JPS58149680A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も行なわれているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、水溶液中で反応を行なわせている。しかし、こ
のような方法によれば、反応条件を一定に維持しつつ、
新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失活さ
せることな（、生成物と酵素を分離することが非常に固
着であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反応
が回公式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するため、既に種々の方法にて酵
素を担体に固定化し、この固定化酵素に基質を反応させ
ることが提案されている。このような酵素の固定化方法
の一つとして、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオ
ン結合又は物理吸着にて結合させる担体詰合法が知られ
ている。しかし、従来、この方法において用いられてい
る担体は、通常、セルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔
性ガラス等の径１−乃至数一の粒子であり、このような
粒子に酵素が固定化された固定化酵素は通常、カラムに
充填され、固定されて、基質溶液と接触されるので、基
質が高分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難（、反
応に長時間を要すると共に反応収率か低いという問題が
ある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたものて
あって、反応系に詔いて遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど間
層にならない高活性の固定化酵素を提供することを目的
とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、（ａ）メチルア
クリレート、エチルアクリレート及びアクリルアミドか
ら選ばれる少な（とも一種のラジカル重合性単量体０．
２〜ｌＯ重量襲、（ｂ）この単量体と共重合し得る第一
のラジカル重合性単量体１０〜９５重量襲、（ｃ）多官
能性内部架橋用単量体１〜２０重量囁、及び（ｄ）第二
のラジカル共重合性単量体としてのアクリロニトリル又
はメタクリロニトリル１〜６０重量％を乳化共重合させ
て得られる水分散型高分子重合体粒子の分散液にヒドラ
ジンを反応させ、上記重合体の有する前記アクリル酸エ
ステル又はアクリルアミド単位を酸ヒドラジド単位に変
換し、この酸ヒドラジド基を介して酵素を上記重合体粒
子に共有結合にて結合させることを特徴とする。

本発明においてはメチルアクリレート、エチルアクリレ
ート及びアクリルア夷ドから選ばれる少なくとも一種の
ラジカル重合性単量体を後述する他の単量体と乳化共重
合させ、か（して得られる水分散型高分子重合体粒子の
有する上記アクリル酸エステル又はアクリルアミド単位
をヒドラジンにより酸ヒドラジド単位に変換させる。こ
の峻ヒドラジド単位に変換される単量体としてアクリル
酸のＯｓ以上のアルキルエステルやメタクリル酸エステ
ル、メタクリルアミドを用いると、酸ヒドラジド化に厳
しい条件を要し、高分子重合体粒子の分散安定性を損な
うので好ましくな（、また、多量の熱エネルギーを要す
るので好ましくない。

第一のラジカル重合性単量体としては上記メチルアクリ
レート、エチルアクリレート及びアクリルアミド並びに
後述する第二のラジカル重合性単量体としてのアクリロ
ニトリル反びメタクリロニトリルを除いて、特に制限さ
れることなく、種々の単量体が用いられ、好家しくはエ
チレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピ
オン酸ビニル、アクリル酸のＯｓ以上のアルキルエステ
ル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルスチレン
、ビニルトルエン、ブタジエシ、イソプレン、メタクリ
ルアミド等の一種又は二種以上が用いられる。特に好ま
しくはアクリル酸のＯｓ以上のアルキルエステル、メタ
クリル酸エステル又はスチレンが用いられる。これらの
ラジカル共重合性単量体は、得られる共重合体が酵素反
応の行なわれる温度より高いガラス転移点を有するよう
に選ばれる。

また、多官能性内部架橋用ラジカル重合性単量体として
は多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートか好まし
く、具体的にはエチレ、ングリコールジメタクリレート
、トリエチレングリコールジメタクリレート、ジプロピ
レングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレング
リコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジ
アクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレ
ート、トリメチロールプロパントリアクリレート、テト
ラメチロールメタンテトラアクリレート等が用いラレル
。ジビニルベンゼンも廟いられる。

更に、本発明においては、水分散型高分子重合体粒子は
、第二の共重合性単鎖体成分としてアクリロニトリル及
び／又はメタクリロ二トリルを含有することが必須であ
る。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は上記
各単量体を水媒体中にて通常の方法で乳化共重合させる
ことにより得ることかできるが、得られる重合体粒子中
に乳化剤が混在すると、酵素が失活する等の有害な影響
かあられれることがあるので、乳化重合に際しては乳化
剤を用いないのが好ましい。本発明にかける単量体組成
によれば、特に乳化剤を要せずして安定に乳化共重合さ
せることかできるからである。但し、乳化剤が酵素に対
して有害な影響を与えなければ乳化剤を必要に応じて用
いてもよい。

本発明において乳化共重合させる単量体組成は、メチル
アクリレート、エチルアクリレ−［及びアクリルアミド
から選ばれる少な（とも一種の単量体・！ｌ−１０重量
襲、好家計くは０．５〜８重量重量率一の単量体１０〜
９８０〜９８璽量襲くは２０〜９００〜９０璽量襲橋用
単量体１〜２０璽量襲、好ましくは２〜１０璽量襲、及
びアクリロニトリル又はメタクリロニトリル１〜６０重
量囁、好ましくは５〜４０璽量襲である。

メチルアクリレート、エチルアクリレート及び／又はア
クリルアミドの量は、得られる重合体粒子への酵素固定
化量と関連し、少なすぎるときは酵素を十分な量にて固
定化することができず、一方、多すぎるときは、得られ
る重合体粒子の有する上記アクリル酸エステル又はアク
リルアミド単位をヒドラジンにて酸ヒドラジド化する際
に水溶性成分が多量に生じるので好ましくない。即ち、
このような水溶性成分が生じると、一部は水不溶性の重
合体粒子中テルに吸着されて残り、ヒドラジド基を介し
て酵素を重合体粒子に固定化するとき、この水溶性成分
にも酵素が固定化される。仁のように水溶性成分を含む
担体６ζ酵素が固定化された固定化酵素は、酵素反応の
際に水不溶性の水分散型高分子重合体粒子から溶出し、
固定化酵素自体の活性の経時低下が著しいうえに、基質
や反応生成物と混合するので、反応後にその分離を要す
る等の種々の不都合か生じる。

しかしながら、本発明に従って、メチルアクリレート、
エチルアクリレート及びアクリルアミドから選ばれる少
なくとも一種の単量体と内部架橋用単量体とアクリロニ
トリル又はメタクリロニトリルとを乳化共重合させるξ
とｋより、重合の安定性が確保されると共に、！Ｉｔ、
＜ない水溶性重合体の生成が抑止される。このような結
果が得られる理由は明確ではないか、重合初期に生じる
メチルアククレート、エチルアククレート及び／又はア
クリルアミドを主成分とする水溶性低分子量重合体にア
クリロニトリル又はメタクリロニトリルと内部架橋用車
量体か有効に共重合して水不溶化すると共に、重合が安
定化するのであろう。従って、アクリロニトリル又はメ
タタリロニトリルの量が上記範囲より少なすぎるとき、
又は多すぎるときは、重合の安定性が損なわれる。また
、内部架橋用単量体が少なすぎるときは水溶性重合体の
副生が多くなり、一方、多すぎるときは重合が安定性に
欠けるようになる。

本発明において水分散型高分子重合体粒子の平均粒径は
０．０３〜２１．好ましくは０．０７〜ＩＰである。粒
径が小さすぎると、固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収か困難となり、一方、粒径か
大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積が小さくなり
、酵素の固定化量か少なくなると共に、水中に分散させ
るのが困難となるので好ましくない。

本発明においては、このようにして得られる水分散型高
分子重合体粒子の水分散液にヒドラジンを反応させ、重
合体の有するメチルアクリレート、エチルアクリレート
又はアクリルアミド単位を酸ヒドラジド単位に変換する
。このための条件としては重合体粒子の水分散性か損な
われずに、酵素の固定化に用い得るに足る量のヒドラジ
ド基が生成するように選ばれる。好ましくは５〜５０襲
濃度の抱水ヒドラジンを用い、４０〜８０℃の温度で１
〜２４時間反応させる。反応温度か高い程、また、抱水
ヒドラジンのＪｉｆｆが高い程、ヒドラジド基が多く生
成することは明らかであろう。

このようにしてヒドラジド基を有せしめた重合体粒子に
酵素を共有結合により固定化するには、ヒドラジド基に
酵素を固定化するため（従来より知られている方法によ
ることができる。例えば、一つの方法として、重合体粒
子の有するヒドラジド基に塩峻酸性下に亜硝酸ナトリウ
ムを作用させて酸アジド基とし、この酸アジド基に酵素
のアミノ基を反応させ、ペプチド結合を形成させること
により酵素を重合体粒子に固定化する。また、別の方法
として、重合体粒子に無水コハク酸を反応させてスクシ
ニルヒドラジド基とし、水溶性カルボジイミドを用いて
酵素を反応させることにより、酵素のアミノ基にペプチ
ド結合を形成させて、重合体粒子に固定化することもで
きる。このようにして酵素を重合体粒子に共有結合にて
固定した後、固定されていない酵素を遠心分離、膜分離
等によって除去すれば、本発明による固定化酵素が得ら
れる。

不発明による固定化酵素は分散液として用いられ、基質
と接触される６ｗＡ定化醇化酵素用量は、固定化酵素の
粒径や酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度
等により適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でよく、
菌体外酵素でもよい。また、酵素は必らずしも高度に精
製されている必要はな（、抽出液や部分精製品も用いら
れる。更に、本発明に従って単一の酵素を固定化しても
よいが、複数の酵素を固定化してもよい。酵素の具体例
としては、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、キサン
チンオキシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１．グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギン酸アセチ
ルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランス
フェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラーゼ、グル
タミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェラーゼ、グ
ルタミン酸−ビルピン酸アミノトランスフェラーゼ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトランスフ
ェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アラクトキナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランスフェラーゼ
、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移酵素、アス
パラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノア
シラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニン
デイミナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシン、トロ
ンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パパイン
、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ、ヘキ
ソキナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、ペニシリンアミ
ダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ
、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加水
分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、アスパ
ルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェニルア
ラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、７マール駿ヒ
ドラターゼ、リンゴ峻シンテターゼのようなリアーゼ、
アスパラギナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコー
スホス７エートイソメラーゼ、グルタミン酸うセ７−ゼ
、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのような異性
化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオンシンタ
ーゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ等を挙げ
ることかで舎る。

本発明による固定化酵素は、以上のように、酵素がヒド
ラジド基を有する水分散型高分子重合体粒子に共有結合
にて固定化されており、従来のセルロース誘導体担体粒
子等の場合と興なり、固定化酵素自体が遊離の酵素と同
様に反応系内を自由に移動できるため、基質の拡散が反
応（殆ど影響を与えず、従って、高分子量の基質の場合
にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行な
わせることができる。しかも、酵素は担体に固定化され
ているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤を
用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によって容易
に回収でき、長期間にわたって繰返して使用することが
できる。

更に、本発明において用いる担体としての水分散性高分
子重合体粒子は、その製造面からみれば、乳化剤を用い
ることなく、且つ、望ましくない水溶性重合体の生成な
く、安定に乳化共重合にて得ることかできる。また、ア
クリロニトリル又はメタクリレートリルと内部架橋剤を
併用することにより、得られる水分散型高分子重合体粒
子は強度が大きいと共に、粒子相互の粘着も起らない。

実施例１ メチルアクリレ−）　１０ｙ　、メチルメタクリレート
７３ｇ、　　）リエチレングリコールジメタクリレー？
　２ｇ及びアクリロニトリル１５１を蒸留水２３０ｇに
加え、過硫酸カリウム０．３１を水１０ｙに溶解した重
合開始剤水溶液を１０℃の湿度で窒素気流下に加え、１
２０ｍで攪拌しつつ８時間重合させて、固形分３０襲、
平均粒径０．ＩＳｐの重合体粒子の水分散液を得た。重
合は非常に安定に行なわれて、凝集物は０．０３弧であ
った。

この重合体粒子分散液１０Ｇ−に４０襲抱水ヒドラジン
４０　ｄを加え、攪拌しながら５０℃の温度で６時間反
応させた後、遠心分離して沈降した重合体粒子を０．１
　Ｍ塩化す）　＋７ウム水溶液で洗滌した。

このようにして得られた酸ヒドラジド基を有する重合体
粒子を０．３Ｎ塩酸水溶液１００１１１１４に再分散さ
せ、５℃に冷却し、１Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液５０−
を加えて、５℃で１時間反応させることｋより、酸ヒド
ラジド基を酸アジド基に変換した。

遠心分離して沈降した重合体粒子を０．１　Ｍスルファ
ミン酸水溶液、次に水で洗滌した後１、水１００ｄに分
散させた。

トリプシン１．５１　を水３０ｍに溶解した酵素水溶液
を上記重合体粒子分散液に加え、５℃の温度で２００時
間反応せた。反応後、遠心分離して沈降した重合体粒子
を０．１Ｍリン酸水素二カリウム及び０．１Ｍりン酸二
水素カリウムから皺襞した緩衝液（ｐＨ７，０）で洗滌
して未向定のトリプシンを除き、再び緩衝液に分散させ
て本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のトリプシン同定化量は、重合体粒子１
ｇ当り２０１１１９であり、また、１％カゼイン水溶液
を基質として測定した活性収率は７０％であった。

尚、活性収率きは固定化された酵素の活性の理論量に対
する実際の活性の割合を意味する。ここでは、１％カゼ
イン水溶液を基質として酵素を３５℃で１０分間反応さ
せた後、５襲トサクロル酢酸により高分子量タンパク質
を沈殿させ、遊離の非タンパク性分解質量を２８０　ａ
ｍの吸光度から求め、この吸光度を１分間に１．０増加
させる活性を１単位として、酵素固定化量を同じ活性を
有する遊離の酵素量で除して求めた。

尚、反応後の上記固定化酵素を遠心分離し、緩衝液で洗
滌して再び基質と反応させたところ、最初の反応とほぼ
同じ活性を示した。

比較例１ メチルアクリレート１０ｙ　、メチルメタクサレ−ドア
５１及びアクリロニトリル１５ｙを実施例１２同様にし
て乳化共重合させ、固形分３０％、平均粒径０．１５μ
の重合体粒子の水分散液を得た。凝集物は０．５％であ
った。

この重合体粒子分散液に実施例１と同様の方法によりト
リプシンを固定化したところ、トリプシンの固定化量は
重合体粒子ｌ、当り１５ＩＩＩＩＳＪであり、活性収率
は実施例１と同じ条件下で７０％であった。また、この
反応後に遠心分離して沈降した重合体粒子を緩衝液で洗
滌した後、再び基質と反応させたところ、その活性は最
初の活性の７０％に低下していた。

比較例２ メチルアクリレ−）　１０ｆ、メチルメタクリレート８
８ｆ及びトリエチレングリコールジメタクリレ）　２ｙ
を実施例１と同様に乳化共重合させ、固形分２９％、平
均粒径０．２５μの重合体粒子の水分散液を得た。重合
は不安定であって、凝集物は５外であった。

実施例２ アクリルアミド１０ｆ、スチレン５％、メチルメタクリ
レ−）１８ｙ、ジビニルベンゼン２ｆ及びアクリロニト
リル２０ｐを蒸留水２３０ｆに加え、実施例１とｒｉｓ
ｓの方法にて乳化共重合して、固形分３０囁、平均粒径
０．２５μの重合体粒子の分散液を得た。

重合は非常に安定であって、凝集物は０．０２％であっ
た。

この重合体粒子の水分散液１００ｍ１に４０％抱水ヒド
ラジン４０　ｓａｇを加え、攪拌しながら６０℃の温度
で３時間反応させて、重合体の有する酸アミド基を酸ヒ
ドラジド基化した。遠心分離し、沈降した重合体粒子を
０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗滌した。

この重合体粒子を再び水ｔｏｏｙｚ分散させ、無水コハ
ク８２０ｇを加えて、ｐＨを４に調整しながら室温で４
時間反応させた後、遠心分離して沈降した重合体粒子を
水で洗滌した。かくして得られたスクシニルヒドラジド
基を有する重合体粒子を水１００　ｍに分散し、ｌ−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミド−メト−ｐ−トルエンスルホン酸２０ｙを水２０
０ｄに溶解したカルボジイミド水溶液を上記分散液に加
え、攪拌し、ｐＨをＳ、Ｏに調整した。

α−アミラーゼ２，５ｆ　を水５０１１Ｊに溶解し、ｐ
Ｈを５．ＯＫ調整したｉｆ？素水溶水溶液記重合体粒子
分散液に加え、攪拌下、ｐＨを５．６に調整しつつ、５
℃で２４時間反応させてα−アミラーゼを重合体粒子に
固定化した。反応後、遠心分離によ′り沈降した重合体
粒子を緩衝液ＫＣ＃ｃ滌して未固定のα−アミラーゼを
除去し１、再び、緩衝液に分散させて本発明による固定
化酵素・番樽た。

この固定化酵素のα−アーミ・ラー、ゼの固定化量は重
合体粒子１　当り３０７であり、活性収率は３６外であ
った。活性収率は、３こつでは、１％デンプン水溶液を
葺質として固定化酵素を３５℃で１０分間反応させ、ヨ
ウ素デンプン反応からデンプンの分解量を求めることに
より、固定化酵素の活性、デンプン分解速度（ｓ９／分
、）を得、これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵
素固定化量で除して求めた。

特許出願人　　　日東電気工業株式会社代理人　弁理士
牧野逸部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１１　　＜ａＪメチルアクリレート、エチルアクリレ
   ート及びアクリルアミドから選ばれる少な（とも一種の
   ラジカル重合性単量体０．２〜１０重量２゜（６）この
   単量体と共重合し得る第一のラジカル重合性単量体１０
   −１１５重量囁、（Ｃ）多官能性内部架橋用単量体１−
   ２０重量襲、及び（ｄ）第二のラジカル共重合性単量体
   としてのアクリロニトリル又はメタクリロニトリル１〜
   ６０重量襲を乳化共重合させて得られる水分散型高分子
   重合体粒子の分散液にヒドラジンを反応させ、上記重合
   体の有する前記アクリル駿エステル又はアクリルアミド
   単位を酸ヒドラジド単位に変換し、この酸ヒドラジド基
   を介して酵素を上記重合体粒子に共有結合にて結合させ
   ることを特徴とする固定化酵素の製造方法。 （２）　　水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μ
   の平均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化酵素の製造方法。 口）　第一の単量体がアクリル酸のＯｓ以上のアルキル
   エステル、メタクリル酸エステル又はスチレンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素
   の製造方法。 （４）多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポ
   リアククレート又はポリアククレートであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製造方
   法。