JPH10509176A - ε−アミノ基の選択的アシル化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はタンパク質のアシル化に関する。さらに詳しくは、遊離のα−アミノ基の存在下、プロインシュリン、インシュリン又はインシュリン類似体のε−アミノ基を選択的に１ステップでアシル化する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ε−アミノ基の選択的アシル化 本発明は、タンパク質のアシル化に関する。更に詳しくは、本発明は、プロイ ンシュリン、インシュリン、またはインシュリン類似体のε−アミノ基を遊離の α−アミノ基の存在下、１ステップでアシル化する方法に関する。 アミノ基のアシル化は、タンパク質の化学的な修飾に使われる最も一般的な方 法の内の１つである。アシル化の一般的な方法は、Methods of Enzymology 25,4 94-499(1972)に記載されており、活性化エステル、酸ハライド，または酸無水物 の使用を含む。活性化エステル、特に脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステルの使用は、脂肪酸を用いて遊離のアミノ酸をアシル化するのに、特に有利 な方法である。Lapidotら（J.of Lipid.Res.8: 142-145(1967)。Lapidotらは、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造、及びＮ−ラウロイル−グリシン 、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−セリン、及びＮ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸の製造 におけるその使用について記載している。 LindsayらはBiochem.J.121: 737-745(1971)に、インシュリンのアミノ基の選 択的アシル化の初期の研究を記載した。Lindsayらは、低い試薬濃度、中性付近 のｐＨにおいて、インシュリンとＮ−スクシンイミジルアセテートとが反応性を 示し、２つのモノ置換生成物、Phe^B1-アセチル-インシュリン及びG1y^A1アセチル インシュリンを生成することを記載している。ｐＨ８.５で、Phe^B1-アセチル-イ ンシュリンの生成量は低くなり、Lys^B29アセチルインシュリンも生成された。そ こで、Lindsayら（前掲）は、反応性の順序は、ｐＨ６.９では、グリシン（Ａ１ ）≒フェニルアラニン(Ｂ１)>>リジン（Ｂ２９）であり、ｐＨ８.５では、グリ シン（Ａ１）＞フェニルアラニン（Ｂ１）≒リジン（Ｂ２９）であると結論した 。 Lindsayら(U.S.Patent 3,869,437)は、最高７つまでの炭素原子を含むアシル 基と、所望により、Ａ¹−及び／又はＢ²⁹アミノ基を４つまでの炭素原子を含む アシル基で保護した、Ｂ¹アミノ酸のアシル化を開示した。Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル類は、特に有利なアシル化剤であると記載されている。Ｂ¹ アシル基がアシル化されたインシュリンを最大の収量（収率）で得るためには、 アシル化剤の割合を比較的低く（アシル化剤を１〜２モル当量）する。さらに、 モノ置換Ｂ¹生成物の最大収量はｐＨ７又はその近辺で得られる。ｐＨ８.５〜９ .０では、Ａ¹及びＢ²⁹位における余分な置換が有利となり、所望のＢ¹アシル化 生成物の収率はかなり低下した。 D.G.Smyth（U.S.特許3,868,356）及びSmythら（U.S.特許3,868,357）は、Ａ¹ 、Ｂ¹又はＢ²⁹アミノ酸アミノ基の少なくとも１個が、保護アミノ基に変換され たＮ−アシル化、Ｏ−置換インシュリン誘導体を記載している。アシル化は比較 的少ない過剰のアシル化剤、例えば、アミノ基当たり２〜３molのアシル化剤を 用いて、中性または僅かにアルカリ性のｐＨ、例えば７−８で行われる。反応は Ａ¹−及びＢ¹−アミノ基の反応による２−置換誘導体の形成を伴い、非常に高収 率で進む。過剰のアシル化剤（例えば、１０モルまで）の存在下、反応はさらに Ｂ²⁹−アミノ基にまで進み、３−置換誘導体を形成する。 ムラニシ及びキソ（特願平１−２５４,６９９）は、インシュリンを選択的に アシル化するために、脂肪酸インシュリン誘導体の調製のための５段階合成を開 示した。ステップ１：活性化された脂肪酸エステルの調製；ステップ２：インシ ュリンのアミノ基のｐ−メトキシベンゾキシカルボニルアジド（pMZ）による保 護；ステップ３：インシュリン−pMZの脂肪酸エステルとの反応；ステップ４： アシル化インシュリンの脱保護；ステップ５：アシル化インシュリンの単離、精 製。最も注目すべきは、１つのアミノ基の選択的なアシル化は、他のアミノ基を 保護するためにpMZ保護基を使用することによってのみ達成されるということで ある。この方法を用いてムラニシ及びキソは以下の化合物を製造する：Lys^B29− パルミトイルインシュリン（ε−アミノ基がアシル化）、Phe^B1−パルミトイル インシュリン（Ｂ鎖のＮ−末端α−アミノ基がアシル化）、及びPhe^B1，Lys^B29 −ジパルミトイルインシュリン(ε−アミノ基とＮ−末端α−アミノ基の両方が アシル化)。 同様に、ハシモトら（Phrmaceutical Research 6: 171-176(1989)）は、Ｎ− パルミトイルインシュリンの４段階合成を教示した。合成は、Ｎ−末端Ａ¹−グ リシン及びＢ²⁹−リジンのε−アミノ基のpMZによる保護、脱保護を含む。参考 文献に記載された条件の下では、２つの主要なアシル化生成物、Ｂ¹−モノパル ミトイルインシュリン及びＢ¹,Ｂ²⁹−ジパルミトイルインシュリン、が製造され る。 従って、本発明以前には、インシュリンのＢ²⁹−Ｎ^ε−アミノ基の選択的アシ ル化は、α−アミノ基の保護及び脱保護によって行われていた。 本発明は、プロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体のε−ア ミノ基をアシル化するための、選択的な１−ステップ合成法を提供するものであ る。本発明により、１ステップ工程で高収率に、ε−アミノ基を選択的にアシル 化することができるということは、全く驚異的である。かくして本発明は、タン パク質中の他のアミノ基の保護及びその後の脱保護の必要性を解消したのである 。本発明は、より効率的でより安価なε−アミノアシル化インシュリン誘導体の 製造法を提供するものである。 本発明は、遊離のε−アミノ基及び遊離のα−アミノ基を有するプロインシュ リン、インシュリンまたはインシュリン類似体の、脂肪酸による選択的なアシル 化法であって、ε−アミノ基と可溶性の活性化脂肪酸エステルとを、極性溶媒中 、塩基性条件下で反応させることを含む方法を提供する。 発明の開示において用いられるアミノ酸の略語は全て、37C.F.R.§1.822(B)(2 )に記載のごとく、米国特許商標局に許容されたものである。 上記のごとく、本発明はプロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類 似体のε−アミノ基の、高度に選択的な１ステップアシル化を提供する。本発明 は、α−アミノ基よりもε−アミノ基を優先的にアシル化する条件を指定する。 一般に、モノ−アシル化α−アミノ基の生成は、収率５％以下である。 本明細書中、「インシュリン」という語句は、ヒトインシュリン、ブタインシ ュリン、又はウシインシュリンを指す。インシュリンは３つの遊離のアミノ基を 有する：Ｂ¹−フェニルアラニン、Ａ¹−グリシン、及びＢ²⁹−リジン。Ａ¹及び Ｂ¹位の遊離のアミノ基はα−アミノ基である。Ｂ２９位の遊離のアミノ基はε −アミノ基である。 本明細書中、「プロインシュリン」という語句は、式： Ｂ−Ｃ−Ａ （式中、ＡはインシュリンＡ鎖又はその機能的な誘導体； Ｂはε−アミノ基を有するインシュリンＢ鎖又はその機能的な誘導体；そして Ｃはプロインシュリンの連結ペプチドを表す） で示される適切に交差結合したタンパク質を示す。 好ましいプロインシュリンは、ＡがヒトインシュリンのＡ鎖、Ｂがヒトインシ ュリンのＢ鎖、そしてＣが天然の連結ペプチドであるものである。プロインシュ リンが天然配列であるとき、プロインシュリンは３つの遊離のアミノ基：Ｂ¹− フェニルアラニン（α−アミノ基）、Ｃ⁶⁴−リジン（ε−アミノ基）及びＢ²⁹− リジン（ε−アミノ基）を有する。 「インシュリン類似体」という語句は、式： Ａ−Ｂ （式中、ＡはインシュリンＡ鎖の機能的な誘導体；そして Ｂはε−アミノ基を有するインシュリンＢ鎖の機能的な誘導体を表す） で示される適切に交差結合したタンパク質を示す。 好ましいインシュリン類似体は、Ｂ²⁸位のアミノ酸残基がAsp、Lys、Leu、Val 又はAla； Ｂ²⁹位のアミノ酸残基がLys又はPro； Ｂ¹⁰位のアミノ酸残基がHis又はAsp； Ｂ¹位のアミノ酸残基がPhe、Aspであるか、又は単独で欠失しているか、Ｂ²位 の残基の欠失と同時に欠失している； Ｂ³⁰位のアミノ酸残基がThr、Alaであるか、欠失している；そして Ｂ⁹位のアミノ酸残基がSer又はAsp； ただし、Ｂ²⁸又はＢ²⁹のいずれかがLysであることを条件とする。 当業者に既知の標準的な生物化学的な語句で言えば、好ましいインシュリン類 似体はLys^B28Pro^B29-ヒトインシュリン(Ｂ²⁸はLys、Ｂ²⁹はPro)；Asp^B28-ヒトイ ンシュリン(Ｂ²⁸はAsp)；Asp^B1−ヒトインシュリン、Arg^{B31 B32}−ヒトインシュ リン、Asp^B10−ヒトインシュリン、Arg^A0−ヒトインシュリン、Asp^B1,Glu^{R1 3} -ヒトインシュリン、Ala^B26−ヒトインシュリン、des(B30)−ヒトインシュリン 、及びGly^A21−ヒトインシュリンである。 「アシル化」という語句は、タンパク質の遊離アミノ基に共有結合的に結合し た１又はそれ以上のアシル基を導入することである。 「選択的なアシル化」という語句は、α−アミノ基に対して、ε−アミノ基を 優先的にアシル化することを意味する。一般に、選択的アシル化により、モノア シル化ε−アミノ基生成物の量の、モノ−アシル化α−アミノ基生成物の量に対 する比率は、約５以上になる。好ましくは、その比率は約１０以上であり、最も 好ましくは約５０以上である。 「脂肪酸」という語句は、飽和又は不飽和のＣ₆−Ｃ₂₁脂肪酸を指す。「活性 化脂肪酸エステル」という語句は、Methods of Enzymology 25，494−499(1972) 及びLapidotら（J.of Lipid.Res.8: 142-145(1967)）に記載された一般的手法を 用いて活性化された脂肪酸を意味する。好ましい脂肪酸は、飽和脂肪酸であり、 ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６） 、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）、及びステアリン酸（Ｃ１８）である。最も好まし い脂肪酸はパルミチン酸である。活性化脂肪酸エステルには、ヒドロキシベンゾ トリアジド（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びその誘導体のよう な試薬の誘導体が含まれる。好ましい活性化脂肪酸エステルは、Ｎ−スクシンイ ミジルパルミテートである。 「可溶性」という語句は、液相に、インシュリン、インシュリン類似体又はプ ロインシュリンのアシル化に十分な量のエステルが存在することを意味する。液 相にインシュリン１モル当たり、約１から４モル当量の活性化エステルが存在す ることが好ましい。 本明細書中、「塩基性条件下」という語句は、反応の塩基性度を指す。反応は 、全ての遊離アミノ基が実質上、脱プロトン化して行われる必要がある。水性溶 媒又は半（セミ）−水性溶媒混合物中、塩基性条件とは、ｐＨ９.０以上で反応 させることを意味する。非水性有機溶媒中では、塩基的に、水中におけるｐＫａ 値１０.７５と同等又はそれ以上に匹敵する塩基の存在下で反応を行う。 「交差結合」という語句は、システイン残基間のジスルフィド結合の形成を意 味する。適切に交差結合したプロインシュリン、インシュリン又はインシュリン 類似体は３つのジスルフィド架橋結合を有する。第１のジスルフィド架橋はＡ鎖 の６位と１１位のシステイン残基間に形成される。第２のジスルフィド架橋はＡ 鎖の７位システイン残基とＢ鎖の７位システイン残基の間を結合している。第３ のジスルフィド架橋はＡ鎖の２０位システイン残基とＢ鎖の１９位システイン残 基の間を結合している。 本発明以前には、当業者は複数ステップ合成において、保護基を用い、ε−ア ミノ基を選択的にアシル化していた。ムラニシ及びキソ（特願平１−２５４,６ ９９）は、アシル化インシュリンの合成のための５−ステップ合成を開示してい る。同様に、ハシモトら（Phrmaceutical Research 6: 171-176(1989)）は、Ｎ −パルミトイルインシュリンの４段階合成を教示している。いずれの参考文献も 、インシュリンのアシル化には、ｐＭＺ保護基の使用を教示している。 本発明では、１ステップ合成により、高収率でＮ^ε−アシル化されたプロイン シュリン、インシュリン又はインシュリン類似体を製造する。反応により、アミ ノ保護基を用いることなくＮ^ε−アシル化タンパク質を製造することができる。 アシル化は、極性溶媒中で、塩基性条件下、活性化脂肪酸エステルとタンパク質 のε−アミノ基とを反応させることにより、行われる。弱い塩基性条件下では、 全ての遊離のアミノ基が脱プロトン化される訳でなく、Ｎ−末端アミノ基が有意 にアシル化される。水性溶媒又は半−水性溶媒混合物中では、塩基性条件とは、 反応をｐＨ９.０以上で行うことを意味する。タンパク質の分解はｐＨ１２.０以 上の範囲で起こるので、反応混合物のｐＨは好ましくはｐＨ９.５から１１.５、 最も好ましくは、１０.５である。有機及び水性溶媒を混合した反応混合物のｐ Ｈ測定値は混合する前の水相のｐＨ値である。 表１のデータは、反応の選択性に対するアルカリ性度の影響を示す。表１のデ ータは、２モル当量のＮ−スクシンイミジルパルミテートを５０％ＣＨ₃ＣＮ／ 水中でヒトインシュリンをアシル化して得られた。 表１は、ε−アミノ基のアシル化が反応の塩基性度に依存することを示してい る。ｐＨ９.０以上では、反応は、Ｂ２９−リジンのε−アミノ基を選択的にア シル化する。 非−水性溶媒中では、ε−アミノ基（群）を十分に脱プロトン化するために、 塩基的に、水中におけるｐＫａ値１０.７５と同等又はそれ以上に匹敵する塩基 の存在下で反応を行う。即ち、塩基は少なくとも、トリエチルアミンと同様に強 塩基でなければならない。好ましい塩基はテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、 ジイソプロピルエチルアミン、又はテトラブチルアンモニウムヒドロキシドであ る。 極性溶媒の選択は、プロインシュリン、インシュリン又はインシュリン類似体 及び脂肪酸エステルの溶解性に大いに依存する。最も重要なのは、溶媒が全て有 機溶媒である。一般に許容される有機溶媒には、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等がある。水 性溶媒及び水性及び有機溶媒の混合物でも操作できる。極性溶媒の選択は試薬の 溶解性によってのみ制限される。好ましい溶媒及び溶媒系は、ＤＭＳＯ；ＤＭＦ ；アセトニトリル及び水；アセトン及び水；エタノール及び水；イソプロピルア ルコール及び水；イソプロピルアルコール、エタノール及び水；及びエタノール 、プロパノール及び水である。好ましくは、溶媒はアセトニトリル及び水、最も 好ましくは、５０％アセトニトリルである。当業者は他の極性溶媒も使用可能で あることを認識するであろう。 反応物の比率は、重要でない。一般に活性化脂肪酸エステルが過剰モル存在す ることが好ましい。好ましくは、１〜４モル当量、最も好ましくは１〜２モル当 量のエステルを用いて反応を行う。しかしながら、当業者は、活性化エステル濃 度が極めて高いと、有意量のビス又はトリ−アシル化生成物が生成されることを 認めるであろう。 反応温度は、重要でない。反応は０〜４０℃の間で行い、一般に１５分から２ ４時間で完了する。 アシル化後、反応を止め、生成物を逆相又は疎水性クロマトグラフィー等の標 準的な手法で精製する。その後、凍結乾燥又は結晶化等の標準的な手法で生成物 を回収する。 プロインシュリン、インシュリン及びインシュリン類似体は、古典的な方法( 溶液法)、固相法、半−合成法、及びより最近では、組換えＤＮＡ法を含む、既 知の様々なペプチド合成法の内、任意の方法で調製しうる。例えば、Chanceら(U .S.特許出願07/388,201，EPO 公開383 472)、Brangeら(EPO 214 826)及びBelaga je ら(U.S.特許5,304,473)には、様々なプロインシュリン及びインシュリン類似 体の製造が開示されており、それらは本明細書に引用して組み込まれる。本発明 のインシュリン類似体のＡ鎖及びＢ鎖も、組換えＤＮＡ法を用い、プロインシュ リン様前駆体分子を経て調製される。Frankら、Peptides: Synthesis-Structure -Function，Proc.Seventh Am.Pept.Symp.，D.Rich 及び E.Gross編(1981)(引用 して本明細書に組み込まれる)参照。 以下の実施例は、本発明の更なる例示を与えるにすぎない。本発明の範囲は以 下の実施例のみからなるものではない。 実施例１ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いる ＤＭＳＯ中でのインシュリンのアシル化 生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（７１.９mg）をＤＭＳＯ ６.５ ８mlに溶解した。肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、室温で溶液を撹拌した 。固体の活性化したエステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２０mgをＤ Ｍ ＳＯ２mlに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で溶液になるまで、激しく撹 拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）溶液 を調製した。その時点で、ＢＨＩ溶液５mlに、１,１,３,３−テトラメチルグア ニジン（２６.８μl）を加え、ＤＭＳＯ（９４.４ml）と先に調製した活性化エ ステル溶液（４００μl）を加えた。室温（２０〜２５℃）で約６０分間、反応 を進行させた。試料を１５分後に除去し、１Ｎ酢酸で２０倍希釈し、ＨＰＬＣで 分析した。反応を止めた試料中のＢ²⁹−Ｎ^ε−パルミトイルヒトインシュリンの 量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、６７.１％であった 。 実施例２ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル 及び水中でのインシュリンのアシル化 生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（１９９.５mg）をｐＨ２.５で、 ５０mＭ硼酸溶液２０Ｌに溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５ に再調節し肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。出発物質の 試料を除去し、２７６nmでの吸収を測定した結果、１０.５５であった。固体の 活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２４gを約５０℃に予熱 しておいたアセトニトリル２.４Ｌに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で 溶液になるまで、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイ ミジルパルミテート）溶液を調製した。その時点で、ＢＨＩ溶液のｐＨを、１０ ％ＮａＯＨを加えて約１０.２２に調節した。ｐＨ調節ＢＨＩ溶液にアセトニト リル（１８Ｌ）を加えた。室温（２０〜２５℃）で１１０分間、反応を進行させ た後、水（１２３Ｌ）を加えて反応を止め、得られた希釈液のｐＨを１０％ＨＣ ｌ及び１０％ＮａＯＨを用いて２.０１に調節した。反応を止めた反応液中のＢ2 9−Ｎ^ε−パルミトイルヒトインシュリンの量をＢＨＩの初期値で割ることによ り計算した反応収率は、７３％であった。 実施例３ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル 及び水中でのLys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンのアシル化 Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン結晶（２.２２g）をｐＨ２.５で、５０mＭ硼 酸溶液１００mlに溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用いて２.５に再調 節し肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した。固体の活性化エス テル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）２７０mgを約５０℃に予熱しておい たアセトニトリル２７mlに加え、全活性化エステル粒子が肉眼観察で溶液になる まで、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパル ミテート）溶液を調製した。溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.２ ２に調節し、溶液を４℃で１５分間撹拌した。ｐＨ調節溶液にアセトニトリル（ ７３ml）を加え、先に調製した活性化エステル溶液を加えた。４℃で８５分間反 応を進行させ、１Ｎ酢酸（６００ml）を加えて反応を止めた（最終ｐＨ２.８５ ）。反応を止めた反応液中のＢ２８−Ｎ^ε−パルミトイルLys^B28Pro^B29−ヒトイ ンシュリンの量をLys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンの初期値で割ることにより計 算した反応収率は、７２.５％であった。 実施例４ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いる アセトニトリル及び水中でのＢＨＩのアシル化 生合成的なヒトインシュリン（ＢＨＩ）結晶（３ｇ）をｐＨ２.５で、５０mＭ 硼酸溶液３００mlに溶解した。必要に応じて、溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを用 いて２.５に再調節し、肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌した 。固体の活性化エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）４００mgをアセ トニトリル４０mlに加え、激しく撹拌することにより、活性化エステル（Ｎ−ス クシンイミジルパルミテート）溶液を調製した。その時点で、ＢＨＩ結晶溶液の ｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.２に調節した。次いで、ＢＨＩ溶液に アセトニトリル（２４０ml）を加え、予め調製した活性化エステル溶液を加えた 。室温（２０〜２５℃）で約９０分間、反応を進行させた後、水（１８００ml） を加えて反応を止め、得られた希釈液のｐＨを１０％ＨＣｌを用いて約２.５に 調節した。反応を止めた反応液中のＢ²⁹−Ｎ^ε−パルミトイルヒトインシュリン の量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した反応収率は、７５.７％であっ た。 実施例５ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるアセトニトリル 及び水中でのプロインシュリンのアシル化 ヒトプロインシュリン（ＨＰＩ）水溶液（２８.２mg／ml）を、最終的に１６. ２mg／mlＨＰＩで、１００mlとなるよう、５０mＭ硼酸溶液で希釈した。同時に 、固体のＮ−スクシンイミジルパルミテート１５０mgを、急速に撹拌しながらア セトニトリル（ＡＣＮ）１５mlに加えることにより、活性化エステル溶液を調製 した。次いで、ＨＰＩ溶液のｐＨを１０％ＮａＯＨを加えて１０.２に調節した 後、ＡＣＮ８８mlを加えた。活性化エステル溶液１２ml（ＨＰＩの２倍モル過剰 ）を加えて反応を開始した。最終的な反応液の容量は２００mlで、５０％水性Ａ ＣＮ中、ＨＰＩを８mg／ml含有していた。室温（２０〜２５℃）で約６０分間、 反応を進行させた後、等量（２００ml）の５０mMグリシン、ｐＨ１０.０を加え て反応を止めた。 α−アミノアシル化種に対するε−アミノアシル化種の正確な割合は計算され ていないが、任意の特定の時点での、クロマトグラムにおける、全てのε−アミ ノアシル化種の総和は全面積の８７−９０％であるが、全関連物質（恐らく、α −アミノアシル化種をも含む）の総和は全面積の７％未満（＜７％）であった。 実施例６ ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる Arg^B31Arg^B32 −ヒトインシュリンのアシル化 Arg^B31Arg^B32−ヒトインシュリン（１.３mg）をｐＨ１０.４で、２００mＭ（ ３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）緩衝液２００μlに 溶解した。次いで、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したヘキサ ノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０.３μＭ）を加え、溶解す るまで撹拌した。反応混合物を室温（２０〜２５℃）で約４時間、撹拌した後、 ０.１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを約２.５に調節して反応を止めた。ＨＰＬＣ分析 の前に混合物を０.４５ミクロンのフィルターに通してゼラチン様粒子を除去し た。出発物質からの表題の化合物の分離は、Ｃ４逆相アナリティカルＨＰＬＣカ ラム を用いて達成された。反応を止めた反応液中のＢ２９−Ｎ^ε−ヘキサノイル−Ar g^B31,Arg^B32−ヒトインシュリンを、Arg^B31Arg^B32−ヒトインシュリンの初期値 で割ることにより計算した反応収率は、６９.４％であった。 実施例７ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるＤＭＳＯ中での Leu^B26 ヒトインシュリンのアシル化 Leu^B26−ヒトインシュリン（１.０mg）を１mlの９５％ジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）、５％トリエチルアミン（ＴＥＡ）に溶解した。次いで、Ｎ,Ｎ− ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮ−スクシンイミジルパルミテート （０.７μＭ）を加え、溶解するまで撹拌した。反応混合物を室温（２０〜２５ ℃）で約９０分間、撹拌した後、試料を０.１Ｎ ＨＣｌを用いて０.２mg／mlま で希釈することで反応を止めた。ＨＰＬＣ分析の前に混合物を０.４５ミクロン のフィルターに通してゼラチン様粒子を除去した。出発物質からの表題の化合物 の分離は、Ｃ４逆相アナリティカルＨＰＬＣカラムを用いて達成された。反応を 止めた反応液中のＮ^ε−パルミトイル−Leu^B26−ヒトインシュリンを、Leu^B26− ヒトインシュリンの初期値で割ることにより計算した反応収率は、３６.４％で あった。 実施例８ Ｎ−スクシンイミジルパルミテートを用いるジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）中でのヒトインシュリンのアシル化 生合成ヒトインシュリン結晶（１mg、０.１７mmol）を２０mlのＤＭＳＯに室 温で完全に溶解することにより、インシュリン溶液を調節した。同時に、５０℃ において、Ｎ−スクシンイミジルパルミテート（０.０８１７ｇ、０.２３mmol） を３mlのＤＭＳＯに溶解することにより、活性化エステルの溶液を調節した。激 しく撹拌されたインシュリン溶液に、まず、１,１,３,３−テトラメチルグアニ ジン（０.４３２ml、３.４mmol）を加え、次いで、活性化エステルの全容液を加 えた。３０分後、予め０℃に冷却しておいた０.０５Ｍ ＨＣｌ（１２０ml）を 加えて反応を止めた。混合物のｐＨは約１.８であった。反応を止めた混合物の 逆相ＨＰＬＣ分析により、Ｂ²⁹−Ｎ^ε−パルミトイルインシュリンは、溶出した 全タンパク質の７２.２％であり、全モノ−アシル化インシュリンの９５％を表 していた。 全反応混合物を、水中に０.１％トリフルオロ酢酸及び２０％アセトニトリル を含有する溶媒で予め平衡化しておいたVydac C4分離用逆相カラム(5x25 cm)に 負荷した。負荷後、カラムを、まず同じ溶媒５００mlで洗浄した後、０.１％ト リフルオロ酢酸、アセトニトリル及び水からなる溶媒系（９Ｌ中、アセトニトリ ル濃度勾配２０→８０％）を用いて流速４ml／分で溶離した。アセトニトリル濃 度約５３％からなる溶媒系でＢ²⁹−Ｎ^ε−パルミトイルインシュリンは溶出した 。凍結乾燥して溶媒を除去した後、Ｎ^ε−パルミトイルインシュリンの収量は４ １４mg（０.０６８４mmol）又は出発物質からの収率は４０.２％であった。 実施例９ １−オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる Lys^B28Pro^B29 −ヒトインシュリンのアシル化 Lys（B28）、Pro（B29）ヒトインシュリン（ＫＰＢ）結晶（２.０ｇ）を５０m Ｍ硼酸緩衝液２００mlにｐＨ２.５で溶解した。溶液のｐＨを、１０％ＨＣｌを 用いて２.５に再調節し、肉眼観察で結晶が完全に溶解するまで、溶液を撹拌し た。固体の活性化エステル（１−オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル）１７５mgをアセトニトリル２５.６２mlに加え、肉眼観察で全活性化 エステル粒子が溶液になるまで激しく撹拌して活性化エステル溶液を調製した。 ＫＰＢ溶液のｐＨを、１０％ＮａＯＨを加えて約１０.４に調節し、溶液を室温 で約５分間撹拌した。ｐＨを調節したＫＰＢ溶液にアセトニトリル（１７６ml） を加え、予め調製した活性化エステル溶液を加えた。室温で約９０分間、反応を 進行させた後、１０％ＨＣｌ（２.７５v/v％）５.５mlと３倍容量（１２００ml ）の冷ｄＨ₂Ｏを加えて反応を止めた（最終ｐＨ２.７０）。反応を止めた反応液 中のLysＢ２９（Ｃ８）ＫＰＢの量をＢＨＩの初期値で割ることにより計算した 反応収率は、７５.７％であった。疎水性クロマトグラフィー（ＳＰ２０ＳＳ） による精製のために溶液を８００mlづつに２分した。カラムクロマトグラフィー の後、限外ろ過及び凍結乾燥を行った。 表２のデータは、インシュリン、インシュリン類似体及びプロインシュリンの 選択的アシル化を証明している。脂肪酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス テルを用いて室温で実験を行った。以下の表において、ＴＭＧ及びＴＥＡは、そ れぞれ、テトラメチルグアニジン及びトリエチルアミンを表す。ＮＤはなんらの データも得られなかったことを意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハンクワイアー，ジョーゼ・マイケル アメリカ合衆国46151インディアナ州 マ ーティンズビル、ペインテッド・ヒルズ70 番 (72)発明者 クリオーシウナス，エイダス・ブラダス アメリカ合衆国46254インディアナ州 イ ンディアナポリス、ディアー・クリーク・ ドライブ 5344番 (72)発明者 モーサー，ブライアン・アレン アメリカ合衆国46217インディアナ州 イ ンディアナポリス、ウエスト・ハンナ・ア ベニュー 751番 (72)発明者 シューマン，ロバート・セオドア アメリカ合衆国46143インディアナ州 グ リーンウッド、ウィロー・ストリート2596 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遊離のε−アミノ基及び遊離のα−アミノ基を有するプロインシュリン、イ ンシュリン又はインシュリン類似体を脂肪酸により選択的にアシル化する方法で あって、ε−アミノ基と可溶性の活性化脂肪酸とを、極性溶媒中で塩基性条件下 に反応させることを含む方法。 ２．タンパク質がヒトインシュリン、インシュリン類似体又はLys^B28Pro^B29−ヒ トインシュリンである請求項２記載の方法。 ３．活性化脂肪酸エステルが、Ｃ₆−Ｃ₁₈脂肪酸のＮヒドロキシ−スクシンイミ ドエステルである請求項１記載の方法。 ４．活性化脂肪酸エステルが、Ｃ₁₄−Ｃ₁₈脂肪酸のＮヒドロキシ−スクシンイミ ドエステルである請求項１記載の方法。 ５．活性化脂肪酸エステルが、パルミチン酸のＮヒドロキシ−スクシンイミドエ ステルである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．遊離のε−アミノ基及び遊離のα−アミノ基を有するプロインシュリン、イ ンシュリン又はインシュリン類似体を脂肪酸により選択的にアシル化する方法で あって、ε−アミノ基と可溶性の活性化脂肪酸とを、半−水性溶媒中、ｐＨ約９ .０〜１２.０において反応させることを含む方法。 ７．タンパク質がヒトインシュリン、インシュリン類似体又はLys^B28Pro^B29−ヒ トインシュリンである請求項６記載の方法。 ８．ｐＨが約９.５〜１０.５である請求項７記載の方法。 ９．半−水性溶媒がアセトニトリルと水である請求項８記載の方法。 １０．溶媒が５０％アセトニトリルである請求項９記載の方法。 １１．脂肪酸エステルが、Ｎ−スクシンイミジルパルミテート、Ｎ−スクシンイ ミジルオクタノアート、又はＮ−スクシンイミジルミリステートである請求項１ ０記載の方法。