JPH10114776A

JPH10114776A - 制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６およびその製造方法

Info

Publication number: JPH10114776A
Application number: JP28457496A
Authority: JP
Inventors: Emiko Tsuji; 恵美子辻; Kuniko Wakazono; 邦子若園; Kunio Isshiki; 邦夫一色; Yoshio Watanabe; 吉雄渡辺; Kazuyuki Dobashi; 和之土橋; Takeo Yoshioka; 武男吉岡
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1996-10-08
Filing date: 1996-10-08
Publication date: 1998-05-06

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトがん細胞の増殖を低濃度で抑制する物質
の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）、【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リベルテラ（Ｌｉ
ｂｅｒｔｅｌｌａ）属に属する微生物が生産する新規な
制がん性物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】がんの化学療法剤として、ダウノマイシ
ン、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗生
物質、シスプラチン、カルボプラチンなどの白金系化合
物、ビンクリスチンなどのアルカロイド系化合物、タキ
ソールなどのテルペン系化合物などが臨床的にも広く利
用されており、また臨床試験に供されているものもあ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述したがんの化学療
法剤として提案されている多くの化合物はかなり強力な
制がん作用を示すが、毒性、制がん作用ともに決して満
足できるものではない。そのため、当分野では常に新規
骨格を有する制がん性物質の提案が望まれている。本発
明は、実験腫瘍に対して強い増殖阻止作用を有する新規
な制がん性物質を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な制
がん性物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分
離し、その生産する代謝産物について研究を重ねた結
果、新たに分離したリベルテラ（Ｌｉｂｅｒｔｅｌｌ
ａ）属に属する菌株が、培養液中に各種実験腫瘍に対し
に対して増殖阻止作用を示す物質を生産していることを
見出した。該培養液から有効物質を分離精製し、その理
化学的性質を調べたところ、該有効物質は、いかなる既
知物質とも相違し、かつ優れた制がん作用を有すること
を見出し、本発明を完成した。

【０００５】本発明により提供される新規制がん性物質
は、下記式（Ｉ）で示される化合物である。本発明者ら
は、該化合物をＭｅｒ−ＷＦ１７２６物質と命名した。
以後、本明細書において該化合物を上記名称を用いて説
明する。

【０００６】

【化２】

【０００７】さらに本発明は、リベルテラ（Ｌｉｂｅｒ
ｔｅｌｌａ）属に属し、制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７
２６を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物か
ら該制がん性物質を採取する該制がん性物質の製造方法
を提供するものである。

【０００８】本発明に使用される微生物は、リベルテラ
（Ｌｉｂｅｒｔｅｌｌａ）属に属し、制がん性物質Ｍｅ
ｒ−ＷＦ１７２６を生産する能力を有する菌株であれば
よい。例えば、神奈川県藤沢市引地川河畔より採取され
た土壌から分離されたリベルテラ属に属するＭｅｒ−Ｗ
Ｆ１７２６株を挙げることができるが、この菌株に限ら
ず、リベルテラ（Ｌｉｂｅｒｔｅｌｌａ）属に属し、制
がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６を生産する能力を有す
る菌株であれば、それらの変異株も含めてすべて本発明
に使用することができる。

【０００９】本菌株は、形態的性質として、分生子柄に
隔壁があり、繰返し分岐しており、膝状の屈曲が小さく
不明瞭であり、肥厚化しない。また分生子は三日月形
で、透明で無隔膜である。以上の性状を既知の菌種と比
較したところ、カビの一種であるリベルテラ属（Ｌｉｂ
ｅｒｔｅｌｌａ）の性状と一致した。そこで本発明者ら
は、本菌株をリベルテラエスピー（Ｌｉｂｅｒｔｅｌ
ｌａｓｐ．）Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６と命名した。本菌
株は、平成８年６月１１日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５６８０として寄託さ
れている。

【００１０】本発明の制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２
６は上記菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養するこ
とにより製造される。上記菌株の培養方法は、原則的に
は一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養に
よる振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で行
うのが好適である。

【００１１】培養に用いられる培地としては、リベルテ
ラ（Ｌｉｂｅｒｔｅｌｌａ）属に属する微生物が利用で
きる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培
地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることがで
きる。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シ
ュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリ
ン、澱粉、糖蜜などを単独又は組合わせて用いることが
できる。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、
肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、
尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニ
ウムなどの無機窒素源を単独又は組合わせて用いること
ができる。その他、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、
リン酸カリウム、塩化コバルトなどの塩類、重金属類
塩、ビタミンＢ、ビオチンなどのビタミン類も必要に応
じて添加することができる。なお、培養中発泡が著しい
ときは公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することも
できる。消泡剤の添加にあたっては、目的物質の生産に
悪影響を与えない濃度とする必要があり、例えば、使用
濃度として０．０５％以下で使用することが好ましい。

【００１２】培養条件は、上記菌株が良好に生育して制
がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６を生産し得る範囲内で
適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは、５〜９程
度、通常中性付近とすることが好ましい。培養温度は、
微生物が良好に生育する温度、通常２０〜４０℃、好ま
しくは２８〜３５℃に保つのがよい。培養時間は、２〜
８日間程度でよく、好ましくは３〜５日間である。もち
ろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特
性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応
じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。

【００１３】培養中の制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２
６の蓄積量は、検定細胞株として、例えばＫ５６２（ヒ
ト白血病細胞株）を用いた殺細胞活性測定により検定で
きる。上記培養液中に蓄積された制がん性物質Ｍｅｒ−
ＷＦ１７２６は、濾過、遠心分離等の一般的固液分離手
段によって菌体を分離し、濾液または上澄液からの抽出
により回収可能である。

【００１４】制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６の分
離、精製は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行
うことができる。例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノール
等を用いた溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム
・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三
菱化学（株）製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカ
ゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロ
マトグラフィーによる方法を用いることができる。これ
らの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種
類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン
系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコー
ル、含水アセトン等を用いることができる。さらにセフ
ァデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・
ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲル濾過、
シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィ
ー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体ク
ロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることがで
き、これらの方法を単独または適宜組合せて、場合によ
っては反復使用することにより、分離、精製することが
できる。

【００１５】以上のようにして得られる制がん性物質Ｍ
ｅｒ−ＷＦ１７２６は以下に示す物理化学的性質を有す
る。（１）色および形状：白色粉末（２）分子式：Ｃ₂₉Ｈ₃₅Ｏ₈ （３）マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ、マトリックス；
ｍ−ニトロベンジルアルコール）：ポジティブ；５２６［（Ｍ＋Ｈ）⁺］ネガティブ；５２４［（Ｍ−Ｈ）^-］

【００１６】（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール
溶液中で測定した極大吸収は下記のとおりである（単
位：ｎｍ）。 λｍａｘ：２２５、２７５、２８３（５）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ）：主要な吸収
は、下記のとおりである（単位：ｃｍ^-1）。 νｍａｘ：３２５４、２９７２、１７６５、１７１７、
１６６３、１６１０、１５１２、１４５６、１３１０、
１２４８、１２１３、１１１９、１０３５、１００５、
９６８、８８５、７５６、６６７

【００１７】（６）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００Ｍ
Ｈｚ、ＣＤＣｌ₃）：主要な吸収は、下記のとおりであ
る。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈ
ｚ）、１．１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）、１．２５
（３Ｈ，ｓ）、１．５０（３Ｈ，ｓ）、２．１５（１
Ｈ，ｂｒｄ）、２．３０（１Ｈ，ｍ）、２．６５（４
Ｈ，ｍ）、２．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５，１３Ｈ
ｚ）、２．９４（１Ｈ，ｍ）、３．００（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝３，５Ｈｚ）、３．５６（１Ｈ，ｂｒｓ）、３．
８０（３Ｈ，ｓ）、４．３９（１Ｈ，ｓ）、５．２３
（１Ｈ，ｍ）、５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ）、
５．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８，１５Ｈｚ）、５．９６
（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈ
ｚ）、６．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．０６
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）

【００１８】（７）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００Ｍ
Ｈｚ、ＣＤＣｌ₃）：主要な吸収は、下記のとおりであ
る。 δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１３．２ｑ、１９．７ｑ、２０．
１ｑ、２４．４ｑ、３５．８ｄ、３９．１ｔ、４０．８
ｄ、４４．２ｔ、４５．９ｄ、４８．１ｄ、５３．７
ｄ、５５．３ｑ、５７．３ｓ、６０．６ｄ、７８．０
ｓ、８７．０ｓ、１１４．３ｄ×２、１２０．４ｄ、１
２７．９ｓ、１２８．４ｄ、１３０．５ｄ×２、１３
１．４ｄ、１４２．２ｄ、１４９．３ｓ、１５８．９
ｓ、１６９．９ｓ、２１１．７ｓ信号の多重性に関するデータはＤＥＰＴ試験によって得
た。

【００１９】本発明のＭｅｒ−ＷＦ１７２６物質は、各
種ヒトがん細胞の増殖を低濃度で抑制し、制がん性物質
として有用である。（各種ヒトがん細胞に対する増殖阻害作用）ＲＰＭＩ１
６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）へＫ５６２（ヒト白血病
細胞株）、ＭＫＮ２８（ヒト胃がん細胞株）、ＰＣ６
（ヒト肺がん細胞株）、ＭＣＦ７（ヒト乳がん細胞株）
およびＨＴ２９（ヒト大腸がん細胞株）をそれぞれＫ５
６２（２×１０⁴個／ｍｌ）、ＭＫＮ２８（５×１０⁴個
／ｍｌ）、ＰＣ６（５×１０⁴個／ｍｌ）、ＭＣＦ７
（２×１０⁴個／ｍｌ）およびＨＴ２９（２×１０⁴個／
ｍｌ）を接種し、同様に本発明の物質を０．００１〜１
００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。これを３７℃にて５
％炭酸ガス培養器中で７２時間培養し、ＷＳＴ−１試薬
（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ：株式会社同仁
化学研究所製）を加え、さらに３時間培養を継続した
後、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定
し、５０％増殖阻害濃度を求めた。またサイトカラシン
Ｅも同様に測定した。結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】表１から明らかなように、Ｍｅｒ−ＷＦ１
７２６物質は、各種ヒトがん細胞の増殖を低濃度で抑制
した。

【００２２】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細
に説明する。

【００２３】

【実施例】

実施例１ Mｅｒ−ＷＦ１７２６株の斜面培地（ＰＤＡ寒天培地）
から１白金耳ずつを３本の１００ｍｌの種母培地（ポテ
ト澱粉２％、グルコース１％、大豆粉２％、リン酸１カ
リウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ無
調整）を入れた５００ｍｌ容のエルレンマイヤーフラス
コに接種し、２８℃で３日間回転撹拌機上で培養して種
母培養液を得た。この種母培養液２００ｍｌを生産培地
（ポテト澱粉１．５％、グルコース２％、綿実粕０．２
５％、グルテンミール０．２５％、乾燥酵母０．２５
％、小麦胚芽０．２５％、炭酸カルシウム０．２％、硫
酸第一鉄０．０２５％、ｐＨ無調整）１５Ｌを含む３０
Ｌ容ジャーファーメンター１基に接種して、２８℃で６
５時間通気撹拌培養（通気量７．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌２
００ｒｐｍ）を行なった。

【００２４】培養終了後、培養液（約１５Ｌ）を吸引濾
過により菌体と上清に分け、約１３Ｌの培養上清を回収
した。この培養上清を５Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ
８に調整した後、１０Ｌの酢酸エチルで抽出を行なっ
た。得られた酢酸エチル抽出液を飽和食塩水１Ｌで洗浄
後、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し、さらに減圧下に
て濃縮乾固し固形物１．４ｇを得た。

【００２５】これをヘキサン／酢酸エチル混液（２：
１）で充填したシリカゲルカラム（メルク社製、Ａｒ
ｔ．７７３４、２φ×４７ｃｍ）シリカゲルクロマトグ
ラフィーに付した。ヘキサン／酢酸エチル混液（１：
２）で洗浄後、メタノールで溶出させ、溶出液を約１８
ｍｌずつ分取した。Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６物質の検出
は、各フラクションのがん細胞に対する増殖抑制活性と
ヘキサン／酢酸エチル混液（１：５）を展開溶媒とする
シリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製、Ａｒ
ｔ．５７１５、リンモリブデン酸発色、Ｒｆ０．３７）
を併用して行い、活性を示すフラクションを集め、減圧
下に濃縮乾固した。

【００２６】これをメタノール１０ｍｌに溶かし、あら
かじめメタノールで充填したセファデックスＬＨ−２０
カラム（ファルマシア社製、３．８φ×４５ｃｍ）に付
し、メタノールで展開し、溶出液を約１８ｍｌずつ分取
した。Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６物質の検出は、先と同様に
各フラクションの増殖抑制活性とヘキサン／酢酸エチル
混液（１：５）を展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマ
トグラフィー（メルク社製、Ａｒｔ．５７１５、リンモ
リブデン酸発色、Ｒｆ０．３７）を併用して行い、活性
を示すフラクションを集め、減圧下に濃縮乾固した。

【００２７】この乾固物をクロロホルムに溶かし、フラ
ッシュクロマトグラフィーを行なった。即ち、あらかじ
めクロロホルム／メタノール混液（１００：１）で充填
したシリカゲルカラム（メルク社製、Ａｒｔ．９３８
５、２φ×３０ｃｍ）に付し、同じ組成の展開液５００
ｍｌおよびクロロホルム／メタノール混液（５０：１）
５００ｍｌで展開し、溶出液を約１０ｍｌずつ分取し
た。Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６物質の検出は、先と同様に各
フラクションの増殖抑制活性とクロロホルム／メタノー
ル混液（２０：１）を展開溶媒とするシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー（メルク社製、Ａｒｔ．５７１５、リ
ンモリブデン酸発色）で行い（Ｒｆ０．４）、活性を有
し、シリカゲル薄層クロマトグラフィーで単一スポット
をなすフラクションを集め、減圧下に濃縮乾固してＭｅ
ｒ−ＷＦ１７２６物質１２．２ｍｇを得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者土橋和之神奈川県秦野市南が丘３丁目４−１５− 204 (72)発明者吉岡武男神奈川県綾瀬市吉岡1782−10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】で示される制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６。
【請求項２】リベルテラ（Ｌｉｂｅｒｔｅｌｌａ）属
に属する制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６生産菌を培
養し、培養物から制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１７２６を
採取することを特徴とする制がん性物質Ｍｅｒ−ＷＦ１
７２６の製造方法。