JPH05200111A - リポ蛋白除去装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ａ）血漿分離手段と、ｂ）血漿分離手段から
送られてくる血漿の流入口とリポ蛋白吸着除去後の血漿
の流出口とを有し、球状蛋白質の排除限界分子量が１０
０万以上１億以下のポーラスポリマーハードゲルにリポ
蛋白と親和性を有するポリアニオン化合物を固定してな
る吸着体を充填したカラムとから構成される血漿からの
リポ蛋白除去装置。 【効果】 優れたリポ蛋白除去能力を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液中の有害成分の除
去装置、さらに詳しくは、血液より分離された血漿から
リポ蛋白、特に低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）および／また
は極低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を選択的に吸着除去す
るリポ蛋白除去装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中に存在するリポ蛋白のうちＬＤＬ
はコレステロールを多く含み、動脈硬化の原因となるこ
とが知られている。とりわけ家族性高脂血症等の高コレ
ステロール症では正常値の数倍のＬＤＬ値を示し、冠動
脈の硬化等をひきおこす。この治療のため、血中のＬＤ
Ｌの低下を目的として食事療法、プロブコール、コレス
チラミン等の薬物療法が行なわれているが効果に限界が
あり、副作用も懸念されている。特に家族性高脂血症に
対しては患者の血漿を分離した後、正常血漿あるいはア
ルブミン等を成分とする補液と交換する、いわゆる血漿
交換療法が現在のところほぼ唯一の効果的な治療法であ
る。しかしながら、周知の如く血漿交換療法は、（１）
高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用いる必要がある、
（２）肝炎ビールス等の感染のおそれがある、（３）有
害成分のみでなく有用成分も同時に除去してしまう等の
欠点を有する。

【０００３】これらの欠点を解消する目的で膜による有
害成分の除去が試みられているが、選択性の点で満足で
きるものはいまだ得られていない。また、同じ目的で抗
原、抗体等を固定した、いわゆる免疫吸着体を用いる試
みがなされており、これは選択性の点ではほぼ満足でき
るものの、用いる抗原、抗体の入手が困難かつ高価であ
るという致命的な欠点を有する。

【０００４】さらには、有害成分に親和性を有する化合
物（いわゆるリガンド）を固定した、いわゆるアフィニ
ティークロマトグラフの原理による吸着体も試みられて
いる。これに用いるリガンドは比較的安価で、選択性も
比較的よく好都合であるが、担体にアガロースに代表さ
れるソフトゲルを用いるため、カラムに充填した場合に
十分な流量を得るのが困難であった。すなわち近年発達
した体外循環回路を用いた血液、血漿かん流療法（いわ
ゆるプラズマフェレーシス等）にこれらの吸着体を用い
ようとすれば、高流量を得るためにカラム形状に特別の
工夫を要し、またしばしば詰まりを生ずるため予備のカ
ラムを用意しておく必要があるなど問題点が多く、安定
して治療を行える状況には到っていない。吸着体の流れ
特性を向上させるためには機械強度の大きい担体を用い
ればよいのは明白であるが、これらの担体を用いるとア
ガロース等のソフトゲルに比べて吸着能力が低下するこ
とが知られている。

【０００５】一方、硫酸化多糖等のポリアニオン化合物
がリポ蛋白と親和性をもち、金属イオンの共存下で沈澱
を形成することが知られており〔例えばM.Burnstein an
d H.R.Scholnic.Adv.in Lipid,Res.,11,67(1973)〕、臨
床分析等に用いられている。しかしながらこの方法で患
者の血中からＬＤＬを除去しようとすれば、処理しよう
とする血漿に対し少なくとも０．０５％のポリアニオン
化合物および０．０２Ｍ以上の金属イオンを添加しなけ
ればならず、また生じた沈澱を遠心分離等の方法で分離
する必要が生じ、操作が煩雑で危険性が高く、事実上適
用不可能であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価で流れ
特性がよく、かつソフトゲルを担体に用いた場合に比し
吸着能力が低下しない、除去能力に優れたリポ蛋白吸着
体を得、これを充填したカラムからなる血漿からのリポ
蛋白除去装置を提供するものである

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、特定のポーラスポリマーハードゲルを用い、これ
にリポ蛋白と親和性を有するポリアニオン化合物を固定
してなる吸着体をカラムに充填してなる装置により上記
課題が解決される事を見出し、本発明を完成した。すな
わち本発明は、ａ）血漿分離手段と、ｂ）血漿分離手段
から送られてくる血漿の流入口とリポ蛋白吸着除去後の
血漿の流出口とを有し、球状蛋白質の排除限界分子量が
１００万以上１億以下のポーラスポリマーハードゲルに
リポ蛋白と親和性を有するポリアニオン化合物を固定し
てなる吸着体を充填したカラムとから構成される血漿か
らのリポ蛋白除去装置を要旨とする。

【０００８】以下詳細に本発明を説明する。本発明に用
いるに適した吸着体の担体は、（１）耐圧性であるこ
と、（２）比較的大きな径の細孔を有することが必要で
あり、ポリマーハードゲルは本発明に最も適した担体で
ある。ここでいうハードゲルとは、デキストラン、アガ
ロース、アクリルアミド等のソフトゲルに比べ溶媒によ
る膨潤が少なく、また圧力により変形しにくいゲルのこ
とをいう。ハードゲルとソフトゲルは次の方法により区
別することができる。すなわち後記参考例に示したごと
くゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性液体を流し
た際の圧力損失と流量の関係が、ハードゲルではほぼ直
線となるのに対し、ソフトゲルでは圧力がある点を越え
るとゲルが変形し圧密化して流量が増加しなくなる。本
発明では後記参考例に示したカラムを用いた場合、少な
くとも０．３kg/cm²まで上記直線関係のあるものをハー
ドゲルと称する。

【０００９】次に要求される性質は、比較的大きな径の
細孔を有することである。すなわちＬＤＬは分子量が少
なくとも１００万以上といわれる巨大分子であり、これ
を吸着除去するためにはＬＤＬが細孔内に侵入できるこ
とが必要である。次にＬＤＬが細孔内に侵入できても、
細孔内に侵入する確立がある程度大きくなければ吸着体
としての性能は低い、即ち移動相と固定相（細孔内）間
の分配比（固定相の濃度／移動相の濃度）が大きいほど
好ましいと考えられる。従って細孔径が大きいほど有利
と思われる。細孔径の測定法には種々あり、水銀圧入法
が最もよく用いられているが、ポリマーハードゲルの場
合には適用できないことがある。従って細孔径の目安と
して排除限界分子量を用いるのが適当である。排除限界
分子量とは成書（例えば波多野博行、花井俊彦著、実験
高速液体クロマトグラフィー、化学同人）等に述べられ
ているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細
孔内に侵入できない（排除される）分子のうち最も小さ
い分子量をもつものの分子量をいう。

【００１０】現象的には、排除限界分子量以上の分子は
移動相体積Ｖo 近傍に溶出されることから、種々の分子
量の化合物を用いて溶出体積との関係を調べれば排除限
界分子量を求めることができる。排除限界分子量は対象
とする化合物の種類により異なることが知られており、
一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチレングリコ
ール等についてよく調べられているが、リポ蛋白につい
ては殆ど調べられていない。従って最も類似している球
状蛋白質（ビールスを含む）を用いて得られた値を用い
るのが適当である。排除限界の異なる種々の担体を用い
て検討した結果、予想に反し排除限界分子量がＬＤＬの
分子量より小さい１００万程度のものである程度のＬＤ
Ｌ吸着能を示し、また細孔径の大きいもの程能力が大き
いわけではなく、むしろＬＤＬ以外の蛋白が除去される
ことから最適な細孔径の範囲が存在することが明らかに
なった。すなわち１００万未満の排除限界分子量をもつ
担体を用いた場合はＬＤＬの除去量は小さく実用に耐え
ないが、排除限界分子量が１００万ないし数百万とＬＤ
Ｌの分子量に近い担体でも、ある程度実用に供し得る吸
着体が得られる。

【００１１】一方排除限界分子量とＬＤＬの吸着量、お
よびＬＤＬ以外の蛋白質の吸着（いわゆる非特異吸着）
との関係を調べると、排除限界分子量が大きくなるにつ
れＬＤＬの吸着量が増加するが、この増加は排除限界が
１０００万を越えると頭打ちとなり、一方ＬＤＬ以外の
蛋白、例えばＬＧＧ、ＩＧＭ等の吸着が目立つようにな
ることがわかった。さらに排除限界分子量が１億を越え
るとリガンドの固定化量が減少して結果的にＬＤＬの吸
着量が減り、非特異吸着が無視できなくなる。従って本
発明に用いる担体の好ましい排除限界分子量は１００万
以上１億以下であり、最も好ましくは３００万以上７０
００万以下である。

【００１２】次に担体の多孔構造については表面多孔性
よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上であ
ることが好ましい。担体の形状は、粒状、繊維状、膜
状、ホローファイバー状等任意の形状を選ぶことができ
る。粒子状の担体を用いる場合、その粒子径は１μ以上
５０００μ以下であることが望ましい。さらに担体表面
には固定化反応に用い得る官能基あるいは容易に活性化
し得る官能基が存在していると好都合である。これらの
官能基の代表例としては、アミノ基、カルボキシル基、
ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物基、サクシニル
イミド基、塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポキシ
基等があげられる。

【００１３】本発明に適したポリマーハードゲルの代表
例としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、架
橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋
されたビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、架橋
されたスチレン−無水マレイン酸共重合体、架橋ポリア
ミド等の合成高分子の硬質多孔体、およびこれらの表面
に多糖類、合成高分子等をコーティングしたもの等があ
げられるが、これらに限定されるわけではない。これら
のポリマーハードゲルは単独で用いてもよいし２種類以
上混合してもよい。

【００１４】本発明に用いるに適したリポ蛋白と親和性
を有するポリアニオン化合物の代表例としては、デキス
トラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ
硫酸、ヘパラン酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キ
シラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫
酸、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アル
ギン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、
カラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、
ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メベサ
ルフェート等の硫酸化多糖、リンタングステン酸、ポリ
硫酸化アネトール、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリ
ン酸等があげられる。最も好ましい例としては、デキス
トラン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸があげられる。

【００１５】リポ蛋白と親和性を有する化合物（リガン
ド）を担体に固定する方法としては既知の種々の方法を
用いることができる。すなわち物理的吸着法、イオン結
合法、共有結合法等である。本発明に用いる吸着体は、
滅菌時等にリガンドが脱離しないことが重要であるので
結合の強固な共有結合法が望ましく、イオン結合法を用
いるにしてもリガンドを共有結合的に架橋にしておくこ
とが望ましい。また必要によりスペーサーを担体とリガ
ンドの間に導入してもよい。リガンドの固定化量につい
ては、リガンドの性状、活性により異なるが、有意のリ
ポ蛋白吸着量を得るにはカラム体積１mlあたり０．０２
mg以上が好ましく、また経済性を考慮すると１００mg以
下が望ましい。さらに好ましくはカラム体積１mlあたり
０．５mg以上２０mg以下である。

【００１６】上記の如くして得られた吸着体は、一方に
血漿分離手段から送られてくる血漿の流入口と他方にリ
ポ蛋白吸着除去後の血漿の流出口とを備えたカラム内に
充填される。血漿分離手段としては特に制限はなく、公
知の分離手段が用いられる。本発明の装置を用いてリポ
蛋白を除去するには、先ず血漿分離手段により血液から
血漿を連続的に分離した後、該血漿を流入口から吸着体
の充填されたカラム内に導入し、そこで血漿中のリポ蛋
白を選択的に吸着除去した後、流出口よりカラム外に排
出する。本発明の装置を用いてＬＤＬを除去する際、処
理しようとする血漿に多価金属イオンを添加することに
より除去効率、選択性を向上させることが可能である。
この目的に用いる多価金属イオンとしては、カルシウ
ム、マグネシウム、バリウム、ストロンチウム等のアル
カリ土類金属イオン、アルミニウム等のII属元素イオ
ン、マンガン等のVII 属元素イオン、コバルト等のVIII
属元素イオン等があげられる。

【００１７】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。 参考例 両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円
筒カラム（内径９mm、カラム長１５０mm）に、ソフトゲ
ルとしてアガロースゲル（Biorad社製Biogel A5m、粒径
５０〜１００メッシュ）、ポリマーハードゲルとして東
ソー株式会社製トヨパールHW65（粒径５０〜１００μ
ｍ）を、それぞれ均一に充填し、ペリスタティックポン
プにより水を流し、流量と圧力損失の関係を求めた。結
果を図１に示す。図１は、ポリマーハードゲルの場合は
圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、ア
ガロースゲルの場合は圧密化を引き起し圧力を増加させ
ても流量が増加しないことを示している。

【００１８】実施例１〜６、比較例１ （１）吸着体Ａ〜Ｇの製造 吸着体Ａ：架橋アクリレートゲル（全多孔性のハードゲ
ル）であるトヨパールHW55〔球状蛋白質の排除限界分子
量（以下、蛋白質の排除限界と略称する）700,000 、粒
径５０〜１００μｍ〕１０mlに飽和ＮａＯＨ水溶液６m
l、エピクロルヒドリン１５mlを加え攪拌しながら５０
℃で２時間反応しエポキシ化ゲルを得た。このゲルに濃
アンモニア水２０mlを加え５０℃で２時間攪拌しアミノ
基を導入した。得られたエポキシ化ゲル２mlに０．５ｇ
のデキストラン硫酸ナトリウムを含む水溶液２mlを加え
pHを１２に調整した。この混合液を４０℃に保ち１８時
間反応させた後、ゲルを濾別し、２モル食塩水溶液、
０．５モル食塩水溶液、次いで水で洗浄した。未反応の
エポキシ基をモノエタノールアミンと反応させることに
よりブロックし、デキストラン硫酸ナトリウムが固定さ
れたゲルを得た。固定化量は１．６mg／mlであった。

【００１９】吸着体Ｂ：架橋アクリレートゲル（全多孔
性のハードゲル）であるトヨパールHW60（蛋白質の排除
限界1,000,000 、粒径５０〜１００μｍ）１０mlに飽和
ＮａＯＨ水溶液６ml、エピクロルヒドリン１５mlを加え
攪拌しながら５０℃で２時間反応しエポキシ化ゲルを得
た。このゲルに濃アンモニア水２０mlを加え５０℃で２
時間攪拌しアミノ基を導入した。得られたエポキシ化ゲ
ル２mlに０．５ｇのデキストラン硫酸ナトリウムを含む
水溶液２mlを加えpHを１２に調整した。この混合液を４
０℃に保ち１８時間反応させた後、ゲルを濾別し、２モ
ル食塩水溶液、０．５モル食塩水溶液、次いで水で洗浄
した。未反応のエポキシ基をモノエタノールアミンと反
応させることによりブロックし、デキストラン硫酸ナト
リウムが固定されたゲルを得た。固定化量は１．０mg／
mlであった。

【００２０】吸着体Ｃ：架橋アクリレートゲル（全多孔
性のハードゲル）であるトヨパールHW65（蛋白質の排除
限界 5,000,000、粒径５０〜１００μｍ）１０mlに飽和
ＮａＯＨ水溶液６ml、エピクロルヒドリン１５mlを加え
攪拌しながら５０℃で２時間反応しエポキシ化ゲルを得
た。このゲルに濃アンモニア水２０mlを加え５０℃で２
時間攪拌しアミノ基を導入した。次いでコンドロイチン
ポリ硫酸２００mgを１０mlの水に溶解しpHを４．５に調
整した後、これに３mlの上記アミノ基含有ゲルを加え
た。これに１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド２００mgをpHを４．５に保ちなが
ら添加し４℃で２４時間振とうした。反応終了後、２モ
ル食塩水溶液、０．５モル食塩水溶液、次いで水で洗浄
しコンドロイチンポリ硫酸固定化トヨパールゲルHW65を
得た。固定化量は１．２mg／mlであった。

【００２１】吸着体Ｄ：全多孔性セルロースハードゲル
であるセルロファインＡ−３（チッソ株式会社製、蛋白
質の排除限界50,000,000、粒径４５〜１０５μｍ，）を
フィルター上で吸引し水分を減少させた後、その１０ｇ
をとり、これに２０％ＮａＯＨ４ｇとヘプタン１２ｇ、
さらにノニオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ２０を１滴加え
４０℃で２時間攪拌した。これにエピクロルヒドリン５
ｇを加え４０℃でさらに２時間攪拌した。反応終了後上
澄みを廃棄し、ゲルを水洗いしてエポキシ化されたゲル
を得た。得られたゲル２mlに０．５ｇのデキストラン硫
酸ナトリウムを含む水溶液２mlを加えpHを１２に調整し
た。この混合液を４０℃に保ち１８時間反応させた後、
ゲルを濾別し、２モル食塩水溶液、０．５モル食塩水溶
液、次いで水で洗浄した。未反応のエポキシ基をモノエ
タノールアミンと反応させることによりブロックし、デ
キストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルを得た。固
定化量は１．５mg／mlであった。

【００２２】吸着体Ｅ：全多孔性セルロースハードゲル
であるセルロファインＡ−３（蛋白質の排除限界50,00
0,000、粒径４５〜１０５μｍ，）をフィルター上で吸
引し水分を減少させた後、その１０ｇをとり、これに２
０％ＮａＯＨ４ｇとヘプタン１２ｇ、さらにノニオン性
界面活性剤ＴＷＥＥＮ２０を１滴加え４０℃で２時間攪
拌した。これにエピクロルヒドリン５ｇを加え４０℃で
さらに２時間攪拌した。反応終了後上澄みを廃棄し、ゲ
ルを水洗いしてエポキシ化されたゲルを得た。得られた
エポキシ化ゲルに濃アンモニア水１５mlを加え４０℃で
１．５時間攪拌した後ゲルを濾別、水洗いしてアミノ基
が導入されたゲルを得た。次にポリビニルアルコール硫
酸２００mgを１０mlの水に溶解しpHを４．５に調整した
後、これに３mlの上記アミノ基含有ゲルを加えた。これ
に１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カル
ボジイミド２００mgをpHを４．５に保ちながら添加し４
℃で２４時間振とうした。反応終了後、２モル食塩水溶
液、０．５モル食塩水溶液、次いで水で洗浄しポリビニ
ルアルコール硫酸固定化ゲルを得た。固定化量は１．５
mg／mlであった。

【００２３】吸着体Ｆ：フィルター上で吸引し水分を減
少させたセルロファインＡ−３を５ｇはかりとり、これ
に１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル２．５
mlさらに０．１ＮのＮａＯＨ水溶液７．５mlを加え攪拌
しながら室温で１８時間反応させ、ゲルにエポキシ基を
導入した。得られたエポキシ化ゲル２mlに０．５ｇのデ
キストラン硫酸ナトリウムを含む水溶液２mlを加えpHを
１２に調整した。この混合液を４０℃に保ち１８時間反
応させた後、ゲルを濾別し、２モル食塩水溶液、０．５
モル食塩水溶液、次いで水で洗浄した。未反応のエポキ
シ基をモノエタノールアミンと反応させることによりブ
ロックし、デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲ
ルを得た。固定化量は１．８mg／mlであった。

【００２４】吸着体Ｇ：トヨパールHW65１０mlに飽和Ｎ
ａＯＨ水溶液６ml、エピクロルヒドリン１５mlを加え攪
拌しながら５０℃で２時間反応しエポキシ化ゲルを得
た。得られたエポキシ化ゲル２mlに０．５ｇのデキスト
ラン硫酸ナトリウムを含む水溶液２mlを加えpHを１２に
調整した。この混合液を４０℃に保ち１８時間反応させ
た後、ゲルを濾別し、２モル食塩水溶液、０．５モル食
塩水溶液、次いで水で洗浄した。未反応のエポキシ基を
モノエタノールアミンと反応させることによりブロック
し、デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルを得
た。固定化量は１．２mg／mlであった。

【００２５】（２）装置の作成及びリポ蛋白の除去 上記（１）で得られた吸着体Ａ〜Ｇをそれぞれ内径９m
m、長さ４７mmのカラムに均一に充填し、カラムの一方
の血漿流入口に血漿分離手段を接続してリポ蛋白除去装
置を作成した。これらの装置を用い、ヒト血漿１８mlを
０．３ml／分の速度で流し血漿中のリポ蛋白を吸着除去
した。カラムより流出した血漿中のリポ蛋白濃度および
蛋白濃度を測定し、元の血漿中の濃度との比較によりそ
れぞれの除去率を求めた。結果を表１に示す。尚、表中
の蛋白の除去率については、リポ蛋白の除去による蛋白
濃度の減少は除外して示した。

【００２６】

【表１】 註）ＶＬＤＬ：極低密度リポ蛋白 ＬＤＬ：低密度リポ蛋白 ＨＤＬ：高密度リポ蛋白

【００２７】

【発明の効果】叙上の通り、本発明の装置は安価で流れ
特性がよく、ソフトゲルを担体に用いた場合に比べてリ
ポ蛋白の吸着除去能力に優れている。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例のソフトゲル「Biogel A5m」及びポリマ
ーハードゲル「トヨパールHW65」を用いた場合の流速と
圧力損失との関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）血漿分離手段と、ｂ）血漿分離手段
   から送られてくる血漿の流入口とリポ蛋白吸着除去後の
   血漿の流出口とを有し、球状蛋白質の排除限界分子量が
   １００万以上１億以下のポーラスポリマーハードゲルに
   リポ蛋白と親和性を有するポリアニオン化合物を固定し
   てなる吸着体を充填したカラムとから構成される血漿か
   らのリポ蛋白除去装置。