JPS5863396A - １２β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はデオキシコール酸及び／又はその塩から微生物
により１２β−ヒドロヤシアンドロスタ−１，４−ジエ
ン−３，１７−ジオ／を製造する方法に関し、詳しくは
デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２β
−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７
−ジオンを生産するシュードモナス・オバリスに属する
細−を、主炭素源としてデオキシコール酸及び／又はそ
の塩を冨む培ｍｒｃ培養して１２β−ヒドロキシアンド
ロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを半成せし
め、これを採取することｔ−特徴とする１２β−ヒドロ
キシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン
の製造方法に関する。

従来、デオキシコール−に微生物を作用させて１２β−
ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジオ〈−３，１７−
ジオン（以下、１２β−ヒドロキシＡＯＤと称す）會得
る方法として次に示す報告が見られる。まずバルネス（
Ｐ、Ｊ、　Ｂａｒｎｅｓ　）らによって、シュードモナ
ス−エスピーＮＣＩＢ　１０５９０１０５９０（Ｐｓｅ
ｕｄｏ　ｓｐ、　ＮＣＩＢ　Ｉ　Ｑ　５９０　）　ｇ株
を用いる方法が報告されている（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ
ｏｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

（１９７４年）、１１５〜１１６頁及びＴｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ、　３２巻、８９〜９３頁−（１９７６年）参
煕〕０この方法は、デオキシコールｅを０．１−含む無
機塩培地１０１でシュードモナス・エスピーＮＣｌＢ１
０５９０ｉｉ１１株を１４時間好気的に培養し、デオキ
シコール酸１゜ｆから１２　ｊ？−ヒ）”ａキシＡＤＤ
　９６０Ｔｑ及Ｃｊ’１２α−ヒドロキシブレブナ−１
，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸６５７１
１９を主生産物として得、さらに１２α−ヒドロキシア
ンドロスタ−１，４−・ジエン−３，１７−ジオン、１
２β−ヒドロキシ−４−ア／ドロステン−３，１７−ジ
オ／及び１２ｒ、１７ξ−ジヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３−オンを微量成分として得るものである。

この方法は１２β−ヒドロキシＡＤＤの収率が１゜チ未
満と低い点、１２β−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン−２０α−カルボン酸カ１２β−ヒドロ
キシＡＤＤの収量の約２／３＆ｉ副生し１２β−ヒドロ
キシＡＤＤへの選択率が低い点、及び基質であるデオキ
シコール酸の績度が０．１−と低い点で実用的ではない
６な、お１、この方法で使用されているシュードモナス
・ａｐ−ＮＣＩＢ１０５９０菌株については、この菌株
が動物糞便から採取されたシュードモナス属に属する細
菌であること以外には全く報告されていない。マ九、テ
ネンン（Ｍ、　Ｅ、　Ｔ＠ｎｎｅａｏｎ　）らニよル、
嫌気性大ｍｍｔ−用いテテオキシコール酸がら１２β−
ヒドロキシＡＤＤ及び１２α−ヒドロキシプレグナ−１
，４−ジエン−３−オン−２０α〜カルボン酸を得ル方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８ｏｃ、Ｔｒａｎｓ、、　５　
巻、　１７５８〜１７６０頁（１９７７年）＃照）；　
オーｚｙ（Ｒ，Ｗ、Ｏｗａｎ）　らＫよる、バクテロイ
デス・７ツギリスＸＦ２３（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅａむ
ａｇｉｌｉｓ　ＸＦ　２３　）菌株又はバクテロイデス
・フラギリス・サブスピーシーズ・セタイオタオミクｏ
　ンＥ　５９　（Ｂａｃｔ＠ｒｏｉｄａａ　ｆｒａｇｉ
ｌｉａ　５ｕｂａｐ。

ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ　Ｅ　５９　）Ｂｉ
ｇ株を用イテデ＃　ｄｔ　シ：ｙ−ル酸から１２β−ヒ
ドロキシＡｉ）Ｄ、１２α−ヒドロキンアンドロス／−
１，４−９エン−３，１７−ジオ／、１２β−ヒトｃ１
ｄ？シー４−アンドロステン−３，１７−ジオン及び１
２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジェノｉ−３−Ａ
ｒ　７−２０　ａ　−力Ａ／ボン酸を得る方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、　、　５巻、１７１
１〜１７１３頁（１９７７年）参照〕が知られているが
、これらの方法はいずれ４ｈｔｌＩｋ気性ｆＩＡ′ｔ−
用いておシ、用いる基質が低濃度となること、培養に兼
期間を要すること、目的物の収率が低いことなど工業的
に発酵生産するに当り種々の問題点を有する０ 本発明者らはデオキシコール酸及び／又はその塩を基質
として１２β−ヒドロキシＡＤＤ金生産する微生物の探
索を長期間貸なった結果、シュードモナス・オパリスに
属する特定の細醒がデオキシコール酸及び／又はその塩
を基質として１２β−ヒドロキシムＤＤを高選択率、高
収率で生麹することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

本発明者らが得た上記のシュードモナス・オパリスに属
する細菌としては、シュードモナス・オバリスＤ　−４
Ｑ　（Ｐｓ＠ｕｄｏｍｏｎａａ　ｏｖａｌｉｓ　Ｄ−４
０）−株（徴工研曹寄第６１４７号）がある。この菌株
はデオキシコール酸及び／又はその塩を含む培地で培養
された場合、培養期間のいずれの時期においても１２α
−ヒドロ中シグレグナー１．４−ジエン−３−オン−２
０α−カルボン酸をほとんど生産しない点で前記のバル
ネスらの方法で用いられたシュードモナス・エスピーＮ
ＣＩＢ　１０５９０菌株とは区別される。

本発明者らが得たシュードモナス・オパリスＤ−４０ｇ
株の両生的性質を列挙すると次表のとおりである。

一徹鏡的所見 形　態　　　　　　　　　　　短禅菌、単画（−都連鎖
状）大きさ　　　　　　　　　　０．４〜０．７Ｘ１．
５〜２．５μ壁　毛　　　　　　　　　　　極鞭毛（１
〜３本、束毛）胞子　　　　　なし ダラム染色　　　　　　　　　陰　性 抗酸性　　　　　　　　　　　な　し 培地における培養所見 ニュー）　ＩＪエンド寒天平板　　円形、扁平状、金縁
、白色、培養　　　　　　　　　　　混光、透明、平滑
ニュートリエンド寒天斜面　　拡布状、白色〜桃色、平
滑、培養　　　　　　　　　　　透明 ニュー）　ＩＪエンド液体靜装　　厚膜状、沈渣培養 ポテト・グルコース寒天糾　　拡布状、白色、平滑面培
養（注１） ゼラチン穿刺培養　　　　　　液化せずリドマスミルク
　　　　　　　リドマスを脱色、ミルクを凝固せず、ペ
プトン化せず ＢＣＰミルク　　　　　　　　アルカリ性脱窒反応　　
　　　　　　　　　　十 ＭＲテスト　　　　　　　　　　　　　　　−ｖＰテス
ト　　　　　　　　　　　　　　　−インドールの生成
　　　　　　　　ヘ　　一硫化水素の生成　　　　　　
　　　　　　生澱粉の加水分解　　　　　　　　　　　
　十クエン酸の利用　　　　　　　　　　　　十コハク
酸の利用　　　　　　　　　　　　　十グルタミ／酸の
利用　　　　　　　　　　十ｐ−ヒドロキシベンゾエー
トの利用土 無機窪素源の利用　　　　　　　　　　　十ウレアーゼ
　　　　　　　　　　　　　　−オキシダーゼ　　　　
　　　　　　　　　十カタ２−ゼ　　　　　　　　　　
　　　　±酸素に対する態度　　　　　　　　　好気的
０・Ｆテスト （１）Ｌ−アラビノース　　　　　　−（２）Ｄ−キシ
ロース　　　　　　　　−−（８）Ｄ−グルコース　　
　　　　　　−　　　　　　　−（４）Ｄ−マンノース
　　　　　　　　−−（６）Ｄ−フラクトース　　　　
　　　　−（６）Ｄ−ガラクトース　　　　　　　−−
（γ）マルトース　　　　　　　　　　　　−　　　　
　　　　−（８）シュークロース　　　　　　　　　−
−１０）ラクトース　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　−■トレハロース　　　　　　　　　　−−
（６）Ｄ−ノルビット　　　　　　　　　−　　　　　
　　−（鴫り−マンニット　　　　　　　　−−１１ニ ーイノジット　　　　　・・ に）グリセリン　　　　　　　　　− に）デンプン　　　　　　　　　　−　　　　　　−（
注１）：培地組成； ポテトエキス４．０ｆ／ｊ、グＡ／　コース２　ｏ、０
．／ノ及び寒天１５．０ｆ／Ｊ （注２）：生理学的性質において、＋、士及び−は次の
ことを意味する。

＋・・・・・・その性質又はその生成あり士・・・・・
・その性質又はその生成の有無が判定し難い−・・・・
・・その性質又はその生成なしく注３）：ヒュー・アン
ド・ライフノン培地の炭素源をそれぞれ糖類１〜１５と
代えた培地での菌による糖類からの酸の生成及びガスの
発生を観察したものである。

＋・・・・・・酸の生成又はガスの発生あり±・・・・
・・酸の生成又はガスの発生の有無が判定し難い −・・・・・・酸の生成又はガスの発生なし上記の表に
示した菌学的性質に基づき、シュードモナス・オバリス
Ｄ−４０菌株の同定を行なった。シュードモナス・オバ
リスＤ−４０自体は、桿菌であること、極鞭毛を有して
いること、ダラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的
所見及び好気性であること、０−Ｆテストの結果がマイ
ナ奔であることなどの生理学的性質からパージエイズ・
マニュアル・オプ・ディター建ネイティブ・バクテリオ
ロジー第７版及び第８版に基づき、シュードモナス属に
属する細菌であると同定した。

さらにシュードモナス・オバリスＤ−４０菌株は、両端
に丸みを持った短桿菌でめる点、寒天平板上で形成する
コロニーが円形で光沢を有する点、インドールを生成し
ない点並びに糖類から酸及びガスの生成が認められない
点から、シュードモナス属のオパリス種に属する細菌で
あると同定した。

本発明の方法による１２β−ヒドロキシＡＤＤの生産は
、デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２
β−ヒドロキシＡＤＤを生産するンユードモナス・オパ
リスに属する細菌を、デオキシコール酸及び／又はその
塩を含む培地に培養することによシ行なわれる。デオキ
シコール酸の塩としては具体的にはデオキシコール酸の
ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカル
シウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩であ
る。デオキシコール酸及び／又はその塩の濃度は通常的
１〜２００　ｆ／Ｉの範囲でよいが、生産される１２β
−ヒドロキシＡＤＤの収量、培養条件及び操作性などの
経済的観点から約１０〜１００　ｆ／ｌの範囲が好まし
い。培養方法Ｆｉ原則的には一般微生物の好気培養で採
用される方法と同じであるが、通常は液体培地による振
盪培養法又は通気攪拌培養法が用いられる。培地として
は上記のデオキシコール酸及び／又はその塩を基質とし
て１２β−ヒドロキシＡＤＤを生産するシュードモナス
・オパリスに属する細菌が資化利用できる栄養源を含有
するものであればよい。炭素源としてはデオキシコール
酸及び／又はその塩を単一炭素源としてもよく、或いは
デオキシコール酸及び／又はその塩にアラビノースなど
のペントース類；クルコース、マンノース、フラクトー
ス、カラクトースなどのヘキノース類；シュークロース
、マルトースなどの二糖類；澱粉分解物；糖アルコール
類、グリセリンなどの多価アルコール類；又はポリペプ
トン、ペプト／、肉エキス、木芽エキス、コーンステイ
ープリカー、酵母エキス、６極アミノ酸、有機酸などを
併用してもよい。また窒素源としては、例えば硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、＃酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無
機窒素源、又はポリペプトン、ペプトン、肉エキスなど
の有機ｉｉ１木源が用いられる。また、この他に燐酸水
１ｇ２カリウム、燐［１２水素カリウム、硫酸マグネシ
ウムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特徴はな
いが、通常２５〜３５℃で１０時間〜７日間振盪培養又
は通気攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積された１２β−ヒドロキ
シＡＤＤを分離、採取するには、１２β−ヒドロキシＡ
ＤＤｔ−溶解しかつ水と相分離する有＊溶謀、例えば酢
酸エチル、クロロホルム、クロロホルムとメタノールの
混合液などを用いて抽出する方法が採られる０この有機
溶媒による抽出は、陶体を含んだ状−の培養液について
行なってもよいし、予め培養液中の菌体その他の不溶成
分を濾過又は遠心分離などにより分離除去し、得られた
培養濾液又は上清について行なってもよい。

後者の抽出方法を採る場合には、必要に応じて濾過又蝉
遠心分離などによって盆離除去される不溶成分について
上記の有機溶媒瞥よる抽出操作を行なうことにより、培
養液中に析出又は沈澱している１２β−ヒドロキシＡＤ
Ｄを回収することができる。このよう、にして得られた
抽出液を集め、これより溶媒を溜去することによって目
的とする１２β−ヒドロキシＡＤＤをほぼ全量回収する
ことができる０得られた抽出物中には１２β−ヒドロキ
シＡＤＤの他に一存基質やデオキシコール及び／又はそ
の塩並びに副生物が含まれており、その抽出物を例えば
シリカゲルカラムに吸着させ、クロロホルムとエタノー
ルの混合液で溶出させることにより１２β−ヒドロキシ
ＡＤＤを取得することができる。

本発明の方法により得られる１２β−ヒドロキシＡＤＤ
は、その人環を部分水添し１２位のヒドロキシ基を化学
的に除去することによって利尿剤として有用なスビロン
ラクトンなどのステロイドの合成原料となる４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンに誘導することができる。

例えば、１２β−ヒドロキシＡＤＤをトリス（トリフェ
ニルホスフィン）クロロロジウムを用いて部分水添する
ことにより１２β−ヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンを得（Ｃ，Ｄｊｅｒａｓｓｉ　ａｎｄ
　Ｊ。

Ｇｕｔｚｗｉｌｌｅｒ　　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ＠ｍ、８ｏｃ
、、　　８８巻、４５３８〜４５３９頁（１９６６年）
参照〕、この１２β−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−シ；に７ｔ２−メチル−２−エチル−１，
３−ジオキノランと反応させることにより３位と１７位
のケト基が保繰された１２β−ヒドロキシ−５−アンド
ロステン−３，１７−シオンー３，１７−ビス（エチレ
ンアセタール）を得る（Ｇ、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ　＠
ｔａ１．．　　Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　７５巻、５０２４〜５０２６
頁（１９５４年）参照〕。このアセタールをｐ−）ルエ
ンスルホニルクロリドでトシル化し、水素化トリエチル
ホウ素リチウムで還元して１２位のヒドロキシル基を脱
離後、鉱酸／アセトンで処理して３位と１７位の保鏝基
を脱離させることにより４−アンドロステン−３，１７
−ジオ／とすることができる０以下実施例によって本発
明をさらに詳細に説明する。

実施例１ シュードモナス・オバリスＤ−４０Ｔｉｌｉｉ株（＃工
研曹を第６１４７号）を次に示す方法で培養した。

デオキシコール酸５０ｆ１硝酸アンモニウム２．０？、
燐酸２水素カリウム１．Ｏｆ、燐酸水素２カリウム５．
　Ｏｆ　、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｆ。

酵母エキス０．２ｆ及び水酸化ナトリウム５．Ｏｆに水
道水を加えて容量をＩＪＫ−瞥し、これを培地とした。

この培地を５００−容坂ロフラスコに１００１１１ｊ宛
１０本に分注し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行な
った。予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて２
日間増殖させた種菌を上記の５００−容坂ロフラスコあ
た〕１０ｄ宛添加し、３０℃で５日間振盪培養した。培
養後、これらの培養液を集め、遠心分離機で菌体を除去
後、得られた培養液上清をクロロホルム／メタノールの
２７１容量比の混合液１，５Ｉで抽出し、ロータリー・
エバポレーターでクロロホルム／メタノール混−ル酸の
酸化生成物及び未変換のデオキシコール酸の混合物を得
た。

上記の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えて１％溶液とし、この溶−ａｔＯμ！ヲミクロボンダ
パックＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフ
ィー（米国ウォーターズ社製、ＨＬＣ−ＧＰＣ−２４４
型）に注入した。移動相としてＰｔ′１４．０に調整し
た水／メタノールの２５／７５拌量此の混合液を流速１
耐／分で流し、検出を屈折率方式で行なったところ第１
図のクロマトグラムが得られた。このクロマトグラムに
２けるピークＡ１ピークＢ、ピークＣｍびピークＤは標
準品のピークと照合することによシ各々１２β−ヒドロ
キシＡＤＤ１１２α−ヒドロキシ−３−ケトル５β−グ
レグナンー２０α−カルボン酸、１２α−ヒドロキシ−
３−ケト−５”””β−コラン酸及びデオキシコール酸
のものと一致した。

上記の混合物２０９を少量のクロロポルム／エタノール
の９９．５１０．５容量比の混合液に溶解させ、６００
ｔのシリカゲルカラムに吸着させた。このカラムをクロ
ロホルム／エタノールの９９．５１０．５容量比の混合
液１１で洗滌後、クロロホルム／エタノールの９９／１
容量比の混合液２Ｊをカラムに流し、得られた溶出液か
ら溶媒を溜去することにより、１２β−ヒドロキシＡＤ
Ｄ３．４ｆを単離した。ついで、上記のカラムにりａａ
ホルム／エタノールの９９／１容量比の混合液１１及び
その９８／２容量比の混合液２ＪをｔＣｔ−序で流して
洗滌後。

りｌ：ｌＪ：ｌホルム／エタノールの９７／３容量比の
混合液２ｊで溶出することによシ、マず１２α−ヒドロ
キシ−３−ケト−５、β−コランａを得、ついで１２α
−ヒトｃ１中シー３−ケトー５β−グレグナン−２０α
−カルボン酸を得た。各々の化合物の収量Ｆｉ１２α−
ヒドロキシー３−ケト−５β−コラン酸が１５０ｑ、１
２ｇ−ヒドロキシ−３−ケト−５β−プレグナ／−２０
α−カルボ／酸が１００岬であった。その後、上記のカ
ラムにクロロホルム／エタノールの９０７１０容量比の
混合液ＩＪを流し、得られた溶出液からデオキコール敵
を約４ｆ回収した。得られた各々の化合物を下記の方法
で同定した。

１２β−ヒドロキシＡＤＤ 融点；２１３℃ マススペクトルｒｎ］；／ｚ　二３００　（Ｍ）←２８
５　（Ｍ、−ＣＲ２，、）汁°　　。

２８２　［Ｍ−Ｈ２０］” またｍ／ｚ＝１２２より３−ケト−１，４−ジェ／の存
在が確認された。

ＮＭＲスベク）／’（９０ＭＨｚ）δＣＤＣｌ５゜ＨＭ
ｓ　’ ０．９６　（３Ｈ、８）　１８−ＣＨｓｔ、ｚｘ（ａＨ
，５）１ｃ＋−ＣＲ５ ２，３０−！−２，５０（２Ｈ、ｍ）　１６−ＣＲ５３
，７２（ＩＨ，ｄｄ　、Ｊ＝５Ｈｚ及び１０ｄＺ）１２
α−Ｈ６，０６（ＩＨ，ａ）４−Ｈ ６，２０（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）２−Ｈ６，９８（
ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０ＨｚＭ−Ｈ１２α−ヒドロキシ−３
−ケト−５β−プレグナン−２０α−カルボン酸 マススペクトルｍ／ｚ　：　３６２　（Ｍ）”３４４（
Ｍ−ＨｘＯ）” ３２６　（Ｍ　−２Ｈ＊０）“。

またｍ　／　ｔ　＝　７４より−ＣＨ−ＣＯＯ）Ｉの存
在が確認され丸。

みＨ３ ＮＭＲｘべ／）＃（９０ＭＨｚ）ａ　ＤＭＳＯ−”　・
）ＩＭＳ　　　　　’ ０．６３（３Ｈ，５）１８−ＣＨｓ ｌ、０７（６Ｈ，ｍ）１９−ＣＨｓ及び２１−　ＣＨｓ
３．７５（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ４，２８
（ＩＨ，ｄ）１２α−０Ｈ １２α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−コラン酸マスス
ペクトルｒｎ／ｚ　：　３９０　（Ｍ）←３７２　（Ｍ
−ＨｘＯ）” ３５４（Ｍ−２Ｈ雪Ｏ）＋。

３３９（Ｍ−２Ｈ鵞０−　ＣＨｓ　）“。

またｍ　／　Ｚ　＝６０よ？）−ＣＨｚ−ＣＯＯＨの存
在が確認された。

ＤＭＳＯ−Ｈ６ ＮＭＲスペクトル（９０ＭＨＫ）δＨＭＳ　　　’０．
５７（３Ｈ，ａ）１８−ＣＨ３Ｉ、、、、。

０．８３（３Ｈ，ｄ）２１−ＣＨｓ ｏ、８９（３Ｈ，Ｉ）１９−ＣＨｓ ３．７６（ＩＨ，ｔ　、Ｊ＝＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ第１
図のクロマトグラムにおける各ピークの面積比を積分針
（島津製作所製、島津クロマトパックＣ−ＲＩＡ）で求
め、この面積比から得られたデオキシコール酸の酸化生
成物の収量及び未変換のデオ午シコー・ル酸の残存量を
算出すると次表のとおりである。

ＳＡ施例２ シュードモナス・オバリスＤ−４０菌株（黴工研曹寄第
６１４７号）を次に示す方法で培養した。

デオキシコール酸０．２Ｆ、　グルコース０．０６Ｆ。

硝駿アンモニウム０．０２ｆ、燐酸２水素カリウム０．
０１ｆｓ燐駿水素２　力９　？Ａ　Ｏ，０５？、　硫１
１ｖグネシウム・７水和物０．００２ｆ、酵母エキス０
．００２＃を水道水に加えて容量を１０１に調整し、こ
れを培地とした。この培地を試験管（内径２１８１　Ｘ
長さ２００　ｍ　）に注入し、１２０’Ｃ，−ｔ’１５
分間、蒸気殺菌を行なった。予め、デオキシコール酸１
−％ペプトンＯ，Ｓ　＊　、肉エキス０．５優、塩化ナ
トリウム０．５１Ｇ、寒天１．５饅及び水駿化ナトリウ
ム０．１−を含有する水溶液から作成したスラント上で
１日間増殖させた種菌の１白金耳を上記の試験管中の培
地に植菌し、′３０℃で３日間振盪培養し良。培養後、
培養液からクロロホルム１００ｄを用いてデオキシコー
ル酸の酸化生成物及び未変換のデオキシコール酸を抽出
した。分液後、抽出液からロータリー・エバポレーター
でクロロホルムを榴去するととＫより、デオキシコール
酸の酸化生成物と未変換のデオキシコール酸との混合物
を１４０”ｆ得ｆ＃−０ 上記の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えて２．−溶液とし、この溶液２０μｍをマクロボンダ
パックＣ−１８カラムを備え九高速液体クロマトグラフ
ィー（米国ウォーターズ社製、ＨＬＧ−ＧＰＣ−２４４
型）に注入した。移動相としてｆ４′１４．　Ｏに調整
した水／メタノールの２５／７５容量比の混合液を流速
１１Ｅ＃／分で流し、検出を行なった。以下、実施例１
と同様の方法により得られたデオキシコール酸の酸化生
成物の収量及び未変換のデオキシコール酸の残存量を求
めた０その結果を次表に示す０

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたデオ牛シコール酸の酸化生
成物及び未変換のデオ中シコール峡の液体クロマトグラ
ムを表わす。 御拙願人株式会社クラレ 代塩入弁理士本多　峯 保栴爵聞（弁） ：１１ 手続補正書（自発）　　　　　　　　　１昭和５７年　
１月１１日 特許庁長官島田春樹殿 １．４４件の表示 昭和５６年特許願第１６３９６７号 ２、発明の名称 １２β−ヒドロ中シアンドロスター１，４−ジエン−３
，１７−ジオンの製造方法 倉敷市酒津１６２１番地 （１０８）株式会社り　ラ　し 代表取綺役岡林次男 ４、代　理　人 明細書の特許請求の範囲の掴及び発明の詳細な説明の掴 Ｓ、補正の内容 （１）　　明細書第１頁第６〜１５行の記４ｍ（％許請
求の範囲）を別紙のとお９訂正する。 情）　明細書第２頁第３〜４行における「主炭素源とし
て」を削除するＯ 以上 （別紙）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２β
   −ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７
   −ジオンを生産するシュードモナス・オパリスに属する
   細菌を、主炭素源としてデオキシコール酸及び／又はそ
   の塩を含む培地に培養して１２β−ヒドロキシアンドロ
   スタ−１，４−シェアー３．ＩＴ−ジオンを生成せしめ
   、これを採取することを特徴とする１２β−ヒドロキシ
   アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの製
   造方法。