JPS5945888A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶性の担体
に酵素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応させる
ことが提案されている。このような酵素の固定化方法の
代表的なものに、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イ
オン結合又は物理吸着によって結合させる担体結合法が
知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通常、セルロース、デキストラン、アガロース等の多
糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス
等の径１顛乃至数ｍｍの粒子であり、このような粒子に
酵素が固定化された固定化酵素は、通常、カラムに充填
され、固定されて、基質溶液と接触されるので、基質が
高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し雛く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問題があ
る。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素の製造方法を提供する
ことを目的とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、（ａｌアクリル
酸エステル又はメタクリル酸エステル５〜９８重量％、
■）この単量体と共重合し得る第１の単量体０〜９０重
量％、ｔｅｌ多官能性内部架橋用単量体１〜２０重量％
、及び（ｄｌ第２の単量体としてのアクリロニトリル又
はメタクリコニトリル１〜６０重量％とからなる単量体
組成を乳化共重合させ、得られる水分散性高分子重合体
粒子をケン化してカルボキシル基を生成させ、次いで、
このカルボキシル基を介して酵素を共有結合にて固定化
することを特徴とする。

本発明においては、アクリル酸エステル及び／又はメタ
クリル酸エステルく以下、（メタ）アクリル酸エステル
と称する。）を１成分とする２以上の単量体組成を、好
ましくは乳化剤の不存在下で乳化共重合し、かくして得
られる水分散性高分子重合体粒子が側鎖に有するエステ
ル基をケン化することにより、その表面に高い密度でカ
ルボキシル基を生成させ、このカルボキシル基を介して
酵素を共有結合により固定化するのである。

ここに、（メタ）アクリル酸エステルとしては、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素又はメチル基を示し、Ｒ２は炭素数
１〜３のアルキル基又はベンジル基を示す。）で表わさ
れるものが好ましく用いられ、特に、（メタ）アクリル
酸エステルが好ましく用いられる。

かかる（メタ）アクリル酸エステルと共重合させる第１
の単量体としては、アクリロニトリル、メタクリレート
リル、及び上記（メタ）アクリル酸エステルを除いて、
これらと共重合性を有し、且つ、得られる共重合体が酵
素反応の行なわれる温度よりも高いガラス転移点を有す
る限りは特に制限されるものではないが、好ましくは、
エチレン、プロピレン、塩化ビニル、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルスチレン
、ビニルトルエン、ブタジェン、イソプレン、アクリル
アミド、メタクリルアミド等の１種又は２種以上が用い
られる。特に、スチレンが好ましく用いられる。但し、
この第１の単量体は、必ずしも単量体成分として単量体
組成に含有される必要はない。

尚、第１の単量体として、重合時の安定化や重合体粒子
の安定化のために、全単量体組成の５重量％以下の範囲
でイオン性基を有する単量体を用いてもよい。かかるイ
オン性基としては、例えば、スルホン酸基、カルボキシ
ル基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級アミ
ノ基等の塩基性基等を挙げることができる。このような
イオン性基を有する単量体の具体例としては、スチレン
スルホン酸、スルホプロピルメタクリレートのようなス
ルホン酸基を有する単量体、アクリル酸、メタクリル酸
、イタコン酸のようにカルボキシル基を有する単量体、
アシッドホスホキシエチルメタクリレート、３−クロロ
−２−アシッドホスホキシエチルメタクリレートのよう
なリン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタ
クリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド
のような第３級アミノ基を有する単量体、メタクリルア
ミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、メタ
クリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドのような第４級アミノ基を有する単量体を挙げるこ
とができる。

また、内部架橋用多官能性単量体としては１．多価アル
コールのポリ　（メタ）アクリレートが好ましく、具体
的には、エヂレングリコールジメタクリレート、ジエチ
レングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコ
ールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタ
クリレート、１．３−プチレングリコールジメタクリレ
−１・、トリエチレングリコールジアクリレート、トリ
メチロールプロパントリメタクリレート、トリメチロー
ルプロパントリアクリレート、テトラメチロールメタン
テトラアクリレート等が用いられる。ジビニルベンゼン
も好ましく用いられる。

更に、本発明においては、水分散性高分子重合体粒子を
得るための単量体として、単量体組成は第２の単量体成
分として、アクリロニトリル及び／又はメタクリロニト
リルを含有することが必須である。

本発明においては、以上のような各単量体を水媒体中に
て通常の方法にて乳化共重合体させることにより、側鎖
にエステル基を有する水分散性高分子重合体粒子を得る
ことができるが、得られる重合体粒子中に乳化剤が混在
すると、酵素の固定化の際に酵素が失活する等の有害な
影響が現れることがあるので、乳化共重合体に際しては
乳化剤を用いないのが好ましい。本発明による上記単量
体組成によれば、特に乳化剤を要せずして安定しこ共重
合させることができるが、乳化剤が酵素に対して有害な
影響を与えなければ、乳化剤を必要しこ応じて用いても
よい。

本発明における単量体組成は、（メタ）アクリル酸エス
テル５〜９８重量％、好ましくは２０〜９３重量％、こ
の単量体と共重合し得る第１の単量体０〜９０重量％、
好ましくは０〜８０重量％、多官能性内部架橋用単量体
１〜２０重量％、好ましくは２〜１０重量％、及び第２
の単量体としてのアクリロニトリル又はメタクリコニト
リ１９１〜６０重量％、好ましくは５〜４０重量％とか
らなる。

単量体組成において（メタ）アクリル酸エステル単量体
の量は、これから得られる水分散性高分子重合体粒子を
ケン化して生じるカルボキシル基量、従って、このカル
ボキシル基に固定化し得る酵素の固定化量とも関連し、
少なすぎるときは酵素を十分な量にて固定化することが
できず、多すぎるときは重合の安定性を損なうと共に、
得られる重合体粒子の安定性も損なわれるので、好まし
くない。

本発明において用いる（メタ）アクリル酸エステルは疎
水性であるため、水溶性重合体を生じることがなく、し
かも、これを（メタ）アクリロニトリルとを乳化共重合
させることにより、重合が非常に安定に行なわれて、凝
集物が殆ど生成しない。（メタ）アクリロニトリルの量
が上記範囲よりも少ないとき、又は多すぎるときは、重
合の安定性が損なわれるおそれがあるので、好ましくな
い。また、内部架橋用単量体は、後述する重合体粒子の
ケン化の際の粒子の安定性を高めるのに寄与し、上記範
囲で用いることが好ましい。

本発明によれば、上記のようにして得られたエステル基
を有する水分散性高分子重合体粒子は酸又はアルカリの
水溶液によりケン化され、エステル基はカルボキシル基
に変えられる。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、リン
酸等が、また、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニア等が、それぞれ適宜に用い
られる。これら酸又はアルカリ水溶液の濃度は、通常、
０．０１〜５規定、好ましくは０．０５〜２規定である
。

本発明においては、重合体粒子の表面のみをケン化すれ
ば足り、ケン化条件は適宜に選ばれる。通常、上記のよ
うな酸又はアルカリを用いて、２０〜７０“Ｃの温度で
数分乃至数十時間ケン化する。

酸又はアルカリの濃度が高すぎるときは、重合体粒子の
安定性が悪くなり、重合体粒子が凝集したり、水溶化し
たりする。また、濃度が低すぎるときは、ケン化に不必
要に長時間を要するので好ましくない。温度が高すぎる
場合も、重合体粒子の安定性が悪くなるので好ましくな
い。

このようにして得られる水分散性高分子重合体粒子は表
面に高密度にて水酸基を有するが、その粒子径はケン化
の前後で殆ど変わらず、ケン化後に僅かに大きくなる程
度である。

水分散性高分子重合体粒子の有するカルボキシル基の量
は、重合体粒子１ｇ当り０．００５〜２０ミリ当量、好
ましくは０．０１〜５ミリ当量である。

負荷量が小さく、酵素反応が十分に行なわれないからで
あり、一方、多すぎるときは、水分散性高分子重合体粒
子の安定性が損なわれることがあるからである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ
乃至１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とす
る固定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた
後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、単
位体積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量
が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難となる
ので好ましくない。

水分散性高分子重合体粒子の有するカルボキシル基を介
して酵素を共有結合にて固定化する方法は特に制限され
ず、従来より知られている方法が適宜に採用される。

例えば、一つの方法として、カルボキシル基と酵素の有
する遊離のアミノ基を水溶性カルボジイミド、例えば、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−）ルエン
スルホネート等と反応させて、共有結合を形成させるこ
とができる。具体的には、例えば、重合体粒子の有する
カルボキシル基の５〜５０倍当量の上記カルボジイミド
の水溶液に酵素を加え、温度５°Ｃ程度、ｐｎを４．５
〜６．０程度に保ちつつ、静置又は攪拌すればよい。

別の方法として、水分散性高分子重合体粒子表面のカル
ボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイミドをカルボジ
イミドの存在下に反応させた後、１ 酵素のアミノ基を反応させ、共有結合を形成させること
ができる。更に、別の方法として、水分散性高分子重合
体粒子表面のカルボキシル基にジアミンを作用させて、
重合体粒子表面にアミノ基あ導入し、このアミノ基によ
り酵素を共有結合にて固定化することもできる。例えば
、前記したカルボジイミドを用いて、酵素のカルボキシ
ル基を重合体粒子のアミノ基にはさせることができ、ま
た、グルタルアルデヒドのような架橋試薬を用いて、酵
素の７ミノ基を重合体粒子に結合させることができる。

ジアルデヒドを架橋試薬として用いる場合には、重合体
粒子の有するアミノ基に対して過剰量を反応させ、重合
体粒子に一方のアルデヒド基により結合したジアルデヒ
ドの他方の遊離アルデヒド基に酵素のアミノ基を結合さ
せる。

また、更に別の方法として、ジアゾカップリング法によ
ることもできる。例えば、アミノ基を導入した重合体粒
子にｐ−ニトロベンズアルデヒドを反応、結合させ、次
にニトロ基を通常の方法、例えば水素化ホウ素ナトリウ
ムと亜ニチオン酸す２ トリウムによってアミノ基に還元し、このアミノ基を亜
硝酸ナトリウムによってジアゾニウム基とし、これを酵
素のアミノ基とカップリングさせるのである。

以上のようにして、酵素を重合体粒子に共有結合させた
後、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心分
離、膜分離等の適宜の手段によって除去すれば、本発明
の固定化酵素を得る。

本発明による固定化酵素は水分散液として用いられ、基
質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定化酵素の
粒径や酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度
等により適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でもよく
、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ずしも高度に精
製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用いら
れる。更に、本発明に従って、単一の酵素を固定化して
もよいが、複数の酵素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の酵素が用
いられる。具体例として、アミノ酸オキシダーゼ、カタ
ラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミ
ノトランスフェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラ
ーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−ビルピン酸アミノトランスフェ
ラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチル
トランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランス
フェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移
酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−
アラニンラセマ−ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウ
リカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン
、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パ
パイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、ペニシリ
ンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ラク
ターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのよう
な加水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、
アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマー
ル酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなりア
ーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラ
セマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのよ
うな異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオ
ンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ
等を挙げることができる。

５ 本発明による固定化酵素は以上のように、表面に高密度
にカルボキシル基を有する水分散型高分子重合体粒子に
、上記カルボキシル基を介して酵素が共有結合により固
定化されており、従来のセルロース誘導体粒子等を担体
とする場合と異なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同
様に反応系内を自由に移動できるため、基質の拡散が反
応に殆ど影響を与えず、従って、高分子量の基質の場合
にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行な
わせることができる。

しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の担体に固
定化されているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、
凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によ
って容易に回収でき、かくして、長期間にわたって高い
酵素活性を保持させつつ、繰返して使用することができ
る。

更に、一般にカルボキシル基を有する単量体は水溶性で
あるため、他の単量体との乳化共重合が容易ではなく、
単独重合体を生成することが多く、また、共重合体を得
ても重合体粒子表面のカルボ６ キシル基の密度が小さく、重合体粒子における酵素の負
荷量を大きくすることが困難であるが、本発明によれば
、前記単量体組成により、乳化剤を′特に用いることな
く、望ましくない水溶性重合体の生成を抑えて、安定に
水分散性高分子重合体粒子を得、これをケン化してカル
ボキシル基を生じさせるので、カルボキシル基を有する
水分散性高分子重合体粒子を安定に得ることができ、且
つ、重合体粒子上のカルボキシル基密度が高いので、酵
素を高負荷量にて固定化することができる。更に、（メ
タ）アクリロニトリルと内部架橋用単量体を併用するこ
とにより、得られる水分散性高分子重合体粒子は強度が
大きいと共に、粒子相互の粘着も起こらない。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。

実施例１ メチルアクリレート８０ｇ、）リエチレングリコールジ
メタクリレー）２ｇ及びアクリロニトリル１５ｇを蒸留
水２３０ｇに加え、２，２゛−アゾビス−２−アミジノ
プロパンニ塩酸塩０．３　ｇ　’ｆｃ水１０ｍ１に溶解
した重合開始剤水溶液を６０°Ｃの温度で窒素気流下に
加え、１２０　ｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合させて、
固形公約３０％、平均粒径０．４μの重合体粒子の水分
散液を得た。重合は非常に安定に行なわれて、凝集物は
０１０４％であった。

次に、上記の重合体粒子水分散液に２Ｎ力性ソ一ダ水溶
液１００ｍ１を加え、室温で一夜攪拌した後、２Ｎ塩酸
水溶液を加えて中和し、重合体粒子を遠心分離し、洗滌
した。

このようにして得られた重合体粒子１ｇ（乾燥重量）当
りのカルボキシル基量ば３．３ミリモルであった。

上記重合体粒子の水分散液１００ｍ１に１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−
メト−ｐ−１−ルエンスルホネート４０ｇを水２００ｍ
１に溶解した水溶液を加え、攪拌しつつ、ｐＨを５．０
に調整した。α−アミラーゼ２゜５ｇを水５００ｍ１に
熔解し、ｐＨを５．０に調整した水溶液を上記重合体粒
子水分散液に加え、攪拌下にｐＨを５．０に調整しなが
ら、５℃の温度で２４時間反応させた。

この後、重合体粒子を遠心分離し、沈降した粒子を緩衝
液で洗滌し、未固定のα−アミラーゼ、未反応のカルボ
ジイミド及び反応副生物を除去した後、再び緩衝液中に
分散させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量は、重合体粒
子１ｇ当り７０■であり、また、活性収率は４０％であ
った。

尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の理論量に
対する実際の活性の割合として定義される。ここでは、
１％デンプン水溶液を基質として、固定化酵素を３５°
Ｃで３０分間反応させ、ヨウ素デンプン反応からデンプ
ンの分解量をもとめることにより、固定化酵素の活性、
即ち、デンプン分解速度（■／分）を得、これと等しい
活性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求め
た。

実施例２ ９ 実施例１で得た水酸基を有する重合体粒子水分散液１０
０ｍ１に、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネ
ート２０ｇを水２００ｍ１に溶解した水溶液を加え、攪
拌しつつ、ｐｉ（を５．０に調整した。次に、ｍ−キシ
リレンジアミン３．０ｇを水３０ｍ１に熔解したｐｌ＋
５．０の水溶液を上記分散液に加え、攪拌下にｐＨを５
．０に調整しつつ、室温で４時間反応させた。この後、
遠心分離して沈降した重合体粒子を水洗し、未反応のカ
ルボジイミド及びジアミン、反応副生物を除去し、かく
して、アミノ着を有する水分散性高分子重合体粒子を得
た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散させ、グルタル
アルデヒドの５％水溶液６０ｍ１を加え、室温で２４時
間反応させた後、遠心分離により精製し、アルデヒド基
を有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

次に、０．１Ｍリン酸水素二カリウム及び０．１　、Ｍ
リン酸二水素カリウムから調整した緩衝液（ｐｌ（７゜
０ ０）１００ｍｌに上記重合体粒子を分散させ、これにウ
レアーゼ３ｇを緩衝液３０ｍ１に溶解した酵素水溶液を
加え、５℃の温度で２０時間反応させて、ウレアーゼを
重合体粒子に固定化した。反応後、遠心分離して沈降し
た重合体粒子を緩衝液で洗滌し、緩衝液に再分散させて
、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は、重合体粒子
１ｇ当り４０■であり、活性収率は５０％であった。活
性収率は、固定化された酵素の活性の理論量に対する実
際の活性の割合として定義され、ここでは、０．０３　
Ｍの尿素水溶液を基質とし、３５℃で１０分間固定化酵
素を反応させ、生成したアンモニア量（μモル／分）を
塩酸滴定で求めて活性を測定し、これと等しい活性を有
する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

実施例３ 実施例２で得られたアミノ基を有する水分散性高分子重
合体粒子の水分散液１００ｍ１にｐ−ニトロベンズアル
デヒドの１％エタノール溶液２００ｍｌを加え、室温で
２時間反応させた後、遠心分離し、洗滌し、ニトロ基を
有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散させ、これに０
．ＩＭ亜ニチオン酸ナトリウムと０．５　Ｍ炭酸水素ナ
トリウムを含有する水溶液１００ｍ１を加え、室温で２
時間反応させて、重合体粒子の有するニトロ基をアミノ
基に還元した。遠心分離後、十分に洗滌し、アミノ基を
有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に分散させ、これに０．
１　Ｍの亜硝酸ナトリウムの０．５　Ｎ塩酸水溶液５０
ｍ１を加えて、室温で１時間反応させ、重合体粒子の有
するアミノ基をジアゾニウム基に変えた。

この後、重合体粒子を十分に洗滌して、ジアゾニウム基
を有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水１００ｍ１に再分散させ、これにト
リプシン０．３ｇを緩衝液３０ｍ１に分散させた酵素溶
液を加え、５℃の温度で２４時間反応させた後、遠心分
離し、沈降した重合体粒子を緩衝液で洗藷し、未固定の
トリプシンを除去した。これを再び緩衝液に分散させて
、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素におけるトリプシンの固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り３．５■であり、また、活性収率は４０
％であった。

尚、１％カゼイン水溶液を基質として、酵素を３５°Ｃ
で１０分間反応させた後、５％トリクロル酢酸により高
分子量タンパク質を沈殿させ、遊離の非タンパク性分解
質量を２８０　ｎｍの吸光度から求め、この吸光度を１
分間に１゜０増加させる活性を１単位として、活性収率
を求めた。

実施例４ エチルアクリレート３０ｇ１スチレン４０ｇ１ジビニル
ベンゼン２ｇ及びアクリロニトリル３０ｇを蒸留水２３
０ｇに加え、実施例１と同様に重合し、固形公約３０％
、平均粒径０．２５μの重合体粒子の水分散液を得た。

重合は非常に安定に行なわれて、凝集物は０．０２％で
あった。

上記重合体粒子を実施例１と全く同様にケン化３ して、カルボキシル基を有する水分散性高分子重合体粒
子を得た。

この重合体粒子の水分散液１００ｍ１に１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−
メト−ｐ−トルエンスルホネート２０ｇを水２００ｍ１
に溶解した水溶液を加え、攪拌しつつ、ｐｌ（を５．０
に調整した。ウレアーゼ３．０ｇを水５００ｍ１に熔解
し、ｐＨを５．０に調整した水溶液を上記重合体粒子水
分散液に加え、攪拌下にｐｌ（を５．０に調整しながら
、５　”Ｃの温度で２４時間反応させた。

この後、重合体粒子を遠心分離し、沈降した粒子を緩衝
液で洗滌し、未固定のウレアーゼ、未反応のカルボジイ
ミド及び反応副生物を除去した後、再び緩衝液中に分散
させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼ固定化量は、重合体粒子１
ｇ当り５８■であり、また、０．０３Ｍ尿素を基質とし
て、実施例２と同様に求めた活性収率は３０％であった
。

４ 比較例１ 実施例１において、アクリロニトリルを用いない以外は
実施例１と全く同様にして重合を行なったが、重合中に
全体が凝集し、重合を円滑に行なうことができなかった
。

比較例２ 実施例１において、トリエチレンジメタクリレートを用
いない以外は実施例１と全く同様にして重合を行なった
ところ、６％の凝集物が生成した。凝集物を除いた後、
この重合体粒子水分散液を、実施例１と同じ条件下でケ
ン化したところ、全体がゲル状となり、重合体粒子の水
分散液を得ることができなかった。

特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１（８１アクリル酸エステル又はメタクリル酸エス
   テル５〜９８重量％、ｆｂｌこの単量体と共重合し得る
   第１の単量体０〜９０重量％、（Ｃ１多官能性内部架橋
   用単量体１〜２０重量％、及び（ｄ）第２の単量体とし
   てのアクリロニトリル又はメタクリコニトリル１〜６０
   重量％とからなる単量体組成を乳化共重合させ、得られ
   る水分散性高分子重合体粒子をケン化してカルボキシル
   基を生成させ、次いで、このカルボキシル基を介して酵
   素を共有結合にて固定化することを特徴とする固定化酵
   素の製造方法。 （２）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素の製造方法。 （３）　　多官能性内部架橋用単量体が多価アルコール
   のポリ　（メタ）アクリレートであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方法。 （４）アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステルが
   メチルエステル又はエチルエステルであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方法
   。