JPS58501703A

JPS58501703A - 微生物鑑別方法及び微生物鑑別試剤の組み合わせ

Info

Publication number: JPS58501703A
Application number: JP57502956A
Authority: JP
Inventors: ランキ・ツウラ・マリユ−ト; セ−デルンド・ハンス・エリツク
Original assignee: オリオン−イチメ・オイ
Priority date: 1981-10-16
Filing date: 1982-09-29
Publication date: 1983-10-13
Also published as: ATE31735T1; AU548854B2; CA1192120A; RO86356A; US4486539A; EP0079139A1; JPH0632637B2; JPH0632637B1; DE79139T1; FI63596C; EP0098267A1; DK275183A; US4563419A; EP0079139B1; RO86356B; HU196242B; WO1983001459A1; AU8957582A; DK173744B1; SU1386031A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

微生物を鑑別するだめの方法及び試剤の組合せ本発明は、固体担体に核酸をサンドウィッチ状に交雑することを主体とした微生物の鑑別方法、及びその方法に用いられる試剤の組合せに関する。従来からある微生物の鑑別においては、所定のサンプル中における微生物の存在は問題の微生物を単離することにより立証される。増菌培養後に、微生物；ｄその生化学的特性を基礎として又は免疫学的方法を用いて同定される。このタイプの鑑別においては、サンプル中の微生物が生育しうろことが必要である。その上、単離による同定は手間の多い方法であし、ビールスの場合には４−６週間を必要上する。本発明の目的は、サンプル中の微生物の存在が感応性でかつ特異性の核酸の交雑技術を用いて得られる遺伝物質即ち核酸を同定することにより立証される鑑別方法を提供することである。核酸の交雑は、それ自身核酸の同定を調査するため“ め古いかつ良く知られた方法である。補足性の核酸線維は、ベース対合の規則に従って緊密な２重線維構造を形成する能力を有し、その結果得られる雑種は残留する単線維の核１酸から分離されうる。核酸の同定に基づくいくつかの方法は、既に微生物の鑑別に利用されてきた。腸性毒素発生の大腸菌（Ｅｓｃｈθｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　）は、毒素製造のだめの遺伝子を探針として用いる集落交雑により糞サンプルから同定された。陽性交雑（は、放射能写真によシ立証される（　Ｍｏ５ｅｌｅｙ　、Ｓ、Ｌ、外、Ｊ、工ｎ　ｆ　ｅ　Ｃｉ：　、　ＤＩ　Ｓ。（１９８０）１４２，８９２−８９８）。集落交雑）ま、グルンシュタインとホグネスにより元々は開発された方法に基づいている（　Ｐｒ０ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７５）　７２．３９６ｌ−３９６５）。また交雑は、単純庖疹ウィルスのタイプ１とタイプ２とを鑑別する方法として用いられた（　Ｂｒａｕｔｉｇａｍ、Ａ、Ｒ，外、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ。Ｍｉｃｒｏ’ｂｉｏｌ　（１９８０）１２，２２６−２３４）。しかしながらこの方法では、早い鑑別が不可能であり、増菌培養した後にウィルス型が判定された。そしてこの方法においては、２重線維の雑種は、親和クロマトグラフィにより溶液中で単線維の捷まに残る核酸の成分から分離される。最近、エプスタイン−パルウィルス（サンプル）で感染された細胞からのＤＮＡが適当な予備処理の後にフィルターの上に直接固定されるということが発表された。開現の核酸は放射性の探針でフィルターを交雑することにより同定され、また陽性交雑は放射能写真により検出される（　ＢｒａｎｄＢｍａ、１．＆上記した方法と連化の方法は、西ドイツ特許第２，９５０，２９５号明細書、及びＬａｎｃｅｔ　Ｏｃｔ、　１０　、１９８２　、　ｐｐ、　７６５−７６７に記載されている。西ドイツ特許第２，９５０，２９５号明細書中には、Ｄ１払組換え技術により放射性にラベルされたＤＮＡ探針を製造する方法が記載されている。このＤＮＡ探針は肝炎Ｂ型ウィルスからつくられる。Ｌａｎｃｅｔ中には、肝炎Ｂ型ウィルスを検出するための方法にとの探針をオリ用することが記載されている。この方法においては、サンプルから得られるＤＮＡはニトロセへロースフィルターに移され、固定されたサンプルからの肝炎ＤＮＡは試剤として探針を用いることにより検出される。２つＯ試剤が用いられるため、我々の方法は上記した方法に較べて非常に特異であり、かつ異なったキットをつくることを可能とさせている。そしてこのことにより、異なった微生物又は微生物グループは各々の問題となる微生物又は微生物グループに対するテストの特異性を阻害することなしに同一のサンプルから検出されうる。本発明による方法においては、２つの異なった核酸フラグメント試剤（１つは固体担体に固着されたものであり、他は適当するラベルで札付けされたものである）が用いられ、サンプルＤＮＡは液体状態にある。ここで記載された発明は、サンドウィッチ交雑技術（Ｄｌ、１ｒ＋＝、。Ａ−、、Ｒ，＆　Ｈａｓｓｅｌｌ、Ｊ、　Ａ、　（１９７７）　Ｃｅｌ工１２．２３−３６）を基礎とするものであり、サンプルの取扱いと交雑の検出を間車なものとしている。このためにこの技術は、鑑別の用途には特に適している。本発明において述べられた方法では、全ての所望の微生物又は微生物グループは、同定される微生物又は微生物グループの変質した単線維の核酸線維を含有する１つの同にサンプルから、サンプルを分けることなしに同定されうる。この方法では、同定される各々の微生物又は微生物グループに対して２つの核酸試剤が必要である。試剤：は同定される微生物のゲノムからつくられる２つの別々の核酸フラグメントであり、共通にはいかなる因果的連鎖ももたず、好捷しく（マゲノム中でお互に接近して位置している。試剤（寸、直接に微生物Ｏゲツムから又は確立されたＤＮＡ組換え技術を用いることによりつくられる。２つの核酸フラグメントのうち、１つは、変質された後に固体担体好ましくはニトロセルロースフィルターに固定される。寸だ単線維形態をした残りの１つは、好捷しいラベルで札付けされる。同定される各々の微生物又は微生物グループに対して２つの異なった試剤、即ち上記の核酸試剤がサンプル中における固定される単線維核酸と接触されると、核酸は固体担体上で補足性の核酸フラグメントにかわる。担体上においてこのようにして形成された交雑は、ラベルされた補組性の核酸フラグメントにかわった後にラベルされだ状態になる。ラベルされた核酸フラグメントは単独では相体に固着された核酸フラグメントに交雑しないが、サンプルから出てくる対応する単線維の核酸のみには交雑する。即ち、サンプルあ・らの補足性核酸が交雑したこれらの担体のみがラベルされた状態になシうる。これらの担体は容易に洗浄され、そのラベルは確立された方法により測定される。本発明による方法は、原則的にはウィルス、バクテリア、菌類及び酵母のような微生物を含有する全てのＤＮＡ−又はＲＮＡを同定するために用いられうる。この方法は、微生物がＤ　Ｎ　Ａ又はＲＮ　Ａ−を含有するかどうかに関係なく、全ての問題となるバクテリア及びウィルスを同時にかつ同一のサンプルから同定することが可能となるという特異な利点をもつ。試剤の好ましい組合せにより、同定される各微生物がラベルされた核酸試剤を具備したそれ自身の固体担体を有するように″キラ）　”　（ｋｉｔｓ　）を開発することが可能となる。試剤組合せ中に含まれる全てのフィルター（寸、ラベルされた核酸試剤と共に同時にサンプルに添加されうる。交雑が行われると、固体担体は洗浄され、それらのラベリングは測定される。ラベルされた状態となる唯一の担体は、調査されたサンプル中の微生物ゲノムに対して桶川性である因果的連鎖を含有するものである。方法と試剤の組合せは、例えば医薬的微生物学、獣医的微生物学、食品衛生学の調査において、また植物疾病の微生物的鑑別において用いられる。適当なサンプル物質は、例えば血液、糞及び鼻粘液、尿道粘液のような全ての動物・植物の組織均等質、患者の分ｌ、物である。この方法は、臨床的サンプル中に普通に存在する微生物のレベルを検出するのに十分な程に鋭敏であるということが評価されうる。勿論、同定テストの前にサンプル中に存在する微生物を培養により予備的に増菌することは可能であり、いくつかの場合には必要となるだろう。またこの方法は、微生物がもはや培養されえないが鎧なりの量の微生物の汚物を含有する（例えば抗生物質処理を開始した後に　）ようなサンプルの調査に対して、又は微生物の培養が特に手間どりかつ困難である（例えば嫌気菌により生じる感染の場合に化膿性サンプル中に多数存在するような嫌気性のバクテリア）場合に適する。この方法は、次の試剤の組合せ、″キット”の形態で採用されるが、勿論その一部は別々にも使用されうる。呼吸感染ａ）バクテリア：β一連鎖球％（Ａ−グループ）インフルエンザ菌（Ｈａ、ｅｍｏｐｈｉｌｕＳｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）　％肺炎球菌、マイコプラスマニュモニア（ＭｙｃＯｐｌａ、ｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ、ａｅ　）、マイコバクテリアｂ）　ウィルス：インフルエンザＡ１　インフルエンザＢ１　パラインフルエンザ１−３、呼吸性ンンシテアルウィルス、アデノウィルス、コロナウィルス、ソノウィルス下　痢ａ）バクテリア：サルモネラ、シゲラ、エルジニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｊ、ａ　ｅｎｔｅｒｏｃ○１ｉｔｉｃａ　）　、腸性毒素発生の大腸菌、クロストリジウムジフィシル（Ｃ１○ｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　）　、カンピロバクテリアｂ）ウィルス：ロタウィルス、パルボウィルス、アデノウィルス、腸内ウィルス性　病ａ）バクテリア：淋菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）、梅毒トレポネー？　（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ　）　、クラミジア　トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｊ、ａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　）ｂ）　ウイルス：ヘルペクス単性ウィルスＣ）酵母：カンジダアルビカン、ニア、　（Ｃ！ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）ｄ）原虫類：腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　Ｖａｇｉｎａｌｉ８　）ａ）バクテリア：β一連鎖球菌（Ａ− グループ）、肺炎球菌、単一グループとしての腸性バクテリアａ）バクテリア：サルモネラ、ウエルチ菌（Ａ型）　（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｊｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　）試剤の選択に依存するが、テストの特異性は、共通の遺伝子の領域から同定試剤を選択することにより、限られた微生物の属（例えばサルモネラス）又は全体の微生物の群（例えば腸性バクテリア）に限定さｆうる。本発明において記載されたサンドウィッチ交雑技術に必要な核酸試剤は、ＤＮＡ組換え技術によりつくられる。試剤の製造とテストの操作は、実施例１に記載されている。試剤アデノウィルス２型（ＫＴＬ、例えばヘルシンキの国立公衆健康協会に菌株寄託されている）が培養され、純化された後に、Ｄ　Ｎ　Ａが単離された（　Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ　、　Ｕ　＆　ＳａｍｂｒｏＯｋ　、　Ｊ　（１９７３）Ｊ、ＭＯ］、Ｂ１０１．７５．１２５−１５０）（以下、単にＡｄ２−ＤＮＡとい゛う）。ＤＮＡは、４つの再生可能なフラグメントに分断するＢａｍＨニー拘束酵素（ＢＲＬ即ちペセスダ調査研究所）で消化された。４つのフラグメントのうち２つは、Ｔ４−リガ−ゼ（ＢＲＬ）の助けをかりてベクトルプラスミドｐＢＲ３２２（ＢＲＬ）のＢａｍＨニーサイトに挿入された（フラグメントはリゲーションの前に分離されなかったが、プラスミドに添加された挿入体はクローニングの後にのみ各々同定された）。その後、バクテリアの宿主（大腸菌ＨＢ１０１　（Ｋ　１２　）　ｇａｌ　、　ｐｒｏ−，１ｅｕ−。ｈｒｓ、−、ｈｒｍ−、ｒｅｃＡ、　５ｔｒｒ、　Ｆ−）　（ＫＴＬから入手）は、組換えプラスミドから構成されたプラスミドＤＮＡ、即ちアデノウィルス− ＤＮＡのフラグメントを受入れた分子で変形された２１１［］−２１１４）。変形されたバクテリアのクローンのうち、組換えプラスミドが最も確実に含まれるように選択された。アンピシリンとテトラサイクリン抗体遺伝子がｐＢＲ３２２−プラスミドによりバクテリウムに移植される（　Ｂｏｌｉｖａｒ　Ｆ、他（１９７７）ｏｅｎｅ　２．９５−１１３）。しかし組換えプラスミドを含有するバクテリアは、ＢａｍＨＩ−拘束サイトがテトラサイクリン遺伝子の内部にあり、この領域中に挿入する外来のＤＮ　Ａが遺伝子を破壊するために、テトラサイクリンに鋭敏である。プラスミドの挿入体は、プラスミドの増菌の後に、ＢａｍＨ工消化の後における拘束フラグメントの大きさをアガロースゲルの電気泳動を利用して決定することにより特徴づけられた。　Ａｄ２−ＤＮＡの隣接するＢａ翻ＩＤ−とＣ−フラグメント（ｃｆ、遺伝子マツプ）は、試剤として選択された（　Ｓ６’ｄｅｒｌｕｎｄ。Ｎ０他、（１９７６）Ｃｅｌｌ　７，５８５−５９３）。所望の組換えプラスミ　ド、Ａｄ２Ｃ−ｐＢＲ３２２、ＫＴＬ　扁Ｅ　２６１とＡｄ２Ｄ−ｐＢＲ３２２。ＫＴＴ、ＡＥＨ２３０は、文献に記載されたように培養され、純化すれた（　Ｃｌｅｗｅｌｌ　、　Ｄ、　Ｂ、　＆　Ｈｅ１ｉｎｅｋｉ　、　Ｄ、　Ｒ，（１９６９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６２．　１１５９ −１１６６　）。祖換えグラスミドＡｄ２Ｄ−ｐＢＲ３２２はフィルター試剤として用いら′Ｆｌだ。廿ノプルがｐＢＲ３２２−因泉的連鎖を含有しないために、グラスミド因果的連鎖を取り除くことは本方法においては不必要でちる。しかしながら放射性にラベリングするためて、核酸はＢａｍＨＩ消化の後にアガロースゲルの電気泳動によりｐＢＲ３２２−Ｄ　Ｎ　Ａ　から分離された。、Ｃ−フラグメントは、フェノール抽出又は電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅ１ｕｔコ。ｎ）によシＬＧＴ− アガ０−ス（Ｍａｒｉｒ＋ｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　、　Ｉｎｃ、）から単離され（Ｖｔ’１ｅｓｌａｎｄ、ｅｒ　、Ｌ、（１９７９）Ａｎａｌ、Ｂｊ、ｏｃｈｅｍ、９８　．３０５−３ｏ９）、エタノール沈澱化により濃縮された。残留のプラスミド連鎖のフィルターとの直接的な交雑によりもたらされる交雑の素地がラベルされた核酸試剤を汚染することをさけるためには、別々のベクトルにラベリングするために選択された核酸フラグメントを分けることが特に好都合である。ＢａｍＨニー消化により得られたＤＮＡフラグメントが容易に移転することのできＺ単線維のＤＮＡ−ファージＭ　１５ｍｐ　７　（ＢＲＬ）が最適のベクトルとして用いられる（Ｍｓｓｓｉｎｇ組換えプラスミドＡａ２Ｄ−ｐＢＲ３２２は単線維形態に変質され、不規則に０，２　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（５分、１００　℃）　ノ処理によりイくつカの位置で刻み目をつけられた。その後にＤＮＡは冷却され、フィルターへ移転する直前に、中和され、移転溶液％　４　ｘ　ＳＳＣ媒体／氷（Ｓ　Ｓ　Ｃ−０，１５Ｍ　ＮａＣ／、０．０１５　Ｍクエン酸ナトリウム）にピペットで移された。フィルター（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈ’ｕｌｌＢ　ｆｉ−８５ニトロセルロース）は、ＤＮＡに適用される前に、４ＸＳＳＣ溶液中で完全に湿潤された（約２時間）。ＤＮＡは、溶液を弱い減圧下にフィルターを通じて吸引することにより、稀釈溶液＜　ｏ、ｓ　−１，ｏ　ｇ／ｒＡ）中でフィルターに付着した。フィルターは、　Ｄ１□ＪＡを約ｉａｏμ ｒ２／ａｍ２まで吸収することができる（　Ｋａｆａｔｏｓ　、　Ｆ、　（、他（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７　。１５４１−１５５２　）ｏ　我々は、　０．５　ｐ９　ＤＮＡ／　２．５　（Ｒフィルターの直径と１．０μｇ　ＤＮＡ／　０．７　＠フィルターの直径との間のＤＮＡ濃度を用いた。ＤＮＡ　濾過の後に、フィルターはｄ　ｘ　ＳＳＣ中で洗浄され、室温で乾燥され、最後に真空オーブン中で２時間、８０℃で焼かれる。その後にフィルター上のＤＮＡは安定なものとして残り、フィルターは室温で長期間にわたり保用いられた放射性ラベルは１２５■−アイソトープであった。このアイソトープは大部分の大きな実験室単位において入手可能である、γカウンターを利用して検出することができる。このアイソトープの半減期は６０日であり、そのために１２５■でラベルされた試剤の使用期間は約４ケ月である。 ′“刻み目の転位”（Ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）ラベリングこの方法の原理は、核酸中のヌクレオチドの１つを放射性のもので置換することであり、このことにより全体のＤ　Ｎ　Ａ、分子はラベルされた状態になる。こればＲｉｇｂｙ、　Ｐ、Ｖ／、Ｊ、他により発表された方法（Ｊ、　Ｍｏｂ、　Ｂ１１１．　（１９７７）　１１３．２′５７−２５１）により行われる。この反応において、溶液が＋２５　Ｉでラベルされたデオキシヌクレオシドトリホスペード、この場合には　ニーｄＣＴ　Ｐ（Ｒａｄｉｃｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｅｎｔｒｅ　、　Ａｍｅｒｓｈａｒｒ＋　：　＞１５００　Ｃｉ／ｒｈｍＯ１）を基質として含有する時に、ＤＮＡは放射性的にラベルされた状態になる。最適条件の下では、比活性１０９Ｃｐｍ　／’μｇの一１１１Ａが得られる。ラベルされたＤＩｚＡは、簡単なゲルｉｆ　Ｊにより、例えばＢｉ、ｏＧｅｉ　Ｐ　３０　（ＢｉｏＲａｄ　）を用いて反応混合物中に残存するヌクレオチドからｌｍ−ｆｆ’ｊされる。他のラベリング方法Ｍ１３ｍｐ７−ファージ中でつくられた単続維の核酸試剤は、化学的ヨウ素化によりラベルされる。その際に反応性の１２５工が核酸に共有的に添加される（　Ｃｏ＝：＝ｅｒ、ｆｏｒａ　、　Ｓ、　Ｌ、（１９７１）９１つの方法としては、末端の転移に゛より放射性ヌクレオチドで末端をラベリングすることにより、核酸を放射性にすることができる（　Ｒｏｙｃｎｏｕａｈｕｒｙ　、　Ｒ＆、　Ｖ／ｕ　、　Ｒ，（１９８０）　Ｍｅｔ’ｎ。Ｅｚｚｖｒｒ＋ｏ１．６５　、４３−６２　）。上記した試剤の製造は、遺伝子物質がＤＮＡ０形態をした微生物に関している。ＲＮＡウィルスの場合には、ゲノムフラグメ７１−の分裂（ｃｌｃｎｉｎ（７）は、ウィルスＲＮ　ＡのＤＮＡｒピー（ＣＤＮＡ）が反対のトランスクリフターゼの助けで最初につくられ、次いでＤＮＡ−ポリメラーゼにより第２のＤ　Ｎ　Ａ　！維をコピーし、その後に上記し、たようにＤ　Ｎ　Ａが分裂されるというようにして生じる（　５ａｌｓｅｒ、　Ｖ／、（１９７９）　ｉｒ、　Ｇｅｈｅｔｉｃ　Ｅ＊ｇｉ　−ｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｅｄ、　Ａ、Ｍ、　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ　、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　、　ｐｐ　５３−８１　）。最も好ましい分裂法は、用いられる微生物に応じて選択される。ベクトルのみならず宿主も変わりうる。ベクトルとしてλ−ファージ、他のグラスミド、コスミド、バチルスサブチリスバクテリアにおける分裂等を含有することもできる（Ｒｅ　ＣＯｍ　’Ｏｉ　ｒ、ａ　ｎ　Ｔ、Ｄ　↑ＪＡ　、Ｂｅｒ＋ｃ？、＝ａｒＣｋ　Ｐａｐｅｒｓ　ｉｒ、ｙｉｃｒｃｂ二Ｃ１Ｏｇｙ　。Ｖｏｌ　１　５　、ＥｄＳ、　Ｋ、Ｊ、ＤｅｎｎｌＳｉＯｎ　＆　Ｌ、　Ｗ、　Ｅｒ、ｑｖｌｓｔ、Ｄｏｗｄｅｎ。ＨｕｔｃｈｉｎｓＯｈ　＆　Ｒａ５ｓ、　工ｎｃ、（１９８１）　：　Ｉｓｈ− Ｈｏｒｏｗｉｃｚ　、　Ｄ。調査される微生物の核酸は、微生物自体からまた感染された細胞から取りはずされ、その後に単線維の形態に変質されねばならない。ウィルスゲノムは、サンプル物質を１％のナトリウムドデシルサルフェー）（ｓＤｓ）で処理し、更にゲノムを保護する蛋白質をプロティナーゼに処理（１巧／ｍｌ！　、　３７℃、６０分）で破壊することにより、遊離される。バクテリアのサンプルは、更にリゾチームとＥＤＴＡの処理を用いてこまかく分けられねばならない。サンプルが多量の粘性高分子量の細胞性のＤＮＡを含有する場合には、例えば超音波処理により又は細い針を通して数回サンプルを通過させることにより、サンプルはその粘性を減少させるだめにいくつかの場所で剪断されねばならない。交　雑交雑は、１％のＳＤＳと０゜５ｑ／ｍＪのＤＮＡ、（サケの精子又は子牛の胸腺）を含有する４　ｘ　ＳＳＣＳＣデルト溶液（Ｄｅｎｂａｒｄｔ。６４１−６４６）における５０チホルムアミド（脱イオン化され、−２０℃で保存されている）中で、３７℃かつ１６−２０時間通常は夜通し行われる。テストのために選択されたフィルターは、適当な容器中で培養されており、その中に交雑混合物が添加され、交雑が開始される。交雑混合物には、（ａ）予備処理されたサンプル（これには、５分間沸騰させた後に０℃ですばやく冷却することにより変質された放射性核酸試剤が添加される）；（ｂ）濃縮されたホルムアミド− ，５ＳＣ−、及びデン・・ルト溶液（これは変質され冷却された核酸混合物・１ａ）にペレットで移される）が含まれる。混合の後に、交雑混合物は交雑容器中でフィルターにペレットで移される。交雑の後に、フィルターは注意深く洗浄され、個々にγ−カウンター中でカウントされる。本発明は、次のいくつかの実施例に基づいて明確にされる。照）テストの詳細は、表１までの本文中で明確になる。サンドウィンチ交雑法は、溶液からウィルス−Ｄ　Ｎ　Ａを検出することができるが、ウィルスのゲノムは感染された細胞からも同等にうまく検出されうる。交雑素地は、サンプルなしにフィルターとラベルされた核酸試剤のみを含むチューブ中で測定される。素地はラベルされた核酸試剤中におこるｐＢＲ３２２連鎖により影響される。これらの連鎖は、それを伝達するサンプルなしで直接にフィルターと交雑する。子牛の胸腺を含有し、如何なるＤ’　１．Ｉ　Ａも含有しないフィルターは対照としてテストに用いられる。これは、一方では交雑の特異性を示し、また他方では例えば不十分な洗浄により生じる非特異性の素地のレベルを示す。次の表においては、試剤による素地は、フィルターに交雑されたｃｐｍ−値から差引かれた。１）　Ａｄ２Ｄ−ｐＢＲ３２２−プラスミド、２μｇ２）子牛の胸腺ＤＮＡ　１ ℃ｇ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌ／ｌａｎｈｈｅｉｍ）３）ブランク（ＤＮＡを含まず）ラベルされた核酸試剤：Ａｄ、　−ＢａｍＨＩ　Ｃ−フラグメント、精製済み、比活性９０Ｘ　１０６ｃｐｍ／μｇ　（２００，０００Ｃｐｍ　１２５，１．／反応）５０％のホルムアミド、　４　ｘ　ＳＳＣ，０，５ｍｙ／ｒｎｅのサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａと１係のＳＤＳを含有するデンノ・ルト溶液、３７℃。０．１％の８３０％室温、４０分サンプル：アデノウィルス２型Ｄ１すＡ（ＢＲＬ）アデノウィルス２型による感染はＨｅＬａ−細胞中で起った。次いで細飽け、１％のＳＤＳによる処理、更にｉ　ｍｙ　／ｍｅのプロテイナーゼーＰ

【酵素（シグマ）による５７℃。３０分間の消化により分裂された。変質の前に、サンプルは細い針を通過させられた。表にあられれだ数値１は、試剤の素地を差引くことにより補正された。なお、試剤の素地は、サンプルなして同様な交雑を行うことにより用いられたモデルのＲＮ　Ａ−ウィルスは、セムリキ森林ウィルス（Ｌｏｎ、ｄｏｎ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｈｙｇｉｅｎｅ　ａｎａ　’ｒｒｏｐｉｃａ１Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手されたプロト型の菌株）であった。そのゲノムは草線唯のＲＮ　Ａ−である。型としてウィルスゲノムを用いて、　ｃＤＮＡがつくられた。それは＊　Ｇａ　ｒ　Ｏｆ　５他により記載されたように（ＰｒＯｃ、Ｎａｔｌ、Ａ−Ｃａｄ、ｓｃｉ、（１９８０）ＵＳＡ７７．６３７６−６３８０）ｐＢＲ３２２プラスミドのＰｓｔエサイトに分けられた。このようにして得られた組換えプラスミドはｐＫＴ！：５１Ｚ　ＫＴＬ　＆、　ＥＨ２３２である。ウィルスゲノムから出てくるこのプラスミドの挿入体（ｄ約１４００ヌクレオチド長であり、構成の蛋白質領域、約ヌクレオチド２００からヌクｌ／オチド１６００までである（なお番号付けは構成遺伝子の初めから出発し、でいる）　（ＧａｒＣｆｆ、Ｈ，他１９ｓｏ　）。試剤の製造のために、全体○組換えプラスミドｐＫＴＨ３１２はＥｃｏＲ工拘束酵素（ＢＲＬ）で鎖状化され（セムリキ森林ウィルスからつくられる連鎖ばＥｃｏＲＩ−酵素のだめの認識サイトを含まない）、鎖状化されたプラスミドはｘｈｏｌｘ　−酵素（ＢＲＬ）を用いて２つのフラグメントに切断された。後者の拘束サイトはセムリキ森林ウィルス連鎖で位置された。より大きなＥｃｏＲＩ−ＸｈＯニーフラグメントＡ（約３９００ベース対合）はフィルターに付着し、より小さ々フラグメン）Ｂ（約１８５０ベース対合）は° “刻み目移転″技術を用いて１２５工でラベルされた。遊離のセムリキ森林ウィルスとウィルス感染細胞の両方はこのテストにおいてサンプルとして用いられた。両方の場合において、サンプルのウィルス特異性核酸は全てＲＮＡから構サンドウィッチ交雑法による１）　ｐＫＴＨ３１２プ５　スミＭ　（７）　ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏニー　フラｆ　メｙ　）　Ａ（１，２μｇ）２）子牛の胸腺ＤＮＡ１μｇ５）ブランク（ＤＮＡを含１ず）ラベルされた核酸試剤；プラスミドｐＫＴ耶１２のＥｃｏＲＩ−Ｘｈ、ｏニーフラグメントＢ１比活性９０Ｘ１０６ｃｐｍ／μｇＤＮＡ　（２００，０００ｃｐｍ　１２５工／反応）交雑：表１に記載した通り。洗浄：表１に記載した通シ。セムリキ森林ウィルス（５０μｇ）はテストの前にＳＤＳで分裂された。感染された細胞は表１に記載された通りに取扱われた。セムリキ森林つィルスによる感染は、ＢＨＫ−２１細胞中で行われた。表中に示された数１′直は、サンプルなしの同様な交雑により得られた試剤素地に対して補正された。サンドウィッチ交雑試剤ｄ　、Ｌｅｂｏｗｉｔｚ　＆　ＷｅｉｓｓｍａｒＩにより記載されたように（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　ＭｉｃｒＯｂｉＯｌ、　工ｍｍｕｎｏ１．８７゜４５−１７２　）、Ｐｓｔニー酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　ｆ用いてＤＮＡを２つの部分に切断することにより５Ｖ４０−ウィルスＤＮＡ（ＢＲＬ）からつくられた。フラグメントは単離さオル１アガローゼゲル電気泳動により純化された。フラグメン）Ａ（４０００ベ一ス対合）は刻み目移転により１２５工で放射性的にラベルされ、またフラグメン）　Ｂ　（１２２０ベ一ス対合）はフィルターに付着された。ＤＮＡフラグメントは、その各々が速いメセンジャーと遅いメセンジャーの両者に対してコーディングする領域を含有するように選択された。即ち、フラグメントＢｉｄ、構成蛋白質遺伝子ＶＰｉから約７００のベースを、また速いメセンジャーのために遺伝子から６００以上のベースを含有する。ＳＶ４０ウィルスのＤＮＡはそれ自身で共有的に閉環したリングであるため、鎖状化する前にテストにより検出することが不可能である。しだがって、感染されだ細胞がサンプルとして用いられる場合には、その方法がウィルス性のゲノムのＲＮＡコピーを検出するのにどれ程に適しているかを調べることができる。表３の結果から明らかなように、このテストは感染された細胞の調査（て非常にうまく適している。また表は、同じ試剤がウィルス性ＤＮＡとそれからつくられたｍＲＮＡの両方を調査するのに用いられることを立証している。表　３１）ＰＳｔＩ−拘束酵素で消化された環状５Ｖ４０−ウィルスＤＮＡの短い方のフラグメントＰｓｔ　Ｉ　Ｂ　（０，２μｇ）２）子牛の胸腺ＤＮＡ１μｇ５）ブランク（ＤＮＡを含まず）ラベルされた核酸試剤：５ｖａｏ−ウィルスＤＮＡ−の長い方のＰｓｔ工Ａ−フラグメント、比活性２８　Ｘ　１０６ｃｐｍ／　μｇＤＮＡ　（２００，０００ｃｐｍ　１２５Ｉ／表１に記載の通り、交雑時間は４０時間′でちる。表１に記載の通り。Ｓ　■４　Ｑ−ウィルスＤＮＡ（ＢＲＬ）はＥ　ｃ　ｏ　Ｒ工拘束酵素（ＢＲＬ）により鎖状化された。Ｃ〜Ｔ１−細胞（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＣｅｈｔｒｅ　、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｕｐ＋１ｖｅｒｓｉｔｙ　）　ｔ７１　Ｓ　Ｖ　４０− ウィルス（ＪａｎｉＣｅ　Ｙ、　ｃｈｏｕ　＆　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇ、　Ｍａｒｔｉｎｉ、　ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ　７５＞ら人手）で感染され、細胞はイ惑染後４０時間でかり取られた。サンプルの処理は表１に記載の通りであった。表に示された数値は、サンプルなしで行われた間際な交雑から得られた試剤の素地に対して補正された。試剤は゛、Ｂ、アミロリクエファシェンスＥ　４８　（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｏｆ　Ｆｉｎｌａｎｄ、　ＶＴＴ　）のα−アミラーゼ遺ｆ云子のフラグメントであり、拘束酵素による処理及びその後のアガローゼゲル電気泳動によりこのテストの目的のために組換えプラスミドｐＫＴＨ１０（Ｐａ／ｌｖａ　、工、他（１９８１）　Ｇｅｎｅ、　１５゜４３−５１）から単離された。このテストに、用いられるフラグメントはα−アミラーゼ遺伝子のＣ１ａＩ−ＥｃｏＲＩ　フラグメント領域（４６０ベ一ス対合）　（Ｃ１ａＩ　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ、ｎｎｈｅｉｍ　）とＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（１５００ベ一ス対合）でちった。ＥｃａＲＩ−ＢａｍＨエフラグメントはフィルターに付着され、またＣ１ａＩ− ＥｃａＲＩ　フラグメントは刻み目移転により放射性的に１２５１でラベルされた。表４から明らかなように、サンプル中のＢ、アミロリフエフアノアンスは、単一のα−アミラーゼ遺伝子をもとにしてサンドウィンチ交雑により同定された。大腸菌はとのテストでは否定的な結果を示した（素地から認識不可能であった）。１）プラスミドｐＫＴＨ１０からのα−アミラーゼ遺伝子のＥｃＯＩ’ＳＮ−ＢａｍＨＩフラグメント、０．３５　ｇ２）子牛の′狗腺ＤＮＡ、１μｇ３）ブランク（ＤＮＡを含まず）ラベルされた核酸試剤ニプラスミドｐＫＴＨ１０からのα−アミラーゼ遺伝子のＣ１ａニーＥｃａＲＩフラグメント、比活性３５　Ｘ　１１０６ｃｐ／μｇ（２ｏｏｏ’ｏ。ｃｐｍ　工／反応）交雑：表１に記載の通り洗浄：表１に記載の通りバクテリアのサンプルは３７℃で３０分間リゾチーム（６７ｐｇ／ｍｅ）で処理されたｏ５ｍｌｉｉのＥＤＴＡが寸だ、大腸菌サンプルに加えられた。この処理の後に、ＳＤＳが全てのサンプルに加えられ（最終濃度２％）、次いでサンプルの取扱いに関する本文中で述べたように、このものは沸騰により変質されないうちに、その粘性を減らせるために２回細い針を通過させられた。表にあられれる数値は、サンプルなしの同様な交雑：′こより得られた試剤の素地に対して補正された。このテストで調査されたサンプルは、３つのウィルス（アデノウィルス、ＳＶ４０ウィルス、及びヘルペス単性ウィルス）により感染された細胞、及びバチルスアミロリクエファシエンスハクテリアを含有するサンプルであった。次の試剤が全て同時に各サンプル、５つつフィルターに加えられた。これらのフィルターは、ＳＶ４０ウィルス、アデノウィルス、ノくチ、ＩＬスアミロリクエファンエンスのα−アミラーゼ遺伝子及び子牛の肥腺からの一つの型のＤＮＡを含有するものとＤＮＡ−を少しも含有しないものである。更に次のラベルされた核酸試剤が２００．ＯＤＤ　ＣＩ）ｍが加えられた。ＳＶ４０ウィルス−、アデノウィルス−及びα−アミラーセ遺伝子Ｄ　Ｎ　Ａ− 試剤この実例は、サンプルに試剤の組合せを加えることにより、サンプルの分割や！＠釈なしに適当な系列の微成物を同時に調査することか可能でちることを示している。サンプルはウィルス性とバクテリア性の両方の核酸を含有していてもよい。フィルターはサイン（マーク、付は札）により認識されうる。サイン（寸、そのフィルターが含有する連鎖を同定する。微生物はそのフィルターに付着され、交雑された。サイン１は、番号や文字である。例えば１や！ＥＶ４０２やＡ−ａ等であり、またＳＶ４０に対して才、ＡＤに村して△１、バチルスに対して○のような他Ｏしるしであることもある。１）表６に同じ２）表１に同じ３）表４に同じ４）子牛の胸腺ＤＮＡ、１μｇ５）ブランク（ＤＮＡを含有せず）ラベルされた核酸試剤：表３と同じＳＶ４０ウィルス、表１と同じアデノウィルス、表４と同じα−アミラーゼ遺伝子交雑：表１に同じ洗浄：表１に同じＳＶ４０ウィルスとアデノウィルスで感染された細胞サンプルは各々表３と表１に記載されている。１０６ペロ（ＶｅｌＯ）細胞は、ヘルペス単性ウィルス１型で感染された。この細胞は、細胞効果が見られるような感染の後２０時間でとり入れられた。サンプルは、アデノウィルス感染細胞のために記載された通り（表１参照）処理された。表中の数１゛直は、サンプルなしで同等な交雑を行うことにより得られた試剤の素地に対して補正される。試剤は、大腸菌のｏｍｐ　Ａ−遺伝子（外膜■白質Ａ−遺伝子）からつくられた。出発物質として用いられる雑種プラスミドｐＫＴＨ４０とｐＫＴＨ４５は、　Ｈｅｎｎｉｎｇ他（１９７９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６゜４５６０−４３６４により記載されたｐＴＵ　１００プラスミドからつくられた。フィルター試剤として用いられるプラスミドｐＫＴＨ４５（例えばＮａｔｉｏｎａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ　Ｎｏ、−・−の様なＫＴＬに寄託されている）は、７４０ベ一ス対合から構成されてちり、ｏｍｐ　Ａ−遺伝子の５′−末端光からｐＢＲ３２２−プラスミドの中に挿入されていた。プラスミドｐＫＴＨ４０は、ＯｍｐＡ−遺伝子の３′末端先から３００ベ一ス対合、また大腸菌のゲノムから下記の１７００ベ一ス対合を含有する。ｐＫＴＨ４０プラスミドは、大腸菌のＤＮＡフラグメントを受けとるためにＢａｍＨ工拘束酵素で分裂された（これが上記の１７００ベ一ス対合を含有する）。このフラグメン、ト他（１９８１）、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９　、２８７１− ２８８８により記載された方法に従って単線維のバクテリオファージＭ１３ｍｐ　７に移転された。組換ファージｍＫＴＨ１２０７（ＫＴＬに寄託Ｎｏ、・・・）は、前記した“他のラベリング方法″の所で記載したように】２５　■のアイソトープでラベルされ、サンドウィッチ交雑法における探針として用いられた。分裂された大腸菌細胞からのＤＮＡは、単離され、精製された大腸菌からのＤＮＡと同様に、表６に示されるようにサンドウィッチ交雑により検出されうる。１）　ｐＫＴＨ４５プラスミド１．０８８μｇ（２×１０１１分子）２）子牛の胸腺ＤＮＡ　１．．０８８μｇ３）ブランク（ＤＮＡを含有せず）ラベルされた核酸試剤：ｍＫＴＩ（１２０７、比活性ＢＸ　１１０７ｃｐ／、ｃ＋ｇ　ＤＮＡ（２００，０００ｃｐｍ／４　Ｘ　ＳＣＣ，ＢＳＡ　（牛の血清アルブミン）を含まない１ ×デンハルト溶液、０．２５％のＳＤＳ　、２００μｇ／ｍｅのへリング精子ＤＮＡ、１７．５時間、＋６５℃ 洗浄：表１に同じ大腸菌に１２ＨＢ１０１−ＤＮＡは、Ｍａｒｎｃｕｒ　（１９６１）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。３　、２０８−２１８により記載されたマーミュア−法に従って単離されたＯ　ＤＮＡは７ｍＭのＮａＯＨ（＋　１００℃、５分間）で変質された。細胞はリゾチーム（ｓｏｏ　ｐｇ／ｒｎｅ　）、ＥＤＴＡ　（７０ｍＭ、＋３７ ℃、３０分間）　、　ＳＤＳ　（０，２５％、＋６５℃）で処理された。そして遊離のＤＮＡは１４　ｍＭのＮａＯＨ（＋　１００℃、５分間）で沸騰されることにより変質された。表に示された数値は、サンプルなしの同様な交雑から得られた試剤の素地に対して補正された。補正書の翻訳文提出書（特許法１８４条の７第１項）昭和５８年６月　７　日特許庁長官若杉和夫　殿１　特許出願の表示Ｐ　ＣＴ　／　Ｆ　工８２　／　０００３８２゜発明の名称微生物を鑑別するための方法及び試剤の組合せ３　％許出願人オリオンーイチメ・オイ特　π■　謂　請求　の　範　囲１　共通の連鎖をもたないがお互に所定の微生物又は微生物群のゲノム中で好寸しくは接近して位置する２つの異なる核酸試剤が所定のサンプル中にある詔微生物又（１微生物群を同定するために用いられ、寸だ核酸試剤の１つが固体担体に付着した単線維の核酸フラグメントで、他が適当なマーカーでラベルされた単線維の核酸フラグメントであるような、固体担体上への核酸のサンドウィンチ交雑を基礎とした微生物又（１微生物群を同定するための微生物鑑別法において、異なった微生物又は微生物群を同時に同定するために、多数の核酸試剤が分割されないサンプル中における全ての微生物又は微生物群の核酸と接触させられ、その際にサンプルの核酸は公知の方法により最初は単線維状態にされ、次いでサンプルの核酸は固体担体に付着した補足性の核酸フラグメントに交雑して、担体付着の雑種はその後に起るラベルされた核酸、イラグメントのサンプル核酸フラグメントへのアニーリングによりラベルされた状態になり、最後に担体付着のラベルは確立された方法により測定されることを特徴とする前記微生物鑑別法。２、特許請求の範囲第１項による方法において用いられる多数の試剤の組合せにおいて、該組合せは同定される各々の微生物又は微生物群のために２つの核酸試剤を含みまた試剤に対して微生物又（・１微生物群の相互に好ましくは接近している異なった部分からつくられた必須の２つの異なった核酸フラグメントが微生物のゲノムから直接に又は確立されたＤＮＡ組換え技術を用いてつくられ、これらの群又は種の特異な核酸フラグメントは単線維にされたものであり、その１つは固体担体に付着され、他は適当なマーカーでラベルされていることを特徴とする試剤の組合せ。ろ　アデノウィルスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体としてアデノウィルス組換プラスミドＡ（］、２　ＤｐＢＲｓ２２．−４だラベルされた核酸試剤としてアデノウィルスＡｄ２−Ｂａ、ｍＨＩ　Ｃ−フラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された多数の試剤の組合せ。４　セムライフ森林ウィルスの同定のためＶＣ１核酸試剤を付着した固体担体としてｐＫＴＨ３１２プラスミドのＥｃｏＲＴ−ＸｈＯＩフラグメン）Ａ、ｔたラベルされた核酸試剤としてｐＫＴＨろ１２プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントＰを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された多数の試剤０組合せ。５　Ｅ：Ｖ４０ウィルスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体としてＳＶ４０ウィルスのＰｓｔＩ　Ｂフラグメント、４／ζはラベルされた核酸試剤と１〜でＳＶ４０ウィルスのＰｓｔＩ　Ａフラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された多数の試剤の組合せ。６　バグＪレスアミロリクエファン工／スの［司定のため（ζ、１−ε酸試剤１を−イ・」着した固体担体としてバチルスアミ［：２リクエフア／エンスゲラスミドｐＫＴＨ１０のα−了ミラーセ遺伝イのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、またラベルされた核酸試剤としてバチルスアミロリクエファ／エンスゲラスミドｐＫＴＨ４ｏのα−アミラーセ遺伝子のＣ］、ａＩ−ＥｃＣＲエフラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の多数の試剤の組合せ。７　核酸試剤を付着した固体担体としてプラスミドｐＫＴＨ４５才だラベルされた核酸試剤として組換えファー／ｍＫＴＨ１２０７を用いて、大腸菌が同定されることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された多数の試剤の組合せ。８　異なった微生物から出てくる核酸を含有する同一のサンプルから、アデノウィルス、　ＳＶ４０ウィルス及びバチルスアミロリクエファンエンスのような異なった微生物、ウィルス及びバクテルアを同定し、区別するために、核酸試剤を何着した固体担体としてアデノウィルスのＡｄ２ＤｐＢＲ３２２絹換えグラスミド、ＳＶ４０ウィルスのＰｓｔＩ　Ｂフラグメント及びバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１Ｏのα−アミラーセ遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＥａｒａＨＩフラグメンｌ−を、寸だラベルされた核酸試剤としてアデノウィルスのＡａ、　２−　Ｂａ、ｍ■ｌ　Ｉ　Ｃフラグメン）　、　ＳＶ４０ウィルスのＰ　ｓ　ｔ　工Ａフラグメント、及びバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１［１のα−アミラーセ遺伝子のＣ］、ａＩ−ＦＣＯＲ丁フラグメントを含イ］することを特徴とする特、ｉ′Ｖ請求の範囲第２　、５．５及び６項に記載さへグー多数の試剤の１千１合せ。国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１　共通の連鎖をもたないがお互いに所定の微生物又は微生物群のゲノム中で好ましくは接近して位置する２つの異なる核酸試剤が所定のサンプル中にある該微生物又は微生物群を同定するために用いられ、また核酸試剤の１つが固体担体に付着した単線維の核酸フラグメントで、他が適当なマーカーでラベルされた単線維の核酸フラグメントであるような、固体担体上への核酸のサンドウィッチ交雑を基礎とした微生物又は微生物群を同定するだめの微生物鑑別法において、核酸試剤が分割されないサンプル中における全ての微生物又は微生物群の核酸と接触させられ、その際にサンプルの核酸は公知の方法により最初は単線維状態にされ、次いでサンプルの核酸は固体担体に付着した補足性の核酸フラグメントに交雑して、担体付着の雑種はその後に起るラベルされた核酸フラグメントのサンプル核酸フラグメントへのアニーリングによりラベルされた状態になり、最後に担体付着のラベルは確立された方法により測定されることを特徴とする前記微生物鑑別法。２、特許請求の範囲第１項による方法において用いられる試剤の組合せにおいて、該組合せは同定される各々の微生物又は微生物群のために２つの核酸試剤を含み、捷だ試剤に対して微生物又は微生物群の相互に好ましくは接近している異なった部分からつくられた必須の２つの異なった核酸フラグメントが微生物のゲノムから直接に又は確立されたＤＮＡ組換え技術を用いてつくられ、これらの群又は種の特異な核酸フラグメントは単線維になされたものであり、その１つは固体担体に付着され、他は適当々マーカーでラベルされていることを特徴とする試剤の組合せ。３　アデノウィルスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体としてアデノウィルス組換プラスミドＡｄ２ＤｐＢＲ３２２、またラベルされた核酸試剤としてアデノウィルスＡｄ２−　ＢａｍＨ工Ｃ−フラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された試剤の組合せ。４　セムライク森林ウィルスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体としてｐＫＴＨ３１２プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメン）Ａ１−ｉだラベルされた核酸試剤としてｐＫＴＨ６１２プラスミドのＥｃ　ｏＲニーＸｈｏエフラグメントＢを含有する５　ＳＶ４０ウィルスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体として５ｖ４０ウイルスのＰｓｔより　フラグメント、またう、ごルされた核酸試剤としてＳＶ４０ウィルスのＰｓｔ工Ａフラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された試剤の組合せ。６　バチルスアミロリクエファシェンスの同定のために、核酸試剤を付着した固体担体としてバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１０のα− アミラーゼ遺伝子のＥｃ’ｏＲＩ−Ｂａ、ｍＨエフラグメント、またラベルされた核酸試剤としてバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１０の α−アミラーゼ遺伝子の（４ａ　Ｉ　−Ｅｃ　ｏＲＩ　フラグメントを含有することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の試剤の組合せ。７　核酸試剤を付着した固体担体としてプラスミドｐＫＴＨ４５またラベルされた核酸試剤として組換えファージｍＫＴＩ（１２０７を用いて、大腸菌が同定されることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載された試剤の組合せ。８　異なった微生物から出てくる核酸を含有する同一のサンプルから、アデノウィルス、５Ｖ４Ｑウイルス及びバチルスアミロリクエファシェンスのような異なった微生物、ウィルス及びバクテリアを同定し、区別するために、核酸試剤を付着した固体担体としてアデノウィルスのＡｃｔ２ＤｐＢＲ３２２組換えプラスミド、ＳＶ４０ウィルスのＰｓｔＩＢフラグメント及びバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１０の〜−アミラーゼ遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨエフラグメントを、またラベルされた核酸試剤としてアデノウィルスのＭ２− ＢａｍＨＩ　Ｏフラグメント、ＳＶ４０ウィルスのＰｅｔ工Ａフラグメント、及びバチルスアミロリクエファシェンスプラスミドｐＫＴＨ１０のα−アミラーゼ遺伝子の０１ａＩ−ＥｃｏＲエフラグメントを含有することを特徴とする請求の範囲第２．３．５及び６項に記載された試剤の組合せ。