JPS5886096A - １２β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はデオキシコール酸及び／又はその塩から微生物
により１２β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエ
ン−３，１７−ジオンを製造する方法に関し、詳しくは
デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２β
−ヒドロキシアンドロ、ｘ、ｐ−１，４−ジエン−３，
１７−ジオンを生産スルエアロモナス属に属する細菌を
、主炭素源としてデオキシコール酸及び／又はその塩を
含む培地に４１して１２β−ヒドロキシアンドロスタ−
１，４−ジニンー３．１７−ジオンを生成せしめ、これ
を採取することを特徴とする１２β−ヒドロキシアンド
ロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの製造方法
に関する。

従来、デオキシコール区に微生物を作用させて１２β−
ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−
ジオン（以下、１２β−ヒドロキ７ＡＤＤと称す）を得
る方法として次に示す報告が見られる。まずバルネス（
Ｐ、　Ｊ、Ｂａｒｎｅａ　）らによって、シュードモナ
ス・、エスピーＮＣＩＢ　　１０５９０１０５９０（Ｐ
ｓｅｕｄｏ　ｓｐ、ＮＣＩＢ　　１０５９０）菌株を用
いる方法が報告されている。（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ
、Ｃｈｅｍ。

Ｃｏｍｍｕｎ、（１９７４年）ｔ　１１５〜１１６頁及
びＴａｔｒａｈｅｄｒｏｎ　、　３２巻、８９〜９３頁
（１９７６年）参照〕。この方法は、デオキシコール酸
を０．１％富む無機塩培地１０ｊでシュードモナス・エ
スビ−ＮＣＩＢ　　１０５９０菌株を１４時間好気的に
１１１１１し、デオキシコール酸１０ｆから１２８−ヒ
ドロキシＡＤＤ９６０”ｒ及び１２α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン＃
１６５７岬を主生産物として得、さらに１２α−ヒドロ
キシアンドロスタ−１，４−ジエン−３゜１７−ジオン
、１２β−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオン及び１２ξ、１７ξ−ジヒドロキシ−４−ア／
ドロステン−３−オンを微量成分として得るものである
。この方法Ｆｉ１２β−ヒドロキシＡＤＤの収率が１０
％未満と低い点、１２β−ヒドロキシプレ’；ｆ　す−
１，４−−）、ｘ　７−３−オン−２０α−カルボン酸
が１２β−ヒドロキシＡＤＤの収量の約２／３程副生し
１２β−ヒドロキシＡＤＤへの選択率が低い点、及び基
質であるデオキシコール酸の濃度が０．１９６と低い点
で実用的ではない。また、テネソン（Ｍ、、Ｅ。

Ｔｅｎｎｅｓｏｎ　）らによる、嫌気性大腸菌を用いて
デオキシコール酸から１２β−ヒドロキシＡＤＤ及び１
２α−ヒドロキシプレグナ−ｉ、４−ジエン−３−オン
−２０α−カルボン酸を得る方法（Ｂｌｏｃｈ＠ｍ。

Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、　５巻、１７５１３〜１７６０
頁（１９７７年）参照〕　；オーエン（ル、　Ｗ、　Ｏ
ｗ＠ｎ　）らによる、ノ（クチロイデス・フラギリスＸ
　Ｆ　２３　（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ＠ａｆｒａｇｉＬｉ
ｓ　ＸＦ　２３　）　ｉｉｉ株又はバクテロイデス・フ
ラギリス・サブスビーシーズーセタイオタオミクロンＥ
５９　　（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　　　ｆｒａｇｉｌ
ｉａ　　　５ｕｂｓｐ、　　　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍ
ｉｃｒｏｎｉ５９）＠株を用いてデオキシコール酸から
１２β−ヒドロキシＡＤＤ、１２α−ヒドロキシデンド
ロスター１．４−ジエン−３，１７−ジオン、１２β−
ヒドロキン−４−アンドロステン−３，１７−ジオン及
び１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−
オン−２０α−カルボン酸を得る方法（Ｂｉｏｃｈｅ＋
ｎ、８ｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、　５巻、１７１１〜１７１
３頁（１９７７年）参照〕が知られているが、これらの
方法はいずれも嫌気性菌を用いており、用いる基質が低
ｒＩｋ度となること、培養に長期間ｔ−要すること、目
的物の収率が低ｉことなど工業的に発酵生産するに当り
槙々の問題点を有する〇 本発に！Ａ者らはデオキシコール酸及び／又はその塩を
基質として１２β−ヒドロキシＡＤＤを生産する微生物
の探索を長期間材なった結果、エアーモナス属に属する
特定の細１１力五＼デオキシコール酸及び／又はその塩
を基質として１２β−ヒドロキシＡＤＩ）Ｊ−高遥択率
、＾収率で生産することを見出し、本発明を完成するに
至った。

本発明者らが得喪上記のエアロモナス属に属する細菌と
しては、エアロモナス・ノ１イドロフイラＤ　−２３８
（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａＤ−２３
８）　９株（ａＩ工研薗寄第６１４９号）及びエアロモ
ナス・プンクｐ　ｐ　Ｄ　−２９８（Ａｅｒｏｒｎｏｎ
ａ＠ｐｕｎｃｔａｔａ　Ｄ−２９８）菌株（ｉｉ工研薗
寄第６１５１号）力４る０本発明者らが得たエアロモナ
ス・ノ・イト°ロフイラＤ−２３８菌株及びエアロモナ
ス・ブンクタタＤ−２９８１１１１株の一宇的性質を列
挙すると次表のとおりであ゛る０ （注１）：培地組成： ポテトエキス４．０　ｔ／Ｉ　、　　グルコース２０．
０　ｔ／Ｊ及び寒天１５．Ｏｆ／ｊ （注２）：生理学的性質において、士、十及び−は次の
ことを意味する。

ト・・・・・その性質又はその生成あり土・・・・・そ
の性質又はその生成の有無が判定し難い−・・・・その
性質又はその生成なし く注３）：ヒュー・アンド・ライフノン培地の炭素源を
それぞれ糖類１〜１５と代えた培地での麺による糖類か
らの敵の生成及びガスの発生を観察したものである。

十・・′・・・酸の生成又はガスの発生あり±・・・・
・酸の生成又はガスの発生の有無が判定し峻い −・・・・・酸の生成又はガスの発生なし上記の表に示
した菌学的性質に基づき、エアロモナス・ハイ下ロフイ
ラＤ−２３８菌株及びエアロモナス・プンクタタＤ−２
９８菌株の同定をパージエイズ・マニュアル・オプ・デ
イターミネイティブ・バクテリオロジー第７版及び第８
版に基づき行なった。エアロモナス・ハイドロフイラＤ
−２３８’１株及びエアロモナス・ダン菌株タタＤ−２
９８劇株はいずれも桿菌であり、極鞭毛を有しているこ
と、ダラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的Ｐａｒ
見並びに好気性であること、オキシダーゼ反応及びカタ
ラーゼ反応がともに陽性であり、グルコース及びラクト
ースから敵を生成し１発酵的（Ｆｅｒｒｎｅｎｔａｔｉ
ｖｅ　）であることなどの生理学的性質からエアロモナ
ス輌に属する細菌であると同定した。これらの菌株はグ
ルコースの代鉗が発醇的ヤあることからエアロモナス輌
とｔｉｔ類縁のシュードモナス属に属する細菌とは異な
る。また、両鉋株はいずれも水田の土から採取した細−
であり、このことからもエアロモナス属に属するとする
のが妥当である。さらに、エアロモナス・ハイドロフイ
ラＤ−２３８菌株はグルコースから酸を生成しガスを発
生すること、ＶＰテストが陽性であること、グルタミン
酸を唯一炭素源として利用できることなとの生理学的性
質からエアロモナス属のハイドロフィラ種ＫＩｓする細
菌であると同定した。エアロモナス・プンクタタＤ−２
９８１１ｉ株はゼラチンを液化すること、ミルクを酸性
にすることなどの培地における培養所見及びインドール
を生成すること、硫化水素を生成しないことなどの生理
学的性質からエアロモナス属のプンクタタ種に属する細
―であると同定した。

本発明の方法による１２β−ヒドロキシＡＤＤの生産は
、デオキシコール酸及び／又はその塩を基質とし″Ｖ１
２β−ヒドロキシＡＤＤを生産するエアロモナス属に属
する細菌を、デオキシコール酸及び／又はその塩を含む
培地に培養することによシ行なわれる０デオキシコール
酸の塩としては具体的にはデオキシコール酸のナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム、
マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩である。

デオキシコール酸及び／又はその塩の濃度は通常的１〜
２００　ｔ／４の範囲でよいが、生産される１２β−ヒ
ドロキシＡＤＤの収量、培養条件及び操作性などの経済
的観点から”約１０〜１００　ｆ／４の範囲が好ましい
。培養方法Ｆｉ鳳則的には一般黴生物の好気培養で採用
される方法と同じであるが、通常は液体培地による振盪
培養法又は通気攪拌培養法が用いられる。培地としては
上記のデオキシコール教及び／又はその塩を基筒として
１２β−ヒドロキシＡＤＤを生産するエアロモナス属に
属する細菌が資化利用できる栄養源を含有するものであ
ればよい。炭素源としてはデオキシコール酸及び／又は
その塩を単一炭素源としてもよく、或いはデオキシコー
ル酸及び／又はその塩にアラビノースなＥＬＤぺ／ドー
ス類；クルコース、マンノース、フラクトース、ガラク
トースなどのヘキソース類；シュークロース、マルトー
スナトの二糖類；澱粉分解物；糖アルコール類、グリセ
リンなどの多価アルコール類；又はポリペプトン、ペプ
トン、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカー
、酵母エキス、各種アミノ酸、有機酸などを併用しても
よい。また窒素源としては、例えば硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機室−源、又は
ポリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源が
用いられる。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐＠
２水素カリウム、硫敵マグネシウムなどの無機塩類が添
加される。培養条件に特徴はないが、通常２５〜３５℃
で１〜７日間振盪培養又は通気攪拌培養を行なうＯ このようにして培養液中に蓄積された１２β−ヒドロキ
シＡＤＤを分離、採取するには、１２β−ヒドロキシＡ
ＤＤを溶解しかつ水と相分離する有機溶媒、例えば酢酸
エチル、クロロホルム、クロロホルムとメタノールの混
合液などを用いて抽出する方法が採られる。？：、０有
機溶媒による抽出は、Ｉ！体を含んだ状態の培養液につ
いて行なってもよいし、予め培養液中の１体その他の不
溶成分を濾過又は遠心分離などにより分離除去し、得ら
れ九培養濾液又は上清について行なってもよい。

後者の抽出方法を採る場合には、必要に応じて濾過又は
遠心分離などによって分離除去される不溶成分について
上記の有機溶媒による抽出操作を行なうととにより、培
養液中に析出又は沈澱している１２β−ヒドロキシＡＤ
Ｄを回収することができる。このよう圧して得られた抽
出液を集め、こ＼れより溶媒を溜去することによって目
的とする１２β−ヒドロキシＡＤＤをはぼ全量回収する
ことができる６得られた抽出物中には１２β−ヒドロキ
シＡＤＤの他に残存基質のデオキシコール及び／又はそ
の塩並びに副生物が含まれており、その抽出物を例えば
シリカゲルカラムに吸着させ、クロロホルムとエタノー
ルの混合液で溶出させることにより１２β−ヒドロキシ
ＡＤＤを取得することができる。

本発明の方法により得られる１２β−ヒドロキシＡＤＤ
Ｆｉ、その人環を部分水添し１２位のヒドロキシ基を化
学的に除去することによって利尿剤として有用なスピロ
ノラクトンなどのステロイドの合成原料となる４−アン
ドロステン−３，１７−ジオンにＩ導することができる
。例えば、１２β−ヒドロキシＡＤＤをトリス（トリフ
ェニルホスフィン）クロロロジウムを用いて部分水添す
ることにより１２β−ヒドロ中シー４−アンドロステ：
／−３，１７−ジオンを得（（、ＤＪ＠ｒａｓｓｉ　　
ａｎｄ　　Ｊ。

Ｇｕｔｚｗｉｌｌ＠ｒ、　Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈ＠ｍ、　Ｂ
ｏａ、、　ｇ　５３巻、４５３８〜４５３９ｊｉ（１９
６ａ年）参照〕、この１２β−ヒドロキシ−４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを２−メチル−２−エチル
−１，３−ジオキソランと反応させることにより３位と
１７位のケト基が保験された１２β−ヒドロキシ−５−
アンドロステン−３゜１７−シオンー３．１７−ビス（
エチレンアセタール）を得る（　Ｇ、　Ｒｏｓｅｎｋｒ
ａｎｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ　。

８ｏｃ、、７５巻、　５０２４〜５０２６頁（１９５４
年）参照〕０このアセタールｔｐ−トルエンスルホニル
クロリドでトシル化し、水素化トリエチルホウ素リチウ
ムで還元して１２位のヒドロ中シル基を脱離後、鉱酸／
ア七トンで処理して３位と１７位の保饅基を脱離させる
ことにより４−アンドロステン−３゜１７−ジオンとす
ることができる。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ エアロモナ゛ス・ノ・イドロフイラＤ−２３８菌株（黴
工研薗寄第６１４９号）を次に示す方法で培養した。デ
オギシコール９３　ｆ　ｓ硝酸アンモニウム０．１２ｆ
、燐［２水素力ＩＪ　ｌ）　Ａ　０．０６　ｆ　、燐酸
水素２カリウム０．３Ｆ、硫酸マグネシウム・７水昶物
０．０１２Ｆ、酵母エキス０．０２４ｆ及び水敵化ナト
リウム０，３ｔに水道水を加えて容量を６．ＯｓＪに調
整し、これを培地とした。この培地を５００ｇ１容坂ロ
フラスコに入れ、１２０℃で１５分間。

蒸気殺菌を行なった。予め上記の培地と同じ培地で試験
管振盪機にて２日間増殖させた種菌のｌＯｄを上記の５
００ｄ容坂ロフラスコに添加し、３０℃で５日間振盪培
養した。培養後、この培養液を集め、遠心分鴫機で菌体
を除去後、得られた培養液上清をクロロホルム／メタノ
ールの２７１容量比の混合液３００　ｇｌで抽出し、ロ
ータリー°エバポレーターでクロロホルム／メタノール
混合液を溜去することにより、ｉ、ｓｒのデオキシコー
ル酸の酸化生成物及び未変換のデオキシ、コール酸の混
合物を得た。

上記の混合物の極〈一部を取り、これにメタノールを加
えて１優溶液とし、この溶液２０μ４をミクロボンダバ
ックＣ−１８カラムを傳えた高速液体クロマトグラフィ
ー（、米国ウォーターズ社製、ＨＬＣ−ＧＰＣ−２４４
ａｌｌ）＆’Ｃ注入した。移動相として田４．０に調整
１．シ九水／メタノールの２５／７５容量比の混合液を
流速１１Ｌｌ／分で流し、検出を屈折率方°式で行なっ
たとζろ第１図のクロマトグラムが得られ九〇このクロ
マトグラムにおけるビークＡ％　ビークＢ１　ビークＣ
１ビークＤ１　ビークＥ１　ビークＦ及びビークＧは標
準品のビークと照合することによｐ各々１２β−ヒドロ
キシＡＤＤ１１２β−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオン、１２α−ヒドロキシプレグナ−１
，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸、１２α
−ヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン−２０α−カ
ルボン酸、１２α−ヒドロキシ−３−ケト−４−コレン
赦、１２α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−コラン酸及
びデオキシコール酸のものと一致した。

上記の混合物１．８１を少量のクロロホルムに溶解させ
、約３０ｆのシリカゲルカラムに吸着させ九。このカラ
ムにクロロホルム１００１１７を流し、ついでクロロホ
ルム／エタノールの容量比が９９．５１０．５の混合液
２００ｄ、容量比が９９／１の混合液２００−１容量比
が９８７２の混合液３００ｄ。

容量比が９７／３の混合液４ＱＱｓ＋ｊ、容量比が９５
１５の混合液２５０１１４及び容量比が９０／１０の混
合液３００−をこの順序で流し、溶出液を２０−宛フラ
クションチューブに分取し、薄層クロマトグラフィーに
より単一スポットを与える両分をそれぞれ合わせ、ロー
タリー・二ノ（ボレーターで溶媒を溜去した０その結果
、クロロホルム／エタノールの９９．５　／　０．５容
量比の混合液による溶出−分から１２β−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを３０’ｌｔ、
９９／１容量比の混合液による溶出画分から１２β−ヒ
ドロキシＡＤＤを２２０”ｆ得、９８／２容量比の混合
液による溶出画分から１２α−ヒドロキシ−３−ケト−
４−コレン酸を３０”Ｆ及び１２α−ヒドロキン−３−
ケト−５β−コラン酸を２ｏｓｑｌ！友。クロロホルム
／エタノールの９７／３容’ｌ比の混合液による溶出画
分からＩＺａ−ヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン
−２０α−カルボン酸を４０ｑ及び１２α−ヒドロキシ
プレグナ−１，４−ジニンー３−オン−２０α−カルボ
ン酸を７０１１ｖ得り。またクロロホルム／エタノール
０９５１５〜９０／１０容童比の混合液による溶出画分
からデオキシコール酸を４５０”ｌｆ回収した。得られ
た各々の化合物を下記の方法で開示した。

１２β−ヒドロキシＡＤＤ 融点＝２１３℃ マススヘクト／ｌ／　ｍ／ｚ：　３００（Ｍ）”２８５
　（Ｍ−ＣＨａ　）”。

２８２ＣＭ−Ｈ２０）”。

またｍ／Ｚ”＝１２２より３−ケト−１，４−ジエンの
存在が確認された。

Ｎ　Ｍ　Ｒｘ　ヘクトル（９０ＭＨｚ　）δＣＤα３゜
）ＩＭＳ　　’ ０．９６　（・３Ｈ，ａ）１８−ＣＨｓｌ、２１（３Ｈ
，Ｉ）１９−ＣＨ３ ２，３０〜２．５０　（２Ｈ、ｍ　）　１６−ＣＨａ３
．７２（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝５Ｈｚ及び１０　Ｈｚ　）　
１＝２　ａ−Ｈ６，０６（ＩＨ，！Ｉ）４−Ｈ ６，２０（ｔｆｉ、ｄ、Ｊ＝ｔｏＨｚ）ｚ−Ｈ６，９８
（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈ蔦）１−Ｈ１２β−ヒドロキン
−４−アンドロステン−３，１７−ジエンマｘｘべ／　
ト／Ｉ／ｍ／ｚ　：　３０２（Ｍｌ”２８７　（Ｍ−Ｃ
Ｈｓ　）” ２８４　ＣＭ−ＨｚＯ）” ｔたｍ／Ｚ＝１２４より３−ケト−４−エンの存在が確
認されも ＮＭＲスペクトｋ（９０ＭＨｚ）δＩ）ＭＳＯ−４６゜
ＨＭＳ　　　　’ ０．８１　（３Ｈ，ｓ　）　１８−ＣＨａｌ、１０（３
Ｈ，５）１９−ＣＨａ ２．２０〜２．３０（２Ｈ，ｍ）１６−ＣＨ２３，５０
（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝５Ｈｚ及び１０Ｈ１）　１２ａ−Ｈ
４，１９（ＩＨ，ｄ）１２β−０Ｈ ５，６０（ＩＨ，５）４−Ｈ １２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−２ｏα一カルボン敵 マススペクトルｍ／ｚ　−＝　３５８　（ＭＥ　”３４
０　（Ｍ−ＨｚＯ’Ｊ” ３２２　［Ｍ−２Ｈ２０］”“ ′またｍ／Ｚ＝１２２より３−ケト−１，４−ジエンの
存在が確認され１ｍ／ｚ＝７４より一〇Ｈ−ＣＯＯＨの
存在が確認されたＯＨｓ ＮＭＲスペｌ）ル（９０ＭＨｚ）δＤＭＳＯ−ｄ５゜Ｅ
ＭＳ　　　　’ ０．６５　（３Ｈ，８）　１８−ＣＨ５１，０５（３）
１．ｄ）２１−ＣＨｓ ｌ、１３（３Ｈ，ａ）１９−ＣＨａ ３．７４（１）１．ｔ、Ｊ＝３Ｈり１２β−Ｈ４，３３
（ＩＨ，ｄ）１２α−０Ｈ ５，９３（ＩＨ，５）４−Ｈ ６，０３（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝ＩＱＨｚ）２−Ｈ７，０８（
ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）ｌ−Ｈ１２α−ヒドロキシプ
レグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン
酸メチルエステルの融点＝２３７℃１２α−ヒドロキシ
−４−プレグネン−３−オン−２０α−カルボン歇 マススペクトルｍ／ｚ　：　３６０　（Ｍ）”３４５　
（Ｍ−ＣＨａ）“ ３４２　ＣＭ−Ｈ２０）“ ３２４　（Ｍ−ＨｉＯ−ＣＨａ　）　”。

またｍ／ｚ＝１２４より３−ケト−４−エンの存在が１
ｉｕｉｉされ。

ｍ／ｚ＝７４より−ＣＨ−ＣＯＯＨの存在が確認された
。

ＣＨａ Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトル　（９０Ｍｆｉｚ　）δＤＭ８０
−ｄ６゜ＨＭＳ　　　　’ ０．６２（３Ｈ，５）１８−ＣＨａ ｌ、０８（６Ｈ，ｍ）２１−ＣＨａ及び１９−ＣＨａ３
．７５　（１）１．　ｔ　、　Ｊ＝３Ｈｚ）　１２β−
Ｈ４，２８（１）１．ｄ）ｔ２α−０Ｈ ５，５７（１）１．　ａ　）４−Ｈ λ２α−ヒドロキン−３−ケト−４−コレン酸マｘスペ
ク）ルｍ／ｚ：３８８（Ｍコ“。

３７０　（Ｍ−Ｈ５Ｉ（Ｊ　）“ ３５５　ＣＭ−ＨｇＯ−ＣＨａ　）” またｍ／ｚ＝１２４より３−ケト−４−エンの存在が確
認され、ｍ／Ｚ＝６０より−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨの存在が
ａｍされた。

ＮＭＲスペクトル（９０ＭＨ２）δＤＭＳＯ−ｄ６゜）
（ＭＳ　　　　’ ０．６０　（３Ｈ，ａ　）　１８−ＣＨｓｏ、８６（３
Ｈ，ｄ）２１−ＣＨｓ ｌ、０７　（３）１　、　ｓ　）　１９−ＣＨ５３，７
５（１１４，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ５．５６（Ｉ
Ｈ，自）４−Ｈ １２α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−コラン酸マスス
ペクトルｍ／ｍ：３９０（Ｍ）”。

３７２（Ｍ−Ｈ２Ｏ）“。

３５４（Ｍ−２ＨａＯ）”。

３３９　（Ｍ−２Ｈ鵞０−ＣＨｓ）” ｔ＊ｍ、／ｚ＝６ｏ　ｊ　ｔ）　−ＣＨｘ　−ＣＯＯＨ
ｆ）存在ｄｌｌｌＷｔすｔＬｆｉニー。

ＮＭＲ２ベク）ル（９０ＭＨｚ）ａＤＭＳＯ”ＨＭＳ　
　　　’ ０．５７（３Ｍ、１１）１８−ＣＨａ ｏ、８３（３Ｈ，ｄ）２１−ＣＨａ ｏ、８９（３Ｈ，ａ）ｔ９−ＣＩ（ａ ３．７６　（ＩＨ，ｔ　、　、ｙ＝ａｎｚ）１２β−Ｈ
第１図のクロマトグラムにおける各ピークの面積比を積
分針（高滓製作所製、高滓クロマトパックＣ−ＲＩＡ）
で求め、この面積比から得られたデオキシコール酸の酸
化生成物の収量及び未変換のデオキシコール酸の残存量
を算出すると次表のとおりである。

実施例２ エアロモナス・ハイドロフイラＤ−２３８１１ａ（ｉり
代すにエアロモナス・プンクタタＤ−２９８菌株（微工
研菌寄第６１５１号）を用いた以外は実施例１と同゛様
の方法に２リゾオキシコール＠３１からその酸化生成物
及び未変換のデオキシコール酸の混合物１．０２Ｆを得
た。

１配の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えて１憾溶液とし、この溶液２０μｍをミクロボンダパ
ックＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフィ
ー（米国ウォーターズ社製、１（ＬＧ−ＧＰＣ−２４４
１１ｉ）に注入し友。移動相として…４．０に調整した
水／メタノールの２５／７５　容量坊の混合液を流速１
ｇ／／分で流し、検出を行なった。以下、実施例１と同
様の方法によシ得られたデオキシコール酸の酸化生成物
の収量及び未変換のデオキシコール酸の残存量を求めた
。その結果を次表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたデオキシコール酸の酸化生
成物及び未変換のデオキシコール欽の液体クロマトグラ
ムを表わす。 ０　　３　６　　　ｑ　　１２１５　　／２ｒ　　２１
保蒋４閂扮） 手続補正書（１発） 昭和５７年　１月１１日 特許庁長官島田春樹殿 ■、事件の表示 昭和５６年特許願第１８１７８３号 ２、発明の名称 １２β−ヒドロキシアンドロスｌｌ−１，４−ジエン−
３，１７−ジオンの製造方法 倉敷市酒津１６２１番地 （１０８）株式会社り　ラ　し 代表取ｓｉ役岡林次男 ４、代理　人 株式会社クラレ特許部 電、、話東京０３　（２７７）　３１８２６、補正の内
容 （１）　明細書第１頁第６〜１４行の記載（特許請求の
範囲）を別紙のとおり訂正する。 （２）　　明細書第２頁第２行における「主炭素源とし
て」を削除する。 （８）　　明細書第１９貞最下行における［Ｍ−Ｈ２Ｏ
−ＣＨａ　Ｊをｌ　Ｍ−２Ｈ２０Ｊに訂正する。 以上 （別紙）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２β
   −ヒドロキシアンドロースタ−１，４−ジエン−３，１
   ７−ジオンを生産するエアロモナス属に属する細菌を、
   主炭素源としてデオキシコール酸及び／又はその塩を含
   む培地に培養して１２β−ヒドロキシアンドロスタ−１
   ，４−ジエン−３，１７−ジオンを生成、せしめ、これ
   を採取することを特徴トスる１２β−ヒドロキシアンド
   ロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの製造方法
   。