JPS59150340A - Ａｔｌａ抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、成人型（ヒト）ＴＭＡ胞性白面病間達抗原（
Ａｄｕｌｔ　　Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｌｅｕｋｅｍｉａ　　
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＡｎｔｉｇｅｎ：　ＡＴ　ＬＡ　
）に特異的な新規な抗体に関する。

本明ｉ書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関して略号で表示する場合はＩＵＰＡＣ，
ＴＵＢの規定或いは当該分野における慣用記号に従うも
のとし、その例を次に挙げる。またアミノ酸等に関して
光学異性体がありうる場合は、特に明記しなければＬ体
を示すものとする。

ｐ　ｒｏ　；プロリン Ｖａｔ：バリン Ｍｅｔ；メチオニン ）１ｉｓ；ヒスチジン ＧＩＶニゲリシン Ａｌａ：アラニン ＴＯ８；Ｉ）−トルエンスルホニル基 Ｂ　ｏｃ　；第３級ブトキシカルボニル基ヒト白血病ウ
ィルス（ＡＴＬＶ又はＨＴＬＶ）は、成人型（ヒト）Ｔ
細胞性白血病（ＡＴＬ又はＨＴＬ）の患者のＴ＠胞の培
養液中及び該細胞と正常Ｔ細胞との混合培養により確立
されたＡＴＬ細胞の培養液中に見出され、発病との関連
が注目されているウィルスである。該ウィルスあるいは
、上記ＡＴＬ又はＨＴＬに特異的なものとして、近年数
種の関連蛋白（ＡＴＬＡ）が報告された（Ｍ。

Ｙｏｓｈｉｄａ　　ｅｔ　　ａｔ、　　Ｐｒｏｃ　、　
Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ、、ＬＪＳＡ、　　　Ｖｏｌ、７９．２０３１−
２０３５、　　Ｍａｒｃｈ（１９８２）　　、Ｓ、　　
０ｒｏｓｚｌａｎｅｔ　　ａｔ、同Ｖａｔ、７９．１２
９１−１２９４゜Ｆｅｂｒｕａｒｙ　　（１９Ｂ　２　
）及び厚生省癌研究助成金によるシンポジウム；成人Ｔ
ｌｌ胞白血病、リンパ種（ＡＴＬ）とその病因、ライフ
サイエンスセンター出版、Ｉ）り１３７−１３８、昭和
５８年１月５日発行〕。

本発明者等は上記ＡＴＬＡを特異的に測定できる系の開
発及びＡＴＬＡの精製を目的として該ＡＴＬＡに特異的
に反応する抗体を得るべく鋭意研究を進めてきた。その
過程において、上記ＡＴＬＡの抗Ｊｕｌ白のひとつとし
て知られ、ρ２４と呼ばれている蛋白のＮ−末端ペプチ
ド偵を有するある特定のペプチドを合成し、これをハプ
テンとして作成した抗原から所望のＡＴＬＡに特異的な
抗体が収得できることを見い出した。本発明はこの知見
に基づき完成されたものである。

即ち、本発明は一般式 ％式％ （１） 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Ｔ　ｙｒｌを示す。〕で表
わされるヒト白血病ウィルス関連ペプチドおよびその誘
導体から選ばれた化合物と担体との複合体からなる免疫
抗原を哺乳動物体に投与し、生成する抗体を採取するこ
とを特徴とするＡＴＬＡ抗体の製造法に係る。

本発明によれば入手容易な市販のアミノ酸を利用して簡
単な操作で容易に合成することができる上記一般式（１
）で表わされるペプチドをハプテンとして用いて作成し
た免疫抗原を用いることに基づいて、ＡＴＬＡ、殊にｐ
２４に特異反応性を有する抗体を、容易に、大量にしか
も安定して収得することができる。該特異抗体は、これ
を例えばアフィニティークロマトグラフィー用担体と結
合させて、該クロマトグラフに利用する等によりＡＴＬ
Ａの精製における特異抗体として使用でき、また該ＡＴ
ＬＡの各種免疫測定法における特異抗体として使用でき
、ＡＴＬ又はＨＴＬウィルス感染の診断、ひいては、こ
れ等ＡＴＬ又はＨＴＬに関連する疾患の診断、研究等に
有用である。

一般式（１）で表わされるペプチドは、通常のペプチド
合成法、具体的には「ザ　ペプチド（Ｔｈｅ　　Ｐｅｐ
Ｎｄｅｓ　）　Ｊ第１巻（１９６６年）（Ｓ　ｃｈｒｏ
ｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌ　ｕ１１ｋｅ著、Ａ　ｃａｄｅｉｉ
ｃ　　　ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）或いは「ペプチド合成」
〔東屋ら署、丸善株式会社（１９７５年）〕に記載され
る如き方法に従い、例えばアジド法、クロライド法、酸
無水物法、混酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（
ｐ−ニトロフェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法等）、ウ
ッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール
法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（ＨＯＮＢ、）
−１０Ｂｔ、ＨＯ８ｕ　）法等により製造できる。上記
方法においては、固相合成法及び液相合成法のいずれを
も・　適用できる。固相合成法を採用する場合、ＤｃＣ
法、活性エステル法又はＤＣＣ／アディティブ法等によ
るのが好ましい。通常本発明に利用するペプチドは、上
記した一般のポリペプチドの合成法に従い、例えば末端
アミノ酸に順次１個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステ
ップワイズ法により、又は数個の７ラグメントに分けて
カップリングさせていく方法により＠造される。より詳
細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ末端アミ
ノ酸、即ちプロリンをそのカルボキシル基によって、不
溶性担体に結合させる。不溶性担体としては、反応性カ
ルボキシル基と結合性を有するものであれば特に限定は
なく、例えばり００メチル樹脂、ブロモメチル樹脂等の
ハロゲノメチル樹脂やヒドロキシメチル樹脂、フェノー
ル樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジ
ド化樹脂等を使用できる。次いでアミノ保ｍ基を除去し
た後、一般式（１）で表わされるアミノ酸配列に従い順
次アミノ基保護アミノ酸を、その反応性アミノ基及び反
応性カルボキシル基との綜合反応により結合させ、一段
階ずつ合成し、全配列を合成した後、ペプチドを不溶性
担体からはずすことにより製造される。

上記においてヒスチジンは、その側鎖官能基を保護して
おくのが好ましく、これは通常の保護基により保護され
、反応終了後部保護基は脱離される。また反応に関与す
る官能基は、通常活性化される。これら各反応方法は、
公知であり、それらに用いられる試薬等も公知のものか
ら適宜選択される。

アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカル
ボニル ニル トキシベンジルオキシカルボニル ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボ
ニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、０
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル基等が挙げられる。

ヒスチジンのイミノ基の保護基としては、例えばＴｏｓ
，ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル、トリチル基
等が挙げられる。

チロシンの水酸基は、例えばアセチル、ベンゾイル基等
によるエステル化又はベンジル、テトラヒドロピラニル
基等によるエーテル化により保護することができるが、
必ずしも保護する必要はない。

カルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば対
応する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジ
ド、活性エステル（メチルアルコール、エチルアルコー
ル、ベンジルアルコール、ペンタクロロフェノール、ｐ
−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２．３−ジカルボキシイミド等との
エステル）等が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は
、縮合剤例えばジシクロへキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテトラエチ
ルピロホスフィン等の存在下に実施し得る場合もある。

以下、一般式（１）のペプチドの製造例につき反応行程
式を挙げて具体的に説明する。

〔反応行程式−１〕 Ａ−Ｐｒｏ−ＯＨ　　　　　（イ） Ａ−Ｐｒｏ−Ｒ’　　　　　（Ｄ） ↓ Ｈ−Ｐｒｏ−Ｒ’　　　　　（Ａ） ↓　Ａ　−　Ａ　Ｉａ　−　Ｏ　Ｈ　　　（　二）Ａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｒ’　　　（＊）−　Ａ　Ｉａ　−　
Ｐ　ｒｏ　−　Ｒ　’　　　　（　Ａ．　）−Ａ　ｌａ
　−　Ｐｒｏ　−　Ｒ　’　　　　　（ト）−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｒ’　　、　　　（す）↓ Ｈ−ＴＶｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ　　　　　（
１ａ　）〔式中Ａはアミノ基の保護基、Ｂはヒスチジン
のイミノ基の保護基及びＲ１は不溶性担体を示す。〕上
記において、Ａの好ましいものとしてはＢＯＣｌｔｅｒ
ｔ−アミルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル基等を、Ｂの好ましいものとしてはＴ
ＯＳ基等を、またＲ１の好ましいものとしてはクロロメ
チル化ポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレン等
をそれぞれ例示することができる。

上記方法において、アミノｍ＜イ）と不溶性担体Ｒ１と
の反応は、常法に従いアミノｉ！（イ）の反応性カルボ
キシル基を利用してこれをＲ１と結合させることによっ
て行なわれる。該反応は適当な溶媒中、例えばトリエチ
ルアミン、カリウムｔｅｒｔーブトキシド、炭酸セシウ
ム、水酸化セシウム等の塩基性化合物の存在下に行なわ
れる。溶媒としては例えばジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン、テトラヒト０フラン、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等又はこれ
らの混合溶媒等を例示することができる。上記反応は、
通常Ｏ〜８５℃、好ましくは２５〜８０℃程度、数分〜
２４時間程度で終了する。アミノ酸と不溶性担体との使
用割合は通常後者１当鵠に対して前者を過剰色、一般に
１〜３倍当量とするのがよい。

かくして得られる一般式〈口）の固相化アミノ酸の保護
基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。該方法とし
ては例えばパラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金屈ナトリウムによる還元
等の還元的方法、１〜リフルオロ酢酸、塩化水素酸、弗
化水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸による
アシドリシス等を例示することができる。上記触媒を用
いる水素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜４０℃にて
行ない得る。触媒の使用量としては通常１１００１Ｉ１
〜１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜４８時間程度で
反応は終了する。また上記アントリシスは、無溶媒下、
通常０〜３０℃程度、好ましくはＯ〜２０℃程度で約１
５分〜１時間程度を要して行なわれる。酸の使用ｍは原
料化合物に対し通常５〜１０倍量程度とするのがよい。

該アシドリシスにおいて保護基Ａのみを脱離する場合は
酸としてトリフルオロ酢酸又は塩化水素酸を使用するの
が好ましい。更に上記液体アンモニア中金屈ナトリウム
による還元は、反応液がパーマネントブルーに３０秒〜
１０分間程度呈色しているような量の金属ナトリウムを
用い、通常−４０℃〜−７０℃程度にて行ない得る。

次いで得られる一般式（ハ）の固相化アミノ酸とアミノ
酸（ニ）（もしくはそのカルボキシル基の活性化された
もの）との反応は、溶媒の存在下に行なわれる。該溶媒
としては、ペプチド縮合反応に慣用される公知の各種の
もの、例えば無水ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）　、ピリジン、クロロホルム、ジ
オキサン、ジクロロメタン、テトラヒト０７ラン、酢酸
エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸ト
リアミド或いはこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。また該反応は、必要に応じて、通常のペプチド結
合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ　、Ｎ−ジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、Ｎ−エチル−
Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチル−３
−ジイソプロピルアミノカルポジイミド、１−シクロヘ
キシル−３−（２−モルホリニル− ボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在
下に行なうことができる。アミノ１ｍ（ハ）とアミノｍ
＜二）との使用割合としては、特に限定はないが、通常
前者に対して後者を等モル量〜１０倍モル量、好ましく
は答モルＤ〜５倍モルａとするのがよい。脱水縮合剤の
使用量も特に限定はなく、通常アミノ酸（二）に対して
、好ましくは等モル量程度使用される。反応温度はペプ
チド結合形成反応に使用される通常の範囲、一般には約
り℃〜約６０℃、好ましくは約り℃〜約４０℃の範囲か
ら適宜選択される。反応時間は一般に数分〜３０時間時
間上される。

かくして得られる一般式（ホ）のペプチドは、上記と同
様に保護基Ａの脱離後、一般式（１）で表わされるアミ
ノ酸配列に従い、Ａ　−　Ｇ　ｌｙ−　Ｏ　Ｈ、Ｂ　　
　　　　　　　　　　　　　　ＢＡ−１−１ｉｓ−ＯＨ
，　Ａ−Ｐｒｏ−ＯＨ，　Ａ−！ｉｓ　−ＯＨ，Ａ−Ｍ
ｅｔ−ＯＨ，Ａ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ａ−ｐｒｏ−ＯＨ及び
Ａ−ＴＶｒ−ＯＨ（７）各７ミ／酸もしくはそのカルボ
キシ基の活性化されたものと順次縮合反応され、斯くし
て一般式（す）で表わされるペプチドに誘導することが
できる。これら縮合反応及び保護基Ａの脱離反応は、そ
れぞれ前記した方法と同様にして行なわれる。

また得られるペプチド（す）は、同様にして保護基への
脱離、保護基Ｂの脱離及び不溶性担体Ｒ１の脱離により
、式（１）中ＲがＨ−１ｒ基を示すペプチド（１ａ）に
誘導される。ここで保護基Ｂの保ｎ基及び不溶性担体Ｒ
１の脱離反応は、保護基Ａの脱離反応と同様に行ない得
、この場合酸として弗化水素又は臭化水素酸を用いるの
が好ましい。

また一般式（１）中Ｒが水素原子を示すペプチドは、上
記反応において得られる一般式（ト）のペプチドから、
上記と同様にして、保護基Ｂ及び不溶性担体Ｒ１を脱離
することにより得ることができる。尚、上記方法におい
て使用される各アミノ酸は、いずれも公知の市販品でよ
い。

以上のようにして製造された一般式（１）のペプチドは
、反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽出、分配
、カラムクロマトグラフィー等により単離精製される。

かくして得られるペプチドは、これに１２５１．１３１
１等の放射性物質、パーオキシダーゼ（ＰＯＸ）、キモ
トリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グリ
セロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ、
ホスホリラーゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ　５Ｐ−Ｎａｓｅ　、β
−ガラクトシターセ、グルコース−６−フォスフニード
ブハイドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等
の各種酵素試薬等を導入することにより、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）法又はエンザイムイムノアツセィ（
ＥＩＡ）法において用いられる標識抗原として利用でき
る。上記放射性物質の導入は、通常の方法により実施で
きる。例えば放射性ヨードは、クロラミンＴを用いる酸
化的ヨード化法（Ｗ、Ｍ。

）Ｊｕｎ℃ｅｒ　ａｎｄ　Ｆ　、　Ｃ、Ｇ　ｒｅｅｎｗ
ｏｏｄ　；　Ｎ　ａｔｕｒｅ。

１９４　．４９５　（１９６２）、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、
Ｊ、。

８９　．１１４　、（１９６３）参照〕等によりペプチ
ドに導入される。該方法は具体的には、適当な溶媒例え
ば０．２Ｍ　リン酸緩衝液（１）　Ｈ−７，４）等の溶
媒中、クロラミンＴの存在下室温付近にて１０〜３０秒
程度で行なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラ
ミンＴの使用割合は、例えばチロシン１個当り放射性ヨ
ード１個を導入する場合には、ペプチド中に含まれるチ
ロシン分子１ナノモルに対して放射性ヨードを１ミリキ
ユ一リー程度、クロラミンＴを１０〜１００ナノモル程
度用いるのがよく、またチロシン１個当り放射性ヨード
２個を導入する場合には、ペプチド中に含まれるチロシ
ン分子１ナノモルに対して放射性ヨードを２ミリキユ一
リー程度、クロラミンＴを１０〜１００ナノモル程度用
いるのがよ（、Ｎ。斯くして製造される放射性ヨードに
より標識化されたペプチドは、通常の分離手段、例え【
ｆ抽出、分配、カラムクロマトグラフィー、透析等によ
り単離精製される。このようにして得られるペプチドは
必要ならば凍結乾燥させて保存しておくこともできる。

酵素試薬の導入は、通常のカップリング法例えばエルラ
ンガー（Ｂ、　Ｆ、　Ｅｒ１ａｎＣＩｅｒ　）らの方法
（Ａｃｔａ、Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、５ｕｌ）ｐｌ、
、１６８　．２０６（１９７２））及び力ロール（Ｍ、
　）−１，Ｋａｒｏｌ）らの方法（Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａ
ｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　Ｃｉ、、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　、。

５７　．７１３　（１９６７））等の公知の方法によっ
て行なうことができる。すなわち、ペプチドと酵素とを
Ｎａｌ０ｔ等の酸化剤の存在下、ｐｔ−１４〜６の緩衝
液、例えば１ｆｌ１Ｍ酢ＷＩＭ衝液（ｐＨ４，４）中で
、室温付近で２〜５時間反応させ、次いでＮａ　ＢＨム
等で還元することによって行なわれる。酵素はペプチド
１モルに対して１〜３倍モル量程度用いられる。酸化剤
はペプチドの１００〜３００倍モル程度、還元剤は酸化
剤の１〜２倍モル程度用いられるのが好ましい。斯くし
て製造される酵素により標識化されたペプチドは、上記
放射性ヨード標識ペプチドと同様に単離精製され、保存
することができる。

以下、一般式（１）のペプチドをハプテンとして利用し
た免疫抗原の製造方法につき詳述する。

上記免疫抗原は一般式（１）のペプチドをハプテンとし
、これをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な担
体と反応させることにより製造される。上記においてハ
プテンに結合される担体としては、通常抗原の作成に当
り慣用される高分子の天然もしくは合成の蛋白質を広く
使用できる。

該担体としては例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブ
ミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類：馬血清
グロブリン、牛血溝グロブリン、ウサギ血清グロブリン
、人血清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の
血清グロブリン類：馬チログロブリン、牛チログロブリ
ン、ウサギチログロプリン、人チログロブリン、ヒツジ
チログＯプリン等の動物のチログロブリン類：馬ヘモグ
ロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘ
モグロブリン類；キーホールリンベットヘモシアニン（
ＫＬＨ）等の動物のヘモシアニン類二回虫より抽出され
た蛋白質（アスカ−リス抽出物、特開昭５６−１６４１
４号公報、Ｊ、　　ｌｎｕ＋＋ｕｎ、、　　１１１　．
２６０〜２６Ｂ（１９７３）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、１２
２　．３０２〜３０８　（１９７９）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
、、９８　．８９３〜９００　（１９６７）及びＡ　ｍ
、　Ｊ　、　Ｐ　ｈｙｓｔｏ＋、。

１９９　．５７５〜５７８（１９６０）に記載されたも
の又はこれらを更に精製したもの）：ポリリジン、ポリ
グルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン
又はオルニチンを含む共重合体等を挙げることができる
。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。

具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合させる、例
えばグリオキサール、マロンジアルデヒド、ゲルタール
アルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド類；チオール基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばＮ　　、Ｎ’−０−フェニレン
ジマレイミド、Ｎ　。

ＮＺ　　−ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマレイミ
ド化合物；アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、
例えばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、４−（マレイミドメチル）−シク
ロヘキサン−１−カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスク
シンイミドエステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル類ニアミノ基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬、例えばＮ　、Ｎ−ジシクロへ
キシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−ジメチル
アミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピ
ルアミノカルボジイミド、１−シクロへキシル−３−（
２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤等を挙げることができる
。また上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジア
ゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムアリールカルボ
ン酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬、例えば上記
脱水縮合剤とを組合せたものも使用可能である。

上記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくはｐＨ
７〜１０の通常のＩ！ｊ液中、好ましくはｐＨ８〜９の
緩衝液中、０〜４０℃、好ましくは室温付近で行なわれ
る。該反応は通常約１〜２４時間、好ましくは３〜５時
間で完結する。上記において用いられる代表的緩衝液と
しては、次のものを例示できる。

０．２Ｎ水酸化ナトリウム−０，２Ｍホウ＆−０，２Ｍ
塩化カリウム緩衝液、 ０．２Ｍ炭酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ塩
化カリウム緩衝液、 ０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウムー０．２Ｍホウ酸−０，
０５Ｍ塩化ナトリウムＭ衝液、０．１Ｍリン酸二水素カ
リウム−０，０５Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体粘合試薬及び担
体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハプテンに
対して担体を１〜６倍重量程度、好ましくは１〜５倍重
９程度、及びハプテン−担体結合試薬を５〜１０倍モル
程度用いる−のがよい。

上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合体からな
る所望のＡＴＬＡ免疫抗原が収得される。

反応終了後骨られる免疫抗原は常法に従い、例　゛えば
透析法、ゲル濾過法、分別沈澱法等により容易に単離精
製できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法により保存で
きる。

斯くして得られるＡＴＬＡ免疫抗原は、通常蛋白質１モ
ルに対して一ペプチドが平均５〜２０モル結合したもの
であり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の高い
所望の本発明ＡＴＬＡ抗体を再現性よく製造可能とする
ものである。特に上記蛋白質に対するペプチドの結合モ
ル比がに８〜１５のものは、特異性が一層高く高力価、
高感度の抗体を作成し得るものであり好ましい。

上記で得られる免疫抗原による本発明のＡＴＬＡ抗体の
作成は、以下の如くして行なわれる。即ち上記抗原を哺
乳動物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これを
採取することにより実施される。

抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特に制限は
ないが、通常ウサギやモルモットを用いるのが好ましい
。抗体の産生に当っては、上記により得られる免疫抗原
の所定量を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイント
の補助液 （Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ　’　ｓ　Ａｄｊｕ
ｖａｎｔ　）と混合して懸濁液を調整し、これを哺乳動
物体に投与すればよい。例えばウサギに上記懸濁液を皮
肉注射（抗原のＱとして０．１〜５ｍｇ／回）し、以後
２週間毎に２〜１０ケ月、好ましくは４〜６ケ月間投与
し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最
終投与後、抗体が多量産出される時期、通常上記最終投
与の１〜２週間経過後、免疫化された動物から採血し、
これを遠心分離後、血清を分離することにより行なわれ
る。上記によれば、用いる免疫抗原の特殊性に基づいて
、ＡＴＬＡ。

ことにｐ２４に対して優れた特異性を有し、高力価、高
感度の抗体を収得できる。

かくして得られる本発明のＡＴＬＡ抗体は、例えばこれ
をＲＩＡ法、ＦＩＡ法等に利用してＡＴＬＡの定量を高
精度をもって可能とする。また該抗体は、これを酵素ま
たは螢光物質で標識することによってＦＩＡ法、７０−
レツセンスイムノアツセイ（ＦＩＡ）法等に使用できる
。さらに該抗体は公知の不溶化させる物質と反応させて
不溶化抗体とすることもできる。

以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式（１）で
表わされるペプチドの製造例及びこれにより得られるペ
プチドからの抗原及び該抗原からの抗体の製造例を挙げ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

尚、各製造例におけるＲｆ値はシリカゲル上のＨ層りロ
マトグラフィーにて下記混合溶媒を用いて測定したもの
である。

Ｒｆ’・ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５）Ｒｆ
２・・・ｎ−ブタノール−酢酸−ビリジン−水（１５：
３：１０：１２） くペプチドの製造〉 製造例　１ ■　カリウム　ｔｅｒｔ−ブトキシド５．８８ミリ当量
のＤＭＳＯ溶液１４鵬にＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ１，４２
１Ｊを溶解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団
法人蛋白質研究奨励金＞５（］を加えて、８０℃で３０
分反応させる。樹脂をＤＭＳＯ１５０％酢ｖ１／クロロ
ホルム、塩化メチレンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥
して５．２７ｏのＢｏｃ−ｐｒｏ−樹脂を得る。

一部を加水分解後アミノ酸分析を行なった結果アミノ酸
０．３６ミリモル／ｇ樹脂であった。

■　上記■で得たＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂４ｇをクロロホ
ルム３０１１Ｑで３回洗浄後、５０％トリフルオロ酢１
　（ＴＦＡ）のクロロホルム溶液３０舖に加え、室温で
２０分間反応させる。樹脂をりＯＯホルム３０１１１０
で１回、塩化メチレン３０四で５回、１０％トリエチル
アミンの塩化メチレン溶１３０１１１Ｑで３回、次いで
塩化メチレン３０鵬で６回それぞれ洗浄してＨ−ｐｒｏ
−樹□脂を得る。

Ｂｏｃ　−Ａ　ｌａ　−ＯＨの０．６８ｏを塩化メチレ
ンに溶かした溶液２５−に上記Ｈ−ｐ　ｒｏ−樹脂を加
え、次いでＤＣＣの０．７４Ｑを塩化メチレンに溶かし
た溶液５鵬を加え室温で２時間反応させる。

樹脂を塩化メチレン３０ＩＩ１１２で６回洗浄後、Ｂｏ
ｃ−Ａｌａ−ＯＨの０．６８１１１及び１−ヒト０キシ
ベンゾ１−リアゾール０．５５１１１の塩化メチレン溶
液２５戒に加え、次いでＤＣＣの０．７４（ｌを塩化メ
チレンに溶かした溶液５鵬を加えて再度同様に反応させ
るに１カツプリング法）。樹脂を塩化メチレンで充分に
洗浄してＢｏｃ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ−樹脂を得る
。

■　上記■と同様にして、Ｂ　ｏｃ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ
　ｒｏ−樹脂の脱３ｏｃ化を行ない、次いで下記アミノ
酸を順次縮合及び脱Ｂｏｃ反応に付す。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ０，６３゜ Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ１，４７Ｑ １ ｏｓ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ０，７７Ｑ Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ１，４７Ｑ ｏｓ Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨＯ，９０ｇ Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ０，７ＢＱ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＯ，、７７ｉ１１ｏｓ 斯くしてＨ−ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ
−ｏｓ Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ−樹脂の
２．２ｇを得る。

これにアニソール２Ｉｌ１２、弗化水素２５ｍ０および
エタンジチオール０．５ｍ１２を加え、−２０℃で３０
分、次いで０℃で３０分反応させた後、得られるペプチ
ドをセファデックスＧ−２５（ファルマシア社、溶出液
１０％酢酸水溶液）ＣＭ−セファデックスＣ−２５（フ
ァルマシア社：溶出液、０．１〜０．５ＭＩ￥酸アンモ
ニウム水溶液、湯度勾配、Ｉ）Ｈ＝４）次いでμｍボン
ダパックＣ−１８（ウォーターズ社）を用いたＨＰＬＣ
（溶出液：０．０１％酢酸アンモニウム水溶液；アセト
ニトリル−７０：　３０）にて特製して、Ｈ−Ｐ　ｒ。

−Ｖ　ａｌ　−Ｍ　ｅｔ　−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｇ　＋ｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐｒｏ−ＯＨ（以下
「ペプチドＡ」と呼ぶ）３４１■を得る。

Ｒｆ値： Ｒｆｌ＝０．０３　　　　Ｒｆ２−０．２７元素分析値
： （Ｈ−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−Ｍｅｔ　−Ｈｉｓ　−Ｐｒｏ
　−Ｈｉｓ　−Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　０Ｈ−
ＣＨ３ＣＯ２Ｈ・５Ｈ２０として）： Ｃ（％）　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％） 理論値　　４８．３８　７．１１　１６．６７分析値　
　４８．１２　７．２８　１６．３９製造例　２ Ｏ８ 製造例１で得たＨ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ　
−Ｏ８ Ｐ　ｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　ｌａ−Ｐ　ｒｏ−樹
脂１．１ｇ及びＢｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−ジクロロベン
ジル）−ＯＨの１．０６（＋を前記製造例１−■と同様
にして二重カップリング反応させる。次いで１−■と同
様にして、脱保護基及び鋭樹脂反応を行ない、同様に精
製して、Ｈ−Ｔｙｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　ＬＶ−Ａ　Ｉａ
　−Ｐ　ｒｏ　−ＯＨ（以下「ペプチドＢ」と呼ぶ）１
８３ｍｇを得る。

Ｒｆ値： Ｒｆｌ＝０．０４　　　Ｒｆ２＝０．２９元素分析値： （Ｃｓ　＋　Ｈｙ　２０＋　２　Ｎｔ　−８・ＣＨ３Ｃ
Ｏ０Ｈ・６Ｈ２０として） Ｃ（％）　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％） 理論値　　５０．０３　６．９６　１５．４０分析値　
　４９．６８　７．０７　１５．９２〈免疫抗原の製造
〉 製造例　１ ペプチドの合成製造例１で得たペプチドＡの５１Ｉ１ｇ
及びアスカ−リス抽出蛋白２５ｍ（］を００．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液Ｄ　Ｈ＝７．０）３．０−に加え、この溶
液に２％グルタルアルデヒド溶液０．２−を滴下し、室
温で３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留水で
４℃で透析し、凍結乾燥して、免疫抗原２９Ｉｌ１ｇを
得る。以下この抗原を「抗原Ｉ」と言う。

抗原工はアスカ−リス１モルに対してペプチドＡが平均
１０モル結合したものである。尚このペプチドＡとアス
カ−リスとの結合率は、得られる抗原工を更にセファデ
ックスＧ−５０（ｌ出液：生理食塩水、検出：ＯＤ２８
０ｎｍ、流出速度＝３ｍｉｌｌ／時間、分取量：１−づ
つ）でゲル濾過した際、未反応のアスカ−リス及びペプ
チドＡの存在は認められないことより、該ゲル濾過によ
ってアスカ−リスに結合したペプチドＡのフラクション
と他の生成体（ペプチドＡの２量体）のフラクションと
を分離し、ペプチド２Ｑ体の標準濃度の検俸線を作成し
て、上記２量体の量を求め、これを出発原料として用い
たペプチドＡの量から差し引いた値がすべてアスカ−リ
スに結合しているとして求めたものである。以下の抗原
の製造例においてし同様とする。

製造例　２ ペプチドＡ５ｍｇ及びアスカ−リス抽出蛋白２５１Ｉ１
ｇを蒸留水３．０ＩＩｌｆ２に加え、この溶液にジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２００＋ｎｇを加
え、室温で３時間撹拌する。その後反応混合物を一佼蒸
留水で４℃下に透析し、凍結乾燥して、免疫抗ｍ　２８
　ｍｇを得る。以下この抗原を「抗原ＵＪと会う。抗原
■はアスカ−リス１モルに対してペプチドＡが平均１２
モル結合したものである。

製造例　３ アスカ−リス抽出蛋白の代りに、ＫＬＨ（シグマ社）を
使用して、前記製造例１と同様にして免疫抗原を得る。

以下この抗原を「抗原■」と言う。

抗原■はＫ１８１モルに対してペプチド八が平均１０モ
ル結合したものである。

＠造例４ アスカ−リス抽出蛋白の代りに、ＫＬＨ（シグマ社）を
使用して、前記製造例２と同様にして免疫抗原を得る。

以下この抗原を「抗原■」と言う。

抗原■はＫ１８１モルに対してペプチドＡが平均９モル
結合したものである。

製造例　５ アスカ−リス抽出蛋白の代りにＢＳＡを、またペプチド
Ａの代りにペプチドＢをそれぞれ使用して、前記製造例
２と同様にして免疫抗原を得る。

以下この抗原を「抗原Ｖ」と言う。得られた抗原ＶはＢ
５Ａ１モルに対してペプチドＢが平均１５モル結合した
ものである。

〈抗体の製造〉 製造例　１ ■　抗原の製造例１で得た抗原■の１００μ９を１．５
購の生理食塩水に溶解後、これに７０インドの補助液１
−５ｍ１２を加えて調整した懸濁液を３羽の兎（２，５
〜３．０ｋｏ）に皮下投与し、２週間毎に９回周ｍ投与
する。最後の抗原投与後、採血し、遠心分離して抗血清
（本発明ＡＴＬＡ抗体）を得る。８兎に対し、抗体■、
抗体■及び抗体■とする。

■　また、前記抗原の製造例２で得た抗原■を用いて上
記■の抗体製造例と同様にして６羽の兎（２，５〜３．
０ｋｏ）から本発明のＡＴＬＡ抗体を得る。８兎に対し
、抗体■、抗体Ｖ、抗体■、抗体■、抗体■及び抗体■
とする。

■　同様に、前記抗原の製造例３．４及び５で得た抗原
■、抗原■、抗原Ｖを用いて上記■の抗体製造例と同様
にして本発明のＡＴＬＡ抗体を得る。

得られる抗体をそれぞれ抗体Ｘ１抗体ＸＩ及び抗体ＸＩ
とする。

く標識ペプチドの製造〉 ペプチドの製造例２で得たペプチドＢをクロラミンＴを
用いる方法で以下の通り標識化する。

即ち上記ペプチド５μｇの０．５モルリン酸塩鰻ｉＩ液
（ｐ　Ｈ７，５）１０ｔｔＱにＮａ　（＋２５１）（ｃ
ａｒｒｉｅｒ　　ｆｒｅｅ　　Ｎ、　Ｅ、　Ｎ、　）　
１ミリキユーリーの０．５モルリン酸塩緩衝液２０μＱ
を加え、つぎにクロラミン７２０μＱの０．５モルリン
酸塩１衝液２０μＱを加える。室温で２５秒間撹拌して
メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ　２Ｓ２０ｓ　）１００
μｑの０．５Ｍリン酸塩Ｍ衝液２０μＱを加えることで
反応を終わらせる。次いで反応液に１０％の冷沃化ナト
リウム水溶液１０μＱを加え、反応混合物をセファデッ
クスＧ−２５のカラム（１，０〜５０ｃｍ）にかけ（溶
出液０．１％ＢＳＡ及び０．０１％Ｎａ　Ｎ３を含む　
０．２モルアンモニウムアセテートＭ％液、ｐ　Ｈ５，
５）、１２５Ｉで標識されたペプチドＢを得る。

該標識ペプチドの放射活性は、２５５μＣｉ／μｇであ
った。

Ｏ力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定する。

即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で１０．１０２．１０３
．１０４．１０５・・・・・・・・倍に希釈し、これら
のそれぞれ１００μＱに、１２５■標識ペプチド（上記
で得られる標識ペプチドを約９５００ｃｐｍになるよう
に希釈したもの）０．１＋Ｑ及び０．０５モルリン酸塩
Ｍ衝液　（ｐ　Ｈ＝７．４）（０，２５％ＢＳＡ、’Ｉ
Ｏｓ　Ｍ　　ＥＤＴＡ及び０．０２％Ｎａ　Ｎ３を含む
〕０．２−を加え、４℃で２４時間インキュベートし、
生成した抗体と１２５　Ｉ４１１ｉ抗原との結合体を、
デキス１−ランー活性炭法及び遠心分離法（４℃、３０
分間、３０００ｒｐＩ！１）により未反応（結合しない
）１２５■標識ペプチドから分離し、その放ｔＡ線をカ
ウントし、各希釈９度における抗体の１２５１標識ペプ
チドとの結合率（％）を測定する。縦軸に抗体の１２５
ｉ４Ｉ識ペプチドとの結合率（％）及び横軸に抗体の希
釈倍率をとり、各々の８度において結合率をプロットす
る。結合率が５０％となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力
価を求める。抗体■〜Ｘ■について得られた結果を下記
第１表に示す。

第　　１　　表 抗　　体　　　　　力　　価　　　　　抗　　体　　　
　　力　　価Ｉ　　５００００　　■　　３ｏ００ ＩＩ　　　１０００　　■　１５０００ＩＩＩ　　　１
５００　　ＩＸ　　　５０００［９３００００Ｘ　　　
６０００ Ｖ　　　２５００　　ＸＩ　　３０００Ｖｌ　　２００
００　　ＸＩＩ　　８００００抗体のＡＴＬＡ特異性試
験 供試試料として各種濃度のペプチドＡ及び下記ＡＴＬＡ
サンプルを使用する。

ＡＴＬＡ陽性サンプル：ＡＴＬＡ陽性細胞株ＹＡＭ　（
Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２１７．ｐ７３７〜７３９（１９８
２））（７）培養細胞５Ｘ１０”個に生理食塩水３０鶴
を加えてホモジナイズし、次いで１時間遠心分離（１０
５０００）ｌ　）ＬＴ上清を採取し、ＰＢＳで蛋白」を
１０１１Ｊ／１１１１１（この蛋白量は、大板アッセイ
研究所要の総蛋白定量試薬である［トネイン−ＴＰＪを
用いた発色法により測定した）に調整する（以下これを
ｒＹＡＭ上消」とする）。

ＡＴＬＡ陰性サンプル：ＡＴＬＡ陰性細胞株であるＣＣ
ＲＦ−ＣＥＭ　（Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、
　９（８）、ｐ７３１〜７３４　（１９８０））及びＢ
ＡＬＬ−１（Ｎａｔｕｒｅ、　　Ｌｏｎｄｏｎ　、　２
６７゜８４３〜８４４　（１９７７））を上記と同様に
処理して得た上清を用いる（以下これらをそれぞれｒＣ
ＥＭ上清」及びＦＢＡＬＬ上漬」とする）。

また標準希釈剤として０．２５％ＢＳＡ、５ミリモルＥ
ＤＴＡ及び０．０２％のＮａ　Ｎ３を含む０．０５モル
リン酸塩Ｍ衝液（ｐＨ７，４）を使用する。

各々の試論管に、標準希釈剤０．　：１ｌＪＩＱ、供試
試料０．１鶴、抗体の製造例１で得た抗体■（最終力価
に相当、即ち５００００倍希釈となるように希釈したも
の）０．１ｍ［？及び１２５■標識ペプチド（上記で得
られるａｍペプチドを約１００００ｃｐｍになるように
希釈したもの）０．１１１１１を入れ、４℃で７２時間
インキュベーションした後、ノーマルブタ血清（ｎｏｒ
ｌｌａｌ　　ｐｏｒｃｉｎｅ　　Ｓｅｒｕｍ　）の０、
１１１１２を加え、次いでデキストランで被膜した活性
炭の懸濁液０．５舖を加え、４℃で３０分間放置し、次
に４℃、３０００　ｒｐｍの条件下に３０分間遠心分離
を行ない、抗体と１２５■標識ペプチドとの結合体（Ｂ
）を、未反応（結合しない）＋２５　Ｉ標識ペプチド（
Ｆ）から分離し、その放射線をカウントし、各供試試料
の濃度及び希釈率における（Ｂ）の百分率を求める。得
られる結果を第１図及び第２図に示す。

各図中縦軸は結合％（Ｂ／Ｂｏ　ｘ　１００　：但し、
ＢＯは供試試料濃度を０とした時の（Ｂ）の百分率）を
、横軸は供試試料濃度（ペプチドＡの濃度、ＹＡＭ上清
、ＯＥＭ上清及びＢＡＬＬ上清の蛋白濃度）を示す。ま
た第１図において曲線（イ）はペプチドＡを示し、第２
図において曲線（ロ）はＹＡＭ上消を、曲線（ハ）はＣ
ＥＭ上消を、曲線（ニ）はＢＡＬＬ上清を夫々示す。第
１図はベプチドＡと抗体■の親和性の高さを示し、第２
図は抗体のＡＴＬＡに対する選択性の高さを示している
。また第２図より本発明抗体はＡＴＬＡ陰性細胞由来の
蛋白に対して交叉はみられないことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はペプチドＡと本発明の抗体との親和性を示す曲
線である。 第２図は、ＡＴＬＡに対する本発明抗体の反応性（特異
性）を示す曲線である。 （以　上） ユ・１−″ 第１０１ 伝賦菖幻侍濱用ｐ睦１） 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　一般式 ％式％ 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−丁ｙｒ基を示す。〕で表わ
   されるヒト白血病ウィルス関連ペプチドおよびその誘導
   体から選ばれた化合物と担体との複合体からなる免疫抗
   原を捕乳勅物体に投与し、生成する抗体を採取すること
   を特徴とするＡＴＬＡ抗体の製造法。