JPS5962558A - ｐ２４関連ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、成人型（ヒト）Ｔ細胞性白血病ウィルス（Ａ
＜１ｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉ
ｒｕｓ　；ＡＴＬＶ又はＩｌｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　
　ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ；ＨＴＬＶ）に関連す
る新規なペプチドに関する。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合ＩＵＰＡＣ，ＩＵ
Ｂ　　の規定或いは当該分野における慣用記号に従うも
のとし、その例を次に挙げる。またアミノ酸などに関し
光学異性体がありうる場合は、特１こ明示しなければＬ
体を示すものとする。

Ｐｒｏ　　；　プロリン ＶａＩ！；　バリン １ｉ１ｅｔ　　；　　メチオニン Ｈｉｓ　　；　　ヒスチジン Ｇｌｙ　；　　グリシン Ａｌａ　；　　アラニン Ｔｏｓ　　；　　Ｔ”ルエンスルホニル基Ｂｏｃ　　；
　　第８級ブトキシカルボニル基ＡＴＬＶ又ハＨＴ　Ｌ
　Ｖは、成人型（ヒト）Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ又はＨ
ＴＬ　）の患者のＴ細胞の培養液中及び該細胞と正常Ｔ
細胞との混合培養により確立されたＡＴＬ細胞の培養液
中に見む１出され、発病との関連が注目されているウィ
ルスである。該ウィルスに特異的なものとして、近年数
種の関連蛋白が報告されたＣＭ、　Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅ
’ｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　Ｕ
ＳＡ、　Ｖｏｌ　、　７９゜２０８１−２０８５．　Ｍ
ａｒｃｈ　（１９８２）及びＳ、Ｏｒｏｓｚｌａｎｅｔ
　ａｌ、同、　Ｖｏｌ、　７９　＋　１２９１−１２９
４　、Ｆｅｂｒｕａｒｙ（１９８２））。

木発明者等は、ＡＴＬ又はＨＴＬの患者血液中には、そ
のウィルス関連蛋白に対する抗体が存在しており、その
抗体は、特にｐ２４と呼ばれる蛋白に対してほぼ金側が
反応性を有していることξこ着目し、該抗原蛋白である
ｐ２４を特異的に測定できる系の開発及びｐ２４の精製
を目的として該ｐ２４に特異的に反応する抗体を得るべ
く鋭意研究を進めてきた。その過程において、ｐ２４の
Ｎ−末端ペプチド鎖を有するある特定のペプチドが、該
ｐ２４のハプテンとなることを見い出し、ここに本発明
を完成するに至った。

即ち、本発明は一般式 ％式％ （１１ 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Ｔｙｒ基を示す。〕で表わ
される新規なペプチドに係る。

本発明の上記一般式（１）で表わされるペプチドは、入
手容易な市販のアミノ酸を利用して、簡単な操作で容易
に合成することができ、該ペプチドからはこれをハプテ
ンとして、抗原を作成でき、該抗原からは、ｐ２４に特
異反応性を有する抗体を収得することができる。従って
本発明のペプチドは、ｐ２４の標準抗原として、や２４
特異抗原の製造用原料として、更にｐ２４の各種免疫測
定法に使用する標ル犬抗原の製造用原料として有用であ
る。

また、上記抗原から収得されるｐ２４特異抗体は、ｐ２
４の各種免疫測定法及びｐ２４の精製法における特異抗
体として使用でき、Ａ　ＴＬ又はＨＴ　Ｌの診断、研究
等にｎ用である。

本発明の一般式（１）で表わされるペプチドは、通常の
ペプチド合成法、具体的には、「ザペプチド（Ｔｈｅ　
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ第１巻（１９６６年）（Ｓｃｈ
ｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ著＊　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　Ｕ、Ｓ、Ａ−’：ｌ　あるいは「
ペプチド合成」〔東屋ら著、丸善株式会社（１９７５年
）〕　に記載される如き方法に従い、たとえばアジド法
、クロライド法、酸無水物法、混酸無水物法、ＤＣＣ法
、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチル
エステル法等）、ウッドワード試薬ｌｌ用いる方法、カ
ルボジイミダゾール法、酸化還元法、Ｄ　ＣＣ／７７’
イテイブ（ＨＯＮＢ％ＨｏＢｔ、ＨＯ５ｕ）法などによ
り、製造できる。上記方法においては、同相合成法及び
液相合成法のいずれをも適用できる。固相合成法を採用
する場合、ＤＣＣ法、活性エステル法、又はＤＣＣ／ア
ディティブ法によるのが好ましい。通常本発明ペプチド
は、上記した一般のポリペプチドの合成法に従い、例え
ば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させる所
謂ステップワイズ法により一又は数個のフラグメントに
分けてカップリングさせていく方法により製造される。

より詳細には例えばまず、Ｃ末端アミノ酸、すなわちプ
ロリンをそのカルボキシル基によって、不溶性担体に結
合させる。不溶＋１：担体としては、反応性カルボキシ
ル基ど結合性を有するものであれば特に限定なく、例え
はクロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂等のハロゲノメ
チル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹月’Ｇ
ｓ　　ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド 次いてアミン保護基を除去した後一般式（１）で表わさ
れるアミノ酸記列に従い順次アミノＩ保護アミノ酸を、
その反応性アミノ基及び反応性カルボキシル基どの縮合
により結合させ、一段階ずつ合成し、４配列を合成した
後、ペプチドを不溶性担体から（ゴずすことにより製造
される。

上記においてヒスチジンは、その側鎖官能基を保尼して
おくのが望ましく、これは通常の保護基により保護され
，反応終了後該保証基は脱離される。また反応に関与す
る官能基は、通常活性化される。之等各反応方法は公知
であり、それに用いられる試薬等も公知のものから適宜
選択し得る。

アミノ基の保誇基としては、例えばカルボベンツキシ、
ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミル
オキシ力ルボニル、インボルニルオキシカルボニル、ｐ
−メトキシペンジルオキンカルボニル、２−クロル−ベ
ンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、０−
ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチ
オイルなどが挙げられる。

ヒスチジンのイミノ基の保醗基としては、例えば’ｒｏ
ｓ、ベンジル基、カルボベンゾキシ基、トリチル基等が
挙げられる。

又、チロシンの水酸基は、例えばアセチル、ベンゾイル
等によるエステル化またはベンジル、テトラヒドロピラ
ニル等によるエーテル化によって保護することができる
が必ずしも保護する必要はカルボキシル基の活性化され
たものとしては、例えば対応する酸クロライド、酸無水
物又は混合酸無水物、アジド、活性エステル（メチルア
ルコール、エチルアルコール、ベンジルアルコール、ペ
ンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリア
シーツ順、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，８
−ジカルボキシイミド等とのエステル）等が挙げられる
。尚ペプチド結合形成反応は、縮合剤例えばジシクロへ
キシルカルボジイミド、カルボジイミダゾール等のカル
ボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフィト等の存在
下に実施し得る場合もある。

以下、反応行程式を挙げて本発明ペプチドの製造をより
具体的に説明する。

く反応行程式−１〉 Ａ−Ｐ　ｒ　ｏ　−ＯＨｆｉｔ Ｇｌｌ−Ａｌａ−Ｐｒ　ｏ−Ｒ’ ↓ 〔式中Ａはアミノ基の保護基、Ｂはヒスチジンのイミノ
基の保護基及びＲ１は不溶性担体を示す。〕上記におい
て、Ａの好ましいものとしてはＢｏｃ。

４ｅｒｔ−アミルオキシカルボニル基等を、Ｂの好まし
いものとしてはＴｏｓ等を、またＲ１の好ましいものと
しては、クロロメチル化ポリスチレン、ヒドロキシメチ
ルポリスチレン等を夫々例示できる。

上記方法において、アミノ酸（１）と不溶性担体Ｒ１と
の反応は、常法に従いアミノ酸（１）の反応性カルボキ
シル基を利用して、これをＲ１と結合させることにより
行なわれる。該反応は適当な溶媒中、例えばトリエチル
アミン、ｔｅｒｔ−カリウムブトキシリ、炭酸セシウム
、水酸化セシウム等の塩基性化合物の存在下に行なわれ
、溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いはこれ
らの混合溶媒等が挙げられる。

該反応は、通常０℃〜８５℃、好ましくは２５〜８０℃
程度、数分〜２４時間程度で終了する。

アミノ酸と不溶性担体との使用割合としては、後者１当
量に対して前者を過ＩＩＪ量、通常１〜８倍当量使用す
れはよい。

かくして得られる一般式（２）の同相化アミノ酸の保護
基Ａの離脱反応は、常法により行なわれる。

該方法としては、例えばアシドリシス（例トリフルオロ
酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスルホン酸、臭化
水素酸等の強酸によるアシドリシス）が挙げられる。該
アシドリシスにおいて保護基Ａのみを脱離する場合は酸
として、トリフルオロ酢酸又は塩化水素酸を使用するの
が好ましい。該反応は無溶媒下、通常θ〜８０℃程度好
ましくは０〜２０℃にて約１５分〜１時間型度を要して
行ない得る。酸の使用量は原料化合物に対し通常５〜１
０倍量程倍量型るのがよい。

次いで得られる一般式（３）の同相化アミノ酸とアミノ
酸（４）（もしくはそのカルボキシル基の活性化された
もの）との反応は、溶媒の存在下に行なわれる。該溶媒
としては、ペプチド結合形成反応に使用しうることが知
られている各種のもの、例えば無水ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、ク
ロロホルム、ジオキサン、ジクロルメタン、テトラヒド
ロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサ
メチルリン酸トリアミド或いはこれらの混合溶媒等を用
い得る。また、該反応は必要に応じ、通常のペプチド結
合形成反応に用いられる脱水縮合剤、例えばＮ、Ｎ−ジ
シクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチル−８
−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、１−シクロへ
キシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボ
ジイミド等のカルボジイミド類等の存在下に行なうこと
ができる。アミノ酸（３）とアミノ酸（４）との使用割
合としては、特に限定されないが、通常前者に対して後
者を等モル量〜１０倍モル、好ましくは等モル量〜５倍
モルｍ使用するのがよい。脱水縮合剤の使用量としても
特に限定なく、通常アミノ酸（３）に対して等モル須程
度使用するのがよい。反応温度はペプチド結合形成反応
に使用され得ることが知られている範囲、通常約０〜約
６０℃、好ましくは約θ〜８０℃の範、囲から適宜選択
される。反応時間は一般に数分〜３０時間程度である。

かくして得られる一般式（５）のペプチドは、上記Ａ−
Ｐｒｏ−ＯＨ及びＡ−Ｔｙｒ−ＯＩ（の各アミノ酸を順
次縮合され、かくして一般式（９）で表わされるペプチ
ドに誘導することができる。これらの縮合反応及び探触
基Ａの脱離反応は、前記したそれらと同様にして行なわ
れる。

ペプチド＋９１は、前記と同様にして、保護基Ａの脱離
、保護基Ｂの脱離及び不溶性担体Ｒ１の脱離により、一
般式（１）中ＲがＨ−Ｔｙｒ基を示す本発明ペプチド（
ｌａ）に誘導される。ここで保護基Ｂの脱離反応及び不
溶性担体Ｒ１の脱離反応は、いずれも前記保鵡基Ａの睨
１ト反応と同様にして実施され、この場合は、酸として
、弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好ましい。

また本発明ペプチドのうちＲが氷菓原子を示す化合物は
、上記反応において得られる一般式（７）のペプチドか
ら、上記と同様にして、保Ｕ・に基Ｂ及び不溶性担体Ｒ
１を脱離することにより得ることができる。向上記名反
応において、使用する各アミル本発明ペプチドは、反応
混合物力）らペプチドの分離手段、例えば抽出、分配、
カラムクロマトグラフィー等により単離精製される。

かくして得られる本発明の合成ペプチドは、こ１２５　
　　　１８１ れに　Ｉ、　　　Ｉ等の放射性物質やパーオキシダーゼ
（ｐｏｘ）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−ＩＪン酸脱水素
酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ　、
　Ｐ−Ｎａｓｅ　＋β−ガラクトシダーゼ、グルコース
−６−フォスフニードブハイドロゲナーゼ、オルニチン
デカルボキシラーゼ等の各種酵素試薬等を導入すること
により、ラジオイムノアッセイ法（ＲＴＡ法）又はエン
ザイムイムノアツセイ法（ＥＩＡ法）において用いられ
る標識抗原として利用できる。上記放射性物質の導入は
、通常の方法により行なわれる。例えば放射性ヨードは
、クロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法［Ｗ−Ｍ、Ｈ
ｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ；Ｎ
ａｔｕｒｅ、１９４，４９５（１９６２）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ。

８９、Ｊ１４（１９６１３）参照〕　等によりペプチド
に導入される。該方法は具体的には適当な溶媒例えば０
．２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）等の溶媒中、ク
ロラミンＴの存在下、室温付近にて１０〜８０秒程度で
行なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラミン１
゛の使用割合は、例えばチロシン当り放射性ヨード１個
を導入する場合には、ペプチド中に含まれるチロシン分
子１ナノモルに対して放射性ヨードを１ミリキユ一リー
程度、クロラミンＴを１０−１００ナノモル程度用いる
のかよく、またチロシン当り放射性ヨード２個を導入す
る場合には、ペプチド中に含まれるチロシン分子１ナノ
モルに対して放射性ヨードを２ミリキユ一リー程度、ク
ロラミンＴを１０〜１００ナノモル程度用いるのがよい
。かくして製造される放射性ヨードにより標識化された
ペプチドは、通常の分離手段例えば抽出、分配、カラム
クロマトグラフィー、透析等により単離精製される。こ
のようにして得られるペプチドは必要ならば凍結乾燥さ
せて保存しておくこともできる。

上記酵素試薬の導入は、通常のカップリング法、例えば
エルランガ−（Ｂ、Ｆ、　ＥＲＬＡＮＧＥＲ）らの方法
ＣＡｃｔａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５ｕｐｐ１．、
１６８　、２０６（１９７２）　〕　　及び力ｏ　−ル
（Ｍ、Ｈ，ＫＡＲＯＬ）らの方法ＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

５７、７１８　（１９６７））等の公知の方法によって
製造される。即ち本発明ペプチドと酵素とをＮａＩＯ４
等の酸化剤の存在下、ＰＨ４〜６の緩衝液、例えば１ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，４）中で、室温付近で、２〜５
時間程度反応させ、次いでＮａＢＨａ等で還元すること
によって行なわれる。酵素はペプチド１モルに対して１
〜８倍モル量程度用い得る。

酸化剤はペプチドの１００〜ａｏＯ倍モル程度及び還元
剤は酸化剤の１〜２倍モル程度用いられるのが好ましい
。かくして製造される酵素により標識化されたペプチド
は、上記放射性ヨード標識ペプチドと同様にして単離精
製及び保存することができる。

以下、本発明の一般式（１）で表わされるペプチドをハ
プテンとして利用するｐ２４特異抗原の製造方法につき
詳述する。

ｐ２４抗原は、上記本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な担体と
反応させることにより製造される。

上記方法においてハプテンに結合される担体としては、
通常抗原の作成に当り慣用される高分子の天然若しくは
合成の蛋白質を広く使用できる。該担体としては、例え
ば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清ア
ルブミン、大血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン等
の動物の血清アルブミン類；馬血清グロブリン、牛血清
グロブリン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン
、ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン類；
馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロ
プリン、大チログロブリン、ヒツジチログロブリン等の
動物のチログロブリン類；馬ヘモグロブリン、牛ヘモグ
ロブリン、ウサギヘモグロブリン、人ヘモグロブリン、
ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘモグロブリン類；キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の動物の
ヘモシアニン類−回虫より抽出された蛋白質（アスカ−
リス抽出物、特開昭５６−１６４１４号公報、Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎ、、　１１１．２６０〜２６８（１９７Ｂ）、Ｊ
。

Ｉｍｍｕｎ、、　１２２．３０２〜８０８（１９７９）
、Ｊ、Ｉｒｒｍｕｎ、＋９８．８９８〜９０［）（１９
６７）及びＡｍ　、　Ｊ　、　Ｐｈｙｓｉｏｌ−＋１９
９．５７５〜５７Ｂ（１９６０）に記載されたものまた
はこれらを更に精製したもの）；ポリリジン、ポリグル
タミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又は
オルニチンを含む共重合体等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。

具体的にはアミノ基とアミ７基とを架橋結合させる、例
えばグリオキサール、マロンジアルデヒド、ゲルタール
アルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド類；チオール基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばＮ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ、Ｎ−ｍ−フェニレンジマレイミド等のシ
マレイミド化合物；アミノ基とチオール基とを架橋結合
させる、例えばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルへ　４−（マレイミドメチ
ル）−フクロヘキサン−１−カルボキシル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル等のマレイミドカルボキシ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物；ア
ミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる通常のペ
プチド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ、Ｎ−
ジシクロへキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−
ジメチルアミノカルボジイミド−ｌ−エチル−８−ジイ
ンプロピルアミノカルポジイミド、１−シクロへキシル
−３−（２−モリポリニル−４−エチル）カルボジイミ
ド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤等を挙げること
ができる。また上記ハプテン−担体結合試薬としては、
ｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムアリー
ルカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬、例
えは上記脱水縮合剤とを組み合わせたものも使用可能で
ある。

上記抗原の製造反応は、例えは水溶液もしくはｐＨ７〜
１０の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ８〜９の緩１Ｉ
Ｉｒ液中で、０〜４０℃、好ましく（ま室温付近で行な
われる。該反応は通常約１〜２４時間、好ましくは８〜
５時間で完結する。上記において用いられる代表的緩衝
液としては、次のものを例示できる。

０．２Ｎ水酸化ナトリウム−〇、２Ｍホウ酸−０．２Ｍ
塩化カリウム綬街液、 ０．２Ｍ炭酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ塩
化カリウム緩衝液、 ０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウムー０．２　Ｍホウ酸−〇
、０５Ｍ堝（ＩＬナトリウム緩衝液、０、１　Ｍリン酸
三水素カリウム−０，０５Ｍ四ホウ酸す）・リウムσ衝
液 上記においてハプテン、ハプデンー担体結合試桑及び担
体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハブテン１
０対しで担体を２〜６倍重量程度、好ましくは８〜５４
ｅ＋！ｌｉ量程度、及びハプテン−担体１１′３合試４
語を５〜１０倍モル程度用いるのがよい。

」−記反応によりハプテン−担体結ａｉ、を薬を仲介さ
せてｌｊ体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合
体から成るｐ２４抗原が収得される。

反応終了後書られる抗原は常法に従い、例えば透析法、
ゲル濾過法、分別沈殿法等により容易に単離精製できる
。また該抗原は通常の凍結乾燥法により保存できる。

かくして得られるｐ２４抗原は、通常蛋白質１モルに対
しペプチドが平均５−、２０モル結合したものであり、
いずれも引き続き再現性よ＜、ｐ２４ｔこ対する特異性
の高い抗体の作成を可能とするものである。特に上記蛋
白質に対するペプチドの結合モル比が１：８〜１５のも
のは、特異性が一層高く高力価、高感度の抗体を作成し
得るものであり好ましい。

上記で得られる抗原による抗体の作成は、以下の如くし
て行なわれる。即ち上記抗原を咄礼動物に投゛与し、生
体内に産生された抗体を採取することにより行なわれる
。

抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特に制限は
ないが、通常ウサギやモルモットを用いるのが望ましい
。抗体の産生に当っては、上記により得られる抗原の所
定量を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイントの補
助？ｌ　（Ｃｏｍｐ　Ｉ　ｅ　ｔ　ｅＦｒｅｕｎｄ’ｓ
　Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して懸濁液を調整し、之を
哺乳動物体に投与すればよい。例えばウサギに上記懸濁
液を皮肉注射（抗原の折として０．５〜５ｍ７７回）し
、以後２週間毎に２〜１０ケ月、好ましくは４〜６ケ月
間投与し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記＠濁
液の最終投与後、抗体が多量産出される時期、通常上記
最終投与の１〜２週間経過後、免疫化された動物から採
血し、之を遠心分離後、血清を分離採取することにより
行なわれる。上記によれは、用いる抗原の特殊性に基つ
いて、ｐ２４に対して優れた特異性を有し、高力価、高
感度の抗体を収得できる。

かくして得られるｐ２４抗体は、例えばこれをＥＩＡ法
、ＥＩＡ法等に利用してｐ２４の定量を面精度をもって
可能とする。また該抗体は、ごれを酵素または蛍光物龜
で標誠することによってＥＩＡ法、フローレツセンスイ
ムノアツセイ（ＦＩＡ）法等に使用できる。さらに該抗
体は公知の不溶化させる物質と反応させて不溶化抗体と
することもできる。

以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式（１）で
表わされる本発明ペプチドの製造例並びにこれを利用し
た抗原及び該抗原からの抗体の製造例を挙げるが、本発
明はこれに限定されるものではない。

尚、各鱈造例におけるＲｆ値はシリカゲル上の薄層クロ
マトグラフィーにて下記混合溶媒を用いて測定したもの
である。

Ｒｆ・・・ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：ｌ：５）Ｒ
ｆ・・・ｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水（１５：
８：１０：１２） くペプチドの製造〉 製造例１ ■　ｔｅｒｔ−ブトキシリ５．８８ミリ当量のＤＭＳＯ
溶〆（１１４ｍｌにＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ１，４２５’
　　を溶解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団
法人蛋白質研究奨励金）５ｙを加えて、８０℃で８０分
反応させる。樹脂をＤＭＳＯ１５０％酢酸／クロロホル
ム、塩化メチレンの順に、充分に洸浄し、減圧乾燥して
５．２７９のＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を得る。一部を加水
分解後アミノ酸分析を行った結果、アミノ酸０．３６ミ
リモル／９樹脂であった。

■　上記■て得たＢｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂４７をクロロホ
ルム８０ｍｆで３回洗浄後、５０％トリフルオロ酢酸の
クロロホルム溶［８０ｍＡに加えＹ温で２０分間反応さ
せる。樹脂をクロロホルム８０ｍ／で１回、塩化メチレ
ン３０ｍ、ｅで５回、１０鴨トリエナルアミンの麹化メ
チレン溶液８０　ｎ＋！”−８回、次いで塩化メチレン
３０ｍ１で６同人々洗浄してＨ−Ｐｒｏ−樹脂を得る。

Ｂｏｃ　−Ａｉａ　−ＯＨＯ，６８９の塩化メチレン溶
液２５ｍ１に上記Ｈ−Ｐｒｏ−材脂を加え、吹いてＤＣ
ＣＯ７４ｇの塩化メチレン溶液５ｍＪを加え室温で２時
間反応させる。樹脂を塩化メチレン８０ｍ１で６回洗浄
後、Ｂｏ　ｃ　−Ａ／ｌ’　ａ　−ＯＨ０，６８！及び
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．５５　ｙの塩化
メチレン溶液２５ｍ１に加え、次いでＤＣＣｏ、７４Ｐ
の塩化メチレン溶液５ｍｌを加えて再度同様に反応させ
る。樹脂を塩化メチレンで十分に洗浄してＢｏｃ−Ａｊ
’ａ−Ｐｒｏ−樹脂を得る。

■　前記■と同様にして、Ｂｏｃ−ＡＪａ−Ｐｒｏ−樹
脂の脱Ｂｏｃを行ない、次いで下記アミノ酸を順次縮合
及び脱Ｂｏ（反応に付す。

Ｂ　ｏ　ｃ−Ｇ１３　ｙ−ＯＨＯ，６８９Ｂｏｃ−Ｐｒ
ｏ−ＯＨ０，７’１９ Ｂｏｃ−ｈ’ｉｅ　ｔ　−ＯＨＯ，９０ＦＢｏｃ−Ｖａ
ｎ−ＯＨＯ，７８ｆ Ｂｏ　ｃ　−Ｐ　ｒ　ｏ−ＯＨ０，７７ｙＯ８ 覗 −Ｈ４ｓ−Ｇｐｙ−ＡＩ！ａ−Ｐｒｏ−樹脂２．２７に
、フッチオール９．５ｍｌ！ヲ加え、−２０℃で８０分
次いで０℃で３０分間反応させる。得られるペプチドを
セファデックスＧ−２５（ファルマシア社、溶出液１０
％酢酸水溶液）、ＣＭ−セファデックスＣ−２５（ファ
ルマシア社；溶出液、０．１−０．５Ｍ酢酸アンモニウ
ム水溶液、濃度勾配、ｐＨ＝４）次いでμｍボンダパッ
クＣ−１８（ウォーターズ社）を用いたＨＰＬＣ（溶出
液；ｏ、ｏｉ％酢酸アンモニウム水溶液ニアセトニトリ
ルツル０：８０）にて精製して、Ｈ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｖａ
ｊ’−Ｍｅ　ｔ　−Ｈｉ　ｓ　−Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｈｉ　
５−Ｇｌｙ−ＡＪａ　−ｐ　ｒ　ｏ−ＯＨＣ以下「ペプ
チドＡ」と呼ぶ）８４１ｍＦを得る。

Ｒｆ値： Ｒｆ’＝０．０８　　　　　　　Ｒｆ　　＝　０．２７
５Ｈ２０として）： ＣＨＮ 理論値（％１　　４８，８８　　７．１１　　１６．６
７分析値（％＋　　　４８．１２　　７．２８　　１６
．８９Ｔｙｒ　（２，６−ジクロルベンジル）−０Ｈ１
，０６５１を前記製造例１−■と同様にして反応させ、
次いでｌ−■と同様にして、脱保護基及び脱樹脂反応を
行ない、同様に精製して、Ｈ−Ｔ　ｙ　ｒ−Ｐ　ｒ　ｏ
−Ｖａｎ−Ｎｅｔ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｒ−Ｇｌｙ−
Ａｈａ−Ｐｒｏ−ＯＨ［以下「ペプチドＢ」と呼ぶ］１
８８ｍ５’　　を得る。

■ Ｒｆ値　０．０４ Ｉ Ｒｆ値　０．２９ 元素分析値　Ｃ５１Ｈ７２０１２Ｎ１４Ｓ−ＣＨａＣＯ
ＯＨ・６　Ｈ２Ｏ（！：として ＣＨＮ 理論イ直（％ｌ　　　　　　５０．０Ｂ　　　　　　６
．９６　　　　　１５．４０実迎ｊ値（％ｌ　　　４９
．６８　　７．（＋７　　１５．９２〈抗原の製造〉 製造例１ ペプチドの合成製造例１で得たペプチドＡ　５　ｍｙ及
びアスカ−リス抽出蛋白２５ｍＦを００５Ｍリン酸ＪＭ
ｆｌ衝ｆ＆　（ｐＨ＝　７．０　）　８．０　ｍｌ！、
に加え、　この溶液に２呪グルタルアルデヒド溶ｒ（ｔ
ｏ、２ｍＪを滴下し、至温で３時間撹拌する。その後反
応混合物を一夜蒸留水で４℃で透析し、凍結乾燥して、
ｐ２４抗原２９ｍ７を得る。（以下、これを抗原■とす
る） この抗原Ｉは、アスカ−リス１モルに対してペプチドＡ
が平均１０モル結合したものである。尚このペプチドＡ
とアスカ−リスとの結合率は、得られる抗原Ｉを更にセ
ファデックスＧ−５０（溶出液：生理食塩水、検出：Ｏ
Ｄ２８０ｎｍ、流出速度：　３ｍ１ｄ１時間、分取Ｊｉ
：１ｍｌずつ）でゲル濾過した際、未反応アスカ−リス
及びペプチドＡの存在は認められないことより、該ゲル
濾過によってアスカ−リスに結合したペプチドＡのフラ
クションと他の生成体（ペプチドＡの２回体）のフラク
ションとを分離し、ペプチド２＠体の標準濃度の検量線
を作成して、上記２情休の魚を求め、これを出発原料と
して用いたペプチドＡの情から差し引いた値がすべてア
スカ−リスに結合しているとして求めたものである。以
下の抗原製造例により得られる各抗原についても同様で
ある。

製造例２ ペプチドＡ３ｍ５’及びアスカ−リス抽出蛋白２５ｍ２
を蒸留水８．０ｍ７？に加え、この溶液にジシクロへキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）２００ｍＳ’を加え、室
温で８時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留水で
４℃で透析し、凍結乾燥してｐ２４抗原２８ｍＦを得る
。（以下これを抗原■とする） 得られた抗原■は、アスカ−リスに対してペプチドＡが
平均１２モル結合したものである。

製造例８ アスカ−リス抽出蛋白の代りにＫＬＨ（シグマ社）を使
用して、前記製造例１と同様番こしてｐ２４抗原を得る
（以下これを抗原■とする）。

得られた抗原■は、ＫＬＨに対してペプチドＡが平均ｌ
Ｏモル結合したものである。

製造例４ アスカ−リス抽出蛋白の代りにＫＬＨを使用して、前記
製造例２と同様にしてｐ２４抗原を得た（以下これを抗
原■とする）。

得られた抗原■はＫ　Ｌ　Ｈに対してペプチドＡが平均
９モル結合したものである。

〈抗体の製造〉 製造例１ 抗原の製造例１で得た抗原■の１００μ７を１．５ｍｌ
の生理食塩水に溶解後、之にフロイントの補助面１．５
ｍｌを加λて調製した懸深・液を、６羽のウサギ（Ｎｅ
ｗ　Ｚｅａｌａｎｃｌ　ｗｈｉｔｅ　ｒａｂｂｉｔｓ）
（２，５〜８．０〜）に皮下投与し、２週間毎に６回向
■投与する。更にその後１カ月毎に８回、最初投与した
量と同量を投与する。最終投与後７日経過してのち試験
動物から採血し、遠心分離して抗血清を採取して、ｐ２
４抗体を得る。

該抗体は、ペプチドＡ１ペプチドＢ及びｐ２４に反応性
を有する。

又、前記抗原■、■及び■を用いて、上記と同様にして
夫々ｐ２４抗体を得た。これらはいずれもペプチドＡ１
ペプチドＢ及びｐ２４に反応性を有していた。

く標識ペプチドの一製造〉 ペプチドの合成製造例２で得たベプチＦＢをクロラミン
Ｔを用いる方法で以下の通り標識化する。

即ち上記ペプチド５μＶの０．５モルのリン酸塩緩衝液
（ＰＨ７，５）１０μ、ＪにＮａＣＩ〕（ｃａｒｒｉｅ
ｒ　　ｆｒｅｅ　Ｎ、Ｅ、Ｎ、）１ミリキユーリーの０
．５モルリン酸塩緩衝液２０μｌを加え、次にクロラミ
ン７２０μ２の０．５モルリン酸塩緩衝液２０μｌを加
入る。室温で２５秒間撹拌して１０゛０μ７のメタ重亜
硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２０５）　の０、５　Ｍ　Ｉ
Ｉン酸塩緩衝液２０μ１１を加えることで反応を終わら
せる。次いで反応液に１０％の７０−沃化す）　ＩＪウ
ム水溶液１０μｌを加え、反応混合物をセファデックス
Ｇ−２５のカラム（１，ＯＸ　５０ｃｍ）にかけ（溶出
ｒ夜０．１％ＢＳＡ及び０．０１％Ｎ　ａ　Ｎ　Ｂを含
む０．２モル°ｒンモニワムアセテート緩衝液、ｐＨ５
，５）、　　■で標識されたペプチドＢを得る。

該標叔ペプチドの放射活性は２５５μＣｉ／μ７であっ
た。

（以上） に・、＋。

代理人　弁理士　三　　枝　　英　　二　４−１“１、
；゛２．′ 手続補正書（自発） 昭和５７年１０月２７日 特許庁長官　　　若（彫和大　　殿 １、事件の表示 昭和５７年特　許　願第１７１３１３　　月２発明（７
）名称　　戸２４関連ペプチド３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０平和ヒル内電話０６−２０３
−０９４１　（代）自　　　発 ６　袖正により増加する発明の数 な　　　し ７°　補正ａｖ　対象　　明細書中発明の詳細な説明の
項８、補正の内容 別紙添附の通り 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書第１０頁第１３〜１４行に「ｔｅｒｔ　−カ
リウムブト中シリ」とあるを「カリウムｔｔｒｔ−ブト
＋シト」と訂正する。

２　明細書第２５頁第１４行に「１ｅｆｔ　−ブト中シ
リ」とあるを「カリウム１ｔｒｔ　−ｊト＋シト」と訂
正する。

（以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　一般式 ％式％ 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Ｔｙｒ基を示す。〕で表わ
   されるペプチド。