JPH11332981A - 血中の低密度リポ蛋白質除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血球と血漿を分離することなく全血のままで除
去処理しても目詰まりを起こさない、自動化が容易で血
球の損失も防止可能な方法であって、しかも従来のリガ
ンドと比較して更に良好なＬＤＬ及び／又はＶＬＤＬの
除去方法及びこれに用いる吸着体を提供すること。 【解決手段】平均粒子径が１００μｍ以上１０００μｍ
以下の硬質ポリマーゲルに低密度リポ蛋白質に親和性を
有するアニオン性高分子を固定してなる低密度リポ蛋白
質吸着体を用いて血漿と血球を分離せずに血中の低密度
リポ蛋白質を除去減少する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血中の有害成分の
除去方法に関する。さらに詳しくは、血液から低密度リ
ポ蛋白質（ＬＤＬ）及び／又は超低密度リポ蛋白質（Ｖ
ＬＤＬ）を選択的に吸着除去するための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中に存在するリポ蛋白のうち、ＬＤ
Ｌ及びＶＬＤＬはコレステロールを多く含み、動脈硬化
の原因となることが知られている。とりわけ家族性高脂
血症等の高コレステロール症ではＬＤＬ値が正常値の数
倍を示し、冠動脈の硬化等を引き起こす。この治療のた
め、血中ＬＤＬの低下を目的として食事療法や薬物療法
が行われているが効果に限度があり、副作用も懸念され
ている。

【０００３】特に家族性高脂血症に対しては、患者の血
漿を分離した後、正常血漿又はアルブミン等を成分とす
る補液を交換する、いわゆる血漿交換療法が効果的な治
療法である。しかしながら血漿交換療法には、（１）高
価な新鮮血漿又は血漿製剤を用いる必要がある、（２）
肝炎ビールス等の感染の恐れがある、（３）ＬＤＬやＶ
ＬＤＬのみでなく有用成分（血球など）も同時に除去し
てしまう、等の課題がある。これらの課題を解決する目
的で膜による有害成分の除去が試みられているが、選択
性の点で満足できるものではない。

【０００４】また同じ目的で抗原、抗体等を固定した、
いわゆる免疫吸着体を用いる試みが為されている。免疫
吸着体を用いる方法は、選択性の点では良好な除去が可
能であるものの、用いる抗原、抗体の入手が困難でしか
も高価であるという課題がある。

【０００５】ＬＤＬやＶＬＤＬに親和性を有する化合物
（リガンド）を固定した、いわゆるアフィニティクロマ
トグラフィーの原理による除去も試みられている。例え
ばリガンドとしてポリアニオン化合物を用いる除去方法
は、リガンドは比較的安価で、しかも選択性も比較的良
好である。従って、硬質ポリマーゲルにかかるリガンド
を固定した吸着体をカラムに充填し、体外循環回路に組
み込んで血漿かん流療法（いわゆるプラズマフェレーシ
ス等）を行えば、比較的良好なＬＤＬやＶＬＤＬの除去
が可能となる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】カラムを組み込んだ従
来の体外循環回路は、カラムが血球で目詰まりしないよ
うに、いったん血液を血球と血漿に分離し、血漿成分の
みをカラムに供してＬＤＬやＶＬＤＬを除去し、その
後、分離した血球と混合して患者の体内に戻すというも
のである。しかし、このように血球と血漿の分離、除去
処理後の混合が必要であることから、操作を自動化する
ことが困難で手作業で行う必要があった。また血球をい
ったん分離することからその損失が起こりやすいという
課題もあった。更には、リガンドとして用いる化合物に
検討の余地もあった。

【０００７】そこで本発明は、血球と血漿を分離するこ
となく全血のままで除去処理しても目詰まりを起こさな
い、自動化が容易で血球の損失も防止可能な方法であっ
て、しかも従来のリガンドと比較して更に良好なＬＤＬ
及び／又はＶＬＤＬの除去方法及びこれに用いる吸着体
を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果本発明を完成するに
至った。即ち本発明は、平均粒子径が１００μｍ以上１
０００μｍ以下の硬質ポリマーゲルに低密度リポ蛋白質
に親和性を有するアニオン性高分子を固定してなる低密
度リポ蛋白質吸着体を用いて血漿と血球を分離せずに血
中の低密度リポ蛋白質を除去減少する方法である。

【０００９】また本発明は、平均粒子径が１００μｍ以
上１０００μｍ以下の硬質ポリマーゲルに低密度リポ蛋
白質に親和性を有するアニオン性高分子を固定してなる
低密度リポ蛋白質吸着体である。以下、本発明を詳細に
説明する。

【００１０】赤血球は７．５μｍ〜８．５μｍの中くぼ
み円盤状であり、白血球は不定形であるがそのうち５５
〜６０％を占める好中球の塗抹標本で１０〜１２μｍの
大きさである。白血球が不定形であることから、吸着体
をカラムに充填した場合の空隙直径として１５μｍ以上
が必要となる。この大きさの空隙を均一粒子径の球形粒
子の最密充填で確保する場合、粒子径が少なくとも９７
μｍ以上が必要である。一方、粒子径が大きすぎると吸
着体間の空隙が大きくなり血液中のＬＤＬ等が吸着体表
面（吸着体の細孔を含む）に接触する機会が少なくな
り、吸着除去されずに素通りして吸着効率が悪化する。
従って本発明の吸着体は、これを充填したカラムに全血
を供しても血球が目詰まりすることなく、かつ、ＬＤＬ
等がその表面と十分に接触可能とするため、平均粒子径
が１００μｍ以上１０００μｍ以下であり、特に好まし
くは１００μｍ以上５００μｍ以下である。なお、本発
明の吸着体をカラムに充填する場合には、カラムのフィ
ルターとして２０μｍ以上かつ吸着体の粒子径以下の空
隙を有するものを使用する。

【００１１】なお吸着体の粒子径の分布については、小
粒子径の吸着体が多く存在した状態では平均粒子径が１
００μｍ以上でも目詰まりの可能性があることから、８
０μｍ以下の粒子の存在割合を５％以下とすることが好
ましい。

【００１２】ＬＤＬは、分子量が少なくとも１００万以
上といわれる巨大分子である。従ってＬＤＬを効率よく
吸着除去するためには、ＬＤＬが吸着体に接触可能な吸
着体表面（有効表面）の面積を大きくして吸着容量を増
やす必要がある。ＬＤＬが吸着体である硬質ポリマーゲ
ルの細孔内に侵入できれば細孔内も有効表面として利用
されるため吸着容量は飛躍的に向上するが、あまりに細
孔径が大きいと硬質ポリマーゲルの表面積そのものが小
さくなるため、ＬＤＬに対する有効表面が減少し、吸着
容量は低下する。吸着体である硬質ポリマーゲルの細孔
はある程度の分布をもって存在するが、ＬＤＬ吸着のた
めの最適な細孔分布が必要になる。

【００１３】細孔径の測定法は種々あり、中でも水銀圧
入法は最もよく用いられているが、硬質ポリマーゲルの
場合には使用できないことがある。水銀圧入法では乾燥
状態のサンプルを測定するが、一般に硬質ポリマーゲル
は通常の湿潤状態を乾燥状態にすることで細孔構造が変
化する場合が多いためである。従って、本発明の吸着体
である硬質ポリマーの細孔径の目安としては、排除限界
分子量を用いる。

【００１４】排除限界分子量とはゲル浸透クロマトグラ
フィにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子
のうち最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。現
実的には、排除限界分子量以上の分子は移動相体積Ｖｏ
近傍に溶出されることから、種々の分子量の化合物を用
いて溶出体積との関係を調べれば排除限界分子量を測定
することができる。排除限界分子量は対象とする化合物
の種類によって異なり、ゲル浸透クロマトグラフィでの
測定では、標準ポリエチレンオキサイドや標準ポリスチ
レンなどの鎖状合成高分子は蛋白質等の球形に近い高分
子と比較して、同一分子量で約１０倍程度の大きさの分
子と認識される。従って、鎖状合成高分子を使って得ら
れた排除限界分子量は、蛋白質での排除限界分子量と比
べると約１０分の１程度の値となる。

【００１５】本発明者らの知見によれば、標準ポリエチ
レンオキサイドで測定した排除限界分子量が２０万未満
の硬質ポリマーゲルに比較して同排除限界分子量が３０
万以上のものでは排除限界分子量が大きくなるにつれて
ＬＤＬの吸着量が増加する傾向がある。しかし、排除限
界分子量が２０００万を越えると硬質ポリマーゲルでは
表面積が小さくなって吸着体として十分とはいえず、し
かもポリマーゲル自体の機械的強度も弱くなる。従って
本発明の吸着体においては、標準ポリエチレンオキサイ
ドで測定した排除限界分子量が３０万以上２０００万未
満である硬質ポリマーゲルを用いることが好ましい。

【００１６】本発明の吸着体に適した硬質ポリマーゲル
の例としては、架橋ポリメタクリレート、架橋ポリアク
リレート、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、架橋
ポリビニルアルコール、架橋されたビニルエーテル−無
水マレイン酸共重合体、架橋されたスチレン−無水マレ
イン酸共重合体、架橋ポリアミド等の合成高分子及びこ
れらの共重合体、多孔性セルロースゲル等の硬質多孔
体、更には上記したものの表面に多糖類、合成高分子等
をコーティングしたものが例示できるが、これらに限定
されるわけではない。これらの硬質ポリマーゲルは、単
独で用いても良いし２種以上混合して用いても良い。

【００１７】本発明の吸着体に適したＬＤＬ、ＶＬＤＬ
等のリポ蛋白に親和性を有するアニオン性高分子の例と
しては、ポリビニルアルコール硫酸、ポリアクリル酸、
メタクリル酸ポリマー、ポリスチレンスルホン酸及びこ
れらの共重合物等、更にはヘパリン、デキストラン硫
酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸等の
硫酸化多糖があげられる。中でも、ポリアクリル酸、ヘ
パリン、デキストラン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸が
特に好ましいアニオン性高分子として例示できる。

【００１８】アニオン性高分子を上述の硬質ポリマーゲ
ルに固定化する量については、アニオン性高分子の性
状、活性及び硬質ポリマーゲルの有効表面積を勘案して
決定すれば良いが、十分なＬＤＬ等の吸着量を達成する
ため、吸着体１ｍｌあたり０．１ｍｇ以上とすることが
好ましい。例えば硫酸化多糖の場合は、経済性を考慮す
ると１００ｍｇ以下が好ましいが、更に好ましくは吸着
体１ｍｌあたり０．５ｍｇ以上５０ｍｇ以下である。ア
ニオン性合成高分子の場合には特に経済性を考慮する必
要はない。ただし、当該合成高分子の場合、カラム体積
１ｍｌあたり３００ｍｇ以上固定するのは技術的に困難
である。

【００１９】本発明の血中の低密度リポ蛋白質を除去、
減少する方法は、これまで説明してきた吸着体をカラム
に充填し、体外循環回路に組み込んで使用する方法であ
る。ここでカラム以外の体外循環回路は従来から知られ
たものと同様で良いが、本発明の方法では血液を血漿と
血球に分離することなく、全血の状態で体外循環回路に
供することができる。また体外循環回路に組み込む以外
にも、単に人から取得した血液からＬＤＬ及び／又はＶ
ＬＤＬといった低密度リポ蛋白質を除去、減少するため
に使用することができる。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

【００２１】実施例 １ ジオキサン５ｇにアクリル酸グリシジル２ｇとアクリル
酸２ｇを加え、アゾビスイソブチロニトリルを０．１ｇ
加えて５０℃で１６時間重合して共重合物を得た。架橋
親水性ビニルポリマーゲルである市販のゲル（トヨパー
ルＨＷ６０、同ＨＷ６５及び同ＨＷ７５、東ソー（株）
製、標準ポリエチレンオキサイドでの排除限界分子量は
それぞれ５０００００、１００００００又は６００００
００、粒子系分布は１００〜３００μｍ、重量平均粒子
径はそれぞれ１８０μｍ、１９０μｍ又は１７６μｍ、
ただしＨＷ６０は試作品）の各５０ｇに、それぞれ０．
５ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム５０ｇとエピクロルヒ
ドリン５０ｇ及び先の共重合物を加えて６０℃で６時間
反応した。得られたゲルをジオキサン洗浄、水洗浄し、
ポリアクリル酸含有ゲルを得た。

【００２２】得られたゲルの陽イオン交換容量は、それ
ぞれ０．１２ｍｅｑ／ｇ、０．１０ｍｅｑ／ｇ又は０．
０９ｍｅｑ／ｇであった。これらのゲルを内径１０ｍ
ｍ、長さ１０ｃｍのガラスカラムに充填した。カラムに
生理食塩水１０ｍｌを０．２ｍｌ／分で送液した後、人
の血液（全血）２５ｍｌを流速０．２ｍｌ／分で送液し
た。

【００２３】送液開始後、１０ｍｌの流出液は生理食塩
水で希釈されているため廃棄し、その後の５ｍｌを処理
血液として得た。得られた処理血液と元の血液中のＬＤ
Ｌ及び高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）量を市販の分析用カ
ラム（ＴＳＫｇｅｌＬｉｐｏｐｒｏｐａｋ、東ソー
（株）製、内径７．５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を用いて液
体クロマトグラフィで測定した。測定は市販の溶離液
（ＴＳＫ ｅｌｕｅｎｔＬＰ−１、東ソー（株）製）を
０．３５ｍｌ／分で流し、検出は市販の反応試薬（デタ
ミナー−ＬＴＣ Ｒ−１及びＬＴＣ Ｒ−２、協和メデ
ィックス（株）製）を反応させて５５０ｎｍの可視吸収
を測定するポストカラム法を用いた。測定結果を表１に
示す。

【００２４】比較のため、市販のゲル（トヨパールＨＷ
−６５）を充填したカラムを用いた以外は上記と同様の
処理を行い、得られた処理血液と元の血液中のＬＤＬ及
びＨＤＬ量を前記同様に測定した。測定結果を表１に示
す。

【００２５】更に、市販の架橋親水性ビニルポリマーゲ
ル（トヨパールＨＷ−６４Ｆ、東ソー（株）製、標準ポ
リエチレンオキサイドでの排除限界分子量は１００００
００、粒子径分布は３０〜６０μｍ、重量平均粒子径は
４３μｍ）の５０ｇについて、上記と同様にポリアクリ
ル酸を反応させ、内径１０ｍｍ、長さ１０ｃｍのガラス
カラムに充填し、前記同様の処理を行った。その結果、
人血液を送液によりカラムの目詰まりが起こり、処理血
液を得ることはできなかった。

【００２６】表１から明らかなように、本発明の方法に
よればＨＤＬ量に重大な影響を与えることなく、血液中
のＬＤＬを除去・減少できることが分かる。

【００２７】実施例 ２ メタクリル酸グリシジル３００ｇ、ジメタクリル酸ジエ
チレングリコール７５ｇ、モノクロルベンゼン７５０ｍ
ｌを１３００ｍｌの０．０１％ポリビニルアルコール水
溶液中で過酸化ベンゾイルを触媒として攪拌しつつ７０
℃で１５時間重合した。得られた微粒子ゲルをジオキサ
ン洗浄し水洗した後、篩にかけて１００μｍから３００
μｍのゲル（以下、ＧＥＬ−Ａとする）を得た。なお、
ＧＥＬ−Ａの重量平均分子量は１９０μｍであった。

【００２８】ジオキサン５ｇにアクリル酸グリシジル２
ｇ、アクリル酸２ｇ及びアゾビスイソブチロニトリルを
０．１ｇを加えて５０℃で１６時間重合してえられた共
重合物と５０ｇのＧＥＬ−Ａを０．１ｍｏｌ／ｌの水酸
化ナトリウム水溶液中で反応させてポリアクリル酸含有
ＧＥＬ−Ａを得た。ポリアクリル酸含有ＧＥＬ−Ａの陽
イオン交換容量は、１．４ｍｅｑ／ｇであった。

【００２９】また、別途ＧＥＬ−Ａの５０ｇを水１００
ｍｌに分散し、３弗化ホウ素・エチルエーテル錯体１ｇ
を加えて２時間反応することでＧＥＬ−Ａのエポキシ基
を開環して水酸基を導入し親水化した親水化ＧＥＬ−Ａ
を得た。この親水化ＧＥＬ−Ａの排除限界分子量は標準
ポリエチレンオキサイドで測定すると５０００００であ
った。

【００３０】ポリアクリル酸含有ゲルＧＥＬ−Ａを内径
１０ｍｍ、長さ１０ｃｍのガラスカラムに充填した。カ
ラムに生理食塩水１０ｍｌを０．２ｍｌ／分で送液した
後、人の血液（全血）２５ｍｌを流速０．２ｍｌ／分で
送液した。

【００３１】送液開始後、１０ｍｌの流出液は生理食塩
水で希釈されているため廃棄し、その後の５ｍｌを処理
血液として得た。得られた処理血液と元の血液中のＬＤ
Ｌ及び高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）量を市販の分析用カ
ラム（ＴＳＫｇｅｌＬｉｐｏｐｒｏｐａｋ、東ソー
（株）製、内径７．５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を用いて液
体クロマトグラフィで測定した。測定は市販の溶離液
（ＴＳＫ ｅｌｕｅｎｔＬＰ−１、東ソー（株）製）を
０．３５ｍｌ／分で流し、検出は市販の反応試薬（デタ
ミナー−ＬＴＣ Ｒ−１及びＬＴＣ Ｒ−２、協和メデ
ィックス（株）製）を反応させて５５０ｎｍの可視吸収
を測定するポストカラム法を用いた。測定結果を表１に
示す。

【００３２】表１から明らかなように、本発明の方法に
よればＨＤＬ量に重大な影響を与えることなく、血液中
のＬＤＬを除去・減少できることが分かる。

【００３３】実施例 ３ ジオキサン１０ｇにスチレンスルホン酸４０ｇとアクリ
ル酸グリシジル２０ｇを加え。アゾビスイソブチロニト
リルを１ｇ加えて重合し共重合物を得た。実施例１で使
用した市販のゲル（トヨパールＨＷ６５）の５０ｇに
０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム５０ｇとエピクロル
ヒドリン５０ｇを加えて６０℃で６時間反応した。更に
先の共重合物を加え、２時間反応した。

【００３４】得られたゲルをジオキサン洗浄、水洗浄し
て、ポリスチレンスルホン酸含有ゲルを得た。得られた
ゲルの陽イオン交換容量は０．０５ｍｅｑ／ｇであっ
た。このゲルを内径５ｍｍ、長さ５ｃｍガラスカラムに
充填し、実施例１と同様の処理を行った。測定結果を表
1 に示す。

【００３５】表１から明らかなように、本発明の方法に
よればＨＤＬ量に重大な影響を与えることなく、血液中
のＬＤＬを除去・減少できることが分かる。

【００３６】実施例 ４ 実施例１で用いた市販のゲル（トヨパールＨＷ６５）の
５０ｇに０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム５０ｇとエ
ピクロルヒドリン５０ｇを加えて６０℃で６時間反応し
た。このゲルを水洗後、２８％アンモニア水を加えて５
０℃で５時間反応し、１ｍｏｌ／ｌ塩酸を加えてから水
洗してアミノ基を導入した。

【００３７】ヘパリン１ｇを２０ｍｌの水に溶解し、ｐ
Ｈを４．５に調整した後、上記のアミノ基含有ゲルに加
えた。これに１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド０．１ｇを加えて２５℃で１６時
間反応した。１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム水溶液、水で
洗浄しヘパリン含有ゲルを得た。このゲルのヘパリン固
定化量はゲル１ｍｌあたり４８ｍｇであった。

【００３８】このゲルを内径１０ｍｍ、長さ１０ｃｍの
ガラスカラムに充填し、実施例１と同様の操作を行っ
た。測定結果を表１に示す。

【００３９】表１から明らかなように、本発明の方法に
よればＨＤＬ量に重大な影響を与えることなく、血液中
のＬＤＬを除去・減少できることが分かる。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【発明の効果】本発明の吸着体は、血液中のＨＤＬ量に
重大な影響を与えることなくＬＤＬやＶＬＤＬを吸着、
除去し、その血液中量を減少することができる。しか
も、除去、減少操作の再には血液を全血のまま供するこ
とが可能である。

【００４２】本発明の除去、減少する方法においても、
血液中のＨＤＬ量に重大な影響を与えることなくＬＤＬ
やＶＬＤＬを除去し、その血液中量を減少することがで
きる。しかも、除去、減少操作の再には血液を血球と血
漿に分離することなく全血のまま供することが可能で、
血球の損失も防止可能ある。このように本発明は、処理
操作に要する時間を短縮するとともに自動化が容易な簡
便な操作を提供するものである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】平均粒子径が１００μｍ以上１０００μｍ
   以下の硬質ポリマーゲルに低密度リポ蛋白質に親和性を
   有するアニオン性高分子を固定してなる低密度リポ蛋白
   質吸着体を用いて血漿と血球を分離せずに血中の低密度
   リポ蛋白質を除去減少する方法。
2. 【請求項２】粒子径が８０μｍ以下の粒子の存在が５％
   以下である硬質ポリマーゲルを用いる請求項１の血中低
   密度リポ蛋白質除去方法。
3. 【請求項３】排除限界分子が標準ポリエチレンオキサイ
   ドを用いた測定で３０万以上２０００万以下である硬質
   ポリマーゲルを用いる請求項２の血中低密度リポ蛋白質
   除去方法。
4. 【請求項４】合成高分子からなる硬質ポリマーゲルを用
   いる請求項１の血中低密度リポ蛋白質除去方法。
5. 【請求項５】アニオン性高分子がアニオン性合成高分子
   又は硫酸化多糖である請求項１の血中低密度リポ蛋白質
   除去方法。
6. 【請求項６】平均粒子径が１００μｍ以上１０００μｍ
   以下の硬質ポリマーゲルに低密度リポ蛋白質に親和性を
   有するアニオン性高分子を固定してなる低密度リポ蛋白
   質吸着体。
7. 【請求項７】粒子径が８０μｍ以下の粒子の存在が５％
   以下である硬質ポリマーゲルである請求項６の低密度リ
   ポ蛋白質吸着体。
8. 【請求項８】排除限界分子が標準ポリエチレンオキサイ
   ドを用いた測定で３０万以上２０００万以下である硬質
   ポリマーゲルである請求項６のを用いる請求項２の低密
   度リポ蛋白質吸着体。
9. 【請求項９】合成高分子からなる硬質ポリマーゲルであ
   る請求項６の低密度リポ蛋白質吸着体。
10. 【請求項１０】アニオン性高分子がアニオン性合成高分
    子又は硫酸化多糖である請求項６の低密度リポ蛋白質吸
    着体。