガンドのライブラリー は、可溶性の標識されたレセプターを用いて結合アッセイにおいて最も効率的に 評価される。細胞の大きさの固体支持体又はビーズを採用することにより、高感 度のレセプター結合分析及び容易なビーズ取り扱いのためにフローサイトメトリ ーを用いることができる。 フローサイトメトリーは（これは通常は、蛍光活性化細胞ソーティング又はＦ ＡＣＳと言われる）、本発明の目的のために「蛍光活性化分子ソーティング」又 は「蛍光活性化ビーズソーティング」と同じとしてみなされるべきである。細胞 表面抗原又はレセプターを発現する哺乳動物細胞をクローニングするためのＦＡ ＣＳ法における当業者は、本発明のアッセイ方法を容易に実行できる。一般に、 これらのアッセイは、分子ライブラリーの多様な分子を表すビーズの混合物に対 する蛍光タグで標識されたレセプターの結合を含む。非結合の又は非特異的に結 合したレセプターを洗浄して除いた後、ＦＡＣＳ装置を用いてビーズをソートし 、そして、同定し、高い蛍光を示す個々のビーズに物理的に単離する。Methods in Cell Biology，Vol.33(Darzynkiewicz，Z，とCrissman，H.A.編，Academic P ress)及びDanglとHerzenberg，1982，J.Immunol．Meth．52:1-14参照（これらは 引用することにより本明細書の一部である）。いったん所望のビーズが単離され ると、ビーズ上の目的の分子の同定（又は分子構造、組成、 又は合成状態）を確認するためにタグを同定する。 標準ＦＡＣＳ装置は、約１０⁴事象／秒の速度にてビーズ（細胞）の蛍光分析 を可能とし、そして、単一のビーズクローニングモードで操作された場合は、ソ ート速度は、５〜１０倍遅い。非常に巨大なライブラリー（例えば、１０⁷ビー ズよりはるかに多い場合）のアッセイにおいては、親和性選択性予備スクリーニ ングのいくつかの様式が、セル−ソーターを用いた個々のビーズの単離に先だっ て用いられ得る。例えば、レセプターコートされたサブミクロンのサイズの超常 磁性粒子は、磁気活性化ソーティングを用いて、巨大な混合された集団から特定 の細胞をアフィニティ精製するためにしばしば用いられる（Miltenyiら，1990， Cytometry 11:231-238、これは引用することにより本明細書の一部である）。非 常に稀な結合事象を検出する高い可能性を得るために、ライブラリー中のおのお のの異なった化合物が、ライブラリー中で多くのビーズ上に存在しなければなら ない。１０μｍの粒子から構築されたエンコードされたライブラリーの大きさの 実際的な上限は、百倍の冗長性を考えると、恐らく、１０¹⁰〜１０¹¹ビーズ上で 合成された化合物が１０⁸〜１０⁹の化合物であろう。より大きなライブラリーが 、より小さなビーズを用いて調製されうるが、慣用のサイトメトリーは、約１μ ｍの直径よりもかなり小さい粒子を検出又は操作するのは成功しそうもない。も ちろん、本明細書中の他の場所に記した如く、本発明は、分子ライブラリーの合 成及びス クリーニングにおけるこのような小さいビーズの種々の用途を提供する。たとえ ば、本発明のオリゴヌクレオチドタグ連鎖法を用いることにより、ライブラリー の分子をソートするためにＦＡＣＳ方法論を用いる必要がない。 それにも拘わらず、本発明の目的のためのＦＡＣＳ装置の力は過小評価すべき でない。本発明の一つのアッセイ法において、タグが付与された分子ライブラリ ーが、蛍光ビーズ上で合成される。ビーズは、細胞より小さく、そして蛍光物質 からなる。ライブラリーは、目的の細胞表面レセプター、例えばＧ蛋白質連結レ セプターを高レベルでの発現する細胞の懸濁液と共に温置される。もちろん、種 々の対照、例えば、全行程を、細胞表面蛋白質を高レベルで発現しない細胞を用 いて行い、そして偽の陽性を同定するためにそれらの対照を用いることもできる 。 とにかく、レセプターを発現する細胞は、レセプターのためのリガンドを表す 何らかのライブラリーメンバーに結合できる。蛍光標識された細胞は、蛍光が結 合していないライブラリービーズ及び非標識の細胞から、光分散、又はたとえば 細胞核からの他の蛍光シグナルに基づくＦＡＣＳ装置を用いて、容易に区別及び 分離されうる。ソート後、細胞に付着されたビーズからのタグは、レセプターに 対して特異的なリガンドを同定するために試験される。用途に依存して、所望の レセプターを最も高いレベルで発現する細胞を、例えば、最も輝いている細胞の みを選択することによりソートし、そして、特異的結合事象を最大化するた めに結合条件を調節する。目的のレセプターに特異的なリガンドと他の細胞表面 レセプターに特異的なリガンドを区別するために、目的のレセプターを高いレベ ルで発現している細胞及び発現していない細胞に結合するビーズに付随するタグ を試験できる。 本発明の方法はまた、現在のＦＡＣＳ装置がソートできる最も小さいビーズよ りも小さいビーズ上に合成されたタグが付与された分子ライブラリーをソートす るために、ＦＡＣＳ装置を用いることができるようにする。この方法において、 エンコードされた合成ライブラリーは、単一の変換経路上でのエフェクター活性 についてスクリーニングされる。合成ライブラリーは、以下のいくつかの改変を 用いて構築される；（１）ビーズは、１μｍ又はそれより小さく、そしてＦＡＣ Ｓにてソートできる必要はなく、いくつかの場合には、かなり小さいビーズを用 いることが可能である、（ｂ）タグは、細胞内環境に耐性（特には、ヌクレアー ゼ耐性）であるオリゴヌクレオチドであり、ホスホロチオエートが、この目的の ために好ましい；及び（ｃ）ペプチド（又は他の多様な化学物）は、細胞内環境 内で切れるリンカーを介してビーズ支持体に付着される。このようなリンカーは 、細胞に害でない外部要因、例えば光の適用によって切断されうるリンカー、及 び、細胞内環境に不安定なリンカー、例えばホスホジエステル結合又はジスルフ ィド結合を含みうるが、いずれの場合でも、切断可能なリンカーは、並列の合成 プロセスに対して安定でなければな らない。 ライブラリービーズは、好ましくは機械的プロセス、例えば、バイオリスティ ック ブロジェクション（biolistic projection）によってレセプター細胞内に 導入される。いくつかの場合には、内部化をもたらす生物化学的に仲介されるプ ロセスが用いられ得るが、このルートは、通常、望まない細胞内区画中への取り 込み（即ち、リゾソーム局在）を結果する。いったんビーズが細胞内に存在する と、目的のペプチド又は他の成分は放出される。１０μｍのビーズが、１０¹⁰ペ プチドの（又は他の）合成部位の示された能力を有するなら、その時は、もしそ の能力が容量で計られた場合は、該物質の１μｍのビーズが、合成されたペプチ ドの１０⁷分子を含む。もし全ての合成されたペプチドが、直径約１０μｍの単 一の（球状）細胞（約０．５ｐＬの容量）中に放出された場合は、そのときは、 約３０μＭの遊離のペプチド濃度を結果する。この濃度は、ビーズ上での合成密 度によって制御されるが、より低い負荷密度は、より厳重なスクリーニング様式 （即ち、より活性な化合物のためのスクリーニング）を提供する。受容体細胞は 目的の経路の活性化又は不活性化により蛍光シグナルを製造するように設計され ている。所望の結果を生じる個々の細胞は、ＦＡＣＳ装置によって選択され、そ して、ビーズにまだ付着されておりかつ細胞内に含まれているタグが、活性合成 化合物を同定するために増幅されて配列決定される。 他の実施態様において、大きなビーズが採用され、そして、検出可能な化合物 を生じるために基質を切断することにより、蛍光又は他の検出可能なシグナルを 生じることができるレセプター（即ち、酵素ベータガラクトシダーゼ）を発現す る細胞の集団をスクリーニングするために用いられる。その後、ビーズは、細胞 の集団と混合されて、それはビーズに付着することを許される。もし、細胞表面 上のレセプターが、ビーズ上の化合物によって刺激された場合は、その時は、検 出可能な化合物が製造され、ビーズに付着した活性化された細胞を活性化されて いない細胞と分類するための基礎が提供される。適当な試薬（即ち、遊離の標識 された又はされていないレセプター）を、高親和性リガンドの選択を最大とする ために採用できる。 もちろん、目的のライブラリー分子をスクリーニング及び選択するためのフロ ーサイトメトリーについて、種々の代替法がある。一つの実施態様において、エ ンコードされた合成ライブラリーは、抗微生物活性についてスクリーニングされ て、２次元でプレートされうるバクテリア又は他の微生物、例えば、ウイルスに 感染した細胞、ガンを含む多くの真核細胞及びいくつかの原生動物の成長を阻害 する又はそれらを殺す化合物を発見できる。関係する又は関係ない化学構造の巨 大なライブラリーは、ビーズ上で合成されたペプチド又は化合物のビーズからの 放出を制御することにより、寒天培地中の細胞に対してスクリーニングされうる 。 方法の工程は以下の通りである。（１）目的の細胞を寒天プレートの上にまく 。（２）細胞を寒天の他の層で覆う。ここで他の層中では、合成されたペプチド ／薬剤を担うビーズが、個々のビーズが、例えばキャピラリーチューブを用いて 、固体寒天から引き上げられ得るような分散を提供する希釈度で懸濁されている 。（３）ビーズからのペプチド／薬剤の放出を開始する。（４）プレートを培養 して、寒天中で固定化されたビーズから、周りの寒天中及び指示細胞を含有する 下の寒天中へのペプチド／薬剤の拡散を行う。（５）個々のビーズから拡散され たテスト化合物が、指示細胞の成長／形態／表現型に影響した程度を読む。（６ ）指示細胞が所望の応答（たとえば、バクテリア繁殖の深さ）を示すゾーンを選 択し、そしてキャピラリーチューブ又は類似物を用いて、テスト薬剤がそれから 拡散されたところの元のビーズを含む寒天のゾーンを拾い上げる。（７）タグを 、例えば、個々のビーズ上のエンコードされた物質のＰＣＲ増幅により読み、所 望の応答を導き出したペプチド／薬剤の構造を決定する。そして（８）任意的に 、適当な薬剤／ペプチドを化学合成し、所望の効果を確認する。 テスト化合物をビーズから放出する種々の方法がある。例えば、ＴＦＡを用い てペプチド／薬剤をビーズから部分的に切断し、そして切断されたペプチドをビ ーズ表面上で、引き続く水（寒天）中への再懸濁が、ペプチド／薬剤の放出及び 、特定のビーズの周りの寒天のゾーンへの、放 出された化合物の局在化を可能とするような形態で乾燥させる。ビーズ環境にお ける特定の変化に感受性である化学を用いて、ビーズにペプチド／薬剤を連結す ることができ、該ビーズ環境は、寒天及び指示細胞上への被覆、又は、被覆及び 寒天の固形化後に始められ、該化学は、たとえば、光感受性連結、チオール感受 性連結、パーヨーデート連結等である。これらの化学試薬は、必要ならば、それ 自身で、他の薄い寒天上掛けを通じて拡散することができる。このような放出化 学は、テスト物質の完全性、ビーズ上の暗号の完全性及び下に敷かれた指示細胞 の健康と両立しなければならない。用いられる特定の放出化学は、もちろん、ラ イブラリーの合成のために用いられた化学のタイプ及び指示細胞の性質に依存す る。方法は、存在するベータラクタムに耐性である新しく進化したバクテリア株 を殺す新しい抗生物質の同定のためのベータラクタム抗生物質のライブラリーの スクリーニングのために、そして公知の抗バクテリアペプチド、例えばマガイニ ン（magainin）のアナログのペプチドライブラリーのスクリーニングのために特 に好ましい。 他の方法はまた、ビーズに基づいた分子ライブラリーをスクリーニングするた めに用いられうる。親和性吸着技術は、本発明のライブラリーと一緒に用いられ 得る。例えば、ビーズの混合物は、レセプターが固定化されている表面に曝され うる（ＰＣＴ特許公開第 91/07087号公報、これは引用することにより本明細書 の一部である）。基質を 洗浄して結合していないビーズを除去した後、表面に結合したビーズを、オリゴ マー／レセプター相互作用の強度を減少する条件（たとえば、低いｐＨ）酸処理 又は塩基処理）を用いて溶出する。親和性吸着のプロセスは、所望により、溶出 されたビーズを用いて繰り返されうる。これらの方法及び関連する変法、たとえ ば、上記した磁気選択の使用は、多様な様式にて行われることができ、例えば、 固体支持体は、クロマトグラフィーカラム中に充填された樹脂であり得る。 本発明の他の方法において、「つながれた」化合物のライブラリーが、関連す る分子のファミリー、例えば、薬理学的目的のレセプターのファミリーのアフィ ニティー精製のために適した形態における構造的な多様性の源として用いられる 。一般に、この方法は、タグが付与されたかつつながれた分子ライブラリーを、 タグが付与されていない分子の第二のライブラリーをスクリーニングするために 用いることに関する。タグが付与され、つながれたライブラリー分子は、アフィ ニティ精製試薬として働き、可溶性蛋白質、オリゴヌクレオチド、炭水化物、抗 体等の複雑な混合物をスクリーニングする。アフィニティ精製に引き続いて、組 み合せライブラリーメンバーに結合する分子が、溶出及び適当な分離及び同定方 法を用いて同定される。その後、組み合せライブラリーは、組み合せ的に合成さ れた化合物のより小さな画分に分けられ、必要ならば繰り返しサイクルを通じて 、どの化合物が結合プロセスを仲介したか を、還元的にそして正確に決定する。 同様の様式において、組み合せ化学ライブラリーが、新しいレセプターを同定 しそしてクローニングするために用いられ得る。多くのレセプターは、配列相同 性を共有する（通常は、先祖からの分岐した進化を反映している）蛋白質のファ ミリーのメンバーであるが、構造的に関係するリガンド／コグネートレセプター のセットについて、それらの特異性／親和性において相違を示す。レセプターフ ァミリー（Ｒｎ）の各メンバーは、それらの異なった特性、即ち、体内での局在 、特異性、リガンドに対する親和性等の故に、特定の薬学的作用及び従って薬剤 の発見及び開発について別々の標的を表しうる。もし、同じファミリーの他のレ セプターの同定が有益であるように十分に重要である結合特性を有するレセプタ ーを同定するなら、その時は、以下の方法を採用して、それらの結合部位特性に おけるＲ₁に関係するレセプターを同定できる。まず、Ｒ₁に結合するリガンドを 同定し、次いで、該リガンドに構造的に密に関係する分子のタグが付与された組 み合せ化合物ライブラリーを創造する。 次いで、レセプターファミリーの追加のメンバーを発現するであろうと信じら れている細胞からのポリソーム調製物を準備する。このようなポリソームは、発 生しつつあるペプチドから殆ど完全に合成された蛋白質までの、蛋白質合成の種 々の段階においてペンダント型レセプターを用いてｍＲＮＡに付着したリボソー ムを含む。合成の完了に近 ずいたレセプター蛋白質は、組み合せライブラリーの１以上のメンバーへの結合 の特異的なレセプター特性を示す。固体支持体につながれた組み合せライブラリ ーを用いて、組み合せライブラリーの任意のメンバーへの親和性を有したレセプ ターを担うポリソームのアフィニティ精製が成される。このようなアフィニティ 精製は、非付着性のポリソームから付着されたレセプター及びレセプターをエン コードする関連するｍＲＮＡを担う固相の分離を達成するために、カラムクロマ トグラフィ法、液相からの固定化された成分のバッチワイズ分離法、又は水性の ２相分離法を含む。 次いで、標準技術（逆転写酵素等）を用いて同起源のレセプター集団をエンコ ードするｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行い、そしてｃＤＮＡ集団を、迅速な配列 分析のために、適したベクター中にクローニングされる。ありそうなレセプター 配列の従来の知識及び予期されうる配列保存の程度に依存して、この方法によっ て豊富となったＤＮＡを増幅するために、ＰＣＲ又は他の増幅の使用が試みられ 得る。適した数のｃＤＮＡクローンの配列分析によって、既に公知のレセプター Ｒ₁の配列との十分な配列相同性を示すｃＤＮＡ（完全長でもそうでなくても） を同定し、同じレセプターファミリー（Ｒｎ）の推定の追加のメンバーを表す。 任意的に、これらの新しいｃＤＮＡ（又はその問題の部分、例えば、リガンド結 合に関係する細胞外ドメインをエンコードする部分）の完全長のｃＤＮＡクロー ンを、 標準クローニング方法により調製し、そしてこれらのｃＤＮＡを標準法（即ち、 適しているように、可溶性又は膜結合蛋白質として真核生物発現系において）に よって発現する。レセプターリガンド相互作用をテストするための標準様式を用 いて、組み合せライブラリーからの混合された化合物の集団又は個々の化合物の 結合についてテストする。このようにして、新しく同定されたレセプターに、ラ イブラリーからのどの化合物が結合するかを正確に同定できる。 個々のビーズは、例えば、限界希釈によって、又は細胞が、小さな超常磁性の ビーズに連結されたレセプターと温置され、そしてその後、レセプターのための リガンドを発現する細胞が、大きい磁力の磁石を用いて抜き取られる方法（Milt enyiら，1990，Cytometry 11:231-238、これは引用することにより本明細書の一 部である）と同様の方法により物理的に分離されうる。上記したように、磁気的 に選択された細胞は、更に分析され、そして、ＦＡＣＳを用いてソートされうる 。放射性ヌクレオチドはまた、レセプターを標識するために役に立ち、放射性標 識されたビーズを選択することによりビーズを同定及び単離できる。 Ｂ．可溶性分子のスクリーニング また、リガンドが、目的のレセプターへの結合に先だって、タグが付与された 又はタグが付与されていない形態にて可溶化されるところの本発明の新しいアッ セイにおいて 有用を成すために、タグが付与された分子ライブラリーを採用できる。可溶性の （ビーズを有さない）タグが付与された分子の非常に巨大なライブラリーをスク リーニングするために、弱い親和性の条件下でアフィニティクロマトグラフィを 用いるのが好ましい。例えば、１０¹⁸子のライブラリ−３０ｍｇは、数百μｇの 目的のレセプターを含有する単一の１０ｍＬのアフィニティクロマトグラフイカ ラムを用いてスクリーニングされうる。オリゴヌクレオチドは、このようなライ ブラリーのための好ましいタグであり、容易にＰＣＲ増幅され、そして、ＤＮＡ 配列決定による分析に先だってタグ情報をソートするために便利な形態である市 販のＴＡクローニングベクター（Invitrigen，Inc.）中にクローニングされる。 更に、オリゴヌクレオチドタグは、上記したように連鎖され、可溶性のタグが付 与された分子のプールを集め、連鎖されたタグを選択されたプールからクローニ ングし、その後所望の化合物を同定するためにタグを配列決定しうる。 可溶性のタグが付与された分子はまた、固定化されたレセプターを用いてスク リーニングされうる。タグが付与された分子を固定化されたレセプターに接触さ せそして洗浄して非特異的に結合した分子を除去した後、結合したタグが付与さ れた分子を、広範囲の種々の方法のいずれかにてレセプターから解放する。タグ は、任意的に増幅され、その後、試験されそして、レセプターに特異的に結合す る分子の構造を同定するために解読される。溶液中のタグが付 与されたオリゴマーは、ビーズへの付着により固定されたレセプターを用いて、 例えば、蛍光的に標識されたリガンドを用いた競合アッセイにより、アッセイさ れうる。固定化されたレセプターを担うビーズを回収し、そして、陽性（標識さ れたリガンドと競合するライブラリー分子によって生じた蛍光の減少）を同定す るためにＦＡＣＳを用いてビーズをソートできる。その後、関連する同定タグは 、増幅されそして解読される。 ライブラリーの可溶性分子は、ビーズ上で合成されて、次いで、アッセイに先 だって切断されうる。一つの実施態様において、分子ライブラリーの微細なビー ズは、ケイ素又は他の適した表面中に「微小の組み立てられた」、非常に小さい 個々の区画又はウェル中におかれる。ビーズは、ウェル当たり平均一つのビーズ を生じるのに十分な充填緩衝液の容量中にそれらを分散することにより、ウェル 中に充填される。一つの実施態様において、ビーズの溶液は、ウェルの上のリザ ーバー中におかれ、そしてビーズは、ウェル中に移される。ビーズからのオリゴ マーの切断は、化学の又は熱の系を用いて達成されうるが、光切断可能な系が好 ましい。目的の分子は、溶液中のタグが付与されていない分子（タグはビーズに 付着されたままである）又は溶液中のタグが付与された分子のいずれかを製造す るために、ビーズから決断されうる。いずれの事象においても、目的の分子は、 ビーズから切断されるが、ビーズ及び同定タグと共に区画内に含まれたままであ る。 一つの実施態様において、ウェルの表面又は表面の一部は、レセプターでコー トされている。結合緩衝液、及びレセプターのための蛍光的に標識された公知の リガンドが、ウェルに加えられて、レセプターに特異的なリガンドの、溶液相競 合アッセイを提供する。蛍光的に標識されたリガンドのレセプターへの結合は、 一つの実施態様中で、単層の固定化されたレセプターの共焦イメージ化により評 価されうる。レセプター表面上に減少した蛍光を有するウェルは、解放されたリ ガンドが、標識されたリガンドと競合することを示している。競合を示すウェル 中のタグ上のビーズは、競合性のリガンドの同定を明らかにするために調べられ る。 陽性のウェルからの同定タグが付与されたビーズの回収は、任意的に、個々の ビーズをウェルの外に引き抜くためにマイクロマニュピュレーターにより実施さ れうる。他の様式は、ビーズ製造の間又は標識付与を通じてのいずれかにおいて 、蛍光分子を取り込んだビーズの使用を含む。適した波長のレーザーは、陽性の みのウェル中にあるビーズを漂白するために用いられる。その後、全てのビーズ がひとまとめに取出され、そして漂白された陽性を同定するためにＦＡＣＳによ ってソートされる。その後、関連したタグは増幅され、そしてレセプターに特異 的に結合する分子を同定するために解読される。 本発明の他の実施態様において、比較的大きなタグが付与されたビーズが用い られ、そこから目的の分子が、一連 の反応において切断される。この方法において、ビーズは、５０〜５００μｍの 直径であり、ビーズ当たり１００〜５００ｐｍｏｌのペプチドと同等の容量を有 し、好ましくは、もしペプチドライブラリーを構築する場合は、約２００ｐｍｏ ｌの容量を有した１００μｍのビーズを用いる。このようなライブラリーの典型 的なサイズは、約１０⁶〜１０⁸、好ましくは１０⁷の異なった分子からのもので ある。ライブラリーは、約１００プールに分けられ、各々は、約１０００００ビ ーズを含む。目的の分子のあるパーセンテージ、約２５％が、プールから分けら れて、ペプチドライブラリーの場合に、例えば、１ｍＬの容量中に５０ｎＭにて 各ペプチドを製造する。 次いで、分けられたプールは、競合性又は機能性アッセイにて試験される。最 も高い活性を持ったプールを同定し、その後、元のプールの残りを回収し、そし てその残りを、プール当たり１０００ビーズの１００のプールに均等に分ける。 その手順を、一つがたった一つのビーズを有するまで繰り返し、そこから、タグ を読みそして目的の化合物を同定する。この方法は、Houghten法の再合成及び構 成限界を避け、そしてプールが、相関されていないランダムな化合物であるとい う利点を有する。多くの低親和性の相関する分子の累積する潜在性故に活性であ る混合物のチャンスが減少する。 Ｃ．天然の生成物ライブラリーのスクリーニング 現在利用可能な自動化された高流量アッセイを用いた、天然生成物スクリーニ ングの存在する限界は、第一は、試料を得そして取り扱う能力（分配、溶解、標 識等）であり、そして第二は、陽性の試料の活性成分を特徴づけるために要求さ れるかなりの労力である。本発明は、容易にスクリーニングされる形態にて非常 に多くの試料を提供し、そして試料中の活性成分を同定する、天然の生成物ライ ブラリーを製造及びスクリーニングするための方法を提供する。方法の基礎は、 「天然生成物」、即ち天然からの代謝的多様性を有する生物化学的及び化学的多 様性の組み合わせである。最も単純な例は、ペプチドのコレクションを微生物の 培養物に与えることを含む。各微生物株は、多くの改変されたペプチド（代謝ラ イブラリー）を製造しうる。各培養物は、（潜在的に）、代謝物の非常に複雑な 混合物を含み、スクリーニングの効率の良い方法が要求される。 いくつかのアプローチが、可能でありそして、要素ごとに分類された又はタグ が付与された、そして可溶性の又はつながれたとして、直交的に分類されうる。 説明のために、「フィードバック」として可溶性ペプチドのライブラリーが考え られる。ライブラリーの均等分配の一つを、微生物発酵スクリーニングプログラ ムに典型的な多くの株の各々と共に培養し、そして培地を典型的な様式にてスク リーニングした。陽性の培養物は、次いで、ライブラリーのサブセットと温置さ れ、そして再スクリーニングされ る。要素毎に分類する（ファクターリング）このプロセスは、殆どの活性代謝物 を生じるインプット ペプチドが同定されるまで続く。その後、活性代謝物の特 徴付けは、同様の前駆体分子の知識を助けとして進められる。従って、第一のス クリーニングは、活性生物を同定し、次の工程は、活性前駆体を同定し、そして 最後は、活性代謝物が標準分析手段により同定される。 しかしながら、全てのその様式においてファクターリングが煩雑なプロセスで ある。別れた合成により製造され、切断されて樹脂を含まないライブラリーは、 無傷の生物による細胞内取り込み及び代謝に敏感に反応する可溶性の化合物を生 じる。しかしながら、個々の化合物の濃度は、かなり低く（コレクションの多様 性に逆相関する）、不十分な酵素的転換及び非常に低い濃度の得られる代謝産物 をもたらす。化合物の濃度は、ライブラリーのサブセットを製造すること及び各 サブセットを、各微生物毎に分離して、別個に発酵することにより増加されうる 。サブライブラリーは、１以上の位置を固定しそして残った位置をランダム化す ることにより構築される。例えば、５０の構築ブロックを用いて２の固定位置の 全ての順列を含む５００のペンタペプチドサブライブラリーがある。これらのサ ブライブラリーの各々は、１２５０００の化合物を含む。タグが付与されたライ ブラリーの使用は、容易性及び感度にて、主要な利点を提供するが、化合物コレ クションを代謝活性に曝す方法においての改変を要求する。組み合せフィード バックは、ペプチドのみであることを必要とせず、組み合せ化学コレクションの 任意のタイプより成ることができる。 オリゴマー及び他の分子ライブラリーは、組み合せプロセス及び同定タグを用 いてエンコードされた各工程において構築されうる。このことは、オリゴマーの タグへの直接の連結及び並列合成を介して成されうる。もしオリゴヌクレオチド が、タグとして用いられれば、その時は、複合体は、比較的大きいが、リポソー ム融合、エレクトロポレーション、溶媒透過等を介して細胞内に積極的に入り込 むには十分に小さい。いったん中に入ると、複合体は、細胞の代謝機構にさらさ れる。改変されたヌクレオチド及びヌクレオチド連結を使用して分解に対するオ リゴヌクレオチドタグの攻撃され易さを避ける。溶解した細胞からの培養物から の活性な代謝産物を回収し、試料をスクリーニングし、そして、前駆体化合物を 明らかにするためにタグを解読する。スケールアップした、活性前駆体を用いた 活性生物の発酵は、特徴付けするために十分な量の活性代謝産物を製造する。ビ ーズ上のエンコードされた組み合せプロセスによって作られた化合物のライブラ リーは、バクテリア、酵母、植物細胞等の溶解物に曝されうる。この様式にて、 タグが付与された複合体を無傷の細胞中に挿入する必要性が避けられ、そして、 ビーズ上の多くの分子の内の比較的少ないものが、検出される（例えば、蛍光活 性化結合アッセイにおいて）ために加工される必要がある。 本発明の他の有用な方法は、他の培養のための原料としての微生物培養の生成 物の利用を含む。説明のために、大きなスケールの培養物（約１Ｌ）からの１０ ０の異なった微生物分離物のコレクションを考える。各培養の上清は、ろ過によ り回収され、そして百の１０ｍＬの等分に分けられる。各々の等分したものを、 １００の株の一つに接種し、温置した。１００００の試料（代謝の代謝産物）を 、それにより、１００の微生物分離物から製造した。組み合せ代謝のこの方法は 、多くの異なった種により、逐次的な代謝にまで拡張されることができ、たとえ ば、微生物発酵の生成物を外来の植物溶解物と共に温置させる又は植物組織の抽 出画分を酵母の培養物と共に温置する。これらの方法は、組み合わせて用いるこ とができ、化学多様性製造法の任意の生成物は、これらの逐次の代謝生成物暴露 工程に付されうる。 本発明の他の観点において、天然生成物多様性は、組み合せ的にタグが付与さ れたリポソームの混合物を創造することによりスクリーニングされ、各リポソー ムは、好ましくは、天然生成物化合物ライブラリーのたった一つのメンバー又は 単一の混合物をカプセルに包み込む。本発明は、化学化合物又は天然生成物抽出 物の１０００〜１００００個の同時アッセイを可能とし、天然生成物抽出物に由 来する、クロマトグラフィ的に分離された画分の１００個のアッセイが、シグナ ル陽性である。この関連で、「同時」は、読み出し系の細胞を用いて、同じチュ ー ブ中で互いにアッセイされたことを意味する。 組み合せ的にタグが付与されたリポソームの混合物は、以下の如くに調製され る。各個々の天然生成物抽出物又は在庫からの化学物質のために、水性相中にテ スト物質をカプセル化するバラバラのリポソームを調製する。独特なリポソーム タグは、カプセル化と同時にリポソーム調製物中に取り込まれる。リポソームは 、低温での長期間の保存ため、コレクションに対して著しく有利なため、及びコ レクションの場所の近くでの天然生成物試料の保存のために、並びに、引き続く 組み合せ実験のために適した形態にて天然生成物抽出物を長期保存するために凍 結乾燥されうる。リポソーム調製物中の脂質は、好ましくは、全ての試料におい て同一であり、そして、所望のサイズ及び完全性の一層のリポソームを製造する ために、タイプ及び組成の点で選ばれる。試薬、例えば、トレハロースは、リポ ソーム形成のときに含められることができて、凍結乾燥及びそれに引き続く水の 添加による無傷のリポソームの再構成を可能としうる。抽出物／化学物質をカプ セル化するタグが付与されたリポソームの製造／再製造のときにまた、高圧技術 を用いて、リポソームによって囲まれる計算された値より大きな量の水性相をカ プセル化できる。容量当量で３〜５倍の増加が、この圧力法によってカプセル化 されることができ、より大きな容量のテスト物質、その結果、細胞に基づいた読 みとりにおけるより大きなシグナルを可能とする。 現在のリポソーム技術は、（各テスト物質の使用の効率に関して）高いパーセ ンテージ（＞８０％）の水性相を取り込むリポソームの創造を可能とする。取り 込まれない水性相は、多様な「洗浄」法によって除かれうる。更に、（タグの付 与の特異性及び包まれた水性相の混合の欠如に関して）カプセル化された水性相 を漏らさない又は交換しないリポソーム、並びに、それらの脂質の一層中に挿入 された化合物を交換しない（タグとして挿入された糖脂質／蛋白質抗原は交換さ れえない）リポソームを創造することが可能である。 広範囲の種々のタグが、本発明の方法で用いられ得る。たとえば、タグは、以 下のものであり得る：（ａ）互いの又はその組み合わせの存在下で各々のフルオ ロフォアの測定を可能とする励起及び放出特性を有する異なったフルオロフォア ：フルロフォアは、カプセル化された水性相中又は再構成されたリポソームの膜 相中で、外側に向って仕切るために選択されうる。（ｂ）原子吸光分析により個 々に区別されうる希土類元素の種々の金属カチオン：希金属原子は、再構築され たリポソームのカプセル化された水性相中で塩として仕切るために設計される。 （ｃ）異なった抗原、該抗原は、必要に応じ、適当なモノクローナル抗体、及び 抗体／フルオロフォアを検出する一次／二次蛍光を用いて、それらの特異的反応 により区別されうる：蛋白質、糖蛋白質及び／又は糖脂質上で担われている抗原 は、外側に向かって、再構築されたリポソームの膜相中で仕切るた めに選択されうる。及び（ｄ）抗原、フルオロフォア及び／又は金属イオンの組 み合わせは、同時のスクリーニングのために可能なサインの数を大きく増加させ ることができる、またサイン混合物中の各成分の異なった「量」が同定されうる ような、フルオロフォア／金属イオン／抗原の種々のレベルを用いて、異なった リポソームのタグ付与の追加レベル（増加した数）がもたらされうる。 全てのリポソームによって共有される一般の蛍光タグを用いることができ、該 リポソームは、リポソームと融合されていない細胞からのリポソームと融合され た細胞の素早い選択を可能とする。このタグは、個々のリポソーム調製の組み合 せ標識において用いられた任意のタグとは異なり、リポソーム産生脂質、サイン タグ及びリポソーム産生のときの薬剤／天然生成物の水性試料と混合される。高 密度にて自己消失する（即ち、リポソーム膜中にて）が、リポソーム融合及び細 胞膜中でのフルオロフォアの横への拡散の後に、細胞の外側の細胞膜中で蛍光を 表す蛍光タグをまた用いることができる。細胞とのリポソーム融合の様式に依存 して、ウイルス起源のフソゲニックな（fusogenic）蛋白質、又は糖脂質、例え ば、（読み出しのために用いられたセルライン中に、必要に応じ取り込まれた適 当なレセプターによって仲介されるレクチン様接着プロセスに依存して）細胞へ のリポソームの強い接着を仲介するものを取り込むこともできる。このような要 素は、リポソーム−リポソーム相互作用（避けられるべきことで ある）に影響しないが、リポソーム−細胞融合の効率を高めうる。 方法は、プロモーターの下流に、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ 、ベータ−ガラクトシダーゼ）を含むセルラインを用いた読み出しシステムを用 いることができ、該プロモータは、外因性ホルモン又はリガンド、例えばステロ イド、サイトカイン、プロスタグランジン、抗体、抗原等の細胞に対する添加に 応答して活性化される。活性化リガンドの、細胞表面レセプター又は細胞内レセ プターのいずれかへの結合は、シグナルカスケードを活性化し、該シグナルカス ケードは、最終的には、応答性のプロモーターの活性化及びシグナル遺伝子の転 写をもたらす。シグナル蛋白質の発現は、定量的に検出される個々の活性化され た細胞からのシグナルの発生をもたらす。アンタゴニストとして細胞内シグナル 変換カスケードのいずれかの部分に作用する化合物に関する研究において、細胞 の全体集団が、外因性のシグナルアゴニスト（サイトカイン、ホルモン等）を添 加することにより予備処理されることができ、そして、リポソーム融合後、個々 の細胞上へのシグナル出力における減少を測定する。アゴニストとして細胞内シ グナル変換カスケードのいずれかの部分に作用する化合物に関する研究において 、外因性のシグナルを細胞に加える必要はなく、そして、リポソーム融合後、個 々の細胞上へのシグナルの出現を測定できる。 タグが付与されたリポソームの混合物は、読みとり細胞 を超える非常に大きな数と混合される。細胞数の過剰は、リポソーム細胞融合後 に、下記の生成物のみが生じるように、重要である：（ｉ）リポソームと融合さ れなかった細胞、及び（ｉｉ）一つのリポソームと融合された細胞（アクセプタ ー細胞）。効率的な混合が、この工程で必須であり、そして連続的に撹拌された 又は線流の細胞懸濁（そこに、リポソーム混合物が遅い速度にて添加されうる） を用いて成される。融合は、標準法、例えば、ＰＥＧの添加又は高電圧の適用に よって起こされる。融合は、もし必要なら、フソゲン（fusogen）又はリガンド −レセプター認識ペアを細胞−リポソーム膜中に含めることにより高められ得る 。この融合工程は、効率的に、単一のリポソームの水性相区画をアクセプター細 胞中に添加する。従って、水性の天然生成物抽出物、化学インベントリー（inve ntory）からのテスト化合物、又は天然生成物抽出物のクロマトグラフィ分離か らの画分は、細胞内シグナル伝達経路中の任意の点において作用することが今や できる。融合工程はまた、特定のテスト化合物試料のサインを与える特異的なタ グを個々のレセプター細胞に加える。もしそれらのタグが、リポソームの脂質膜 中にあったならば、そのときは、タグは、アクセプター細胞の外側の細胞膜中に 分配される。この位置での抗原は、特異的なモノクローナル抗体のパネルにアク セス可能である。特定のリポソームの水性相中にあった希土類金属イオンは、ア クセプター細胞の細胞質中にある。融合工程はまた、共通のリポソームタグを添 加し、該タグは、リポソーム融合を受けなかった過剰の細胞から、アクセプター として作用した細胞を同定する。タグは、リポソーム膜からアクセプター細胞膜 に移動するフルオロフォアでありうる。 細胞の混合物、個々のリポソームに融合された細胞、及び融合されていないリ ポソームは、次いで、外因性のリガンドと（たとえば、アンタゴニストに関して テストされる場合において）温置され、又は（例えば、アゴニストに関してテス トされる場合においては）いずれの追加もなしに温置される。この温置の時間は 、規定された濃度及び温置時間にて、対照化合物を用いて決定される。 好ましくは、目的の化合物（細胞）を選択するためにＦＡＣＳを用いる。例え ば、細胞（アクセプターであっても、そうでなくても）を任意の融合されていな いリポソームからソートするために、前面への又は側面への光散乱がまず用いら れ得る。大きな細胞は、小さなリポソームから容易に分離されうる。次いで、リ ポソームアクセプターであった細胞を、リポソームアクセプターでなかった過剰 の細胞からソートできる。アクセプターであった細胞は、共通のリポソーム由来 の蛍光標識を担い、それに対し、非アクセプター細胞は、この標識に関して非蛍 光である。もちろん、この工程は、任意的であるが、もし、予備ソートとして行 われるなら、後の分析に関係しない（典型的に）主要な細胞を、アクセプターで あった少数のものから分離すること可能とする。アンタゴニストの同定のために 、レセ プター蛋白質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）からの 光放出に基づいてソートでき、主要な蛍光陽性の細胞（より早期の外因性のリガ ンドの添加によりこのようになる）を、少数の蛍光陰性の又は小さい蛍光の細胞 から分離できる。後者の２つの細胞のカテゴリーは、これらの個々の細胞と融合 された特定のリポソーム中にカプセル化されていた化合物の仮定されたアンタゴ ニスト効果からの結果である。アゴニストの同定のために、レセプター蛋白質か らの光放出に基づいてソートでき、主要な蛍光陰性の細胞が、少数の蛍光陽性の 細胞から分離できる。後者の細胞は、リポソーム由来の化合物の仮定されたアゴ ニスト効果からの結果である。 いくつかの実施態様において、全ての目的の細胞を上記の基準に従って集団と してソートし、そして、標準ＦＡＣＳ法を用いて、クローン化された個々として その時々の細胞を集めることができる。これらの個々の細胞は、それらが担う特 定のタグのための単一の細胞として分析され、そして所望の効果を仲介する特定 のリポソームの正確な同定を可能とする。他の用途において、ソートしたイベン ト‐陽性の集団中のタグの分布を分析でき、そして、実験の設計及び、異なった 時間／場所／インベントリーからの試料中に取り込まれた特定のタグに依存して 、全イベント‐陽性集団中のタグのタイプの多様性を決定することが第一にでき る。 集められた単一の細胞又は細胞の集団は、用いられた特 定のタグの組み合わせに適当な方法により分析されうる。蛍光タグは、ＦＡＣＳ 及び／又は伝統的な分光測定法により分析されうる。抗原タグは、適当に標識し たモノクローナル抗体の添加、及びＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、放射性同位元素又は 蛍光分析により分析されうる。金属イオンタグは、最後に、原子吸光分析により 分析されうる。タグの解読後、テストは、第一の経過において陽性を生じたリポ ソームのみの混合物を用いて、又は細胞サンプルを分けるために添加された目的 の各メンバーの純粋なリポソームのいずれかをを用いて、繰り返されうる。 本発明のこれらの及び他の方法は、以下の章で議論するように、本発明の実施 を容易にするために自動化されうる。 VII．装置 モノマーセット（例えば、アミノ酸）のいくつかのためのカップリング工程は 、いくつかの実施態様において、比較的長い温置時間を要求し、そしてこのこと 及び他の理由のため、並列にて多くのモノマー付加を行うための系が望まれる。 本発明は、エンコードされた合成分子ライブラリーの製造及びスクリーニングに 用いる自動化された装置に関する。一つの好ましい装置（これは、５０〜１００ 又はそれ以上の並列反応を同時に行える）は、米国特許シリアル番号第08/14967 5号明細書（1993年11月２日出願、これは引用することにより本明細書の一部で ある）に記載されている。このような装置は、反応混合物又は合成固体支持体の スラリーを、プログラム制御下で、プール化、混合及び再配分のための種々のチ ャンネルに分配できる。 しかしながら、一般に、タグが付与された分子の合成ライブラリーを製造する ための装置は、典型的なペプチドシンセサイザーを、モノマーの多様性及び用い るタグの数及び望まれる同時のカップリング反応の数のための多数のリザーバー と共に配管することを要求する。タグ分配性能力は、単純な指令を、適したタグ の混合物に翻訳し、そして該混合物を分配する。モノマー構築ブロックは、所望 により、特定化された混合物として分配される。反応の撹拌、温度及び時間の制 御が提供される。適当に設計された装置はまた、アッセイ目的のために１〜５０ ｍｇ（粗製の）の１００までの特異的ペプチドを製造するマルチチャンネル ペプチドシンセサイザーとして働く。ＰＣＴ特許公開91/17823号公報（これは引 用することにより本明細書の一部である）参照。 典型的な装置は、（１）合成試薬、例えば、ペプチド及びオリゴヌクレオチド 合成試薬の蓄積、混合及びデリバリー手段、（２）種々の試薬がデリバリーされ 、そしてその中で種々の反応が不活性な雰囲気下で進行しうるシールされたチャ ンバー、（３）シールされた反応容器のマトリックス、（４）試薬の流れを適当 な反応容器に向ける手段、（５）小さなビーズ（０．１〜１００μｍ）を合わせ そして分割するための手段、及び（６）各反応容器中のビーズを各化学反応の終 わりにて洗浄する手段を含む。反応容器のマトリックスは、いくつかの設計の内 の任意の一つを含む。例えば、容器は環状に配置されて、容器が中心軸に関して 回転させられうる（即ち、遠心機）。或いは、容器は、１２ｘ８マトリックス（ ９６ウェルのマイクロタイタープレート様式）に配列されうる。自動装置のデリ バリー、吸引、及び移動機能によって、アクセス性に敏感に反応するいずれの配 置もいくつかの用途にとって有用である。 粒子の組み合わせ及び再分配のために用いられる系は、いくつかの設計の内の 一つを有する。例えば、ビーズは、自動ピペティング装置が、ビーズを組み合わ せ容器に移すために用いられ得るように、適当な表面張力及び密度の溶媒に懸濁 されうる。混合後、ビーズは、同じ自動ピペティ ング装置により反応容器に再分配されうる。或いは、ビーズは、特にバルブを付 けられた反応チャンバーを用いることによって組み合わせられ得る。バルブが開 けられて、溶媒の流れが、ビーズを組み合わせ容器に移送できる。混合後、ビー ズは、流れを各反応容器に戻すことによって再分割される。 他の実施態様において、ビーズは、近接して間隔が開けられた、上部と下部が 開口した反応容器を用いて組み合わせられる。容器に多量の流れを流すことは、 ビーズの混合を可能とする。もしビーズが磁性を有していれば、その時は、ビー ズは、磁場を適用して、容器の底にビーズを引くことにより再分割される。非磁 性のビーズは、反応容器の底を通じての真空吸引により、再分割される。また他 の実施態様において、ビーズは、それらを平らな表面上に分配し、次いで、それ らを「クッキーカッター」の形状をした装置を用いて覆ってそれらをある種の区 域に限定することにより、分割される。このことは、以下に更に完全に記す。 ビーズ洗浄のための系はまた、いくつかの設計の内の一つを有しうる。ビーズ は、液デリバリーと吸引チューブの組み合わせにより洗浄されうる。各反応容器 は、それ自身のチューブのセットを有するか、又は単一のセットが全ての反応容 器のために用いられ得る。後者の場合においては、液デリバリーと吸引ラインは 、ロボットアーム上で取り付けられて、別個に各容器に向かうようにされうる。 各 容器中のビーズは、遠心分離又は、磁気ビーズの使用及び磁場の適用のいずれか により、単一のペレットを形成させられうる。また、試薬が真空の適用により容 器から除かれうるように、底壁が化学的に不活性な膜からなる反応容器を用いる こともできる。試薬はまた、試薬及び洗浄溶液の連続流を提供できる容器、即ち 、各端にルアーフィッティング及び膜を有する容器を用いて、各容器から除かれ うる。 個々の反応チャンバーをあてにしている任意の自動化された結び合い装置は、 非常に重要な実際的な限界に直面している。ここで、各々のチャンバーは、試薬 デリバリー系及び「マザーポット」に連結されており、ビーズはプール化のため にポンプで「マザーポット」に送られ、そしてそこからビーズがモノマー付加の 連続的な繰り返しのために反応チャンバー間に再配分される。多量のモノマー又 は他の構築ブロック単位があり、そして、潜在的に大きな反応数の中で、ビーズ 及び試薬を分割することの困難性は、このような装置を、１００未満の別個の並 列反応に限定しうる。 本発明は、チャンバー間でビーズをポンプで運んで混合及び再配分することの 必要性を回避し、試薬デリバリーを単純化し、そして非常に少数の小さなビーズ の単純かつ正確な分割を可能とする装置を提供する。基本設計は、表面に配置さ れた反応「部位」の配列を有するプレートからなり、表面は、平面あり得るかま たは、反応部位を形成する 浅いウェルの配列からなりうる。一つの実施態様において、１６ｘ１６の配列で 、２５６部位ある。各反応部位は、スポット又はウェルであり、その表面上に一 群の合成ビーズが付着されている。引力は、磁力、真空ろ過、正の機械的ソーテ ィングを伴う重力、又は種々の他の単純な手段である。ビーズは、最初は、希釈 スラリーとして浅いリザーバー中に均等に入れられて、反応部位の配列を覆う。 引力を与えると、ビーズは各部位にて濃縮される。 全てのビーズを反応部位上に配置した後、部位を機械的な分割により分離して 、図２９に示される如くの（一時的な）個々の反応チャンバーを作る。変更は、 永久的に表面に付着されて浅いウェルを形成する区画を提供する。反応成分は、 各チャンバーに分けられ、ビーズは懸濁物中に解放され、そして反応が開始する 。望むなら、ビーズは、表面に再び付着され、そして試薬が除かれうる。カップ リングサイクルの全工程が完了した後、チャンバーの区画が除かれ、そしてビー ズは、部位の配列の上の共通のリザーバー中に解放される。 ビーズの混合は、リザーバー液の対流を誘発することにより起こされ、そして 、次いで、ビーズは、次回のカップリングのために表面部位に再び引き寄せられ る。洗浄工程を含む次の工程は、同様の様式にてなされる。試薬の添加及び除去 は、プラミングと自動化されたピペッティングの組み合わせを用いて成される。 反応特異的な試薬（例えば、モノマー）の付加は、自動化されたマルチピペッタ ー を用いて成されうる。共通の試薬の追加及び全ての試薬の除去は、各反応チャン バーにバルブ操作を要求しない固定化されたプラミング系を用いて成されうる。 いくつかの共通の工程、例えば、洗浄は、チャンバー区画の設置前又は除去後に 、全部一緒にビーズ上で成されうる。 多数のモノマー又は他の構築ブロックの使用は、エンコードプロセスに追加の 負担を与える。一つの、オリゴヌクレオチドのタグのエンコード概要において、 １０００モノマーの基本セットは、各反応工程にタグを付けるために５塩基配列 を要求し、１０２４モノマーのより多いセットは、エンコードのために６塩基を 要求しうる。合成装置のプラミングの複雑さを減少するために（即ち、特異的な 反応付加の数を減少するために）、特定のエンコード戦略が、本発明によって提 供される。この方法を説明するために、２５６の異なった反応を当時に行うこと ができる、１６ｘ１６反応部位の配列を考える。多数の塩基カップリングを用い て各反応を個々にエンコードすることは、困難な作業である。 配列は、１６列及び１６行からなり、配列の各部位は唯一の地理的なアドレス をもつ。部位の各列は、基としてタグが付与されることができ、そして全ての１ ６列が、２塩基コドン（「サブコドン」）を用いて唯一にエンコードされうる。 ストリップ状のテンプレート又はチャンネルブロックは、これらの２塩基付加の ために１６の反応チャンバーを形成するために役立ちうる（塩基は、ダイマーと し てではなく、モノマー性ホスホルアミダイトとしてカップリングされるというこ とを記しておく）。ＰＣＴ特許公開第 WO 93/09668号公報参照。反応部位のアド レス化のこの様式は、他の類似体であり、例えば、光学的方法は、ビーズを標識 するために用いられ、米国特許第5143854号明細書に記載のストリップ状のマス キングプロセスにおける如くである（これは引用することにより本明細書の一部 である）。もし、テンプレート又はチャンネルブロックが用いられた場合は、そ のときは、テンプレートは、ちょうどライブラリー分子の合成中に個々の反応を 単離するグリッドテンプレートであるときに合成表面上に下げられる。 しかしながら、ビーズは、タグを付与する反応中は、それらの空間的な分離が 、次の工程を通じて維持されなければならないので、解放されない。列が、サブ コドンを用いてタグが付与されたときは、テンプレートは持ち上げられ、９０° 回転され、そして行を覆うストリップを形成するように下げられる。その後、１ ６の行が、２塩基サブコドンを用いて標識され、唯一のタグが付与された、４塩 基「スーパーコドン」を有する２５６反応アドレスの各々を結果する。反応アド レスを同定することにより、スーパーコドンはまた、各反応中に添加されたモノ マーを特定する。 VIII．並列のカップリング合成反応の装置 一般に、本発明の装置は、固体支持体上に多様な物質の 合成を提供する。例として、本発明は、ビーズ、例えば本明細書中に記したもの を利用する。多様なペプチド合成の例を以下に議論して、シンセサイザーの議論 のための骨子を提供する。 本発明は、そこで合成反応がおこる多くの基質（これは、「Ｓ」と表す）を利 用する。基質は、任意的に、そこでカップリング反応がおこるリンカー分子「Ｌ 」を提供する。基質は、分配され、そして多様なモノマー、例えば、「Ａ」及び 「Ｂ」と反応して、たとえば、以下の基質のコレクションを形成する： Ｓ−Ａ 及び Ｓ−Ｂ その後、基質は再び組み合わされ、混合されそして再び分配される。このような 、混合及び分配工程の後、２以上の基質のコレクションが形成され、その各々は 、Ｓ−Ａ及びＳ−Ｂの両方を含む。 その後、追加のカップリング反応が起こる。例えば、上記のプールされた生成 物は、モノマーＣ及びＤと反応して以下の生成物のコレクションを形成する： １． Ｓ−Ａ−Ｃ Ｓ−Ａ−Ｄ ２． Ｓ−Ｂ−Ｃ Ｓ−Ｂ−Ｄ 上記の単純な例からでさえ、このような合成技術が、すみやかに多様な生成物の 巨大なコレクションを製造するということが明らかとなる。このような多様な分 子コレクションを合成することを注意深く計画することによって、及び／又はこ のような基質上のタグの並列合成を提供すること によって、基質は、上記の如く、種々の用途において有用であると判る。特定の 実施態様において、本発明は、これらの及び他の用途のための基質を効率よく製 造しうる装置及び方法を提供する。 Ａ．一般事項 図１は、分子の多様なコレクションを合成するために用いる装置を説明してい る。装置は、上部（頂上）の共通のマニホールド２１２及びチューブ２１５及び ２２１〜２２９によって、複数の反応容器２０１〜２０９に連結された親混合容 器２００を含む。上部の共通のマニホールド２１２は、チューブ２２１〜２２９ 及び２１５に連結している。反応容器２０１〜２０９はまた、バルブ１１１〜１ １９及びチューブ２４１〜２９９を介して、選択的に、モノマー付加試薬供給リ ザーバー（貯蔵器）２３１〜２３９に連結している。圧力がかけられたデリバリ ー系（ＰＤＳ）２６５は、親容器２００及び反応容器２０１〜２０９の両者に、 それぞれ、チューブ２６０及び２５６を介して連結されている。 合成反応は、ビーズ懸濁液が、親容器２００から反応チューブ２０１〜２０９ に移動されたときに始まる。バルブ１２９は開口し（全てのバルブは、デフォル ト（すなわち、不履行）では閉じている）、そしてビーズ懸濁液は、親容器２０ ０から、チューブ２１５を通じて、上部の共通のマニホールド２１２に入る。そ の後、ビーズ懸濁液は、 チューブ２２１〜２２９を通じて、反応容器２０１〜２０９間に分配される。そ の後、モノマーリザーバー２３１〜２３９から選択された試薬が、それぞれのチ ューブ２４１〜２４９を通じて、それぞれの反応容器２０１〜２０９に入る。次 いで、カップリング反応が、反応容器２０１〜２０９の中で、その中に含まれる ビーズ上でおこる。 図１は、チューブ２６０を介して親容器２００に連結された、圧力がかけられ たデリバリー系２６５を示している。圧力がかけられたデリバリー系２６５は、 バルブ１０及びベントバルブ９０が開いたとき、チューブ２６０を介して、圧力 がかけられた試薬を、デリバリー系２６５から親容器２００へとデリバリーする 。 圧力がかけられたデリバリー系（ＰＤＳ）２６５はまた、チューブ２５６、分 離バルブ１００、下部のマニホールドバルブ１０１〜１０９、下部のチューブ２ ７１〜２７９、インジェクションバルブ１１１〜１１９及びチューブ２４１〜２ ４９を通じて、反応容器２０１〜２０９に連結されている。ＰＤＳ ２６５から 、選択された反応容器２０１〜２０９へ試薬をデリバリーするために、圧力がか けられた試薬を、開口したバルブ１００を通じて、チューブ２５６及び下部のマ ニホールド２１４に入れる。その後、圧力がかけられた試薬を、選択された開口 したバルブ１０１〜１０９を通じて、選択されたチューブ２７１〜２７９まで押 しあげる。その後、圧力がかけられ た試薬は、選択されたチューブ２４１〜２４９を通じて、選択された反応容器２ ０１〜２０９に押し入れられる。 例えば、所与のモノマーリザーバー２３１から、それぞれの反応容器２０１へ と試薬をデリバリーするために、ＰＤＳ ２６５から圧力がかけられた活性化溶 液のある量を、チューブ２５６中、下部のマニホールド２１４中、そしてチュー ブ２７１へと押し上げる。適当なときに、モノマーリザーバー２３１からある量 のモノマー試薬を、チューブ２７１へと続いている活性化溶液の流れの中に注入 する。試薬の注入に引き続いて、試薬リザーバー２３１から注入されたモノマー 試薬を含む溶液の流れが、チューブ２４１を通じて反応容器２０１へと入り、カ ップリング反応に参加する。 選択された反応容器２０１〜２０９内のビーズを、任意的に、モノマーリザー バー４０６〜４１２からのモノマーを用いてタグを付与するために、モノマーリ ザーバー４０６〜４１２からの圧力がかけられたタグモノマー試薬を、開口した バルブ４〜７を通じてＰＤＳ ２５６の共通のマニホールド２５５に入れる。そ の後、圧力がかけられたタグモノマー及び適当な活性化試薬を、開口したバルブ １００及びチューブ２５６を通じて、下部のマニホールド２１４に入れる。圧力 がかけられたモノマータグ付与試薬及びその適当な活性化試薬を、選択された、 開いているバルブ１０１〜１０９を通じてチューブ２７１〜２７９及び２４１〜 ２４９に、そしてビーズ上でタグの合成が起こる 選択された反応容器２０１〜２０９内へと運ぶ。 所望のモノマー及び／又はタグ付加反応の後、反応容器２０１〜２０９内のビ ーズ懸濁液を、プール化及び混合のために親容器２００に戻す。ビーズ懸濁液を 反応容器２０１〜２０９から親容器２００へと動かすために、ビーズ懸濁液を、 開口したバルブ１２２及び１０１〜１０９を介してチューブ２５０からのアルゴ ンを用いて圧力をかける。バルブ１００及び１１０は閉じられており、それによ って、圧力がかけられたビーズ懸濁液を、チューブ２２１〜２２９へ、上部の共 通のマニホールド２１２へ、開口したバルブ１２９を通じてチューブ２１５へ、 そして最後に親容器２００中に押す。親容器２００において、ビーズ懸濁液は、 所望の分子セットを更に合成するために、反応容器２０１〜２０９間に再配置す るための準備で、混合される。 他の実施態様において、複数の３方バルブが、反応容器２０１〜２０９の各々 と親容器２００の間に備えられ得る。このようなバルブは、好ましくは、上部の 共通のマニホールド２１２内に保持される。このようにして、ある容器が、親容 器２００から分離され得る。このことは、更なる合成のためにビーズ懸濁液を再 分配するときに、特に有利であり得る。例えば、もしビーズが、全ての反応容器 ２０１〜２０９に合成のために最初に配置され、次いで、親容器２００に戻され る場合は、再配置の間、ある３方バルブのみが、例えば、反応容器２０１、２０ ５及び２０９ のみが更なる合成のためにビーズ懸濁液を受けとるように開かれうる。 図１はまた、上部の反応容器ブラケット２９０及び底部の反応容器ブラケット ２９５に連結された、同心でない撹拌機２８０及び２８５を示している。上部の 反応容器ブラケット２９０は、底部の反応容器ブラケット２９５が、同心でない 撹拌機２８０及び２８５の動きについていくことを可能としている間、静止した ままにされている。各同心でない撹拌機は、ボルテックスモーター（渦巻モータ ー）３００と共同して、撹拌力を、底部の容器ブラケット２９５及び反応容器２ ０１〜２０９の底辺に働かせる。ブラケット間のチューブは柔軟性であるので、 この撹拌力は、各個々の反応容器２０１〜２０９の内容物が、反応容器内で撹拌 されそれによって合成反応が高められることを引き起こす。 上部の共通のマニホールド２１２は、チューブ２１５に一端にて連結して、親 容器２００及び上部の共通のマニホールド２１２間の物質を移動するための導管 を提供している。他の端にて、上部の共通のマニホールド２１２はチューブ１２ ６に連結している。チューブ２１６は、バルブ１２１を通じて、上部の共通のマ ニホールド２１２に圧力がかけられたアルゴンを提供する。チューブ２１６はま た、上部の共通のマニホールド２１２が、バルブ１２０を通じてその内容物を排 出できるようにしている。 ２つの容量センサー９０Ｓ及び９９Ｓは、親容器２００ の外側表面の近くに配置されて、親容器２００中の液のレベルを検出している。 もし、液が容量センサーの検出エンベロープの範囲内に存在する場合は、該容量 センサーのスイッチが入る（オンになる）。反対に、容量センサーは、もし液が 検出エンベロープ内に存在しないときは切れる（オフになる）。 センサー１０１Ｓ〜１１９Ｓは、実質的に半透明なチューブ内の液の存在を検 出するための光学センサーである。これらの光学センサーは、液の柱がチューブ 内に存在するときはオンである。光学センサーは、液が検出されないときはオフ である。 同様に、音波（もしくは音響）センサー１２０Ｓは、その検出エンベロープ内 の液の存在を検出する。ビーズ懸濁物を含み、そして音波センサーの検出エンベ ロープ内に配置されたチューブを通じて流れている液が、音波センサー１２０Ｓ をオンにする。逆に、音波センサー１２０Ｓは、センサーの検出エンベロープ内 に配置されたチューブ内に液がないときはオフである。音波センサーは、センサ ー１２０Ｓのために用いられる。何故なら、光学センサーは、ある種の条件下で は、空の半透性のテフロンチューブとビーズ懸濁液を含んだ半透性のテフロンチ ューブとを、確実に区別できないからである。更に、音波センサーは、センサー １２０Ｓのために選ばれるけれども、空のチューブと、液又はビーズ懸濁液のい ずれかで満たされたチューブとの間の違いを認識できる任意のセンサーが用いら れ得 る。音波センサーは、他のタイプのセンサー、例えば光学センサーに比べてかな り高いので、シンセサイザー当たりたった一つの音波センサー１２０Ｓがある。 反応容器バンクは、親容器と反応容器の間に、たったの一つ又は２、３のバル ブがあるように設計される。事実、バルブ１２９は、任意的である。この設計は 、有利である。何故なら、それは、壊れやすいビーズ及び合成されたポリマーに 損傷を与える、バルブの機械的開口及び閉鎖動作の可能性を減少するからである 。また、もし、ビーズのサイズが十分に大きい場合は、それらは、バルブ中に引 っかかりそして系を詰まらせるかもしれない。更に、いくつかのポリマーは、温 度感受性であり、そして、操作中にバルブによって発生した熱により不利に影響 されるかもしれない。従って、ビーズ懸濁物がそれを通じて移動しなければなら ないところのバルブの数を減ずることが望ましい。もし、バルブ１２９が含まれ なければ、圧力をかける技術が、液が親容器及び反応容器バンク間を流れること を防ぐために用いられ得る。 前に記したように、この実施態様において用いられるバルブは、それらのデフ ォルト状態（不履行状態）では閉じている。開口のための特定のコマンド（命令 ）がなければ、バルブは常に、デフォルトの閉じた状態のままである。 Ｂ．機械コンポーネント 機械的に言って、自動化されたシンセサイザーは、おおざっぱに３つのサブシ ステム、反応容器バンク、親容器及び圧力がかけられたデリバリーシステムに分 けられうる。上記したようにカップリング合成は、反応容器内の反応容器バンク にて起こる。親容器は、全ての反応容器からのビーズを保持し、プールしそして 混合する。デリバリーシステムは、適当な溶媒及び／又は適当な試薬／溶媒濃度 での試薬溶液を、親容器又は反応容器バンクのいずれかに、合成プロセス中の適 当な工程にてデリバリーすることを確実とする。更に、システム全体は、操作の 間、シールされている。必要な場合に圧力をかけることは、不活性なガス、例え ばアルゴンを用いて成される。アルゴンは、その利便性及び低い化学反応性故に 、好ましい加圧化ガスである。 議論を容易にするために、自動化されたシンセサイザーを、ここで、特定の例 を参照して記載する。この開示を通じて用いられる特定の例は、ポリペプチドの セットのビーズ上での合成を含む。ビーズは、引き続く各アミノ酸カップリング 反応の同定のために、４つのヌクレオチドモノマー、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧを用いて タグが付与される。 しかしながら、自動化されたシンセサイザーは、上記の特定の例にて記載され た特定のポリマーの合成に限定されないばかりでなく、タグが付与されたポリマ ー合成も限定されないと認識されなければならない。この開示を通じ て、９の反応容器を有する反応容器バンクを用いた、ポリペプチドの合成及び上 記のヌクレオチドを用いたビーズのタグの付与が参照されるけれども、各反応容 器バンクに含まれうる反応容器の数は、固有の、上限も下限もない。事実、装置 のモジュラー構成は、追加の反応容器バンクの付加を容易に可能としている。更 に、多くの他の分子及びタグが、ビーズ上で合成されることができ、また、タグ は完全に除かれることができる。 １．圧力がかけられたデリバリーシステム 特定の例に従ってポリペプチドを合成するために特に調製された、圧力がかけ られたデリバリーシステム２６５の詳細な記載は、３つの部分、ポリペプチド合 成ニ用いるためのリザーバー、ビーズへのタグの付与に用いるリザーバー及びデ リバリーバルブに分けられる。 ａ．ポリペプチド合成に用いるためのリザーバー 特定の例のペプチドを合成するために用いる９のアミノ酸モノマーに加えて、 いくつかの他の追加の「共通」試薬が合成において用いられる。典型的なペプチ ド合成において、例えば、以下の試薬が用いられ得る： ｂ． ビーズへのタグの付与に用いるリザーバー 特定の例において、ビーズは任意的にタグが付与される。ペプチド合成反応に おいて、ビーズは、一つの実施態様にて、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのグループからのヌ クレオチドを含む核酸を用いてタグが付与される。４つのヌクレオチド試薬に加 えて、以下の溶媒及び試薬が、タグの合成の間に用いられる。 これらのヌクレオチド試薬は、自動化シンセサイザーを用いてタグを合成する のに十分な容量及び数量を有するリザーバー中に含まれる。 図２は、たとえば、表３のＭｅＣＮ溶液を含有するための代表的なリザーバー ４００を示している。表２及び３に列記された各リザーバーに結合して２つのチ ューブがある。図２に示されている如く、チューブ４５０は、リザーバーに圧力 をかけてリザーバーの内容物を第二のチューブ４５２にまで押しやるために、圧 力がかけられたアルゴンを含む。いくつかの実施態様において、試薬リザーバー が、常に圧力がかけられている。他の実施態様においては、アルゴンチューブは 、ローカルのオン／オフバルブに よって制御されて、リザーバーの内容物が必要なときのみに試薬リザーバーに圧 力をかける。 ｃ． デリバリーバルブ 図３は、より詳細に代表的な３方ソレノイドバルブを示している。バルブは、 例えば、Fairfield，New JerseyのGeneral Va1ve Corp.のモデル2-110-900であ り得る。更に、図３の３方バルブは、たとえば、リザーバー４１２から試薬をデ リバリーするバルブ４を表している。３方バルブは、図１の圧力がかけられたデ リバリーシステム２６５にて用いられる。本発明の実施態様で使用される３方ソ レノイドバルブは、第一のポート４５４及び第二のポート４５６を含む。３方ソ レノイドバルブはまた、その本体を通ってチャンネル４５８を有し、該チャンネ ルは、第一のポート４５４及び第二のポート４５６と連絡して、常に、液が第一 及び第二のポートの間を自由に流れることを可能としている。共通のマニホール ド４６２を形成するために、第二のポート４５６は、例えば、他の３方バルブの 第一のポート４５４に連結している。他の３方バルブは、たとえば、図１のバル ブ５でありうる。バルブ内のソレノイドは、ワイヤ１９０を通る制御信号に応答 して、選択的に、第三のポート４６０をチャンネル４５８と連結させることがで きる。バルブ４の第三のポート４６０は、図１のリザーバー４１２に連結してい る。 リザーバー４１２からの試薬のマニホールド４６２中へ の注入を制御するために、圧力がかけられた試薬を運ぶライン４６４が、バルブ ４の第三のポート４６０に連結されている。適当なときに、ソレノイドが開き、 そして第三のポート４６０がチャンネル４５８と連絡でき、それによって、第三 のポート４６０から圧力がかけられた試薬が、バルブ４のチャンネル４５８中及 び共通のマニホールド４６２中に注入されることを引き起こす。 図４は、代表的なオン／オフ２方ソレノイドバルブ１０を示している。このバ ルブは、たとえば、Fairfield，New JerseyのGeneral Valve Corp.のモデル2-17 -900であり得、選択的に、液又はガスを、その２つのポートの間のチャンネル内 で流すことを可能とする。図４に示されている如く、バルブ１０は、２つのポー ト４６８及び４７０を含む。バルブ１０はまた、その本体を通じてチャンネルを 有し、該チャンネルは、第一のポート４６８及び第二のポート４７０と連絡して 、液又はガスが、２つのポートの間を流れることを可能としている。バルブ１０ 内のソレノイドは、ワイヤ４７２を通る制御信号に応答して、選択的に、第一の ポート４６８を第二のポート４７０と連絡させることができる。バルブ１０の一 つのポートが、圧力がかけられたガス又は液を運ぶチューブと連結しているとき は、バルブ１０は、該ポートからバルブ１０の他のポートへの流れを許容する又 は阻害するために用いられ得る。 図５は、本発明の一つの観点に従って、圧力がかけられたデリバリーシステム ２６５をより詳細に示している。図 ５は、そこを通って共通のマニホールドが形成される、２４のバルブ０〜２３を 示す。２方及び３方バルブは、そこを通って試薬が流れる共通のマニホールドを 形成するように、それらの第一及び第二のポートを互いに連結することにより鎖 状につなげられる。３方バルブ１〜７、９〜１２及び１４〜２２は、例えば、図 ３のバルブ４と実質的に同様でありうる。２方バルブ０、８、１３、２３は、例 えば、図４のバルブ１０と実質的に同様であり得る。共通のマニホールドは、３ 方バルブの及びオン／オフバルブの貫通したチャンネル、並びに隣接するバルブ 間の連結チューブを含む。上記したように、３方バルブの第三のポートは、バル ブ中のソレノイドによって制御される。各３方バルブの第三のポートは、試薬又 は溶媒のリザーバーからのチューブに連結して、試薬又は溶媒を、ＰＤＳ２６５ へと移動し、かつそこから移動させる。或いは、３方バルブの第三のポートは、 試薬を、例えば、反応容器バンクのバルブ１００へとデリバリーするための出口 ポートとして役立ちうる。２方バルブは、主として、単離バルブ又はアルゴン供 給バルブとして用いられる。 図５に示される如く、バルブ２４は、スペースを節約するために３つの別々の バンク中に物理的に配置されている。図５のデリバリーシステムはまた、バルブ の左のバンクを中央のバンクと連結するためにチューブ４８０を含む。チューブ ４８２は、右のバンクを中央のバンクに連結している。表４は、デリバリーシス テムにおいて用いた バルブを列記しており、典型的な実施態様における、用いたバルブのタイプ及び 各バルブによって制御された試薬リザーバーを特定化している。 例えば、バルブ２２は、６０／１０００インチの貫通したチャンネルを有する ＦＷＯ６０バルブ又はファーストウォッシュアウト（ＦＷＯ）３方バルブで示し た。更に、バルブ２２は、表４に示された如く、ＤＭＦを含む圧力がかけられた リザーバー４３８からの試薬を制御する。更なる例として、バルブ２３は、アル ゴン供給源（示さず）からＰＤＳ２６５の共通のマニホールドへの圧力がかけら れたアルゴンの流れを制御するオン／オフバルブである。 図５は、一方の端から、ＰＤＳ２６５の共通のマニホールドに圧力をかけるた めにバルブ０に連結されたチューブ４８４を示している。他のチューブ４８６は 、バルブ２３に連結されて、そして、他の端からアルゴンを用いてＰＤＳ２６５ の共通のマニホールドに圧力をかけている。 説明として、ペプチド合成脱保護サイクルの間の、圧力がかけられたデリバリ ーシステム２６５の操作を以下に記す。ポリペプチドの脱保護のために、ＤＭＦ 中の１０％ピペリジンの溶液が、反応容器（ＲＶ）バンク中の反応容器にデリバ リーされる。表４は、バルブ１８がリザーバー４３０からのピペリジンの流れを 可能としていることを示している。その結果として、バルブ１８は、圧力がかけ られたリザーバー４３０からピペリジンがＰＤＳ２６５の共通のマニホールド中 に流れるのを可能とするために開口する必要がある。溶液をＲＶバンクバルブ１ １に入れるために、分離バルブ８が閉じられかつ分離バルブ１３が開口して、圧 力がかけられたピペリジンを開口したＲＶバンクバ ルブ１１へと入れる。 図５及び表４に示されている如く、ＲＶバンクバルブ１１及び親容器バルブ１ ０は、バルブの鎖の中心に配置される。この配置は、有利に、これらのバルブと 所与の試薬バルブとの間のマニホールド区画の長さを最小化する。その結果、よ り少ない試薬量が、このマニホールド区画を満たすために要求される。分離バル ブ８及び１３は、マニホールドの一方の端からの試薬が、ＲＶバンクバルブ１１ 又は親容器バルブ１０を越えて行きすぎる及び共通のマニホールドの他の部分に 不必要に入ることを防ぐために閉じられ得る。 表４はまた、３０／１０００インチの直径の貫通したチャンネルを有する３方 バルブである、バルブ４〜７及び９〜１２を示している。これに対し、マニホー ルド中の残りのバルブは、６０／１０００インチの直径を有する貫通したチャン ネルを有する。減少したチャンネルの断面は、マニホールドのそれぞれの部分中 の容量を更に減ずる。その結果、より少ない試薬が、マニホールドを満たすため に要求される。 例えば、ヌクレオチドＡ，Ｔ，Ｃ及びＧは、比較的費用がかかる。それ故、用 いる試薬の量を、必要最少量に保つことが望まれる。ヌクレオチドバルブ４〜７ は、ＲＶバンク出口バルブ１１に近接して配置され、ヌクレオチドバルブとＲＶ バンク出口バルブ１１間の距離を短く保ち、試薬の要求量を少なく保っている。 任意のヌクレオチドバルブ からＲＶバンク出口バルブ１１への進路にそったマニホールドの断面はまた、マ ニホールド中に存在するヌクレオチド試薬の量を更に減ずるために小さく保たれ ている。事実、図５のチューブ４８０、並びにヌクレオチドバルブと分離バルブ ８との間のマニホールドの部分は、３０／１０００インチの減ぜられた断面を有 する。 Ｃ． 反応容器バンク 図６は、本発明の一つの観点に従った、単純化した反応容器バンク５００を示 している。説明の容易化のために、そこを通って溶液が流れるチューブは部分的 に割愛した。反応容器バンク５００は、上方のブラケット５０２、２つの側面の ブラケット５０４及び５０６、及び２つの土台５０８及び５１０を含む。上方の 反応容器ブラケット２９０は、側面のブラケット５０４及び５０６に取り付けら れている。ボルテックスモーター３００は、複数の反応容器２０１〜２０９に、 ドライブベルト５２１を介して撹拌力を供給するために、上方の反応容器ブラケ ット２９０に取り付けられている。反応容器２０１〜２０９の底部は、底部の反 応容器ブラケット２９５に取り付けられている。ブラケット５０２、５０４、５ ０６、２９０、及び土台５０８及び５１０は、任意の適当な物質から作られる。 機械化、強度及び軽量化を容易にするために、アルミニウムが、本実施態様の上 記のブラケットを作るために用いられる。 底部の反応ブラケット２９５は、上方の反応ブラケット ２９０に、シャフトハウジング５２０内の２つの非同心のシャフト２８０により 結ばれている。非同心のシャフト２８０は、上方の反応容器ブラケット２９０内 の開口部（示さず）を通して回転可能に据え付けられている。非同心のシャフト ２８０は、機能的に、ベルト５２１を通じてボルテックスモーター３００に連結 されている。後で記載するように、非同心のシャフト２８０は、ボルテックスモ ーター３００によって供給される回転力を底部の反応容器ブラケット２９５を円 を描くように動かすための撹拌力に変える。この円の動きは、反応容器２０１〜 ２０９の内容物に渦巻き効果を働かせる。各々の反応容器２０１〜２０９は、そ れぞれの下端にて、底部の反応容器ブラケット２９５に取り付けられており、全 ての反応容器は、均一かつ同時に撹拌される。 図６はまた、底部のブラケット５２２を示している。底部のブラケット５２２ は、側面のブラケット５０４及び５０６に取り付けられ、そしてまた、アルミニ ウムを含む任意の適した物質から作られうる。複数のアミノ酸リザーバー２３１ 〜２３９は、真下の底部ブラケット５２２に据え付けられている。アミノ酸リザ ーバー２３１〜２３９中のアミノ酸試薬は、特定の例のポリペプチドのセットを 合成するために構築ブロックとして用いられる。本実施態様は、ポリペプチドの セットの合成のために、バンク当たり９の異なったアミノ酸モノマーを用いるよ うに企画されている。 図６は、側面ブラケット５０４及び５０６に取り付けられた分離バルブブラケ ット５２６を示している。分離バルブブラケット５２６は、複数の下方のマニホ ールドバルブ１０１〜１０９を据え付けるために、チャンネル５３０を含む。図 ６に示される如く、各々の下方のマニホールドバルブ１０１〜１０９は、本実施 態様においてチャンネル５３０内に固定される。しかしながら、下方のマニホー ルドバルブ１０１〜１０９は、市販の取付機材又は他の取付法を用いて、分離ブ ラケット５２６に固定されうる。下方のマニホールドバルブ１０１〜１０９は、 ３方ソレノイドバルブであり、そして図３との関連で先に議論した３方バルブと 同じである。反応容器バンク５００内で用いられるので、下方のマニホールドバ ルブ１０１〜１０９の貫通したチャンネルは、互いに連結されて、共通の下方マ ニホールド２１４を形成し、そこを通って、圧力がかけられたデリバリーシステ ム２６５からの溶液が流れる。 ３つの２方バルブ１００、１１０及び１２２もまた、図６中に示す。９のバル ブ１０１〜１０９は、下方のマニホールド２１４から９の反応容器２０１〜２０ ９への溶液の流れを制御する。共通の下方のマニホールド２１４の最初の端にあ る分離バルブ１１０は、廃液ライン（図６中には示さず）に対して開口している 。共通の下方のマニホールド２１４の第二の端にある分離バルブ１００は、選択 的に、ＰＤＳ２６５から共通の下方のマニホールド２１４の残部への流れを阻害 又は可能とする。任意の分離バルブ１ ２２は、局所のアルゴン圧力を供給して、反応容器バンク５００の種々の部分へ の及びそこからの溶液のデリバリーを助けている。 他の実施態様において、１１の分離バルブ１００〜１１０及び１２２は、１１ バルブブロック、例えば、モデルP/N601374（California,Foster CityのＡＢＩ ）中に備えられる。ブロックは、前もって組み立てられ、そしてその結果、組立 が単純化される。１１バルブブロックの１１のバルブは、実質的には上記したよ うに機能する。 適した物質、例えばアルミニウムで作られたインジェクションバルブブラケッ ト５３２が、側面のブラケット５０４及び５０６に取り付けられている。複数の インジェクションバルブ１１１〜１１９は、インジェクションバルブブラケット ５３２の開口部を通して据え付けられている。図６は、アミノ酸リザーバー２３ １〜２３９からのアミノ酸のインジェクションを制御する、全部で９のインジェ クションバルブ１１１〜１１９を示している。インジェクションバルブ１１１〜 １１９は、３方ソレノイドバルブであり、そして図３に関して先に議論した３方 バルブと同じである。各インジェクションバルブの第一のポートは、反応容器２ ０１〜２０９に連結され、一方各インジェクションバルブの第二のポートは、下 方のマニホールドバルブ１０１〜１０９の第三のポートに連結されている。連結 は、適当な大きさのチューブ、例えば、本実施態様において用いられる１／１６ インチのテフロンチューブを用いて成され る。前記から明らかなように、各インジェクションバルブ１１１〜１１９の貫通 したチャンネルは、反応容器２０１〜２０９と下方のマニホールドバルブ１０１ 〜１０９の第三のポートとの間を溶液が自由に流れることを可能とする。各イン ジェクションバルブ１１１〜１１９の第三のポートは、アミノ酸リザーバー２３ １〜２３９に連結されて、選択的に、下方のマニホールドバルブ１０１〜１０９ と反応容器２０１〜２０９との間を流れる溶液の流れ中へアミノ酸が注入される ことを阻害又は可能とする。 図６はまた、上方の共通のマニホールド２１２を示している。上方の共通のマ ニホールド２１２は、上方の共通のマニホールド２１２を９の反応容器２０１〜 ２０９に連結するために、９のマニホールドポート５４２を含む。本実施態様に おいて、１／８インチの柔軟なテフロンチューブが、マニホールドポート５４２ を反応容器２０１〜２０９の上端に連結するために用いられる。上方の共通のマ ニホールド２１２はまた、そこで個々の反応容器２０１〜２０９からのビーズが プールされかつ互いに混合されるところの親容器（図６中に示さず）と連結する ための第一のエンドポート５４４を含む。第二のエンドポート５４６は、上方の 共通のマニホールド２１２に、３方バルブ加圧／排出バルブ（図６中に示さず） を用いて連結する。加圧／排出バルブ及び第二のエンドポート５４６は、他のル ートを提供し、そこを通って圧力がかけられたアルゴン、溶液、試薬等が上方の 共通のマニホールド２１２へ供給されうる。 あるいは、加圧／排出バルブ及び第二のエンドポート５４６は、更なるルートを 提供し、そこを通って圧力がかけられたアルゴン、溶液、試薬等が上方の共通の マニホールド２１２から適当なリザーバーへと供給されうる リザーバー２３１〜２３９のための他の配置が、図６Ａに示されている。単一 のリザーバーのグループ、例えば、リザーバー２３１〜２３９を用いる代わりに 、複数のリザーバーのグループ、例えば、２３１ａ〜２３９ａ、２３１ｂ〜２３ ９ｂ等が備えられ得る。リザーバーは、回転可能な円形コンベヤー１０００内に 保持されている。リザーバーは、リザーバー内に保持された試薬が、上方表面１ ００２からアクセスされうるように円形コンベヤー１０００の上方表面１００２ にて開口している。円形コンベヤー１０００は、圧力容器（示さず）内に保持さ れて、リザーバーの各々が圧力容器内で同じ圧力がかけられている。リザーバー 内の試薬を反応容器２０１〜２０９に移動するために、チューブ２４１〜２４９ に連絡した複数のチューブが、圧力容器内に配列されている。圧力容器内のチュ ーブは、選択されたリザーバーのグループ、例えば、リザーバー２３１ａ〜２３ ９ａのリザーバー中へと配置されている。チューブは、チューブをリザーバーに 向けて移動することにより又は円形コンベヤー１０００をチューブに向けて移動 することにより、リザーバー中へと配置されうる。円形コンベヤー１０００は、 チューブを選択されたリザーバーのグループと一列に並べるために回転される。 圧力容 器内の圧力は、リザーバー及びチューブ２４１〜２４９間に圧力の勾配が存在す るようにされている。チューブがリザーバー内に配置されたとき及び選択された バルブ１１１〜１１９が開口されたとき、前記した如く、反応容器２０１〜２０ ９へのデリバリーのために、圧力の勾配がリザーバー中の試薬をチューブ２４１ 〜２４９内に運ぶ。このよにして、円形コンベヤー１０００は、試薬が種々の異 なった試薬から選択的に選ばれることを可能とする、例えば、異なった構築ブロ ックのセットが各合成段階にて用いられることを可能とすることによってシンセ サイザーに柔軟性を提供する。 図７は、アミノ酸リザーバー２３１〜２３９、インジェクションバルブ１１１ 〜１１９、下方のマニホールドバルブ１０１〜１０９及び反応容器２０１〜２０ ９間の相互連結をより詳細に示している。下方のマニホールドバルブ、例えば、 バルブ１０１（これは３方はバルブである）は、共通の下方のマニホールド２１ ４に連結されて、溶液が、下方のマニホールドバルブ１０１の第一のポートと第 二のポートとの間を自由に流れることを可能としている。下方のマニホールドバ ルブ１０１の第三のポートは、チューブ２７１を介して、３方インジェクション バルブ１１１の第一又は第二のポートのいずれかに連結されている。第一又は第 二のポーのいずれかのもう一方のポートは、反応容器２０１の一方の端に、チュ ーブ２４１を介して連結されている。反応容器２０１の他の端は、上方の共通の マニホー ルド２１２のマニホールドポート５４２（図７には示さず）に、チューブ２２１ を介して連結されている。チューブ２７１、２４１及び２２１は、化学的に耐性 の物質、例えばテフロンから作られる。事実、本実施態様は、半透明テフロン物 質の低い反応性及び光学特性故に、至る所で、種々の断面積を有する半透明のＰ ＴＦＥ及びＦＥＰテフロンチューブを用いる。 アミノ酸リザーバー２３１は、不活性ガス、例えば、アルゴンを用いて、チュ ーブ５６２を介して圧力がかけられている。アミノ酸リザーバー２３１中の圧力 がかけられたアミノ酸溶液は、チューブ５６０を通って、３方インジェクション バルブ１１１の第三のポートに入る。適当な指令を受けると、インジェクション バルブ１１１は開口して、圧力がかけられたアミノ酸溶液がインジェクションバ ルブ１１１の貫通したチャンネルに入ることを可能とする。 図７はまた、２つの光学センサー１１１Ｓ及び１０１Ｓを示している。光学セ ンサー１１１Ｓ及び１０１Ｓは、実質的に半透明のテフロンチューブ２７１及び ２４１内の液の存在又は不存在を検出する。図７に示されている如く、光学セン サー１１１Ｓは、インジェクションバルブ１１１に下に配置され、そして光学セ ンサー１０１Ｓは、反応容器２０１の下に配置される。光学センサー１１１Ｓ及 び１０１Ｓからのデータは、合成反応の種々の段階の制御にて使用するために制 御コンピューター（図７中には示さず）に送られる。 図８は、図１の非同心の振とう機２８０をより詳細に示している。非同心の振 とう機２８０は、筒状のナックル５６６に連結された２つの筒状のシャフト５６ ４及び５６８を含む。シャフト５６４は、筒状のナックル５６６の中心軸と長さ 方向にて同一線上に並び、そして筒状のナックル５６６の２つの平面状の表面の 一つに連結されている。シャフト５６８は、筒状のナックル５６６の他の平面状 の表面に連結されて、筒状のナックル５６６の中心軸とはオフセットを形成して いる。一つの実施態様において、シャフト５６４及び５６８、及び筒状のナック ル５６６は、単一ピースの金属ストックから機械加工される。 筒状のシャフト５６４が、固定された回転支持体、例えば、ローラーベアリン グ内で回転するように、トルクが与えられている場合は、筒状のシャフト５６４ の回転軸に対してオフセットを形成している筒状のシャフト５６８は、筒状のシ ャフト５６４の回転軸の周りを円の経路にて動く。１以上の非同心の振とう機２ ８０は、例えば、ベルト−アンド−プーリー配置によって機能的に連結されて、 複数の非同心の振とう機２８０が同調して動くことを可能としている。本実施態 様において、２つの非同心の振とう機２８０のシャフト５６８は、単一のブラケ ットに連結されて、シャフト５６４が回転したときにブラケットが円の経路にて 動くようになっている。更に、シャフト５６８及びボルテックスモーター３００ は、各反応容器の底が円の経路にて、１分間当たり約１５００回転にて動くよう に設計 されている。ビーズへのダメージを避けるために、本実施態様の円の経路は、好 ましくは、約３．５ｍｍの半径までに限定される。 図９は、図６の、反応容器２０１〜２０９及びボルテックスモーター３００を 含む反応容器バンク５００の上方をより詳しく示している。図６に関して議論し たように、反応容器バンク５００は、上方のブラケット２９０に連結された複数 の反応容器２０１〜２０９を含む。上方のブラケット２９０は、反応容器２０１ 〜２０９が連結する場所にて複数の開口部６３０を有する。上記の開口部（示さ ず）からのテフロンチューブは、液がテフロンチューブと反応チューブ２０１〜 ２０９との間を自由に流れることができるような様式で、開口部６３０にて、各 々の反応容器２０１〜２０９の上端に連結している。 反応容器２０１〜２０９の下端は、下方の反応容器ブラケット２９５に連結し ている。図１０Ａ及び１０Ｂは、図６の下方の反応容器ブラケット２９５の底の 様子をより詳しく示している。図１０Ａは、下方の反応容器ブラケット２９５の 一部のクローズアップした底の様子である。 図１０Ｂは、下方の反応容器ブラケット２９５内の複数のチャンネル６５０を 示している。柔軟でかつ実質的に半透明なテフロンチューブ（説明の容易化のた めに図１０Ｂからは割愛してある）は、各反応容器２０１〜２０９の下端（これ もまた、説明の容易化のために図１０Ｂから割愛してある）から延びて、チャン ネル６５０内に収まってい る。光学センサーを据え付けるための溝６５２は、各チャンネル６５０に付随し ている。溝６５２は、図１０Ａ中に明瞭に説明されている。 図１０Ｂは、光学センサーを下方の反応容器ブラケット２９５にしっかりと固 定するための、複数の取り付けホール６５４を示している。また、重量を減ずる ための複数の任意のホール６５６が図１０Ｂに示されている。先に議論したよう に、下方の反応容器ブラケット２９５は、円形経路の非同心の振とう機の動きに 追随して、反応容器の内容物を撹拌する。任意的なホール６５６は、ブラケット の重量を減ずるために下方の反応容器ブラケット２９５全体に機械加工されるこ とができ、それによって、ブラケットを動かすために必要な力を減ずることがで きる。 下方の反応容器ブラケット２９５の各端近くの貫通したホール６５８は、非同 心の振とう機２８０を下方の反応容器ブラケット２９５に連結している。反応容 器２０１〜２０９の下端は、下方の反応容器ブラケット２９５内の貫通したチャ ンネル６５０に収まるように柔軟なテフロンチューブ２４１〜２４９によって延 ばされ、下方の反応容器ブラケット２９５の円形の動きに追随する。下方の反応 容器ブラケット２９５は、円形経路を動くので、反応容器バンク中の全ての反応 容器２０１〜２０９中の内容物は、並列様式にて撹拌される。 図９はまた、非同心の振とう機２８０の周りに適合するための任意の非同心振 とう機ハウジング５２０を示してい る。任意の非同心振とう機ハウジング５２０は、中空の筒状のハウジング内に非 同心のシャフトを囲い込み、非同心のシャフトが動いているときに、人のユーザ ーにけがを負わす及び装置に損傷を与える可能性を排除している。 本実施態様は、回転力を非同心の振とう機に供給するために、ステッピングモ ーターコントローラー（モデル ＲＤ１２２、California Fremont の Semix Co rp.製）とともにステッパーモーター（モデル ＰＸ２４５−０１ＡＡ、Califor nia Torrance の Oriental Motor U.S.A．Corp.製）を用いている。図９Ａに示 される如く、３つのプーリー６７０、６７２及び６７４は、ボルテックスモータ ー３００及び２つのドライブベルト５２１及び６７６と協同して、２つの非同心 の振とう機２８０を、任意的な非同心振とう機ハウジング５２０内で、同調して 回転させる。本実施態様は、ステッパーモーター及びステッピングコントローラ ーを用いているけれども、回転力は、他の電気モーター又は空気モーターを含む 、他の適当なタイプのモーターのいずれかによって供給されうる。更に、ボルテ ックスモーター３００によって供給される力は、スプロケット、プーリー及びベ ルト、ギヤ等を含む任意の適した伝達手段によって非同心の振とう機２８０に伝 達されうる。 図１１Ａは、実質的に半透明のテフロンチューブ内の液の存在又は不存在の検 出に用いるための代表的な光学センサー６８０を示している。光学センサー６８ ０は、本実施態様の光学センサー１０１Ｓ〜１０９Ｓと同じである。光 学センサー６８０（モデル ＥＥ−ＳＸ６７１、Illinois，Schaumburg の Omro n，Inc．製）は、光トランスミッター及びコレクターを収容するために、それぞ れ、２つのフォーク状の端６８２及び６８４を含む。光学センサー６８０はまた 、センサーデータを制御コンピューターに伝達するための適当な電気回路構成を 収容するための、そして光学センサー６８０をブラケットに取り付けるための本 体６８６を有する。 図１１Ｂは、光学センサー６８０のフォーク状の端６８２及び６８４をより詳 細に示している。矢印６８８の方向にて、光を実質的に方形の集光部（図１１Ｂ 中には示さず）に伝達するための、実質的に方形のトランスミッター６８５が、 フォーク状の端６８２の内側表面に配置されている。コントローラーは、フォー ク状の端６８４の内側表面に配置され、そして同様に、方形である。実質的に半 透明のテフロンチューブ内の液の存在を検出するために、テフロンチューブは、 ２つのフォーク状の端６８２と６８４の間のギャップを通って取り付けられる。 液が、実質的に半透明のテフロンチューブ内に存在すると、集光部が誘発（トリ ガー）されて、テフロンチューブ内の液の検出を示す。 実際には、実質的に半透明のテフロン物質は、空のとき、光学センサー６８０ を誘発させることができないということが判っている。実質的に半透明のチュー ブ内の液の存在を感知するべく、有利に共通の光学センサーを使用す るために、新しい光学配列ブロックが用いられる。図１１Ｃは、光学配列ブロッ ク６９０をより詳細に示している。光学配列ブロック６９０は、実質的にトラン スミッター６８５によって放出されたいずれの光もブロックする不透明な物質か ら作られる。光学配列ブロックは６９０は、ブロック６９０を光学センサー６８ ０のフォーク状の端の一つと摩擦で係合させるために、２つの保持壁６９２及び ６９４を第一の表面６９６に含み、そして光学配列ブロック６９０をフォーク状 の端の間にしっかりと保持している。一つの実施態様において、保持壁６９２及 び６９４は、図１１Ｂの集光部フォーク端６８４に係合するように設計される。 光学配列ブロック６９０はまた、第二のブロック表面７００内に作られたチャ ンネル６９８を含む。第二のブロック表面７００は、上記の第一の表面６９６の 反対側の表面である。チャンネル６９８の軸は、保持壁６９２及び６９４と直交 している。チャンネル６９８は、テフロンチューブをぴったりと捕らえられるよ うな大きさにされている。結果として、テフロンチューブは、チャンネル６９８ 内に収容され、そして、光学配列ブロック７００がフォーク状の端６８２及び６ ８４の間のギャップ内に取り付けられたときに、上記のトランスミッターストリ ップ６８５に関して直角に配列される。 図１１Ｄは、チャンネル６９８の中央のラインに沿って配置された開口部７０ ２を示している。開口部７０２は、 少量の光が、第一の表面６９６と第二の表面７００の間の穴に沿って、光学配列 ブロック６９０を通じて伝わることを可能としている。実質的に半透明のテフロ ンチューブ、例えばチューブ２４１〜２４９又は２７１〜２７９が、チャンネル ６９８内にぴったりと取り付けられた場合は、開口部７０２の軸は、テフロンチ ューブの中心を通って走る。開口部７０２の形及びサイズは、チューブの光学特 性の一つの関数である。 光学配列ブロック６９０が、図１１Ａに示された様式にて、フォーク状の端６ ８２及び６８４の間に取り付けられた場合は、フォーク状の端６８２内のトラン スミッター６８５からの光は、実質的に半透明のチューブ７０４を通って伝わる 。殆どの光は、チューブ７０４を通って通過した後に、光学配列ブロック６９０ によってブロックされる。チューブ７０４を通って通過する光のいくつかは、開 口部７０２（図１１Ａでは視野から隠れている）に達し、そして開口部７０２の 穴に沿って伝わって、フォーク状の端６８４内の集光部に達する。 開口部７０２の軸は、実質的に半透明のチューブ７０４の中心を通って走り、 チューブの中心を通って通過する光は、フォーク状の端６８４内の集光部の一部 分に達する。空のチューブ７０４を通って走る光は回折されるので、センサーを 誘発するには不十分な光の量が、集光部に達する。液が、半透明のテフロンチュ ーブ７０４内に存在するときは、満たされたチューブを通って通過する光は、そ の 中の液によって集束される。集束された液は、フォーク状の端６８２の方向から 開口部７０２内に入り、フォーク状の端６８４内の集光部を誘発する。液が存在 しないときは、集束効果は、比較的少ない。従って、より少ない光が開口部７０ ２に入る。事実、テフロンチューブ７０４内に液がないときは、開口部７０２を 通って通過する光は、フォーク状の端６８４内の集光部を誘発するには不十分で ある。 先に議論したように、光学配列ブロック６９０は、テフロンチューブ７０４を ぴったりと捕らえるように大きさが決められている。光学配列ブロック６９０が 、フォーク状の端６８２及び６８４の間に取り付けられた場合は、図１１Ａに示 すように、テフロンチューブは、光学センター６８０とブロック６９０によりし っかりと把持される。光学センサー６８０をブラケットに固定することによって 、テフロンチューブ７０４は、ブラケットに固定される。このようにして、この 実施態様の反応容器２０１〜２０９の底から延びるテフロンチューブ２４１〜２ ４９は、底部の反応容器ブラケット２９５に固定される。 図１２に示される如く、反応容器、例えば、本発明の実施態様の反応容器２０ １は、ＦＥＰテフロンチューブ７１０のセグメントからなる。チューブ７１０は 、１／４インチの外径及び０．１９インチの内径を有する。以下により詳細に記 すように、チューブ７１０の直径は、２以上の試薬を反応容器２０１内で同時に 混合する場合の用途のため には、代替的に、かなり大きく作られうる。チューブ７１０は、柔軟なテフロン チューブ２７１とシールされて連結されている。柔軟なテフロンチューブ２７１ は、反応容器バンクの下方の反応容器ブラケット２９５に固定されている。下方 の反応容器ブラケット２９５が、円形の動きにて動くと、柔軟なテフロンチュー ブ２７１の底は、チューブ７１０内の内容物を撹拌するために、底の反応容器ブ ラケット２９５によって表される円形の動きに追随する。 この実施態様において、チューブ２７１は、１／８インチの外径及び１／１６ インチの内径を有する。図１２は、異なった断面積のチューブを互いにシールさ れた状態にて連結するための、第一のカップラー７１４、第二の相互コネクター ７１６及び第三のカップラー７１８を含むチューブコネクターを示している。上 記したチューブコネクターは、Norton，Inc.(Ohio，Akron)から入手可能。チュ ーブ７１０内の基体が柔軟なチューブ７１２に入らないように、チューブ７１０ の底の端に配置されたフリット又はフィルター１１０２（図１２中の視野からは 隠れている）がある。フリットは、例えば、２ミクロンのチタンフリットであり 得る。 チューブ７１０の他の端にて、第四のカップラー７２０、第五の相互コネクタ ー７２１及び第六のカップラー７２２が、シールされた状態で、チューブ７１０ をチューブ２２１に連結している。本実施態様のチューブ２２１は、チューブ７ １０とは異なった断面積を有するので、カップ ラー７２０及び７２２、並びに相互コネクター７２１は必須である。チューブ２ ２１は、上方のマニホールド２１２のマニホールドポート５４２（図６中には示 さず）に連結されている。 柔軟なＯリング７２４は、ブラケット２９０内のホール７２６（切断図にて図 １２中に示した）内に固定されている。Ｏリング７２４は、柔軟に、カップラー ７２２を把持し、それによって、柔軟に、反応容器２０１をブラケット２９０に 固定している。反応容器２０１の底の端が振とうされた場合、Ｏリング７２４は 、中心点(pivot point)として役立ち、そして反応容器２０１の上端を比較的動 かないように保持して、撹拌効果を高める。 図１２Ａ及び１２Ｂに示される如く、一つの特定の実施態様における反応容器 ２０１は、反応容器２０１〜２０９の温度を制御するために、任意的に、温度制 御ジャケット１１００を備えうる。この実施態様における温度制御ジャケット１ １００は、反応容器２０１をライン２２１及び２４１（示さず）に連結するため にフィティング１１０４を含む。入口／出口ポート１１０６、１１０８は、熱伝 導性液を反応容器２０１に供給するために備えられる。熱伝導性液は、反応容器 ２０１を加熱又は冷却するために用いられ得る。この実施態様において、反応容 器２０１は、テフロンチューブ１１１０から形成され、好ましくは、１／４イン チの外径及び１／３２インチの壁厚を有する。チューブ１１１０から離れて、外 側のチューブ１１１２があり、 それは、好ましくは、テフロンから構成され、そして３／４インチの外径と１／ ３２インチの壁厚を有する。外側のチューブ１１１２は、フィティング１１０４ の上に配置されて、熱伝導性液を収容するための環状の空間１１１４を形成して いる。Ｏリング１１１６、１１１８は、外側のチューブ１１１２及びフィティン グ１１０４の間に配置されて、液のしっかりとしたシールを形成する。このよう にして、反応容器２１０を加熱又は冷却するために、熱伝導性液が、ポート１１ ０６、１１０８のいずれかを通じて、環状の空間１１１４内に導入されることが できる。ポート１１０６、１１０８はまた、熱伝導性液が、環状の空間１１１４ を通って、連続的に循環することを可能としている。 一体型で形成された温度制御ジャケット１１２２を有する反応容器１１２０の 他の実施態様を図１２Ｃ及び１２Ｄに示す。反応容器１１２０は、実質的に、反 応容器２０１と同様に機能するが、但し、反応容器１１２０は好ましくはガラス で作られる。温度制御ジャケット１１２２はまた、好ましくはガラスで作られる 。このような構成は、反応容器１１２０及び温度制御ジャケット１１２２が一体 の単位として形成されることを可能とする。反応容器１１２０は、フリット１１ ２４、及びライン２２１及び２４１（示さず）への連結のためのコネクター１１ ２６及び１１２８を含む。入口／出口ポート１１３０、１１３２は、ジャケット １１２２と反応容器１１２０の間の環状の空間１ １３４を通って、熱伝導性液が循環するために備えられる。ホースバーブ（hose barb）１１３６、１１３８は、便利には、入口／出口ポート１１３０、１１３ ２の適した液供給源への連結のために備えられる。このようにして、熱伝導性液 は、反応容器１１２０を加熱又は冷却するために環状の空間１１３４を通じて循 環され得る。 Ｄ． 親容器 図１３は、本実施態様の親容器をより詳しく示している。親容器２００は、例 えば、約３０ｍＬの容量である。チューブ２６０は、試薬又はアルゴンをデリバ リーシステムＰＤＳ２６５（図１３中には示さず）へと移動し、かつそこから移 動させるために、シールされた状態で、親容器２００の底の端に連結されている 。フリット又はフィルター７４６は、基体がチューブ２６０内に入るのを防ぐた めに、親容器２００の底近くに固定されている。物質を添加及び除去するために 、親容器２００の上端に固定された除去可能なキャップ７４３がある。キャップ ７４３を通って固定されているチューブ２１５は、親容器２００と反応容器バン ク内の共通のマニホールド２１２（図１３中には示さず）との間の物質を移動す る。チューブ２１５は、キャップ７４３を通って延びる。圧力がかけられたアル ゴン／排出ライン２７５はまた、キャップ７４３を通って延びる。任意のすすぎ ライン２８１は、親容器５の内側壁をすすぐために、圧力がかけられた溶媒を内 側壁へとデリバリ ーするための溶媒供給源に連結されている。 図１３は、親容器２００の外側近くに据え付けられた、２つの容量センサー９ ０Ｓ及び９９Ｓ（モデル １８−０８、Illinois，Hoffman Estates の Electro matic Control Corp.製）を示している。各容量センサー９０Ｓ又は９５Ｓは、 その近傍にて液の存在を検出して、そして、センサーデータを、それぞれ、ワイ ヤ７５６及び７５８を介して、制御コンピューター（示さず）に伝えている。容 量センサー９９Ｓは、親容器に加えられた試薬のレベルを検出するために用いら れる。容量センサー９０Ｓは、再分配のためにビーズ懸濁物のレベルを検出する ためである。センサーレベルは共に、ビーズの量及び用いられた反応容器の数に 従って調節されるうる。容量センサーデータは、合成プロセスの種々のサイクル を制御するためにソフトウエアによって利用される。 Ｅ．制御系 １．制御コンピューター 自動化した合成器（シンセサイザー）は制御コンピューターを使用して、合成 プロセスの種々のサイクルの間、センサーからのデータを収集し、かつバルブお よび渦巻きモーターを制御する。自動化した合成器と共に使用されるとき、マイ クロコンピューター、ミニコンピューター、ワークステーション、メーンフレー ム等として一般に知られているものを含む任意のコンピューターが、センサーデ ータを処理し、バルブおよび渦巻きモーターを制御する命令を発するために使用 され得る。 さらに、合成器のセンサーからのセンサーデータは、通常のデータ収集法を用 いて、多くの市販の入手可能なデータ収集装置により収集され得る。同様に、コ ンピューターの適当な命令に応答して、市販の入手可能な入出力制御装置によっ て、バルブおよび渦巻きモーターが制御され得る。 １つの実施態様においては、ＩＢＭ‐互換性のマイクロコンピューター（パー ソナルコンピューターもしくはＰＣとしてまた知られている）が制御コンピュー ターとして使用される（Model Gateway 2000 4DX2-50V 、サウス ダコタ州、ス ー シティのGateway 2000 Inc．より）。ＰＣ内には、複数の拡張スロットがあ り、これは種々の拡張基板の追加を可能にする。これらの基板をＰＣのバス供給 源(bus resource)につなぎ、ＰＣがカード上の回路構成要素と 連絡して、電子機能を行うことを可能にする。ある拡張基板はまた、ＰＣが外部 の装置および回路構成要素と連絡することを可能にする。例えば、モデム基板と して一般に知られている基板がＰＣ上の拡張スロットに接続し、ＰＣが、モデム を有する別のコンピューターと連絡することを可能にする。パーソナルコンピュ ーターと共に拡張基板を使用することは、普通の工学的知識の問題である。 １つの実施態様においては、自動化した合成器は、多チャンネルのデジタルＩ ／Ｏ基板（Model PCDIO120-P、カリフォルニア州、サン ディエゴのIndustrial Computer Sourceによる）を経てＰＣと連絡する。PCDIO120-P基板の詳細は、In dustrial Computer Sourceから入手可能な、Product Manual No.00431-050-20A に詳細に記載されている。 各PCDIO120-Pは、５つの24‐チャンネルグループの中に、120 チャンネルのバ ッファ付き入出力（Ｉ／Ｏ）を備える。各24‐チャンネルグループは、プログラ ム可能な周辺インターフェース（ＰＰＩ）８２５５Ａチップにより制御される。 チャンネルは、入力または出力のいずれかについて、８のセットで選択可能であ る。 図14は、制御ハードウェアの一部の単純化したダイアグラムを示す。コンピュ ーター760 、例えば複数の拡張スロットを有しているＰＣは、ディスプレーモニ ター762 およびキーボード764 に接続する。ＰＣＤＰ１２０−Ｐ Ｉ／Ｏ基板76 6 は拡張スロットの１つに挿入されて、ＰＣが５つの制御装置回路768 と連絡す ることを可能にする。各制 御装置回路768 は、導体チャンネル770 を経てＩ／Ｏ基板766 と連絡する。本実 施態様においては、導体チャンネル770 は、24のＩ／Ｏチャンネルを使える性能 を有する50‐導体リボンを含む。 ２．制御装置回路 Ｉ／Ｏ基板766 からの出力信号、典型的にはソース電流15ｍＡおよびシンク電 流24ｍＡは、ソレノイド バルブを操作するのに不適当である。したがって、制 御装置回路768 は、Ｉ／Ｏ基板766 から来る出力信号を、ソレノイド バルブを 実際に操作するのに適した電力を有する電力信号に変換する。制御装置回路768 は、Ｉ／Ｏ基板766 からの24の出力信号を受け、そして次には、合成器の種々の 装置を制御するために、24の電力信号771 出力する性能を有する。各制御装置回 路768 の24の電力ライン771 を図14に示す。 各制御装置回路768 はまた、24までのセンサーライン（各センサーにつき１つ ）からのセンサーデータが集められ得る、中央の物理的位置を備える。24までの 異なるセンサーからのデータは、各制御装置回路768 上のセンサーポート772 に より受け取られ得る。 このようにして、各制御装置回路768 は、Ｉ／Ｏ基板766 の48までのＩ／Ｏチ ャンネル、24の入力および24の出力を使えるようにすることができる。図15は、 本発明の１つの解釈に従う制御装置回路768 の典型的なダイヤグラムを示す。50 - ピンヘッダ781 は、制御装置回路768 をＩ／Ｏ 基板766 （図１５に示されていない）に接続する。ヘッダ781 は、入力ヘッダで あり、バス780 を経てセンサーポート772 に接続される。センサーポート772 は 、ヘッダまたは、制御装置回路768 を24までの入力装置例えばセンサーと接続す るためのコネクタを含む。バス780上の各導体は、１つのセンサーから入力ヘッ ダ781 へ信号を運ぶ。図15はまた、ＬＥＤ表示器信号をセンサーポート772 から 任意の発光ダイオード（ＬＥＤ）のバンクへ運ぶための、任意のＬＥＤバス784 を示す。任意のＬＥＤバス784 における各導体は、バンク786 における１つのＬ ＥＤに信号を運ぶ。 図15はまた、制御装置回路768 をＩ／Ｏ基板766 （図15に示されていない）に 接続するための、別の50- ピンヘッダ788 を示す。ヘッダ788 は、Ｉ／Ｏ基板76 6 からの出力信号を受け取るための出力ヘッダである。バス790 は、８個までの 出力信号を、ヘッダ788 から８極のインバーター７４ＬＳ２４０チップ792 へ運 ぶ。８極のインバーター７４ＬＳ２４０チップ792 は、テキサス州、ダラスのTe xas Instruments，Inc．により製造されている。バス794 は、チップ792 から８ 極のラッチドライバー796 へ、反転させたバッファ付き出力信号を運ぶ。ラッチ ドライバーチップ796 は、カリフォルニア州、サン ジョゼのMicrel，Inc．に より製造されたＭｏｄｅｌ ＭＩＣ５９Ｐ５０である。各ラッチドライバーチッ プ796 からの出力信号は、バス800 を経て出力ポート796 に接続される。任意の ＬＥＤバス 802は、チップ796 から任意の発光ダイオード（ＬＥＤ）のバンク 804に、ＬＥ Ｄ表示器信号を運ぶ。任意のＬＥＤバス802 における各導体は、バンク804 にお ける１つのＬＥＤに信号を運ぶ。 ３．バルブ 本発明の実施態様において使用されるソレノイド バルブ(solenoid valve)、 例えばバルブ４〜７、10、14、90〜91、100 〜121 および129 は、開くように命 令されるまでは通常閉じられている。従って、合成器（シンセサイザー）のすべ てのバルブについて不履行状態は、閉まっているということである。合成器が不 履行状態にあるときは物質が流れることができないので、安全が保証される。開 かれると、バルブは電力を使い、昇温する。系の電力の明らかな消耗の他に、熱 いバルブは、その出入口を通過する化学製品に悪影響を及ぼし得る。通常は、ソ レノイドバルブを開くために、すでに開いているバルブを開いた状態に保持する より大量の電力を要するので、ストライク リレー(strike relay)例えばモデル Ｄ１Ｄ２０（カリフォルニア州、ロング ビーチのクリドム インコーポレーテ ッド(Crydom，Inc.)から）を使用して、バルブを操作する。Ｄ１Ｄ２０のような ストライク リレーは、特定した時間、典型的には100 ミリ秒間、バルブに +12 ボルトを供給して、ソレノイド バルブを閉まった状態から開く。ストライク リレーが +12ボルトを供給している間の時間は、ソフトウエア制御によって特定 され得、ストライクはＩ／Ｏチャ ンネルを経て供給される。その後、ストライク リレーは、減少した電圧、典型 的には見積もられた電圧の半分、または本発明の実施態様においては約６ボルト を供給して、ソレノイド バルブを開いた状態に保持する。従って、バルブを操 作するのにより小さいエネルギーが必要とされ、より少ない熱が生成される。 本発明は、４つの別の電力供給を準備する。第１の電力供給は、コントローラ ー回路768 に見出されるようなＴＴＬチップに電力を供給するために +5 ボルト 出力する。第２の電力供給は、ステッパー モーター(stepper motor)による使 用のために +32ボルト出力する。第３の電力供給は、ソレノイド バルブを作動 するために +12ボルトを与える。任意の４番目の電力供給はまた、センサーによ る使用のために +12ボルトを与える。バルブのための別の４番目の電力供給は、 それらが開いたり閉まったりするときにバルブにより発生するいかなるノイズも 、センサーの操作を妨害しないことを保証する。 その不履行状態において、すべてのバルブは閉められる。さらなる安全基準と して、合成器はさらに、制御コンピューターの不調が発生したときにすべてのバ ルブを遮断するために、固体ウォッチドッグ リレー(solid state watchdog re lay)を準備する。固体ウォッチドッグ リレー例えば、ブレンテク インターナ ショナル(Brentek International)によるモデルＳＭ−ＷＤＴ５（カリフォルニ ア州、サン ディエゴのインダストリアル コンピューター ソース(Industrial Computer Source)から入手可能）が、制御コンピューター とバルブへの電力供給との間に入れられる。ソフトウェアが発生したパルスは、 制御コンピューターからウォッチドッグ リレーへ、Ｉ／Ｏチャンネルの１つで 伝達される。パルスがないとき、例えばＣＰＵ故障、ラッチアップまたは電力故 障のときに、ウォッチドッグ リレーはバルブへの電力供給を遮断し、それによ ってすべてのバルブを閉じる。 Ｆ．制御ソフトウェア ここでは、図16〜24のフローチャートについて、制御ソフトウェアを詳細に議 論する。これらのフローチャートは、制御コンピューターによって発せられる命 令、または合成プロセスの関連した段階を完了することを説明する。以下の議論 を簡単にするために、すべての関連した時間に、加圧された配達系(delivery sy stem)のバルブが制御コンピューターから適当な命令を受け取って、所望の試薬 を反応器バンクのバルブへ配達することを想定する。 図16は、反応器201 〜209 が内容物を排出するように、制御コンピューターに より発せられた一連の命令を説明するフローチャートである。排出の前に、反応 器201 〜209 は液体またはビーズ懸濁液を含む。頂上の共通マニホルド(common manifold)212に結合した、アルゴン供給バルブ121 は開く命令を受け取り、そし て開いて、頂上の共通マニホルド212 をアルゴンで加圧する。同時に、選ばれた ３つ 口のバルブ101 〜109 が開いて、液体が反応器201 〜209 からより低いマニホル ド214 に入ることを可能にする。いくつかのカップリング反応中に、すべての反 応器201 〜209 が使用されるわけではないので、選ばれたバルブ201 〜209 だけ が開く。反応器が合成期間中ずっと空であると、その内容を排出する必要がない 。底のマニホルド214 の廃棄物バルブ110 が開いて流体が出ていくことを可能に する。圧力差の結果として、アルゴン圧が流体を、反応器201 〜209 からより低 いマニホルド214 を通って廃棄物バルブ110 の外へ押し出す。排出する液体が残 っていないことを知らせるセンサー110Sがオフになると、バルブはさらに２〜５ 秒間開いた状態にとどまって、すべての液体が反応器バンクから排出されること を保証する。 図17は、より低いマニホルド214 をきれいにするように、制御コンンピュータ ーにより発せられた一連の命令を描く。開始段階では、より低いマニホルド214 に物質がある。その後、分離バルブ100 が開いて、加圧されたアルゴンがＰＤＳ ２６５から、より低いマニホルド214 に入ることを可能にする。同時に、廃棄 物バルブ110 が開いて、より低いマニホルド214 から物質を排出する。物質が残 っていなくなるまで、物質はより低いマニホルド214 から出る。光学センサー11 0Sが廃棄物管中に物質がないことを検出すると、バルブは不履行状態へ戻る。 図18は、親容器200 の内容物を混合するように、制御コンピューターから発せ られた一連の命令を示す。系は、ア ルゴンを下から親容器に導入して内容物を混合する。アルゴンの泡は、親容器の 底から親容器の内側の内容物の表面へ上ってくるときに親容器200 の内容物をか きまわす。再び、開いたままでいるようにはっきり命令されていなかったすべて のバルブが不履行の状態にある。バルブ100 が開いて、加圧したアルゴンをＰＤ Ｓ ２６５から親容器の底へ導入してその中にある内容物をかきまわす。バルブ 90がまた開いて、アルゴンを親容器から排出する。バルブ100 および90は、約15 〜30秒後に不履行状態に戻る。 図19Ａおよび19Ｂは、ビーズ懸濁液を親容器から種々の反応器へ配分するよう に、制御コンピューターにより発せられた一連の命令を描く。一連の命令は、種 々の反応器をビーズ懸濁液で満たすための体積測定技術を実行する。この方法を 用いて、反応器は流速にあまり依存せずに満たされる。かくして、みられるよう に、ビーズ懸濁液は、その反応器と、ビーズ懸濁液が入っていくマニホルド口と の間の距離にかかわらず、反応器間に均等に分配される。配分サイクルの開始時 に、反応器バンクはアルゴンのみを含み、親容器は段階852 のビーズ懸濁液を含 む。 段階854 では、反応器バンクは、再配分段階に先立ち、反応器バンクに存在す るアルゴンを置き換えるために、ＤＭＦで部分的に満たされている。分離バルブ 100 が開いて、加圧されたＤＭＦが、加圧された配達系からより低いマニホルド に入ることを可能にする。バルブ101 〜109 が開いて、ＤＭＦが反応器へ向かっ て上ることを可能にす る。バルブ120 が開いて、頂上の共通マニホルドからアルゴンを排出する。バル ブ100 、101 〜109 および120 が、あらかじめプログラムされた期間（それぞれ 約３秒であり得る）後に、好ましくは連続して、その不履行状態に戻る。次に、 反応器201 〜209 は、泡を取り除くために混合される。バルブ100 〜109 が約３ 秒間再び開く。このあらかじめプログラムされた期間の満了時に、反応器へ導く 各チューブ241 〜249 におけるＤＭＦのレベルは頂上の共通マニホルド212 に近 くなる。 次に、反応器バンクおよび親容器200 は、段階858 においてＤＭＦで満たされ る。バルブ100 が開いて、加圧されたＤＭＦがＰＤＳ ２６５から反応器バンク に入ることを可能にする。バルブ101 〜109 が開いて反応器バンクをＤＭＦで満 たすことを続ける。バルブ129 が開いて、反応器バンクから溢れ出たＤＭＦが親 容器200 に入ることを可能にする。バルブ90がまた開いて、置き換えたアルゴン を親容器200 から排出する。センサー99S が検出範囲内のＤＭＦを検出するとき 、親容器200 中の流体のレベルが上方の容量性センサー99S のレベルに上るまで 、充填を続ける。次いで、反応器バンクが完全に満たされる。親容器200 は、お よそ第２の容量性センサー99S のレベルまで満たされる。次に、バルブ90、100 、101 〜109 は、段階860 において、その閉じた状態に戻る。 次に、段階862 において、頂上の共通マニホルドのＤＭＦを一掃する。バルブ 121 が開いて、頂上の共通マニホル ドを加圧されたアルゴンで加圧する。バルブ129 が開いて、ＤＭＦが頂上の共通 マニホルドから親容器に入ることを可能にする。バルブ90が開いて、置き換えた アルゴンを親容器から排出する。頂上の共通マニホルドからのＤＭＦをそれによ って、親容器に移す。親容器は、溢れ出ること無くさらなるＤＭＦを受け入れる のに十分な容積を有するように設計される。あらかじめプログラムされた時間、 例えば約５秒の後、バルブ90、121 および129 は、段階864 において不履行状態 に戻る。あらかじめプログラムされた時間は可変であるが、頂上の共通マニホル ドのＤＭＦを一掃するのに要する時間と同じかそれより多くなければならない。 反応器が、ビーズ懸濁液の導入に先立ち、ＤＭＦであらかじめ満たされないと 、すなわち反応器が空であると、ビーズ懸濁液の均等でない分配が生じる。反応 器が空であると、ビーズ懸濁液が親容器から入るところのマニホルド口に最も近 い反応器がまず満たされる。過剰に満たされることが許されるものがあると、幾 つかの反応器については残ったビーズ懸濁液がなくなり得る。 本発明は、反応器がビーズ懸濁液を受け入れる体積を制御する新規な方法を使 用する。第１に、段階866 において、小さいアルゴン柱を、反応器を頂上の共通 マニホルドに結合しているところの各チューブの頂上に導入する。このアルゴン の泡を作るために、バルブ121 を開いて、加圧されたアルゴンが頂上の共通マニ ホルドへ入ることを可能 にする。選ばれたバルブ101 〜109 が連続して開いて、いくらかのＤＭＦが反応 器からより低いマニホルドへ排出することを可能にする。バルブ110 が開いて、 底のマニホルドから、置き換えたＤＭＦを排出する。約0.3 秒後、小さいアルゴ ン柱が、反応器を頂上の共通マニホルドに結合しているところのチューブの頂上 に出現する。次に、バルブ101 〜110 および121 が、段階868 において不履行状 態に戻る。 段階869 では、反応器間の分配のための準備において、親容器中のビーズ懸濁 液が混合される。この段階に関係した命令は、図18に関して議論したものと同様 である。次に、バルブ10および90を、段階870 において不履行状態に戻す。この 段階は、均一なビーズ懸濁液が、選ばれた反応器間に均等に分配されることを保 証する。 一部のビーズ懸濁液を次に、段階871 において、頂上の共通マニホルドへ導入 する。この段階は、頂上の共通マニホルドへ入るビーズ懸濁液が、最後の反応器 チューブ、例えばセンサー109Sと関連した反応チューブが結合するマニホルド口 を流れ過ぎることなしに、頂上の共通マニホルド内に存在するアルゴンのほとん どを置き換えるように、あらかじめプログラムされた時間に従い設定される。約 0.5 秒のあらかじめプログラムされた時間は十分であることが見出された。ビー ズ懸濁液のこの部分を頂上の共通マニホルドへ導入するために、バルブ91を開い て親容器をアルゴンで加圧する。バルブ129 を開いて、ビーズ懸濁液が頂上 の共通マニホルドへ流れ入ることを可能する。バルブ120 を開いて、頂上の共通 マニホルドに存在するアルゴンを排出する。先に議論したあらかじめプログラム された時間の満了後、バルブ91および120 は、段階872 において不履行状態に戻 る。最も重要なことには、バルブ129 が開いた状態を継続して、ビーズおよびポ リマーがバルブ閉鎖動作により損傷を受けることを防ぐ。本発明の実施態様にお いて、２‐口バルブ129 は、先に議論したやり方で、開いた状態にあるように制 御コンピューターからの命令信号を受け続ける。しかしながら、バルブ129 は、 制御コンピューターから命令パルスを受けとると、開いた状態と閉じた状態との 間にトグルで留めた(toggle)ラッチ バルブ(latch valve)であり得る。バルブ1 29 がラッチ バルブで、すでに開いているならば、ラッチ バルブ129 を開い た状態に保つために制御コンピューターによって取り出される動作が必要ない。 図19Ｂは、図19Ａの続きである。頂上の共通マニホルド212 に存在するいくら かのアルゴンが置き換えられた後、ビーズ懸濁液の残部が、段階874 において頂 上の共通マニホルド212 に移される。バルブ91が開いて、親容器200 をアルゴン で加圧する。開いた状態に保持されていたバルブ129 は、加圧されたビーズ懸濁 液が頂上の共通マニホルド212 に入るのを可能にする。選ばれたバルブ101 〜10 9 が開いて、反応器200 内のＤＭＦがより低いマニホルド214 へ出ていくのを可 能にする。バルブ110 が開いて、より低 いマニホルド214 からＤＭＦを排出する。ビーズ懸濁液の抵抗に幾らか依存して 、ＤＭＦは選ばれた反応チューブ201 〜209 を比較的ゆっくりと退く。選ばれた 反応器201 〜209 を頂上の共通マニホルド212 と結合している、選ばれたチュー ブ221 〜229 からの、置き換えられたＤＭＦは、ビーズ懸濁液で置換される。懸 濁液‐泡‐ＤＭＦの柱は、より低いマニホルド214 の方へ下がってゆっくりと進 む。 先に導入された泡の柱はまた、体積マーカーとして有利に役に立つ、すなわち 、各反応器が十分量のビーズ懸濁液を受けとるとき、制御コンピューターが決定 する方法を提供する。泡の柱は、テフロンの表面特性およびＤＭＦとテフロンと の間の高い接触角の故に、ＤＭＦの柱と懸濁液の柱との間に補足されてとどまる 。先に議論したように、本発明の実施態様において使用される光学センサーは、 実質的に半透明のテフロンチューブの内部で、液体柱の存在または不在を検出す ることができる。ＤＭＦが、下方へ進む大量のビーズ懸濁液により置換されると 、泡は反応チューブへ、かつ反応器をより低いマニホルドに結合するところのチ ューブへと下に動く。アルゴンの泡が、下方へ動いた場合に、光学検出器101S〜 109Sにより検出された瞬間、その検出器は直ちにオフになる。先に議論されたよ うに、センサーのデータは、それぞれのバルブ101 〜109 を閉める命令信号を即 座に発する制御コンピューターに伝達される。すべてのバルブ101 〜109 が閉じ られた後、ビーズ懸濁液の輸送が再開され、音響センサー120Sが、親容器を頂 上の共通マニホルドと結合しているチューブ中に流体がないことを検出するまで 、段階878 において続けられる。段階882 において、バルブ129 以外のすべての バルブが不履行状態に戻る。議論したように、バルブ129 は開いた状態にとどま って、ビーズおよびバルブ129 への損傷を避ける。 この時点での合成器は反応器中に懸濁液を有し、あるいは、親容器中にいくら かビーズ懸濁液残留物を有する。すべてのビーズが反応器に移されることを確実 にするために、少なくとも１つのすすぎサイクルを含むすすぎプロセスが使用さ れる。 すすぎサイクルは、段階890 において親容器の内壁をＤＭＦスプレーでシャワ ーして、壁にくっついているいかなるビーズ懸濁液残留物をも解き放つことによ って、始められる。バルブ14が開いて、ＤＭＦのスプレーが壁を洗うことを可能 にする。バルブ90が開いて、置き換えられたアルゴンを親容器から排出する。内 壁は、親容器のＤＭＦのレベルが、より低い容量性センサー90S のレベルに上が り、センサーがオンになるまで、ＤＭＦのスプレーを受け続ける。このセンサー のデータは、制御コンピューターによって受けとられ、このコンピューターは段 階892 において直ちに命令を発してバルブ129 以外のすべてのバルブを不履行状 態に戻す。親容器の内容物を次に、先に議論したやり方で、アルゴンの泡によっ て撹拌する。 あるいは親容器は、それをＤＭＦで再び満たし、次いで それを混合して、親容器の内壁またはフリットにくっついているいかなるビーズ 懸濁液残留物をも解き放つことによってすすがれることができる。第１に、段階 884 では、親容器は新しいＤＭＦで再び満たされる。再充填は、バルブ10を開い てＤＭＦが加圧された配達系から親容器へ入ることを可能にすることにより成し 遂げられる。バルブ90がまた開いて、置き換えられたアルゴンが親容器を出るこ とを可能にする。親容器中のＤＭＦのレベルが、頂上の容量性センサー99S のレ ベルに上がると、頂上の容量性センサー99S はオンになる。このセンサーのデー タは制御コンピューターによって受けとられ、このコンピューターは段階886 に おいて直ちに命令を発して、バルブ129 以外のすべてのバルブを不履行状態に戻 す。次に親容器は、先に議論したやり方で、段階888 においてアルゴンの泡を親 容器に導入することにより混合される。 次に、ＤＭＦとビーズ懸濁液との混合物を、段階894 において、バルブ91を開 けて親容器をアルゴンで加圧し、そして混合物をバルブ129 （すすぎプロセスの 間中ずっと開いたままになっている）を通して頂上の共通マニホルドに移すこと によって、反応器に移す。選ばれたバルブ101 〜109 を開いて、流体が反応器か らより低いマイホルドへ流れることを可能にする。バルブ110 が開いて底のマニ ホルドからＤＭＦを排出する。反応器の底のフリットは反応器内部のすべてのビ ーズを漉して除く。結局、親容器が排出される。センサー120 は、親容器を頂上 の共通マニホルド に結合しているチューブに存在する流体がないときは、オフになる。このセンサ ーのデータは、制御コンピューターに伝達されて、親容器中には送られる流体が 残っていないことを知らせる。制御コンピューターはバルブ91をさらに５〜10秒 間開き続けて、頂上の共通マニホルドを加圧し、そしていかなる残留する混合物 をも反応器中へ動かす。５〜10秒後、バルブ129 以外のすべてのバルブを不履行 状態に戻す。１つのすすぎサイクルが完了する。 先に議論したように、多数のすすぎサイクルが使用されて、実質的にすべての ビーズ懸濁液が親容器から反応器へ移されることを保証する。２〜３回のすすぎ サイクルが十分であるとわかった。 すべてのすすぎサイクルが完了したら、バルブ129 を含むすべてのバルブを、 段階896 において不履行状態に戻す。バルブ129 は、すすぎプロセスを含むビー ズ懸濁液再配分プロセス中ずっと開いたままでいて、ビーズおよびポリマーへの 損傷を最小にすることに注意せよ。次に、反応器バンクは、段階898 において先 に議論したやり方で、すべての流体を排出する。 図19Ａ〜19Ｂにおける段階から、アルゴンの泡の使用により、親容器と反応器 との間の各流路の流速にかかわらず、ビーズ懸濁液を反応器間に均等に分配でき ることが認められ得た。アルゴンの泡がビーズ懸濁液とＤＭＦ試薬との間に安定 に保持される限り、目に見えるマーカーが提供され、センサーが反応器の状態を 決定することを可能にす る。先に述べたように、安定なアルゴンの泡を保持できることは、ＤＭＦの好ま しい物性、すなわちＤＭＦとテフロンとの高い接触角による。 しかしながら、ビーズを反応器に運ぶときは、ＤＭＦ以外の流体を使用するこ とが望ましいことであり得る。これは、特に、代わりの流体が安定なアルゴンの 泡を作ることの助けとなる物性を持たないと、問題を作り得る。例えば、ＤＮＡ 合成の溶媒として使用されるアセトニトリル（ＭｅＣＮ）は、安定なアルゴンの 泡を製造することができない。かくして、ビーズを反応器に分配するための異な る方法が必要とされる。 図19Ｃ〜19Ｄは、安定なアルゴンの泡が製造できないときに、親容器の内容物 を混合するために、制御コンピューターにより発せられる代替の１組の命令を説 明する。この技術は、特に、少数の例えば４までから５の反応器のみが使用され るときに有用である。 段階854a〜860aは、より小さい数のバルブ101 〜109 のみが開いている、すな わち選ばれた反応器に対応するものだけが開いていること以外は、図19の段階85 4 〜860 と同様である。選ばれた反応器は、再配分の段階に先立ち、反応器バン ク中に存在するアルゴンを置き換えるために、溶媒例えばＭｅＣＮで一部満たさ れる。その後、選ばれた反応器および親容器がＭｅＣＮで満たされる。親容器20 0 中のＭｅＣＮの量が、第２の容量性センサー99S のレベル（充填が完了したこ とを示す）に上がったとき、ＭｅＣＮ の流れは止まる。完了すると、次に、選ばれたバルブが閉じた状態に戻る。 次に、段階872aにおいて、親容器に置かれたビーズ懸濁液は、選ばれた反応器 への分配の準備で、混合される。段階874aにおいて、次にビーズ懸濁液は頂上の 共通マニホルドに導入され、そして、バルブ91、129 および101 〜109 の選ばれ たものを開けることにより、選ばれた反応器に分配される。これらのバルブは、 センサー120Sが、親容器と頂上の共通マニホルドとを結合しているチューブ中に 流体が不在であることを検出するまで、開いたままに保持される。アルゴンの泡 が製造されないので、センサー101S〜109Sは使用されない。小さい数の反応器の みがビーズを受け入れるので、ビーズが反応器のそれぞれに到達するのに要する 時間はほとんど等しく、それによって、反応器のそれぞれについて一般に等しい 分配を保証する。 段階890aにおいて、図19Ａ〜19Ｂですでに議論したようなすすぎプロセスが使 用されて、すべてのビーズが反応器に移されることを確実にする。すすぎプロセ スが完了すると、バルブ129 を含むすべてのバルブを、段階896aにおいて、不履 行状態に戻す。次に、反応器バンクは、段階898aにおいて、すべての流体が排出 される。 図20は、反応器を配達系からの所望の試薬で満たすために、制御コンピュータ ーによって発せられる一連の命令を示すフロー チャートである。図20に関して 議論された段階はまた、図21Ａ〜21Ｄにおいて概略的に説明されてい る。このプロセスは、段階900 において、より低いマニホルドが不活性アルゴン でのみ満たされることを想定する。図21Ａは、空のマニホルドを持つ反応器バン クの関連した部分を図で示す。より低いマニホルドがまず、段階902 において試 薬で満たされる。バルブ100 が開いて、試薬がより低いマニホルドに入ることを 可能にし、そして、バルブ110 が開いて、より低いマニホルドから、置き換えら れたアルゴンを排出する。試薬がセンサー110Sによって検出されると、すべての バルブは段階903 において不履行状態に戻る。 幾つかの例において、親容器と頂上の共通マニホルドとを結合しているチュー ブを満たしながら、センサー101S〜109Sは不注意にまたは時期尚早に作動させら れ得る。例えば、試薬が実際にそれに到達する前に試薬の迷い出た一滴によって センサーが作動させられ得る。このことによって、反応器に配達するのに不十分 な量の試薬をチューブに存在させることになり得る。 時期尚早のセンサーの作動に関しての問題を減らす、または除去するために、 制御コンピューターは、段階904 において、チューブをあらかじめ満たすために 設定された量の時間、バルブ101 〜109 を開けることを任意的にプログラムされ ることができる。一般に、センサー101S〜109Sにより検出される前に、チューブ を約75％あらかじめ満たすように、時間が設定される。記載されたように、この 段階は、センサー101S〜109Sの使用を当てにしない。かくし て、あらかじめ満たすことが、反応器に注入されるのに少なくとも十分な量の試 薬がチューブ中に存在して、センサーが時期尚早に作動したとしても、混合を十 分に行うことを保証する。段階905 において、あらかじめ規定された時間がチュ ーブを満たす準備において終了した後、バルブは不履行状態に戻る。 段階906 において、反応器とより低いマニホルドとを結合しているチューブは 、センサーに対して試薬で満たされる。充填プロセスは、時間を節約するために 平行して、または連続して行うことができる。バルブ100 が開いて、加圧した配 達系からの加圧したアルゴンが、より低いマニホルドに入るのを可能にする。選 ばれたバルブ101 〜109 が、連続してまたは平行して開いて、試薬が、反応器と より低いマニホルドとを結合しているチューブに入ることを可能にする。チュー ブの中の試薬のレベルが上方の光センサー101S〜109Sに達すると、光センサーが オンになり、制御コンピューターは直ちに関連したバルブ101 〜109 を閉める。 すべてのセンサー101S〜109Sがオンのとき、すべてのバルブが段階908 において 閉められた状態に戻る。図21Ｂは、この充填段階が完了した後の結果を概略的に 説明する。 次に、底のマニホルドを段階910 において先に議論したやり方できれいにする 。図21Ｃは、きれいにしたマニホルドを有する反応器バンクの関連した部分およ び、頂上の光学センサー例えば101Sとバルブ例えば101 との間のチュー ブの部分の内部にある試薬の柱を示す。底のマニホルドがきれいにされた後、段 階912 においてすべてのバルブを再び不履行状態に戻す。次に、チューブの中の 試薬を、フリットを通して反応器中へ押し出す。 試薬を反応器へと押すために、アルゴンバルブ122 を開いて、加圧された配達 系からのアルゴンが、より低いマニホルドを加圧することを可能にする。排出バ ルブ120 がまた開く。 段階913 において、渦巻（撹拌）モーターを始動させて、あらかじめ決められ た量の時間、反応器バンクのかきまぜを開始する。時間は、反応器内の内容物が 完全に混合されることを可能にするのに十分長い。一般に、約４の時間が適当で あることが見出されたが、合成のタイプによって変えられ得る。 上記した混合期間中、段階914 において、バルブ101 〜109 が、あらかじめプ ログラムされた時間開いて、少量の試薬を反応器に流す。通常、合成プロセス中 、反応器は満たされ、そして排出される。反応器が排出される各時間、その中の ビーズは乾燥し、かつ一緒に凝集して、「ビーズ ケーキ」を形成するようにな る。段階914 は、反応器の内容物を流動化し、ビーズ ケーキを溶解する。ビー ズが反応器の底または底近くにあるときは、渦巻きが最も有効であるので、少量 の流体のみを注入すべきである。さもなければ、ビーズ ケーキは反応器の頂上 に浮遊し、それを溶かすのにより多くの時間を要し得る。段階915 におい て、あらかじめ決められた時間が終了した後、バルブを不履行状態に戻す。 段階916 において、試薬の残存する部分を、バルブ101 〜109 を開くことによ って、反応器へと押す。各容器は、その関連するセンサー101S〜109Sが流体の不 在を検出し、かつ制御コンピューターがそのバルブを閉じるまで、満たされる。 すべてのセンサー101S〜109Sがオフのとき、すべての反応器が満たされる。混合 を改善するために、容器バンクは、満たされると同時にかきまわされる。先に記 載したように、反応器は、すべてのバルブ101 〜109 を一度にまたは連続して開 くことによって、平行してまたは連続して容器を満たすように、プログラムされ 得る。 あるいは、反応器は、センサー101S〜109Sをあてにすることなく、満たされ得 る。例えば、バルブ101 〜109 は、容器を所望のレベルまで満たすのに十分であ るところの、あらかじめプログラムされた時間開かれ得る。0.5 秒〜１秒の時間 が十分であることが見出された。しかしながら、この時間は使用される容器の数 によって変わり得る。すなわち、数が大きいほど、長い時間を要する。図21Ｄは 、満たされた後の反応器のダイヤグラムを示す。 反応器へと押されるべき試薬の体積はまた、バルブ101 〜109 とセンサー101S 〜109Sとの間の管系の長さまたは直径を変えることによって、容易に変化され得 ることに注意せよ。この変化は、反応器を注入バルブ例えばバルブ111に結合す るチューブを、異なる長さまたは断面積を有する チューブで置き換えることにより、容易に成し遂げられ得る。 反応器それ自体の直径を増加することはまた、幾つかの例においては有利であ り得る。例えば、ビーズを２以上の試薬と同時に混合することが望ましくあり得 る。そのような混合は、図21Ａ〜21Ｄに記載された段階に引き続き、第１の試薬 を反応器に導入することによって起こり得る。次に、図21Ｂ〜21Ｄに記載された 段階を繰り返すことによって、第２の試薬を反応器に導入する。しかしながら、 そのように行う際に、第２の試薬の導入の前に、チューブ241 〜249 および271 〜279 に残っているアルゴンによって、アルゴンの泡をビーズ懸濁液と第２の試 薬との間に配置するであろう。反応器からアルゴンの泡を除去するために、反応 器の内径は、反応器内のビーズ懸濁液の高さを減らすためにより大きくされるこ とができ、それによってビーズ懸濁液を通るアルゴンの泡の脱出をより容易にす る。アルゴンの泡の除去後、ビーズ懸濁液と第２の試薬は、先に記載したように 渦を巻かせることによって、互いに混合される。 図22は、活性化したアミノ酸試薬を反応器に注入するように、制御コンピュー ターにより発せられた一連の命令を示すフロー チャートである。図23Ａ〜23Ｃ は、アミノ酸注入プロセスの関連した段階を概略的に説明する。再び、開始時に おいて、より低いマニホルドがきれいにされる、すなわちアルゴンのみを含むこ とが想定される。図23Ａ は、開始時における反応器、より低いマニホルド、バルブ、センサーおよび関連 したチューブのダイヤグラムを示す。貯蔵器231 〜239 のための代替的配置を図 ６Ａに示す。 多数の群の貯蔵器を保持するための回転可能なカラセル(carousel)を実行する 実施態様については、カラセルは回転されて、段階917 において選ばれた群の貯 蔵器とチューブとを調整する。一旦、適当な貯蔵器が選ばれると、段階918 にお いて、マニホルドがアミノ酸活性化試薬例えば0.2 ＭのＨＢＴＵおよび0.6 Ｍの ＤＩＥＡの、ＤＭＦ対ＤＣＭ３：１中の溶液で満たされる。マニホルドは、図20 に関して記載したやり方、すなわちセンサー110Sがオンになるまでバルブ100 お よび110 を開くというやり方で満たされる。その後、段階920 において、すべて のバルブが閉まる。 次に、活性化試薬が、反応器とより低いマニホルドを結合しているチューブに 入る。バルブ100 および120 が開いて、段階922 において、加圧された活性化試 薬がより低いマニホルドに入るようにする。バルブ101 〜109 の選ばれたものが 、より低い光学センサー111S〜119Sが流体の存在を検知するまで開く。段階924 において、すべてのバルブが再び閉まる。図23Ｂは、この初期の充填段階の後、 反応器の関連する部分における流体の存在を図で示す。 注入をなし遂げるために、バルブ100 および120 を再び開いて、段階926 にお いて、加圧された活性化試薬をより 低いマニホルドに入れる。バルブ101 〜109 の選ばれたものが平行して開いて、 加圧された活性化試薬の柱が前記したチューブを前進して上がることを可能にす る。同時に、バルブ111 〜119 の関連したものが開いて、アミノ酸を、加圧され た活性化試薬の、上方へ進む柱に注入し、かつ活性化試薬と混合する。図23Ｃは この注入段階を図で示す。 各センサー101S〜109Sが流体の存在を検出すると、制御コンピューターが、そ のセンサーと関連するバルブ101 〜109 を閉める。段階928 において、すべての バルブ101 〜109 が閉じると、反応器バンクのすべてのバルブが不履行状態に戻 る。アミノ酸と活性化試薬の混合物は、好ましくは上記したチューブ中に約２分 間滞在して、段階930 における適当な活性化を保証することを可能にする。 その後、段階932 において、図17に関して先に議論したやり方で、底のマニホ ルドがきれいにされる。次に、バルブ101 〜109 と上方のセンサー101S〜109Sの 間の混合物の柱を、段階913 〜916 において図20に関して先に議論したやり方で 、反応チューブへと押す。 図24は、反応器バンク内のビーズ懸濁液を親容器に移すための、制御コンピュ ーターにより発せられる一連の命令を示す。開始時に、反応器が排出されており 、かつより低いマニホルドがアルゴンで満たされることが想定される。反応器は 第１に、図20に関して先に議論したやり方で、段階936 において溶媒で満たされ る。その後、すべてのバルブが不履行状態に戻る。 次に、ビーズと試薬との混合物が渦を巻かれて、段階938 において懸濁液を作 る。あるいは、ビーズの混合物は、反応器が満たされていると同時に渦巻撹拌さ れることができる。そのようなプロセスは、懸濁の速度を改善し、容器の底でビ ーズが互いに凝集することを防ぐ助けとなる。反応チューブの内容物は、段階94 0 において親容器に移される。バルブ122 が開いて、より低いマニホルドをアル ゴンで加圧する。バルブ129 が開いて、ビーズ懸濁液が反応器バンクから親容器 に動くことを可能にする。バルブ101 〜109 の選ばれたものを、好ましくは連続 して開いて、アルゴンが各反応器の内容物を、頂上の共通マニホルドへ向かって 上方に、そして親容器中へと吹き飛ばすことを可能にする。反応器の内容物は次 に、親容器へ連続的に移される。上記の移動はまた、バルブ101 〜109 を同時に 開くことにより平行して行うことができるが、連続した移動は反応器バンク内の アルゴン圧を高く保持することを可能にし、したがって好ましい。さらに、好ま しくは、バルブ101 〜109 のそれぞれが、約４秒間開いたままで保持されて、与 えられた反応器の実質的にすべての内容物が親容器に移されることを保証する。 このプロセス中、バルブ90、122 および129 は開いたままに保持される。 すべての反応器の内容物が親容器に移された後、反応器はすすがれ、別の移動 のプロセスが起こり得る。反応器をすすぐために、上記の段階を繰り返し、段階 936 において反応器をＤＭＦで再び満たすことで開始する。段階937 お よび941 に示されるように、ラインサイクル中、バルブ129 は開いたままに保持 されて、ビーズおよびバルブ129 に損傷を与えることを防ぐ。親容器は好ましく は、少なくとも３回の移動分の容積を有する。再結合の最後に、好ましくは、親 容器の流体のレベルがより低い容量性センサー90S より下に達し、そのセンサー をオフにするまで、バルブ110 および91を開くことによって、親容器が排出され る。３つのすすぎサイクルが、十分であることが分かった。 その後、バルブ129 を含むすべてのバルブを、段階942 において不履行状態に 戻す。親容器の内容物を段階944 においてかきまわして、図20に関連して議論し たやり方で、種々の容器からのビーズを混合する。ビーズが親容器から除去され るべきであると、親容器は好ましくは、親容器中の流体のレベルがより低い容量 性センサー90S より下に達し、そのセンサーをオフにするまで、バルブ10および 91を開くことによって、段階946 において排出される。すべてのバルブは引き続 いて、段階948 において不履行状態に戻る。ビーズを含む混合物は次に、使用の ため、親容器から除去され得る。 あるいは、ビーズは、図21Ａ〜21Ｂに関連して議論したやり方で、反応器に再 配分され得る。再配分後、すべてのバルブは不履行状態に戻る。 Ｇ．ソフトウエアの全体的ダイアグラム 第２５図は、ここで付録Ｉとして含まれるソースコード のフローチャートである。モジュール９５０は、ユーザーを示す。コマンドイン タープリター９５２は、ユーザーからのテキストコマンドを受ける。あるいは、 ユーザーは、メニューシステム９５３を用いるシンセサイザー（合成装置）を動 かすためにコマンドを入れることができる。メニューシステム９５３により受け られたコマンドは、コマンドインタープリター９５２により使用しうるフォーマ ットに変換されるか、直接にサポートルーチンモジュール９６２中のサポートル ーチンを呼ぶ。コマンドインタープリター９５２はまた、ユーザーにより文字に より又は他の方法で入れられたコマンドを解釈する。その後、解釈されたコマン ドは、サポートルーチンモジュール９６２中のサポートルーチンを呼び、実行す る。更に、解釈されたコマンドは、ディスプレーフォーマッター９５４によりフ ォーマット化され、ディスプレー７６２上にディスプレーされる。 モジュール９５８は、複数のマクロファイルを含む。一つのマクロファイルは 、たとえば、合成を行なう又はライブラリーを構築するために実際に起るべき工 程の順序を定義する。その最も基本的なレベルにおいて、マクロファイルはたと えば、バルブを制御しかつセンサー情報を読むための別個のコマンドのセットを 含むところのマクロを含む。マクロは、反応容器２０１〜２０９を排液するよう なより高レベルの機能を行うために、他の基本的マクロを用いることができる。 マクロファイル９５８からコマンドインタープリター９ ５２により受けられたマクロは、シンセサイザーライブラリーコントローラ９６ ０中に通される。シンセサイザーライブラリーコントローラー９６０は、実際の 合成のためのマクロを呼ぶ。たとえば、一つのマクロは、合成が始まる前にセッ トされるべき初めのグローバルな変数を特定しうる。 第２５図は、種々のサポートサブルーチンを動かすためのサポートルーチンモ ジュール９６２を示す。一つのそのようなサブルーチンは、自動充填であり、こ れは、すべてのセンサーがオンであるまで反応容器を自動的に充填するためのサ ブルーチンである。サポートルーチン９６２は、コマンドインタープリター９５ ２又はメニューシステム９５３からのインプットを受ける。オプションリスト９ ６４は、機能に対するポインターなどを含む。第２６図は、オプションリスト９ ６４のインプット及びアウトプット、及びそれとコマンドインタープリター９５ ２及びサポートルーチンモジュール９６２との関係を示す。 グローバルな変数及びグローバルなセッティングを保持するための初期化ファ イル９６６もある。初期化ファイル９６６はたとえば、閉じたバルブなどを開く ためにバルブにストライク電圧を供給する時間量を示す値を保持する。ルックア ップテーブルファイル９６８は、たとえばモノマーが適当な選択された反応容器 に入ることを許すべく、シンセサイザーコマンドライブラリーコントローラー９ ６０と共同する。ルックアップテーブルファイル９６８は、た とえば各反応容器のリスト、その対応するタグモノマー、所望のポリマーを合成 するために必要なモノマーのリストを含みうる。 第２５図はまた、ログファイル９７０を示す。ログファイル９７０は、コマン ドインタープリター９５２及びシンセサイザーライブラリーコントローラー９６ ０からのインプットを受ける。ログファイル９７０は、診断目的のためのオペレ ーションアルデータを含む。ログファイル９７０中のエントリーは、たとえば、 呼ばれたマクロに関係する情報を含む。 関連ファイル９７２は、各反応器及びその関連するバルブ及びセンサーのリス トを含む。関連ファイル９７２は、各反応容器及びその関係するバルブ及びセン サーをアドレスする仕事を単純化するために、シンセサイザーライブラリーコン トローラー９６０及びサポートルーチン９６２の両者と共同する。 サポートルーチン９６２によりアウトプットされたディジタルコマンドは、パ ラレルドライバー９７４に入る。パラレルドライバー９７４は、たとえばＰＣＤ ＩＯ１２０‐ＰＩ／Ｏボード７６６でありうる。パラレルドライバー９７４は、 ソレノイドバルブを駆動するために、そのＩ／Ｏチャンネルを通してバルブコン トロール信号９７６をアウトプットする。上記したように、バルブコントロール 信号は、コントローラー回路７６８により更に処理される。更にパラレルドライ バー９７４は、攪拌ステッパーモーター をコントロールするために、ステップモーターコントローラー信号９７８をアウ トプットする。シンセサイザーの光学センサー、超音波センサー及び容量センサ ーからのセンサーインプット９８０もまた、センサーチェックサブルーチン９８ ２を介してサポートルーチン９６２による処理のためにパラレルドライバー９７ ４により受けられる。 第２７図は、バルブを制御するために必要なデータ構造を示す。バルブインデ クスＶＩＮＤＥＸアレイ９８６は、インプットとしてバルブ数９８４を受け、Ｖ ＡＬＶＥＳアレイ９８８へのポインターを備える。ＶＡＬＶＥＳアレイ９８８の 各エレメントは、データバイト９９０へのポインターを含む。各データバイト９ ９０は、バルブデータ情報の８ピットを含む。所定のバルブのためのバルブデー タ情報を含むビットは、そのデータバイト９９０のアドレス、及びデータバイト ９９０中のそのビットの相対的位置を示すシフト値によりアクセスしうる。デー タバイト９９０の各ビットは、バルブを適切に開又は閉するために操作されうる 。各ビット中のバルブデータ情報はアウトプットポート９９２を介して対応する バルブを制御する。 第２８図は、インプットポート９９４からのセンサー情報を受けるために必要 なデータ構造を示す。各センサーの二値状態を示す情報は、データバイト９９６ 中の１ビット中にストアされる。データバイト９９６中の該情報にアクセスする ために、センサー番号が用いられれて、ＳＥＮＳＯＲアレイ９９８にアクセスす る。ＳＥＮＳＯＲアレイ９ ９８の各エレメントは、適当なデータバイトへのポインターを含む。各データバ イト９９６は、センサーデータ情報の８ビットを含む。所定のバルブのためのバ ルブデータ情報を含むビットは、そのデータバイト９９６のアドレス、及びデー タバイト９９６内のそのビットの相対的位置を示すシフト値によりアクセスしう る。 Ｈ．ウインドウズ インターフェース 制御ソフトウエアは、ウインドウズ型のインターフェース又はワークスペース を含みうる。一般に、ウインドウズインターフェースは、スクリーン上の表示の ための一以上の窓を備える矩形のグラフ的なユーザーインターフェース（ＧＵＩ ）である。追加的なウインドウズ対象は、所望により種々のサイズ及びフォーマ ットで（たとえば傾いて又はカスケードにされて）表示されうる。ウインドウの トップには、複数のユーザーコマンド選択を持つメニューバーがあり、その夫々 は、追加的サブメニュー、及びアプリケーション対象を持つ使用のためのソフト ウエアツールを含みうる。ウインドウズはまた、スクリーン対象を表示しかつ操 作するためのエリアを含む。このエリアは、制御コンピュータシステムのメモリ ー中に留るデータ対象とユーザーが相互作用するためのワークスペース又はビュ ーポートである。 ウインドウズインターフェースは、興味のスクリーン対象を選択しまたさもな くば発動するためのスクリーンカーサー（Cursor）又はポインターを含む。マウ スのようなポ インティングデバイスからのユーザー動き信号に応答して、カーサーは、所望の スクリーン位置へとスクリーンを横切ってフロートする（すなわち自由に動く） 。カーサー動きの間又は後に、ユーザーは、従来知られているように対象を選択 し操作するためのユーザーイベント信号を発生しうる（たとえばマウスボタンを 押す及び引きずる）。たとえば、ウインドウは、スクリーンコンポーネントをカ チッと押す（選択する）ことにより閉じられる、サイズを変えられる又はスクロ ールされることができる。キーボードアクセル又はホットキーを含むキイストロ ーク相等物が、キーボードを通してこれらの及び他のユーザー操作を実行するた めに備えられる。すなわち、ウインドウズインターフェースは、制御コンピュー タとの相互作用へのより直観的なアプローチを提供する。 ウインドウズインターフェースの基礎となっているのは、メッセージ又はイベ ントで駆動される構成である。このモデルはたぶん、その操作を、第２５図中で コマンドインタープリターにより例示されているように、伝統的に用いられてき たモード型（modal）又はシーケンシャル構成の操作と対照することにより最良 に記述される。この方法により、読者は、イベント駆動されるシステムの追加的 な柔軟性ならびに複雑性を理解するであろう。 モード型プログラムは、良く定義された開始、中間及び終了を有する一連の個 別の操作ブロック又はモードを含む。すなわち、プログラムは、操作のかなり硬 直したシー ケンスを追い、各ステップは、プログラムが次のステップへ進む前に完了する必 要がある。 モード型プログラムは、設計及び遂行が比較的容易であるが、一般に使用が容 易でない。設計はすべての必要な情報が入れらたことを確かに保証するが、しか し、プログラムにより指示された様式でユーザーが操作することを条件とする。 特に、プログラムは予め決められたモードのセットに従って作られるので、ユー ザーは、予め要求されるモードを初めに完了することなく一つのモードから他の モードへと移ることができない。このシーケンスからユーザーがそれることは、 単純に許されない。モード型プログラムのこの非柔軟性は、現実の世界の仕事を 行うには不十分である。 他方、イベント駆動される構成は、予め選択されたシーケンスを避け、代って イベントループを選択する。イベントループは、ユーザー及びシステムイベント についてのメッセージを処理する集中化されたメカニズムである。それは、種々 のウインドウクラスへのメッセージを回収しそして送るためのイベントキュー及 びメカニズムを含む。 メッセージは、オペレーティングシステムがどのようにして多くのアプリケー ション及びハードウエアイベントたとえばマウスのスイッチ入れ又はキーボード の押圧を管理し同時化するかであり、これはＭＳ‐ウインドウズにおいてウイン ドウズイベントハンドラーによりメッセージへと変換される。プログラミングの 展望からは、メッセージは 単に、特定のイベントについての情報を含むデータ構造である。このメッセージ 構造は、特定のイベントのための象徴的定数として働くメッセージアイデンティ ファイヤーを含んでよい。たとえば、ウインドウ対象からのメッセージは、ウイ ンドウの創作、閉鎖、移動及びサイズ変更についての情報を含みうる。追加的イ ベントデータが、メッセージパラメータとして利用できる。所与のパラメータの 正確な解釈は、表される各イベントタイプにより変る。インプットメッセージは 、システムワイドキュー中に集められ、適当なウインドウへ向けられる。これら メッセージは、タイマー及びスクリーンペイント（スクリーンリフレッシュ）メ ッセージと共に、興味のターゲットアプリケーションへと渡される。 システムキューからメッセージを回収し、そしてそれらを適当なアプリケーシ ョン（これは次に、到着する何らかのメッセージを処理しうる）へと送るために 一つのメカニズムが備えられる。各ウインドウは、そのタイプのすべてのウイン ドウに共通の有る特徴を定義する特定のウインドウタイプに属する。各タイプに は、そのタイプのウインドウに送られたすべてのメッセージを処理するウインド ウズ機能が伴なっている。ウインドウズが特定のアプリケーションに属するメッ セージを配置する（place）ことができる場合に、アプリケーションキューが備 えられる。アプリケーションがインプットを受ける準備が出来ている時、それは 待ちメッセージを単に読む。もし何も見つからないな ら、又はもしより高い優先度の他のアプリケーションのためにメッセージが存在 するなら、ウインドウズは制御を他のアプリケーションへと渡す。 イベントに基づくシステムたとえばマイクロソフト（商標）ウインドウズ（商 標）中のメッセージを回収しそして送るための一般的メカニズムは公知であり、 たとえばペツオルド、Ｃ、「プログラミング ウインドウズ」第２版、マイクロ ソフトプレス、1990年及びカスター、Ｈ、「インサイド ウインドウズ ＮＴ」 マイクロソフトプレス、1993年を見よ。更なる情報は、ワシントン州、レドモン トのマイクロソフト社から入手できるマイクロソフトズ ウインドウ ソフトウ エア デベロップメント中に見られる。上記の各々の開示は、引用することによ りすべての目的のために本明細書に組み込まれる。 第３３図は、制御コンピュータ上に配備された状態のＧＵＩを示す。ＧＵＩは 、ワークスペース１３０３を伴なう矩形のウインドウ１３０１を含む。ウインド ウのトップに、ユーザーコマンド選択１３０６〜１３１３を伴なうメニューバー １３０５がある。これらコマンド選択の夫々は、シンセサイザーの運転を制御す るためのコマンドを含む追加的サブユニットを含む。これらコマンド選択は、マ ウスにより適当なコマンドを発動することにより、合成を自動的に行うか又は手 動的に行うかの柔軟性をユーザーに提供する。 ＧＵＩは、ユーザーフレンドリーな環境であること、す なわちシンセサイザーをプログラミングするのに必要な労力を最小化する意図で 設計される。たとえば、ダイアログボックス対象又は１セットのダイアログボッ クス対象は、各コマンドに伴なう。コマンドが発動される時、適当なダイアログ 対象がワークスペース中に表示され、必要な情報をユーザーが入れるよう相互作 用的に促進する。Ｈｅｌｐコマンド１３１３は、このプロセツにわたってユーザ ーを援助する情報を提供する。ダイア対象を用いて、ユーザーは、伝統的なテキ ストコマンドを用いることなしにシンセサイザーをプログラムできる。 第３４図は、Macrosオプションに結びつけられたサブメニュー１３２０を示す 。ユーザーは、サブメニューアイテム１３２１又は１３２２上のマウスのスイッ チを入れることにより、夫々Learn又はRunコマンドを発動しうる。ウインドウズ 環境において、マクロは、シンセサイザーを制御するための別個のコマンドの１ セットたとえば第１６〜２４図に関係して述べたコマンドを含む対象である。Le arnコマンド１３２１を用いて、ユーザーは特定の機能を行うためのマクロを定 義できる。サブメニューはまた、利用しうるコマンドを発動すべく割当てられた キーストロークを同定しうる。たとえば「Alt+L」は、Learnコマンドを実行する ために用いられる。 マクロが一度「学習」されると、学習されたマクロ又は予め定義された何らか の他のマクロを実行するべく、Runコマンド１３２２が選択されうる。第３５図 は、Runコマ ンドが発動されたときに表示されるダイアログボックス対象を例示する。このダ イアログボックス対象は、利用しうるマクロをリストするエリア１３２５（コン ビネーションボックス）を含む。マクロを選択するために、ユーザーは、Select Macroスペース１３２４中にマクロの名前を入れる。あるいは、ユーザーは、マ ウスのスイッチを入れそして引きずることにより、スペース１３２５中に所望の マクロが選択されるまでスクロールしうる。次にユーザーは、マクロがスペース １３２６中で繰り返されるべき回数を入れる。最後にマクロを走らせるために、 ユーザーは、RunMacroボタン１３２７又はRunSMacroボタン１３２８上でマウス のスイッチを入れる。RunSMacroコマンドは、マクロ機能を逐次的に実行する、 すなわち１度に一つの反応容器を実行するように系に指示する。Cancel選択１３ ２９が選択されたとき、それはダイアログボックス対象１３２６を退出させる。 Ｈｅｌｐ選択１３３０は、ダイアログボックス対象中の別の選択に関する情報を 提供する。 第３６図は、メニューバー上のGroupsオプション１３１０が選択されたときに 表示されるサブメニュー１３３５を示す。サブメニュー１３３０は、特定の反応 容器の１群と結びつけられた１セットのバルブを定義するための用いられるDefi neコマンド１３３１を含む。一度定義されると、バルブ群は、群対象としてメモ リー中にストアされる。コンピュータのメモリーは、多くの群対象を含むことが でき、夫々は独特のバルブ群を定義する。 サブメニュー１３３０はまた、選択された反応容器を所定の期間で充填しそし て排液させるOpen/Pulseコマンド１３３２を含む。Open/Pulseコマンドと結びつ けられたダイアログ対象が発動されると、これが表示される。このダイアログ対 象ボックス（第３５図に示したものといく分似ている）は、それから選択される べきところの利用しうる群対象をリストするコンビネーションボックスを含む。 ユーザーは所望の群を選択し、ダイアログ対象により与えられた割当てられたス ペース中に、選択されたバルブをパルスする所望の期間を入力する。反応容器に 充填するために、ユーザーはOpenボタンのスイッチを入れて、バルブが開かれる べきことを示す。次に、ユーザーは、Pulse又はSPulse（反応容器を逐次的に充 填するための）ボタンのスイッチを入れることにより充填プロセスを開始する。 反応容器を排液するために、ユーザーは、Closeボタン、あるいはPulseもしくは SPulseボタンのスイッチを入れる。 Fill/Drainコマンド１３３３を用いて、ユーザーは、センサーを用いて自動的 に容器を充填又は排液できる。Fill/Drainコマンドが選択されるとき、それは、 Open/Pulseコマンドのダイアログボックス対象と類似のものを表示する。ユーザ ーは、バルブの群を選択し、そして充填機能を実行するためにAutoFill又はSAut oFillボタンを、又は反応容器を空にするためにAutoDrain又はSAutoDrainボタン のスイッチを押す。いくつかの実施態様において、センサーをトリガーした後に バルブを閉じる又は開くのを遅らせ るために、Time Delayオプションが備えられうる。この機能は、センサーが作動 されたときに反応容器がその所望のレベルに完全に達していない状況において特 に有用である。特定の遅れ期間を持つ遅れオプションをセットすることにより、 反応容器は適切に充填されうる。理解されうるように、Groupメニューに結びつ いたコマンドは、合成の間に用いる反応容器の組み合せを選ぶことにおける柔軟 性をユーザーに与える。 第３７図は、Variablesメニュー選択のために用いうるオプションを含むサブ メニュー１３４０を示す。クリエートコマンド１３４１は、マクロ中で実施され うる変数を定義する。変数は典型的には、たとえば値たとえば時間が一つの合成 から他の合成へと変る状況において用いられる。各時間値のためのマクロを作る 代りに、変数が時間に対応して単純に定義される。セットコマンド１３４２を用 いる各合成サイクルの前に、変数が所望の値にセットされる。 第３８図は、Diagnosticsオプションに関連するサブメニュー１３４５を示す 。サブメニュー１３４５は、シンセサイザーのユーザー緊密な制御及び診断目的 のためのシンセサイザーに関する情報へのアクセスを与えるために、Valves1346 、Sensors 1347及びMix 1348コマンドを含む。Mixコマンド1348が選択されると き、それは攪拌モーターを始動して、ユーザーにより指定された期間、反応容器 を混合する。 第３９図において、Valvesコマンドが選択されるとき、 Valve Diagnosticダイアログボックス対象１３９０が表示される。ユーザーは、 ダイアログボックス対象１３９０を介して、所望のバルブに対応するエントリー を選択することによりシンセサイザー中の任意のバルブの操作を制御しうる。た とえばBank１中のValve 100は、ボックス１３９１上のカーサーにスイッチを入 れる（クリックする）ことにより開かれる。便宜には、すべてのバルブが、Clos e Allコマンド１３９７を選択することにより閉じられうる。Cancel コマンド１ ３９８は、ダイアログボックス対象１３９０を閉じる。 第４０図は、センサーコマンドに対応するSensor Diagnosticsダイアログボッ クス対象１３９１を示す。示されるように、ダイアログボックス対象１３９１は 、各センサーと結びついたボックス１３９６を含む。ボックス１３９６は、対応 するセンサーの状態をユーザーに知らせる。たとえば、もしボックスがその中に 「Ｘ」を有するなら、これはそれが関係されるセンサーがオンであることを示す 。逆に、空のボックスは、センサーがオフであることを示す。 第４１図は、Fileオプションが選択されるときに表示されるサブメニュー１３ ５０を示す。Newコマンド １３５１は、合成を実行するための新しい合成セット アップファイルを作り、Modifyコマンド１３５２は、編集のための予め存在する 合成ファイルを選択することをユーザーに許す。合成セットアップファイルが完 成されると、ユーザーはメモリー中のファイルを保存するためのSave１３５４又 はSa ve Asコマンド１３５５を発動する。Printコマンド１３５７は、選択された合成 ファイルをプリントする。print Setupコマンド１３５８は、プリンターを所望 のモードに形成し、たとえばファイルを全体図モードでプリントする。Exitコマ ンド１３５９は、Fileオプションを残すために発動される。 いくつかの例において、たとえば各合成の前に、又は新しいバルブ群が選択さ れるときに、ユーザーはLoad ＣＦＧファイルコマンド１３５６を発動すること によりシステムを形成することを望むかも知れない。システムは、どれが使用に 適するバルブであるかを知らせるために、適当なファイルを読み込む。実際に、 ＣＦＧファイルは、バルブの地図を作る、すなわちバルブを各選択された反応容 器と結びつける。 第４２〜４４図は、合成セットアップファイルを作り、改変するにおいて用い られるダイアログ対象を示す。第４２図において、Set Associate ダイアログボ ックス対象１３６０は、スペース１３６１中に含まれる適当なボックスに照合印 を付すことにより、ユーザーが所望の反応容器を選択することを可能にする。便 宜には、すべての反応容器を容易に選択する又は捨てるために、Check Allボタ ン１３６２及びUncheck AlLボタン１３６３が備えられる。Check Bankボタン１ ３６４ａ〜１３６４ｄは、特定のバンクに属するすべての反応容器をユーザーが 選択することを可能にする。Cancelボタン１３６８が選択されるとき、それ は合成セットアッププロセスを中止する。上述したように、Ｈｅｌｐボタン１３ ６９は、プロセスを通してユーザーを助けるために情報を提供する。合成セット アッププロセスを続けるために、ユーザーはSet Associateダイアログボックス を閉じＯＫボタン１３６５をスイッチを入れ、そしてSynthesis Setupダイアロ グボックス対象を表示する。 第４３図は、Synthesis Setupダイアログボックス対象１３７０を示し、これ によりユーザーは合成のためのStart Macro １３７１、Loop Macro １３７２及 びEnd Macro １３７３を定義する。Start Macro及びEnd Macroは、たとえば、各 合成プロセスの前又は後に反応容器を洗うためのコマンドを含む。Loop Macro は、合成を実行するためのコマンドを含む。これらコマンドは、選択された反応 容器にアミノ酸構築ブロック及びオリゴヌクレオチドを射出すること、反応容器 の内容物を親容器中にプールすること、及びそれらを混合してビーズ懸濁物を形 成すること、そしてビーズ懸濁物を選択された反応容器に分配することを含む。 この射出、プール化及び分配工程は、一合成サイクル成す。合成サイクルは、Nu meber Synthesis Stepsパラメータ１３７４に入れられた値に従って繰返される 。一たびMacrosが定義されると、ユーザーはSynthesis Setupダイアログボック ス対象の内容を保存し、ＯＫボタン１３７５をスイッチを入れることによりセッ トアッププロセスを続ける。やはり、ユーザーはCancelボタン１３７６をスイッ チを入れることによりプロセスを中止しうる。 第４４図は、Amino & Oligo Setupダイアログボックス対象１３８０を示す。 示されるように、ボックスは、各反応容器に関連するエントリー１３８１を含む 。ユーザーは、エントリーに所望のアミノ酸記号及びヌクレオチドコードを入れ る。たとえば、もし反応容器１（ＲＶ０１）のためのエントリーが「Ｖ ＡＴＧ ＣＣＧＡ」を含むなら、これはシンセサイザーにアミノ酸Ｖ及びオリゴヌクレオ チドＡＴＧＣＣＧＡを反応容器１中に射出させる。適当なコードが入れられた後 に、ユーザーは、ＯＫボタン１３８２をスイッチを入れて、セットアッププロセ スを完了する。プロセスを中止するために、Cancelボタン１３８３が備えられる 。判るように、合成ライブラリーは、この合成セットアップ手順を用いて容易に 作られることができる。 合成セットアップが完了すると、ユーザーは合成プロセスを始めることができ る。第４５図において、ユーザーは先ず、Synthesusオプション１３０８を選び 、次にＧｏコマンド１３９１を選択してプロセスを開始する。あるいは、ユーザ ーは、合成ファイル中に保存されたものに類似の機能を遂行するための単一のマ クロを構築しうる。 第４６図において、ＧＵＩは、合成又はマクロ実行の間、ステータススクリー ン１４００を表示する。示されるように、ステータススクリーンは、２つの別々 のエリア１４０１と１４０２に分割される。第１のエリア１４０１は、合成に関 する情報を表示する。たとえばStart Macr o、Loop Macro及びEnd Macroの名前がリストされる。加えて、Loop Numberライ ン１４０８は、合成において残りのループの数に関してユーザーに知らせる。 第２のエリア１４０２は、現在実行されているMacroのファイルネームを表示 する。上述したように、マクロは他のマクロと入れ子にされて、より高レベルの 機能を達成することができる。ステータススクリーンは、呼ばれたマクロの１０ までの入れ子にされたレベル１４０９ａ〜１４０９ｊをリストするよう設計され ることができる。追加的なステータス又は構成情報を表示するために、Command ライン１４１０、Timingライン１４１１、Messageライン１４１２及びＲＶのラ イン１４１３が備えられることができる。たとえば、Commandラインは、どのマ クロコマンドが実行されているかを示しうる。Messageラインは、該当する場合 、ユーザーにより予めプログラムされたようにテキストメッセージを表示する。 Timingラインは、バルブが開かれる又は閉じられる残余の時間量を表示する。Ｒ Ｖのラインは、どの反応容器が用いられるかをユーザーに知らせる。Time to Co mpleteバー１４１４は、合成が完了する前に残っている時間のパーセントをユー ザーに知らせる。 合成又はマクロ実行の間の任意の時点で、ユーザーは、予め指定されたファン クションキーすなわちＦ１２を押すことにより、User Abortモードへと切り変え うる。User Abortモードは、合成の一部として定義されていないマクロを、合成 プロセスを中止する必要なく休止する及び実行す ることをユーザーに可能にする。発動されると、システムは一時的に実行を中止 し、そして第４７図に示されるようにUser Abortダイアログボックス対象１４２ ０を表示する。この時点で、ユーザーは任意のマクロを実行のために挿入しうる 。これは、Select Macroボックス１４２１中の所望のマクロの名前をタイプし、 そしてRun Macroボタン１４２２上でマウスのスイッチを入れることによって行 われうる。 User Abortダイアログボックス対象はまた、Ignoreボタン１４２４を備え、こ れはシステムがあたかもUser Abortモードに入らなかったかの如くに合成プロセ スを続けることをユーザーに可能にする。スキップオプション１４２３は、合成 を続ける前にマクロ中の現行のコマンドを先ずスキップするようシステムに指示 する。Retryボタン１４２５は、系に現行のマクロを始めから実行させる。Abort ボタン１４２６は、ユーザーが合成をキャンセルすることを可能にする。 第４８図は、Editコマンドに関連するサブメニュー１４３０を示す。Editコマ ンドは、サブメニュー中にリストされた適当なアイテムを選択することにより種 々の対象にユーザーが容易にアクセスし、変更することを可能にする。Associat eコマンド１４３１が選択されるとき、メモリー中にストアされたSet Associate 対象をリストするダイアログボックス対象を表示する。所望の対象を選ぶことに より、Set Associateダイアログボックス対象が表示され る。この時点で、ユーザーはダイアログボックス対象の内容をマウスにより編集 できる。終了したとき、ユーザーはＯＫボタンにスイッチを入れ、変更を保存す る。同様に、ユーザーは、所望の対象を選択することにより、Group，Macro，Va riable及びCode対象を編集できる。次に、選ばれた対象は、エディター中に置か れ、ユーザーがテキストを変更することを可能にする。 上記のように、センサーは、一つの液滴の存在により意図せずにトリガーされ るかも知れない。これは、特に合成サイクルの間に用いられる溶液が気泡を高濃 度に含む場合に、問題でありうる。センサーの意図しないトリガーを避ける又は 軽減するために、それらの感度がプログラムされうる。 センサーは、Machine Configコマンド１４５６を用いてプログラムされる。こ のコマンドは、いくつかのエントリー、Fill％、Drain％、TimeOut％及びPtsAve を含むConfigダイアログ対象ボックスを表示する。Fill％は、反応容器がいつ一 杯であるかを決めるために、センサーがオンになったままであるパーセントを指 定する。たとえば、もし80％が入力されると、センサーは、それが読まれる時間 の80％オンでなければならない。Drain％は、反応容器がいつ空であるかを決め るために、センサーがオフのままであるパーセントを指定する。たとえば、もし 20％が入力されると、センサーは、それが読まれる時間の80％オフでなければな らない。Timeoutは、センサーがスイッチオン又はオ フされる前の遅延時間を指定する。PtsAveは、センサーがオン又はオフである時 間のパーセントを決めるために用いられるポイント又は読みの数を指定する。ユ ーザーはまた、読まれるべきセンサー又はセンサー群を指定できる。その後に、 ユーザーは、ＯＫボタンにスイッチを入れ、これはパラメーターに従ってシステ ムを自動的に構成する。 第４９図は、第３３〜４８図に示した制御ソフトウエアのイベント駆動される 構築を示すフローチャートである。示されるように、シンセサイザーのＧＵＩの 心臓であるI/O Objectモジュール１４５０は、ＧＵＩを成す種々の対象モジュー ル間の通信を容易にする。制御ソフトウエアが開始されるとき、モジュール１４ ６０は、構成ファイルをI/O Objectモジュールへとロードする。これらファイル は、Variable Objectsモジュール１４５６、Lookup Table Objectsモジュール１ ４５７、Macro Objectsモジュール１４５８、Group Objectsモジュール１４５９ 、Valve Object Arrayモジュール１４６１及びSensor Object Arrayモジュール １４６２を構成するために用いられる。 Lookup Table Objectsモジュールは、バルブ及びセンサーをそれらの対応する 反応容器へと地図化して、特定の反応容器に関係する夫々個々のバルブ及びセン サーを手でアドレスする必要を除くために用いられるファイルである。Macro Ob jectsモジュールは、定義されたマクロのリストをストアする。Variable Object sモジュールは、定義された変数をストアし、定義された群対象は、Group Objec ts モジュール中にストアされる。 Valve Object Arrayモジュールは、システム中の各個々のバルブを同定する アレイをストアする。バルブを開閉するために、I/O Objectモジュールは、相手 が見つかるまでValve Object Arrayモジュールをスキャンする。相手が見つかる と、Valve Object Arrayモジュールは、その特定のバルブを制御する信号を出す 。バルブ群を制御するために、I/Oモジュールは、Group Objectsモジュールと共 同してValve Object Arrayをスキャンし、それが適当な制御信号を選択されたバ ルブへと送るようにする。 Sensor Object Arrayモジュールは、システム中の各個々のセンサーを同定す るアレイをストアする。I/Oモジュールは、相手が見つかるまでSensor Object A rrayモジュールをスキャンすることにより、センサーを読むことができて、それ が特定のセンサーを読むようにする。センサー群を読むために、I/O及びGroup O bjectsモジュールは、Sensor Object Arrayモジュールをスキャンして、読むべ き適当なセンサーを決める。 ＧＵＩはまた、Dialog Box Objectsモジュール１４５３及びSynthesis Object モジュール１４５４を含む。Dialog Box Objectsモジュールは、あるコマンドが 発動されたときに表示されるダイアログボックス対象を含む。Synthesis Object モジュールは、現行の合成セットアップファイルをストアする。別の合成を実行 するために、ＧＵＩは、メモリーから所望の合成セットアップファイルをSynthe sis Objectモジュール中に読み込む。逆に、Synthesis Objectモジュール中の内容は 、メモリーに書かれて、合成セットアップファイルを保存する。 Main Window Object（ＭＷＯ）モジュール１４５２は、スクリーン上にＧＵＩ の主ウインドウ（第３３図）を表示するView Objectモジュール１４５５と通信 する。ユーザーコマンドに応答して、MessageはＭＷＯに送られる。このメッセ ージは、実行される適当なコマンドを決めるために解釈される。たとえば、もし Macroコマンドが受けられると、ＭＷＯはI/O対象に対して、Dialog Box Objects モジュールからマクロダイアログボックス対象を及びMacros Objectsモジュール からマクロのリストを受取るよう指示する。View Objectモジュールは、この情 報をI/Oモジュールから受け、それをＧＵＩ上に表示する。 一つの実施態様において、I/Oモジュールは、もしコンピュータが誤差動する と、シンセサイザーを停止させるWatchdogルーチンを含む。たとえばI/O対象モ ジュールは、シンセサイザーに２秒毎に１パルスを送るようにプログラムされる ことができる。もし、何らかの理由で、シンセサイザーがこれらのパルスを受け そこなうと、制御コンピュータが誤作動したと考えられ、電力が切られる。 実施例 下記の実施例は、本発明を更に例示するものであり、本発明を限定するもので はない。 実施例１：ライブラリー作成及びスクリーニング 本実施例は、どのようにして樹脂ビーズ上で組み合わせペプチド合成の生成物 が、合成における各アミノ結合（カップリング）工程に一致するビーズにオリゴ ヌクレオチド同定タグを付けることにより明示的に特定されうるかを示す。各タ グは、どのアミノ酸モノマーが合成の特定の工程において結合されたかを伝え、 いずれかのビーズ上のペプチドの全体配列はそのビーズ上のタグを読むことによ り推論されうる。ビーズのコレクションは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）装 置を用いて、蛍光的に標識された抗ペプチド抗体への結合についてスクリーンさ れることができる。抗体がそれに強く結合するこれらビーズは、ＦＡＣＳにより 分離されることができ、個々の分類されたビーズに付着されているオリゴヌクレ オチド同定標識はＰＣＲにより増幅されうる。増幅されたＤＮＡの配列が決定さ れて、抗体に高親和性で結合するペプチド配列の同定を明らかにする。高容量（ capacity）、オリゴヌクレオチドコードに基づく情報保管、増幅方法論及び蛍光 に基づく分類を組み合わせることにより、本方法は、天然及び非天然の化学的構 築ブロックから合成された分子の広大なライブラリーの各メンバーの同定を特定 するため、及び生物学的レセプターのための高い親和性リガンドを有する個々の ビーズを迅速かつ効率的に分離するための手段を提供する。 本実施例において、一本鎖オリゴヌクレオチドが、Ｌ‐及びＤ‐アミノ酸構築 ブロック及び10μｍ直径ポリスチレンビーズを用いる組み合せペプチド合成をエ ンコードする ために用いられた。オリゴヌクレオチドタグは、高い情報内容を有し、極めて高 感度の検出及びデコーディングを受けることができ、かつ本方法を用いるとペプ チド合成に用いられる試薬に対して安定である。ペプチド及びヌクレオチドは、 各ビーズが単一ペプチド配列及びユニークなオリゴヌクレオチド同定タグの両者 の多くのコピーを有するように、並列の交互の合成において組立てられる。オリ ゴヌクレオチドは、共通の５′及び３′‐ＰＲＲプライミング部位を共に有し、 従ってビーズはＰＣＲのための鋳型（テンプレート）として働きうる。エンコー ドされた合成ライブラリーは、約8.2×10⁵ヘプタ‐ペプチドを含み、抗ジノルフ ィンＢモノクローナル抗体Ｄ32.39（バレット アンド ゴールドスティン、198 5、ニューロペプタイズ６：113-120を見よ。これは引用することにより本発明に 組み込まれる）への結合について、該抗体に強く結合する個々のビーズを選別す るために蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）装置を用いてスクリーンされる。分類 されたビーズ上のオリゴヌクレオチドタグのＰＣＲ増幅の後に、ＤＮＡは、ペプ チドリガンドの同定を決めるために、配列決定される。 Ａ．試薬及び一般的方法 この仕事で用いられた単分散10μｍ直径ビーズ物質は、ファルマシア（Pharma cia）から購入された1,12‐ジアミノドデカンリンカーで官能化された、特注合 成されたマクロ孔性のスチレン‐ジビニルベンゼンコポリマーであった。ビーズ は、ファルマシアのジーンアセンブラーサポー トリンカーで誘導体化されていないPharmacia Monobeads（商標）である。ウゲ ルスタッドとモーク、1980、アドバンスド コロイド インターフェース サイ エンス、13：101-140参照（引用することにより本明細書に組み込む）。 すべての保護されたアミノ酸は、バッケムバイオサイエンス インコーポレー テッドから得られた。ＰＣＲ及び配列決定プライマーは、アプライド バイオシ ステム モデル394オリゴヌクレオチド シンセサイザーを用いて合成された。 或るペプチドの真正なサンプルは、Fmoc保護されたアミノ酸、ＨＢＴＵ／ＨＯＢ ｔインサイツ活性化化学、及び40：１：１ ＴＦＡ／水／エタンジチオールでの 脱保護を用いて、アプライド バイオシステム モデル ４３１Ａ ペプチド シンセサイザーで合成された。これらペプチドは、溶離剤として水／アセトニト リル／0.1％ＴＦＡ用いてRainin Ｃ₁₈逆相カラム上でのＨＰＬＣにより精製され （＞95％純度）、構造は、マススペクトルにより検証された。 Ｂ．69塩基オリゴヌクレオチドとオピオイドペプチドジノルフィンＢの並列合 成 オピオイド ップチド ジノルフィンＢ（opioid peptide dynorphin B）のＣ 末端７アミノ酸フラグメントH-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thr-NH₂（RQFKVVT）（ 配列同定番号：２）は、10μｍ直径ビーズ上で69‐マーオリゴデオキシヌクレオ チド（ＳＴ０８）を用いて並列に合成された。 ＳＴ０８の配列は、 5′-ATC CAA TCT CTC CAC （ATC TCT ATA CTA TCA）TCA CC［TA TC CT AT TT TT AC］CTC ACT CAC TTC CAT TCC AC-3′（配列同定番号：20）であった。この配 列の下線を付した部分は、ＰＣＲプライミング部位に対応し、カッコ内の領域は この鋳型を配列決定するために用いられたプライマーに相同である。カッコ内に 閉じられた14塩基配列は、鋳型のコーディング配列を示す。 ビーズは初めに、スクシニミジル4-O-DMT-オキシブチレート（Molecular Prob es）、及びN-Fmoc-2,4-ジメトキシ-4′-（カルボキシメチルオキシ）- ベンズヒ ドリルアミン（すなわち酸開裂しうるクノール(Knorr)カルボキサミドリンカー ）又はN-Fmoc-Thr(t-Bu)-OH（開裂不可の実験のため）のどちらかの1-オキシベ ンゾトリアゾールの混合物で処理された。ビーズ上ＤＭＴ保護されたヒドロキシ ル残基に対するFmoc保護されたアミノ基の比は、約20：１であると分光光学的に 決定された。ビーズは、下記のヌクレオチドの3′-O-メチル-N,N-ジイソプロピ ル ホスホルアミダイドを用いて、自動化シンセサイザー上で20サイクルのオリ ゴヌクレオチド合成に付された：N⁶-Bz-5′-O-DMT-（7-デアザ）-2′-デオキシ アデノシン（ベリィ アンド アソシエイツ、ミシガン、アンアーバー）、N⁴-B z-5′-O-DMT-2′-デオキシシチジン、及び5′-O-DMT-チミジン（グレンリサーチ ）。 次にビーズは、装置から出され、Fmoc保護基を除去する ために、ＤＭＦ中の10％ピペリジンで５分間処理された。最初のアミノ酸残基（ N-Fmoc-Thr(t-Bu)-OH）を結合した後に、ビーズは、ありうる不反応アミンをキ ャップするために無水酢酸及び1-メチルイミダゾールのＤＭＦ溶液で処理された 。すべてのペプチド結合反応は20分間行なわれ、かつＤＭＦ中の0.11Ｍ Fmoc- アミノ酸、0.1Ｍ ＨＢＴＵ、0.1ＭＨＯＢｔ及び0.3Ｍ ＤＩＥＡを含んだ。次 にビーズは、シンセサイザー上での２サイクルのヌクレオチド付加（ＴＣＡでの デトリチレーション；テトラゾール触媒されたホスフィチレーション；無水酢酸 でのキャッピング；アセトニトリル／水中でのヨウ素による酸化）に付された。 アミノ酸結合及びジヌクレオチド付加の連続する工程は、ペプチド配列ＲＱＦＫ ＶＶＴ（配列同定番号：２）の合成及びオリゴヌクレオチドコーディング領域の 構築が完了するまで繰返された。オリゴヌクレオチド合成の更に35サイクルを行 った後に、ビーズは、ピペリジン／ＤＭＦ（１：９、８分間）、チオフェノール ／トリエチルアミン／ジオキサン（１：２：２、４時間）、エチレンジアミン／ エタノール（１：１、55℃で５時間）、そしてＴＦＡ／水（20：１、１時間）に より逐次処理されて、ペプチド及びオリゴヌクレオチド鎖の両者を十分に脱保護 した。酸開裂しうるリンカーを用いた実験において、ＴＦＡ脱保護反応からの上 澄みは減圧濃縮され、そして単離された粗ペプチドが次にＨＰＬＣにより分析さ れた。 Ｃ．エンコードされたライブラリーの構築 上記した並列合成が、ライブラリーの構築に用いられた。ペプチド合成の部位 は、上記したようにすべてのビーズにN-Fmoc-Thr(t-Bu)OBt及びスクシニミジル4 -O-DMT-オキシブチレートの混合物を結合することにより、この実験においてＤ ＮＡ合成部位から異ならしめた。ライブラリー中のオリゴヌクレオチドタグの配 列は、コーディング領域内でのみＳＴ０８と異なっていた。オリゴヌクレオチド ＳＴ０８の3′-保存領域は初めに、35ｍｇの合計ビーズ量（約1.75×10⁸個のビ ーズ）上で合成された。Fmoc保護基が除去され、そして上記のビーズ量は７つの 等しい部に分割された。各部に７つの異なるα-N-Fmoc保護されたアミノ酸（側 鎖保護基がカッコ内に示される）：Arg(N^G-Pmc)，Gln(Trt)，Phe，Lys(^tBoc)，V al，D-Val 及び Thr(^tBu)の一つが結合された。次に各部を、自動化オリゴヌク レオチド合成の２つのラウンドに付した。独自に夫々異なるアミノ酸残基を特定 した、付着されたジヌクレオチドの夫々の配列は、ＴＡ，ＴＣ，ＣＴ，ＡＴ，Ｔ Ｔ，ＣＡ及びＡＣであった。次にビーズをプールし、完全に混ぜ、そして全ビー ズ量をFmoc脱保護に付した。 ビーズ分割、ペプチド結合、オリゴヌクレオチドダイマー合成、ビーズの再プ ール化、及びFmoc除去のこのサイクルを、合計７回繰返した。最後のFmoc保護基 は除去されなかった。代りに、プールされたビーズ量を35サイクルのオリゴヌク レオチド合成に付した。ライブラリーを次に、上記のように完全に脱保護した。 Ｄ．ライブラリー着色及びＦＡＣＳ分析 ライブラリーの部（典型的には0.5〜２ｍｇのビーズ）を、ブロック性緩衝液 （ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、0.05％Tween-20）中に懸濁し、室温で１時間インキュベ ートした。遠心分離によりビーズをペレット化し、ｍＡｂ Ｄ32.39 の溶液（ブ ロック性緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。懸濁物を氷上で30分間イ ンキュベートし、遠心分離によりペレット化し、そしてブロック性緩衝液で洗っ た。次にビーズを、フィコエリスリンをエンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（ Molecular Probes）の溶液中に氷上で20分間懸濁した。ビーズをブロック性緩衝 液中で洗い、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）装置（Becton Dickinson FACStar Plus）中に運ぶために、ＰＢＳ中に希釈した。ｍＡｂ Ｄ32.39を結合したビー ズを、その獲得した蛍光により同定した。ライブラリーの最も強く着色された0. 17％から、及び最低の蛍光を持つ部類（約98％）からの夫々のビーズをＰＣＲ微 小遠心分離ビン中へと分類した。ビーズへのＤ32.39の特異的結合は、10μＭの 最終濃度で可溶性ペプチドＡｃ−ＲＱＦＫＶＶＴ−ＯＨ（配列同定番号：２）に よるｍＡｂのプレインキュベーションによりブロックされた。 Ｅ．ビーズ結合した鋳型のＰＣＲ 製造者から供給された緩衝液系（50 mM KCl，10 mM Tris-HCl，pH 9.0，0.1 % Triton X-100，2 mM MgCl₂）中で0.2 mM dATP，dCTP，及びdGTP，0.8 mM dUTP ，2 mM各プラ イマー、３単位Ｔａｑ ポリメラーゼ（Promega）及び１単位のウラシルＤＮＡ グリコシラーゼ（Gibco BRL）（合計体積70 Ｌ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行っ た。プライマー配列、5′-ATC CAA TCT CTC CAC-3′(SP13)（配列同定番号：２ １）及び5′-(ビチオン)-GTG GAA TGG AAG TGA-3′(SP14)（配列同定番号：２２ ）は夫々、鋳型ＳＴ０８に対して相同及び相補的であった。ＰＣＲ反応は、95℃ 、30秒間の変性、50℃、１分間のプライマーアニーリング、及び72℃、１分間の 延長の45サイクルより成った。反応は、20％アクリルアミド又は２％低融点アガ ロースゲル中での電気泳動により分析された。 Ｆ．ＰＣＲ生成物の配列決定 個々の反応からのビオチン化されたＰＣＲ生成物を、ストレプトアビジンをコ ードされた磁気ビーズ（Dynal社）により分離した。ビオチン化されていない鎖 のアルカリ性溶出及び洗いの後に、各ビーズ試料を配列決定カクテルで処理した 。ジデオキシ配列決定は、プライマー5′-ATC TCT ATA CTA TCA-3′(SP15)（配 列同定番号：２３）及びＢｓｔポリメラーゼ（Bio-Rad）を用いて、製造者の指 示に従い、但し、デオキシ‐対ジデオキシヌクレオチド トリホスフェート（Ph armacia）の１：100の比を用いて、行った。 Ｇ．ペプチド結合親和性の決定 モノクローナル抗体Ｄ32.39に対する種々のペプチドの結合親和性が、競争結 合実験において測定された。ｃＡＭ Ｐ依存性プロテインキナーゼのためのコンセンサス基質配列に融合されたＤ32.3 9のための公知のエピトープを含むトレーサーペプチド（ＬＲＲＡＳＬＧＧＧＲ ＲＱＦＫＶＶＴ(配列同定番号：２４)；50ｐＭ）が［g-³³P］ATP（リ等、1989、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 558-562参照。引用することにより本明細書に 組み込まれる）により高特異性活性に放射性ラベルされ、そして興味のペプチド の種々の濃度（10μＭ〜１ｐＭ）と混合された。このペプチド混合物を、Ｄ32.3 9（0.1 Gmg/ml）でコートされたポリスチレンウェルに加えた。試料を４℃で２ 時間インキュベートし、各ウェルに結びついた放射性をカウントし、競争結合カ ーブを作るために用いた。アッセイの条件下でＩＣ₅₀は、ペプチドの解離定数（ Ｋ_d）に近くなければならない。 実施例２：チアゾリジノン類の合成及び安定性研究 下記の実施例は、本発明方法を用いるチアゾリジノン類の合成に関する。この 合成は、米国特許出願No．08/265,090（1994年６月23日）に詳しく述べられてお り、引用することにより本明細書に組み込まれる。 Ａ．二重ラベルされたチアゾリジノンの調製 H₂N-S-TentaGel（500mg）（市販されているポリスチレンに基づく樹脂、ドイ ツ国、チュビンゲン、Rapp Polymere，１ｇ，0.30ミリモル／ｇ負荷）を、α‐ カーボンにおいてラベルされたFmoc-Gly-OH（2-¹³Ｃ、99％、マサチューセッツ 州、アンドバー、Cambridge Isotope Laboratori es社）で処理した。該樹脂をAc₂Oでキャップし、ピペラジンで脱保護し、そして Fmoc-フォトリンカーがそのOBt活性化エステルとして結合された。樹脂を再びキ ャップし、脱保護し、無水物としてのラベルされていないFmoc-グリシン-OHと反 応させた。キャッピング及び脱保護の一つの追加ラウンドは、遊離アミン樹脂を 生じた。カルボニルにおいてラベルされたPhCHO（カルボニル‐¹³Ｃ）99％、マ サチューセッツ州、アンドバー、Cambridge Isotope Laboratories社）の0.75Ｍ 及びメルカプト酢酸2.0Ｍとの、３Åモレキュラーシーブを含むＡＣＮ中で70℃ で２時間の反応は、二重ラベルされたチアゾリジノン樹脂を生じた。樹脂は徹底 的に洗われ（3X5 ml CH₂Cl₂ 3X5 ml DMF，3X5 ml CH₂Cl₂，3X5 ml MeOH，3X5 ml CH₂Cl₂，3X5 ml Et₂O）、そして真空乾燥された。 Ｂ．ＴＦＡ安定性研究 樹脂の一部（20mg）を95％ＴＦＡ／５％H₂Oで１時間処理し、次にCH₂Cl₂、MeO HそしてEt₂Oで洗った。樹脂のゲル-¹³Ｃ ＮＭＲ分析は、２つのラベルされた炭 素の相対的積分値により証明されるように、チアゾリジノンの損失を示さなかっ た。第３０図のパネルＢを見よ。フォトリンカー又はチアゾリジノンの何らかの 破壊は、ベンジル炭素の積分値の減少を結果すると考えられる。この実験は、チ アゾリジノン及びフォトリンカーの両者がＴＦＡ処理に対して安定であることを 示した。 Ｃ．ＤＮＡ合成安定性研究 樹脂の一部（20mg）を標準ＤＮＡ合成カートリッジに入れ、Ａ、Ｃ及びＴヌク レオチド（それらのホスホルアミドとして用いられた）を用いるＤＮＡ合成の40 サイクルに付し、各サイクルの後にヨウ素酸化を行った。Mockジメトキシトリメ チル（ＤＭＴ）除去は、樹脂を各サイクルの開始時に２％、ＴＦＡ／CH₂Cl₂で処 理することにより行った。樹脂をカートリッジから取出し、ＤＭＦで洗い、ゲル ‐¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル分析により分析した。第３０図のパネルＡを見よ。得 られたスペクトルは、フォトリンカー又はチアゾリシノン分子の破壊をほとんど 又は全く示さなかった。樹脂の一部（２mg）をpH7.4PBS緩衝液中で３時間光分解 し、遊離されたチアゾリジノンをＨＰＬＣで分析した。第３１及び３２図のパネ ルＡを見よ。データは、チアゾリジノンが高純度で遊離されたこと、及びフォト リンカー及びチアゾリジノンの両者が標準ＤＮＡ合成試薬による処理により有意 に変えられなかったことを示した。 実施例３：組み合せ合成 ＹＧＧＦＬの組み合せ合成が、上記合成装置を用いて行われた。合成は、反応 容器１〜６中で行われ、反応容器７〜９は連結されなかった。ビーズに加えられ た６つのアミノ酸は、Ｌ、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ａ及びＦであった。ＹＧＧＦＬが、他の ペプチドと共に特定された。ビーズが親容器に加えられ（29.4mg）、ＤＭＦ中に 懸濁された。各合成サイクルは、再分配、ペプチド結合、キャッピング、アミン 脱保護、ＦＭＯＣのための脱保護のコレクション、ＤＭＦでの すすぎ、及び親容器中で再び一緒にすることの工程を含んだ。 合成に続いて、ラベルされたハーツ抗体が、混合されたビーズに導入された。 ハーツ抗体は、ほとんどＹＧＧＦＬと結合する。ＦＡＣＳ分析はＹＧＧＦＬの存 在を同定した。これは、この特定の組み合せがシンセサイザーにより合成された ことを証明する。実験は、ＹＧＧＦＬを含むペプチドの多様なコレクションが特 定され、シンセサイザーにより合成されうることを示す。 本発明は、明瞭さ及び理解の目的のために例示及び実施例により、いくらか詳 細に記載されたれども、ある変更及び改変を添付の請求の範囲の内で行いうるこ とは明白である。 実施例４：本発明の装置を用いるビーズ分配の調査 親容器からの混合されたビーズが反応容器に均等に分配されるか否かを調査す るために、いくつかのビーズをビオチン化した。ビオチン化されたビーズを一つ の反応容器に手でいれた。ビオチン化されていないビーズを他の８つの反応容器 中に手で入れた。シンセサイザーは、９つの反応容器からのすべてのビーズを親 容器に写す。親容器から試料を取り、蛍光化ストレプトアビジンがビオチル化ビ ーズ上のビオチンと結合することを許した。蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣＳ） 分析は、親容器中のビーズの約9.1％がビオチン化されたことを示す。次にビー ズを９つの反応容器へ再配置し、各容器におけるビオチン化されたビーズ対 全ビーズのパーセントをＦＡＣＳ分析機により調べた。第５表は、ある反応容器 中の混合されたビーズが、親容器とほぼ同じビオチル化ビーズ対全ビーズ比を持 つことを示す。 上記の記載は例示であり、限定的でないことが理解されるべきである。上記の 記載を見て当業者には多くの実施態様が明白であろう。従って、本発明の範囲は 、上記記載により決められるのではなく、添付の請求の範囲ならびに均 等の全範囲により決められるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 9309−2Ｇ Ｇ０１Ｊ 1/42 Ｎ Ｇ０１Ｊ 1/42 0273−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｚ Ｇ０１Ｎ 21/27 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ケダー，ハイム アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94306，パロ アルト，カレッジ アベニ ュー 433 (72)発明者 ドワー，ウイリアム，ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94025，メンロ パーク，ブランナー ア ベニュー 2307 (72)発明者 バーレット，ロナルド，ダブリュ. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94087，サニーヴェイル，カーリスル ウ ェイ 562 (72)発明者 ギャロップ，マーク，エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94022，ロス アルトス，オレンジ アベ ニュー 511 (72)発明者 ニーデルス，ミカエル，シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94024，レッドウッド シティ，テメスカ ル ウェイ 727

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数の基体上で多様な分子を合成する方法において、 複数の反応容器に該基体を分配する工程、 該反応容器の各々の中で異なった試薬を用いて、該反応容器中の該基体に該多 様な分子の第一の部分をカップリングさせる工程、 該基体を、流通管を通じて混合容器中に移し、そして該基体を混合する工程、 該流通管を通じて、該基体を、該混合容器から該反応容器に再分配する工程、 及び 該多様な分子の該第一の部分に該多様な分子の第二の部分をカップリングさせ て、該基体上で多様な分子を形成する工程 を含む合成方法。 ２．該再分配工程が、該基体の少なくとも一部を共通のマニホールドを通じて再 分配する工程を含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．固体支持体上での並列カップリング反応のための装置であって、 親容器、 該親容器に連結された少なくとも一つの反応容器貯蔵場所（ここで、該反応容 器貯蔵場所は、該カップリング反応 を並列で行うために複数の反応容器を含む）、 該親反応容器と該反応容器の間の複数の流通管（ここで、該流通管は、該反応 容器と該親容器の間に流路を形成する）、 該反応容器貯蔵場所に試薬を届けるためのデリバリー系、及び 該親容器と該少なくとも一つの反応容器貯蔵場所の間の、該固体支持体の移動 を調整するための、プログラム可能なコンピューター を含む装置。 ４．共通のマニホールドを含み、かつ該共通のマニホールドが、該複数の流通管 の少なくとも一つに連結されている、請求の範囲第３項に記載の装置。 ５．該デリバリー系が更に、該試薬を、装置の第一の部分から装置の第二の部分 にデリバリーするための手段を含み、かつ該第一の部分が、該第二の部分より高 い圧力を有する、請求の範囲第３項に記載の装置。 ６．該反応容器貯蔵場所が更に、該複数の反応容器の内容物を、同時に撹拌する ための手段を含む請求の範囲第３項に記載の装置。 ７．該反応容器貯蔵場所が更に、第一モードにおいて、該 試薬を該複数の反応容器の選ばれたものへと並列的にデリバリーするための、そ して第二のモードにおいて、該試薬を該複数の反応容器の選ばれたものへと逐次 的にデリバリーするための、該プログラム可能なコンピューターからの指令信号 に応答するバルブ手段を含む請求の範囲第３項に記載の装置。 ８．該親容器、該反応容器貯蔵場所及び該デリバリー系が、該並列のカップリン グ合成反応の間、大気から遮断されている請求の範囲第３項に記載の装置。 ９．該親容器及び該複数の反応容器の間で該固体支持体を移すためのバルブを含 み、ここで、該バルブは、該親容器と該複数の反応容器の間を移動している間に 、固体支持体がそれを通り抜ける唯一のバルブである、請求の範囲第４項に記載 の装置。 １０．該反応容器貯蔵場所が更に、第一モードにおいて、該試薬を該複数の反応 容器の選ばれたものへと並列的にデリバリーするための、そして第二のモードに おいて、該試薬を該複数の反応容器の選ばれたものへと逐次的にデリバリーする ための、該プログラム可能なコンピューターからの指令信号に応答するバルブ手 段を含む請求の範囲第９項に記載の装置。 １１．並列にてビーズ上でカップリング反応を行う方法において、 親容器から複数の反応容器へと、懸濁物中の該ビーズを移す工程、 並列にて、該複数の反応容器の内で、ビーズ上で該カップリング反応を行う工 程、 該ビーズを、該複数の反応容器から該親容器へと移す工程、及び 該ビーズを混合する工程、 を含む方法。 １２．該工程を、所定の回数繰り返す請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．該移す工程が更に、該ビーズの少なくとも一部を共通のマニホールドを通 じて移す工程を含む請求の範囲第１１項に記載の方法。 １４．実質上半透明の管内の液の存在を検出する光学検出器と共に用いるための 光学配列ブロックにおいて、 該光学検出器の発信器からの光のビームを、該管の中心を通して、該光学検出 器の集光部上に振り向ける手段、及び 該光学検出器の発信器から放出された（上記の光のビーム以外の）光が、該検 出器の集光器の一部に達することを 禁止する手段、 を含むブロック。 １５．該振り向け手段が、該光学配列ブロックを通るピンホール孔を含む請求の 範囲第１４項に記載の光学配列ブロック。 １６．該光学検出器が、２つのフォークを含み、発信器は、第一のフォークに配 置され、集光部は第二のフォークに配置され、かつ該光学配列ブロックが更に、 該２つのフォーク間に該光学配列ブロックを摩擦的に係合する手段、及び 該ピンホール孔の長さ方向の軸が、該管の半径方向の軸と、９０度の角度にて 交叉するように該管を配置するための手段 を含む請求の範囲第１５項に記載の光学配列ブロック。 １７．該振り向け手段が更に、発信器及び該光学検出器の集光部の間に該管を配 置するための手段を含む請求の範囲第１４項に記載の光学配列ブロック。 １８．第一のポート及び第二のポートを有する、一つの２方バルブ、 第一の通過路及び第三のポートを有する、一つの３方バルブ、 該第三のポートを該第一の通過路と選択的に連絡させるための、プログラム可 能なコンピューターに応答する手段、 該第一のポートを該第二のポートと選択的に連絡させるための、プログラム可 能なコンピューターに応答する手段、及び 該第一のポートを該第一の通過路に封止的に連結し、それによってマニホール ドを形成する手段、 を含む、試薬をデリバリーするためのデリバリー系。 １９．該第三のポートが、試薬を運ぶ第一の管に連結され、そして該第一のポー ト及び該第二のポートの他方は、アルゴンを運ぶ第二の管に連結され、そしてこ こで、該第一の管は、該マニホールドの方へ又はそこから離れる方のいずれかに 、該試薬を運ぶ、請求の範囲第１４項に記載の系。 ２０．少なくとも一つの反応容器貯蔵場所（ここで該反応容器貯蔵場所は、複数 の反応容器及び複数のモノマーリザーバーを含み、該リザーバーの各々は、該反 応容器の一つに連結している）、及び 共通の試薬リザーバー（該共通の試薬リザーバーは、共通のマニホールドを通 じて該複数の反応容器に共通の試薬をデリバリーするために、該少なくとも一つ の反応容器貯蔵場所に連結している） を含む、ビーズ上でカップリング反応を行うための結み合せ合成装置。 ２１．ライブラリー中の各々の異なった分子が、共有結合的に固体支持体に結合 され、かつ１以上の異なったタグを用いてタグが付与され、ここで、該１以上の 異なったタグの夫々は種々の炭化水素領域及び分子フックを含み、該タグはまた 、共有結合的に該固体支持体に結合されているところの、タグを付与した分子ラ イブラリーを合成するための方法において、（ａ）支持体を複数の反応容器間で 確率論的方法により配分する工程、（ｂ）最初の化学構築ブロックに各反応容器 中の支持体をさらす工程、（ｃ）支持体をプールする工程、（ｄ）支持体を確率 論的方法により複数の反応容器間で配分する工程、（ｅ）化学構築ブロックに各 反応容器中の支持体をさらす工程、及び（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を少なくとも １〜２０回繰り返すことを含む方法。 ２２．該固体支持体がリンカーである請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．該固体支持体が、Monobead（商標）である請求の範囲第２１項に記載の方 法。 ２４．該分子が、リンカーによって該固体支持体に結合さ れる請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２５．該リンカーが切断可能である請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６．該１以上の異なったタグの各々が、 該１以上の異なったタグの各々を該固体支持体に結合する切断可能なリンカー 、 分子フック、及び 該リンカーを該分子フックに連結する種々の長さの炭化水素鎖を含む、請求の 範囲第２１項に記載の方法。 ２７．該１以上の種々のタグの各々が、式 （ここで、ｎは１〜１０であり、Ｘは、切断可能なリンカーであり、そしてＲは 、分子フックである） を含む請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２８．Ｘが、光切断可能なリンカーである請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２９．該分子フックが、ビオチン、活性化可能な基及び高会合ペプチドからなる 群より選ばれる請求の範囲第２１項に記載の方法。 ３０．該分子が、該固体支持体から切断され、次いで、該レセプターへのリガン ドの結合を導く条件下でレセプターと共に温置される、請求の範囲第２５項に記 載のタグが付与された分子ライブラリーのスクリーニング方法。 ３１．該分子がペプチドであり、該固体支持体が、直径で約５０〜５００μｍの ビーズであり、該切断可能なリンカーが、切断可能なリンカーの混合物であり、 そして該ビーズ上の該分子の一部分のみが、該温置工程に先だって切断される、 請求の範囲第３０項に記載の方法。 ３２．複数の異なったメンバーを含む合成ペプチドライブラリーを合成する方法 であって、各メンバーは、ビーズに連結されたアミノ酸モノマーの配列からなる ペプチドを含み、ビーズにはまた、該ペプチド中のモノマーの配列を同定する１ 以上のオリゴヌクレオチド同定タグが連結しており、ここで、該アミノ酸モノマ ーは、Ｆｍｏｃで保護され、そしてピペリジンが、Ｆｍｏｃ保護基を除くために 用いられる方法において、５〜１５％のピペリジンで５〜６０分間又は１５〜３ ０％のピペリジンで１〜３０分間処理することによりＦｍｏｃの除去を行うこと を特徴とする方法。 ３３．該ビーズが、直径で約１０μｍであり、かつドデシルアミンリンカーを用 いて誘導されたマクロ孔性の スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーからなる請求の範囲第３２項に記載の改 善。 ３４．該ビーズが、Monobead（商標）である請求の範囲第３２項に記載の改善。 ３５．該アミノ酸モノマーが、ｔＢｕ側鎖保護基を有し、ＴＦＡが、該tＢｕ側 鎖保護基を除去するために用いられ、そして該オリゴヌクレオチドタグが、７− デアザー２’−デオキシアデノシンを含む、請求の範囲第３２項に記載の改善。 ３６．請求の範囲第２６項に記載の方法における、１以上の異なったタグの存在 を検出するための方法において、 該固体支持体から該１以上の異なったタグを切断する工程、 該１以上の異なったタグを固定化する工程、 増幅可能で検出可能な基を、該１以上の異なったタグ上の該分子フックに連結 する工程、 該増幅可能で検出可能な基を増幅する工程、及び 該増幅可能で、検出可能な基の存在を検出する工程、ここで、該増幅可能で検 出可能な基の存在は、該１以上の異なったタグの存在の指標である、 を含む方法。 ３７．該増幅可能で、検出可能な基が、該分子フックに結合できるオリゴヌクレ オチド配列を含む請求の範囲第３５項に記載の方法。 ３８．請求の範囲第２１項に記載のタグが付与された分子ライブラリー中の固体 支持体に結合された分子の合成順序を決定するための方法において、該固体支持 体に結合された該１以上の異なったタグの存在を個々に検出することを含み、こ こで、該１以上の異なったタグの存在又は不存在が、該分子の合成順中の特定の 合成工程の発生の指標である方法。 ３９．該１以上の異なったタグの個々の検出が、 該１以上の異なったタグをそれらの構造に従って物理的に分離し、それによっ て、１以上の異なったタグのための分離パターンを得る工程、 該分離パターンを保存するために該１以上の異なったタグを固定化する工程、 該タグをオリゴヌクレオチド配列で処理し、それによって、オリゴヌクレオチ ド配列を選択的に、該１以上の異なったタグに結合する工程、 該オリゴヌクレオチド配列を増幅する工程、 該オリゴヌクレオチド配列の存在を検出する工程、ここで、該オリゴヌクレオ チド配列の存在又は不存在は、該１以上の異なったタグの存在又は不存在の指標 となる、 該分離パターン中の該１以上の異なったタグの相対位置により、存在する該１ 以上の異なったタグを同定する工程、及び 該分子の合成順中の特定の合成工程の発生を、該１以上の異なったタグの存在 又は不存在と相関させる工程、 を含む、請求の範囲第３８項に記載の方法。