JPS60173469A - ルミネセンス免疫測定試薬キット及びその為に使用できる化学ルミネセンス標識ハプテン共役体並びにそれらの製造方法 - Google Patents
ルミネセンス免疫測定試薬キット及びその為に使用できる化学ルミネセンス標識ハプテン共役体並びにそれらの製造方法Info
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の対象はハプテン用のルミネセンス免疫測定試薬
、そこに含まれるヘミルミネセンス標識されたノ１ブテ
ンのノ（役結合体及びそれらの製造法である。
、そこに含まれるヘミルミネセンス標識されたノ１ブテ
ンのノ（役結合体及びそれらの製造法である。
ハプテ／のルミネセンス免疫測定試薬は（Ａ）特定のノ
ーブテンに対して特ソＵトを持つ抗体及び（Ｂ）へＬｌ
レミ不センス標識されたノーブチ／の共役結合体よりな
っている。
ーブテンに対して特ソＵトを持つ抗体及び（Ｂ）へＬｌ
レミ不センス標識されたノーブチ／の共役結合体よりな
っている。
このハプテ／の共役結合体は一般にルミネセンス能のイ
する基、結合基及びノーブチ／を含有している。結合基
はその最もＩＩＩ′Ｉ弔な場合には、直接化学結合で置
き換えられていても良いが、活通は結合基によっである
空間距離を保っている。従って結合基は大抵「スペーサ
」とも呼ばれている。ルミネセンス能のある基とノ１ブ
テノとを１げ接結合することによって両基の性質か変化
し試薬の感度と選択性とが低下するこが分かった。−カ
ルミネセ／ス性か変わり、他方その抗体に対する特異性
が変化する。
する基、結合基及びノーブチ／を含有している。結合基
はその最もＩＩＩ′Ｉ弔な場合には、直接化学結合で置
き換えられていても良いが、活通は結合基によっである
空間距離を保っている。従って結合基は大抵「スペーサ
」とも呼ばれている。ルミネセンス能のある基とノ１ブ
テノとを１げ接結合することによって両基の性質か変化
し試薬の感度と選択性とが低下するこが分かった。−カ
ルミネセ／ス性か変わり、他方その抗体に対する特異性
が変化する。
代表的なルミネセンス標識した共役結合体及びそれらを
含有する免疫−１定試薬は、例えばＤＥ−Ｏ３第２９２
１７８１号から公知である。この公報によれば結合基Ｒ
（この明細３ては架橋基ともよばれている）は３４及び
３５頁に記載のごとく、その基の分子量が１０００以下
、殊に２００以下になるように、最高１−５０１殊に１
−１０の炭素原子又はペテロ原子をもたなければならな
い。
含有する免疫−１定試薬は、例えばＤＥ−Ｏ３第２９２
１７８１号から公知である。この公報によれば結合基Ｒ
（この明細３ては架橋基ともよばれている）は３４及び
３５頁に記載のごとく、その基の分子量が１０００以下
、殊に２００以下になるように、最高１−５０１殊に１
−１０の炭素原子又はペテロ原子をもたなければならな
い。
同明細書に記載のルミ不セ／ス免疫測定試薬は限定され
た寿命しか持たす、又対応する保護条例の為に限定され
た程度にしか使用できない放射性物質で処理される必要
かない点てラジオ免疫測定試薬に比較して有利である反
面、う／オ免疫７ＩｌｌＩ定試薬で知られている感度と
再現Ｖ１は達成されない。
た寿命しか持たす、又対応する保護条例の為に限定され
た程度にしか使用できない放射性物質で処理される必要
かない点てラジオ免疫測定試薬に比較して有利である反
面、う／オ免疫７ＩｌｌＩ定試薬で知られている感度と
再現Ｖ１は達成されない。
１） Ｅ −ＯＳ第２９１３５４９号からアンチ配位子
か配位ｒのエピトビ、クセンターに特異的に結合し、化
学発光源を構成する発光性！ｆ変対が追跡子として、又
ヘミルミネセンス諒より出る光を衝突することなく消光
することができる、消光子が得られる化学的に誘導され
る蛍光免疫私櫂か公知である。そのヘミルミネセンス標
識及び消光ｆ標識を持つ共役体か形成せられ、又これら
の共役体を免疫学的対の構成分と結合することになる。
か配位ｒのエピトビ、クセンターに特異的に結合し、化
学発光源を構成する発光性！ｆ変対が追跡子として、又
ヘミルミネセンス諒より出る光を衝突することなく消光
することができる、消光子が得られる化学的に誘導され
る蛍光免疫私櫂か公知である。そのヘミルミネセンス標
識及び消光ｆ標識を持つ共役体か形成せられ、又これら
の共役体を免疫学的対の構成分と結合することになる。
その公報に記載の原理は、もしある染料が励起状態のへ
ミルミネセ／スＹ１化合物又は基から限定された距離内
に存在すると、そのヘミルミネセンス性化合物又は基は
衝突を起こさないで、又輻射線を出さないで、そのエネ
ルギーを消光子に移すことかできるという知見に基づい
ている。それで消光子はへミルミネセンス性化合物又は
基よりも高い波長で輻射線を出すことができ、またその
エネルギーを輻射を伴わない壊変によって失うことがで
きる。この場合原則的にはへミルミネセンス性質または
消光子の複数のモルを、ともに晶分子量配位子（１，ｉ
ｇａｎｄｅｎ）に結合させることができる。前記明細書
には原則的には免疫学的対の各成分に複数の追跡子を結
合させて、多配位子類縁追跡ｒとして知られているもの
を生成できることとが記載されている。しかしながらこ
のようなシステムの特別の利点は記載されていない。不
利な点は類縁の対は相当して活性であるためには匹敵す
る距離に消光子を含有していなければならない点にある
。比較的に小さいハプテンの場合には、これらのハプテ
ンが特別の消光子が受容体に付加結合しないで往々にし
てヘミルミネセンス性を実質的に低下させるという特性
に留意しなければならない。ハプテンとへミルミネセン
ス基との間のこのｑ変効果は既に何度も観察され、試験
の感度および選択性を低下させるので、その様な場合「
スペーサ」が使用される。
ミルミネセ／スＹ１化合物又は基から限定された距離内
に存在すると、そのヘミルミネセンス性化合物又は基は
衝突を起こさないで、又輻射線を出さないで、そのエネ
ルギーを消光子に移すことかできるという知見に基づい
ている。それで消光子はへミルミネセンス性化合物又は
基よりも高い波長で輻射線を出すことができ、またその
エネルギーを輻射を伴わない壊変によって失うことがで
きる。この場合原則的にはへミルミネセンス性質または
消光子の複数のモルを、ともに晶分子量配位子（１，ｉ
ｇａｎｄｅｎ）に結合させることができる。前記明細書
には原則的には免疫学的対の各成分に複数の追跡子を結
合させて、多配位子類縁追跡ｒとして知られているもの
を生成できることとが記載されている。しかしながらこ
のようなシステムの特別の利点は記載されていない。不
利な点は類縁の対は相当して活性であるためには匹敵す
る距離に消光子を含有していなければならない点にある
。比較的に小さいハプテンの場合には、これらのハプテ
ンが特別の消光子が受容体に付加結合しないで往々にし
てヘミルミネセンス性を実質的に低下させるという特性
に留意しなければならない。ハプテンとへミルミネセン
ス基との間のこのｑ変効果は既に何度も観察され、試験
の感度および選択性を低下させるので、その様な場合「
スペーサ」が使用される。
本発明の課題はハプテ／のルミネセ／ス免疫測疋法を改
善し、その取り扱い感度およびｉＴｆ現ＰＣに関してラ
ジオ免疫学測定法に匹敵させることにある。同時にこの
免役学的測定法の各成分を簡単てｉｌｉ ＩＩ、ｌ ’
ｒＩ丁能に大規模に生産することができる様に努力がな
された。この課題はへ外にも、ヘミルミネセンス能のあ
る基とハプテンとの間に、繰り返し゛自能基を持ち、ま
たへミルミネセンス能のある基の複数モルおよびハプテ
／の複数モルを結合している様な鎖状ポリマーである結
合ノλをイ１するヘミルミネセンス標識ハプテ／共役体
を使用することによって達成さねｊ二。
善し、その取り扱い感度およびｉＴｆ現ＰＣに関してラ
ジオ免疫学測定法に匹敵させることにある。同時にこの
免役学的測定法の各成分を簡単てｉｌｉ ＩＩ、ｌ ’
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された。この課題はへ外にも、ヘミルミネセンス能のあ
る基とハプテンとの間に、繰り返し゛自能基を持ち、ま
たへミルミネセンス能のある基の複数モルおよびハプテ
／の複数モルを結合している様な鎖状ポリマーである結
合ノλをイ１するヘミルミネセンス標識ハプテ／共役体
を使用することによって達成さねｊ二。
技術水準によれば結合基はできる限り小さく保たれるべ
きであり、またヘミルミネセンス能のある基は１基しか
ハプテンに結合されているへきてないのたから、この結
果は予想できないものであった。意外にもその変わりに
ヘミルミネセンス能のある複数モルがハプテンの複数モ
ルと共にそれらか十分な距離を於いて、鎖状ポリマーに
結合されているように互に結合されているならば、ハプ
テンについてのルミネセンス免疫学測定試薬の感度およ
び再現性が実質的に向」ユすることが判った。
きであり、またヘミルミネセンス能のある基は１基しか
ハプテンに結合されているへきてないのたから、この結
果は予想できないものであった。意外にもその変わりに
ヘミルミネセンス能のある複数モルがハプテンの複数モ
ルと共にそれらか十分な距離を於いて、鎖状ポリマーに
結合されているように互に結合されているならば、ハプ
テンについてのルミネセンス免疫学測定試薬の感度およ
び再現性が実質的に向」ユすることが判った。
本発明によるルミネセンス免疫学測定試薬にとっては別
の成分として、ハプテンに特異な抗体であって、殊に別
の化学反応によってハプテ／の複数モルが結合している
様な別の鎖状ポリマーを使用することによって収得さ第
１る抗体が使用される。
の成分として、ハプテンに特異な抗体であって、殊に別
の化学反応によってハプテ／の複数モルが結合している
様な別の鎖状ポリマーを使用することによって収得さ第
１る抗体が使用される。
このようにして得られた抗体は遊離形でも鎖状ポリマー
と結合した形でもハプテンに対して極めて特異的である
。
と結合した形でもハプテンに対して極めて特異的である
。
これに反しこれらの１九体は基が他の化学反応によって
結合された、池の鎖状ポリマーに対して何らの特異的な
結合性を有しない。
結合された、池の鎖状ポリマーに対して何らの特異的な
結合性を有しない。
反復した信能基をイ１する鎖状ポリマーとしては特にペ
ブ千ノド類、糖タン白類、グリコリピド類または炭化水
素類が使用できる。この種のポリマーの代表例はデキス
トラン、ペクチン、レンチンおよび天然ガムのような多
糖類、ｐ−Ｌｙ ｓ、 ｐ−Ｌｙ ｓ −Ｇ ］ ｕ、
ｐ−Ｌｉｙ ｓ −Ｔｙ「、ｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒのよ
うなペプチッド、血清アルブミンおよびグロブリンのよ
うなタン白質、トランスフェリン（ジデロフイリン）、
チログロブリン、オロ゛ツムコイド等のような糖タン白
類である。ポリマーはアミノニ、カルブキノルー、カル
ボニル−、チオニル−、ヒドロキシルーおよびまたはへ
ミルミネセンス能のある基およびハプテンがともに常法
および公知の方法側こよってポリマーに結合する如きジ
アゾ結合可能な基のような反復した官能性反応基の充分
な数を持たなければならな％ｓ０そのようなカップリン
グ試薬はたとえば、直接カンブリング用にはグリタルノ
アルデヒド、プロモンアン、ヒドラジン類、ビスエポキ
／ラン類、ジビニＪレスルホン類、エビクロロヒドリ７
類、ペンゾキノノ類、過ヨウ素酸ル類、トリクロロ−８
−）リアノン類、イソチオ／アン酸塩類、アリールアミ
ン類およびフェニルヒドラジン類かある。その際生成す
る結合型はたとえば、ミヒヤエルの付加生成物、７ノフ
塩基、／アン酸エステル−、トリアノニル、エーテル、
イミノ炭酸エステル、アミド、混合無水物、アルキルア
ミンおよびエステルである。直接力゛ンプリング用には
たとえばＥＥＤＧ （Ｎ−エトキンカルボニル−２−エ
トキ；−−１．２−ジヒドロキノリノ）カルボジイミド
、たとえばノ／クロヘキフルカルボノイミド、１−ンク
ロヘキ／ルー３−（２−モルホリニル−（４）−エチル
）カルボ／イミド−メチル−ｐ−）ルエンスホネート、
■−エチルー３−（３−ツメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸地およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドの様な試薬かある。ＭＢＳ（Ｉｎ−マレインイミドベ
ノゾイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）等
のようなヘテロニ官能性試薬もまた適する。 適当スル
ヘミルミネセンス能のある基としては、原則として、そ
のために公知のたとえば、Ｉ）Ｅ−Ｏ８第２９２１７８
１に詳細に要約されているすべての物質か用いられる。
ブ千ノド類、糖タン白類、グリコリピド類または炭化水
素類が使用できる。この種のポリマーの代表例はデキス
トラン、ペクチン、レンチンおよび天然ガムのような多
糖類、ｐ−Ｌｙ ｓ、 ｐ−Ｌｙ ｓ −Ｇ ］ ｕ、
ｐ−Ｌｉｙ ｓ −Ｔｙ「、ｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒのよ
うなペプチッド、血清アルブミンおよびグロブリンのよ
うなタン白質、トランスフェリン（ジデロフイリン）、
チログロブリン、オロ゛ツムコイド等のような糖タン白
類である。ポリマーはアミノニ、カルブキノルー、カル
ボニル−、チオニル−、ヒドロキシルーおよびまたはへ
ミルミネセンス能のある基およびハプテンがともに常法
および公知の方法側こよってポリマーに結合する如きジ
アゾ結合可能な基のような反復した官能性反応基の充分
な数を持たなければならな％ｓ０そのようなカップリン
グ試薬はたとえば、直接カンブリング用にはグリタルノ
アルデヒド、プロモンアン、ヒドラジン類、ビスエポキ
／ラン類、ジビニＪレスルホン類、エビクロロヒドリ７
類、ペンゾキノノ類、過ヨウ素酸ル類、トリクロロ−８
−）リアノン類、イソチオ／アン酸塩類、アリールアミ
ン類およびフェニルヒドラジン類かある。その際生成す
る結合型はたとえば、ミヒヤエルの付加生成物、７ノフ
塩基、／アン酸エステル−、トリアノニル、エーテル、
イミノ炭酸エステル、アミド、混合無水物、アルキルア
ミンおよびエステルである。直接力゛ンプリング用には
たとえばＥＥＤＧ （Ｎ−エトキンカルボニル−２−エ
トキ；−−１．２−ジヒドロキノリノ）カルボジイミド
、たとえばノ／クロヘキフルカルボノイミド、１−ンク
ロヘキ／ルー３−（２−モルホリニル−（４）−エチル
）カルボ／イミド−メチル−ｐ−）ルエンスホネート、
■−エチルー３−（３−ツメチル−アミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸地およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドの様な試薬かある。ＭＢＳ（Ｉｎ−マレインイミドベ
ノゾイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）等
のようなヘテロニ官能性試薬もまた適する。 適当スル
ヘミルミネセンス能のある基としては、原則として、そ
のために公知のたとえば、Ｉ）Ｅ−Ｏ８第２９２１７８
１に詳細に要約されているすべての物質か用いられる。
史にある種のアクリノニウムエステル、／ユウ酸エステ
ルならびにＩＤＥ −ＯＳ第３１３２４９１に説明され
ているイソチオノアノ酸フルオレセインもまた使用でき
る。
ルならびにＩＤＥ −ＯＳ第３１３２４９１に説明され
ているイソチオノアノ酸フルオレセインもまた使用でき
る。
ハプテンとしてはハプテ、ノとこれを担持する分子から
の免疫共役体として注射投与するとき被験動物に免疫化
学反応を生しるすべての分析的に興味のある４１機物
が取り扱われる。代表的なハプテ／および／１ブチ／に
対して特異的な抗体の収得は前記ＤＥ−Ｏ８第２９２１
７８１の４５〜５３頁に説明されている。
の免疫共役体として注射投与するとき被験動物に免疫化
学反応を生しるすべての分析的に興味のある４１機物
が取り扱われる。代表的なハプテ／および／１ブチ／に
対して特異的な抗体の収得は前記ＤＥ−Ｏ８第２９２１
７８１の４５〜５３頁に説明されている。
ジアゾルミノールとしてノアソ化した形でノアシカ、プ
リンタに適した基を自するポリマーと結合しうることか
ヘミルミネセンス能のある基として実用化しつることか
明らかになった。ハプテンは殊にカルボジイミド反応に
よってポリマーに結合する。例へば糖夕／バクであるト
ランスフェリ／がポリマーとして極めて好ましいことか
わかった。
リンタに適した基を自するポリマーと結合しうることか
ヘミルミネセンス能のある基として実用化しつることか
明らかになった。ハプテンは殊にカルボジイミド反応に
よってポリマーに結合する。例へば糖夕／バクであるト
ランスフェリ／がポリマーとして極めて好ましいことか
わかった。
それぞれのハプテ／に対する抗体は殊にこの７）ブテン
を別のカルボッイミドで他のポリマー、例えば血清アル
ノミンにカップリングさせ、抗体の製造の為に選ばれた
動物を処理することによって収得することができる。
を別のカルボッイミドで他のポリマー、例えば血清アル
ノミンにカップリングさせ、抗体の製造の為に選ばれた
動物を処理することによって収得することができる。
その様な抗体は純ハプテンに対しても、またへミルミネ
センス標識ハプテ／共役体に対しても、著しい特異性を
示すことか判明した。他方この場合、非特異性効果及び
交叉反応は避けられる。
センス標識ハプテ／共役体に対しても、著しい特異性を
示すことか判明した。他方この場合、非特異性効果及び
交叉反応は避けられる。
ヘミルミネセンス能を有する基の［ｉｌ、並びに結合基
に使用されたポリマーに結合されているハプテンの量は
一般に少なくとも１０てあって、結合基：へミルミネセ
ンス能のある基：ハプテ／のモル比が少なくとも１：１
０：１０になるへきである。
に使用されたポリマーに結合されているハプテンの量は
一般に少なくとも１０てあって、結合基：へミルミネセ
ンス能のある基：ハプテ／のモル比が少なくとも１：１
０：１０になるへきである。
本発明によるルミネセンス免疫測定試薬に就いては、ハ
プテンに対して特異性をｌ゛する抗体は固体担体に結合
されているのがよい。本出願人による研究の結果固体担
体としては特に、ｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ及びグルタルノア
ルデヒドのような合成ポリペブチ、ドで活性化されたポ
リスチレン球か特に適当であることかわかった。しかし
ながら抗体がその特異反応性をそれはと失うことなく、
担体に再現性よく均＝に結合し得るならば、他の固体担
体も原則的には適当である。
プテンに対して特異性をｌ゛する抗体は固体担体に結合
されているのがよい。本出願人による研究の結果固体担
体としては特に、ｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ及びグルタルノア
ルデヒドのような合成ポリペブチ、ドで活性化されたポ
リスチレン球か特に適当であることかわかった。しかし
ながら抗体がその特異反応性をそれはと失うことなく、
担体に再現性よく均＝に結合し得るならば、他の固体担
体も原則的には適当である。
ルミノールおよびルミノール誂導体のへミルミネセンス
測定は、アルカリ性媒体で過酸化水素およびベルオキシ
ダーゼを加える測定キュベツト中でこの様な球状担体を
使用して非常に簡単に実施できる。この際生しる光反応
はたとえばＬＢＫ社のルミノメータ−ＬＫＢ １２５１
のような公知の測定具を使用して測定することかできる
。
測定は、アルカリ性媒体で過酸化水素およびベルオキシ
ダーゼを加える測定キュベツト中でこの様な球状担体を
使用して非常に簡単に実施できる。この際生しる光反応
はたとえばＬＢＫ社のルミノメータ−ＬＫＢ １２５１
のような公知の測定具を使用して測定することかできる
。
ハプテンに対するそのようなルミネセンス免疫測定試薬
の取り扱い法、感瓜および精度は対応するラジオ免疫測
定のそれらと完全に比肩し得ることか判明した。さらに
本発明のルミネセンス免疫測定試薬は自動化に適し、従
って完全自動化測定装置においても使用することができ
る。
の取り扱い法、感瓜および精度は対応するラジオ免疫測
定のそれらと完全に比肩し得ることか判明した。さらに
本発明のルミネセンス免疫測定試薬は自動化に適し、従
って完全自動化測定装置においても使用することができ
る。
次層実施例で本発明のへミルミネセ／ス標識ハプテ／共
役体、およびそれを用いてつくられたハプテン用のルミ
ネセンス免疫ｆｌｌｌ定試薬を詳細に説明する。これら
の実施例で特に選ばれたヘミルミネセンス能のある基、
結合基およびハプテ／は決して本発明を限定するもので
ない。
役体、およびそれを用いてつくられたハプテン用のルミ
ネセンス免疫ｆｌｌｌ定試薬を詳細に説明する。これら
の実施例で特に選ばれたヘミルミネセンス能のある基、
結合基およびハプテ／は決して本発明を限定するもので
ない。
実ＪｌＩＫ−」−
（ｉ）例えば［（トリョードチロニン（Ｔ３ ） −）
ランスフェリン−（トリョードーノアゾルミノール）の
ような化学発光的に標識されたハプテ／共役体の製造 （ａ）カルボノイミド力、プリングによるトランスフェ
リンＴ３−共役体の製造 トランスフェリン（ベーリングーベルヶ社製の分子計８
８．０００のヒトのトランスフェリン）４４園ｇ（０゜
５ ａｍ）を２回蒸留した蒸留水２１に溶かした。２回
蒸留した蒸留水５００μｌに溶かしたＭＣＤＩ ［１−
シクロヘキンルー３− （２−モルホリニル−（４）−
エチル）カルボッイミド−メチル−ｐ−）ルエ／スルホ
ネート（メルク製、分ｊ’埴４２９）４２．９ｍｇ（１
００μＭ）Ｇ手早く加えた後、０．０ＩＮ塩酸をかきま
ぜなから滴下してｐＨを６に調整した。トリョードチロ
ニン（Ｔ３）（ングマ月製分子ｊｊｌＧ７３） １７（
ト）ｇを２回蒸留した蒸留水ｉｎ＋ｌに懸濁し、ＮａＯ
Ｈの０．５Ｍ／Ｉ溶液を嫡ドし完全に溶解するまでかき
まぜた。 この溶液をかきまぜなから、０．０５Ｎル酸
を加λ−てｐＨを６に１１日Ｓ＋、なから＋ｌｉｉ述の
トラ／スフエリノー液を滴下した。次いて室温で２時間
、次に３°Ｃて２４時間反応を続け、溶液を遠心分離し
た。
ランスフェリン−（トリョードーノアゾルミノール）の
ような化学発光的に標識されたハプテ／共役体の製造 （ａ）カルボノイミド力、プリングによるトランスフェ
リンＴ３−共役体の製造 トランスフェリン（ベーリングーベルヶ社製の分子計８
８．０００のヒトのトランスフェリン）４４園ｇ（０゜
５ ａｍ）を２回蒸留した蒸留水２１に溶かした。２回
蒸留した蒸留水５００μｌに溶かしたＭＣＤＩ ［１−
シクロヘキンルー３− （２−モルホリニル−（４）−
エチル）カルボッイミド−メチル−ｐ−）ルエ／スルホ
ネート（メルク製、分ｊ’埴４２９）４２．９ｍｇ（１
００μＭ）Ｇ手早く加えた後、０．０ＩＮ塩酸をかきま
ぜなから滴下してｐＨを６に調整した。トリョードチロ
ニン（Ｔ３）（ングマ月製分子ｊｊｌＧ７３） １７（
ト）ｇを２回蒸留した蒸留水ｉｎ＋ｌに懸濁し、ＮａＯ
Ｈの０．５Ｍ／Ｉ溶液を嫡ドし完全に溶解するまでかき
まぜた。 この溶液をかきまぜなから、０．０５Ｎル酸
を加λ−てｐＨを６に１１日Ｓ＋、なから＋ｌｉｉ述の
トラ／スフエリノー液を滴下した。次いて室温で２時間
、次に３°Ｃて２４時間反応を続け、溶液を遠心分離し
た。
Ｌ澄相中のトラ／スフエリノーＴ３ −共役体をセフア
ゾ、クス（、−２５（〕γＪレマ／アン（製）まｔこは
つＪレトロゲルＡ６（ＬＫＢｕ製）でゲル濾過して分離
した。この際溶離緩衝液として塩化ナトリウムの０．１
５Ｍ／ｌとともにｐＨ７〜８のリン酸塩１０Ｍ／ｌを使
用した。分取された各フラノク／ヨ／について測光によ
ってタノ白質含自およびＴ３−免疫活性度を試験し、タ
フバク質含イ１フランク／ヨ／を合液した。測定値から
明らかな様に置換、ｒは１４てあった。共役体は凍釘ｒ
Ｗ’ｓ蔵または凍結乾燥することかできた。
ゾ、クス（、−２５（〕γＪレマ／アン（製）まｔこは
つＪレトロゲルＡ６（ＬＫＢｕ製）でゲル濾過して分離
した。この際溶離緩衝液として塩化ナトリウムの０．１
５Ｍ／ｌとともにｐＨ７〜８のリン酸塩１０Ｍ／ｌを使
用した。分取された各フラノク／ヨ／について測光によ
ってタノ白質含自およびＴ３−免疫活性度を試験し、タ
フバク質含イ１フランク／ヨ／を合液した。測定値から
明らかな様に置換、ｒは１４てあった。共役体は凍釘ｒ
Ｗ’ｓ蔵または凍結乾燥することかできた。
（ｂ）ノ゛γゾルミノールのトランスフェリン−Ｔ３
Ｊｌ：ｆＱ体への力、プリング （１）ルミノールの／アフ化反応 ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラノンーノオ／、ニガーヘミ−材製）０．２ｍＭ（
２５，４４ｍｇ）をｌ−Ｍ／ｌの塩酸で５ｍｌに懸濁し
、均一にかきまぜなから水浴て０℃に冷却した。別に！
１１１肖酸カリウム１．５ｍＭ （１２８ｍｇ）を水１
１に溶かし、水浴でＯ′Ｃに冷却した。次に亜硝酸カリ
ウムの冷溶液を黄緑色の濁りか消失して黄色ないし、と
う黄色の透明溶液か形成されるまでルミノール懸濁液に
南トーシた。過剰の亜硝酸を尿素溶液の嫡ドによって除
去した。Ｊｌ成する／アゾルミノール溶液はそのまま使
用できる。凍結状態ではこのものは約１週間安定である
。
Ｊｌ：ｆＱ体への力、プリング （１）ルミノールの／アフ化反応 ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラノンーノオ／、ニガーヘミ−材製）０．２ｍＭ（
２５，４４ｍｇ）をｌ−Ｍ／ｌの塩酸で５ｍｌに懸濁し
、均一にかきまぜなから水浴て０℃に冷却した。別に！
１１１肖酸カリウム１．５ｍＭ （１２８ｍｇ）を水１
１に溶かし、水浴でＯ′Ｃに冷却した。次に亜硝酸カリ
ウムの冷溶液を黄緑色の濁りか消失して黄色ないし、と
う黄色の透明溶液か形成されるまでルミノール懸濁液に
南トーシた。過剰の亜硝酸を尿素溶液の嫡ドによって除
去した。Ｊｌ成する／アゾルミノール溶液はそのまま使
用できる。凍結状態ではこのものは約１週間安定である
。
／アゾルミノールのトう／スフェリンーＴ、３ −共役
体へのノアノ゛力、ブリノグｌ去 凍結乾燥した）・う／スフェ１Ｊ７−Ｔ３−共役体２０
ｍｇを３ｍｌの水にとかし、溶液のｐＨを炭酸ナトリウ
ム緩衝液によって９〜９，５に調整した。／アソルミノ
ール溶液を０°Ｃてかきませトう／スフ、リノーＴ３−
共役体１モルにつき／アゾルミノールか１００モルのモ
ル比になるまて滴ドした。この間ｐＨはさらにｕ２Ｈナ
トリウ緩衝液を添加することによって９に保持された。
体へのノアノ゛力、ブリノグｌ去 凍結乾燥した）・う／スフェ１Ｊ７−Ｔ３−共役体２０
ｍｇを３ｍｌの水にとかし、溶液のｐＨを炭酸ナトリウ
ム緩衝液によって９〜９，５に調整した。／アソルミノ
ール溶液を０°Ｃてかきませトう／スフ、リノーＴ３−
共役体１モルにつき／アゾルミノールか１００モルのモ
ル比になるまて滴ドした。この間ｐＨはさらにｕ２Ｈナ
トリウ緩衝液を添加することによって９に保持された。
最後に反応６４合物を３°Ｃて２４時間放置した。この
様にして得られたトラ／スソエリンー１゛３−ノアゾル
ミノール共役体はトラ／スフエリノー１゛３ −ンアソ
ルミノール共役（４ト同様にゲルｄ＆Ｉ過によって精製
し、分取された各フラクションについて、 （１）測光計を使用し２８０ｍｍで、 （２）Ｔ３−免疫活＋７４ （３）ＬＫＢ １２５１中のノアグルミノールのルミネ
センス反応および （４）Ｔ３抗体との特異的結合とノー、特異性結合ｖ１
を試験した。
様にして得られたトラ／スソエリンー１゛３−ノアゾル
ミノール共役体はトラ／スフエリノー１゛３ −ンアソ
ルミノール共役（４ト同様にゲルｄ＆Ｉ過によって精製
し、分取された各フラクションについて、 （１）測光計を使用し２８０ｍｍで、 （２）Ｔ３−免疫活＋７４ （３）ＬＫＢ １２５１中のノアグルミノールのルミネ
センス反応および （４）Ｔ３抗体との特異的結合とノー、特異性結合ｖ１
を試験した。
測定ＩｉＪ能なタンパク質含自鼠およびＴ３ 抗体ｌ＼
の１１ｆ異的結合をイ１−するが、とるにたる特異結合
を持たないフラ／り／ヨ／を合液しｔ二が、測定値から
トランスフェリ７：１’３：ノアノルミノールの置換率
は１：１４：２０であった。このようにして得られた共
役体は凍結乾燥することも凍結貯蔵することも可能であ
った。
の１１ｆ異的結合をイ１−するが、とるにたる特異結合
を持たないフラ／り／ヨ／を合液しｔ二が、測定値から
トランスフェリ７：１’３：ノアノルミノールの置換率
は１：１４：２０であった。このようにして得られた共
役体は凍結乾燥することも凍結貯蔵することも可能であ
った。
（１１）ハプテ／のルミネセノス免疫北１定法における
ヘルミ不センス標識されたハプテ／」（膜体の使用（Ｔ
のへミルミネセンス測定法におけるトラ／スフェ１．
１７− Ｔ −ノアノ゛ルミｌ−ル）（ａ）固イＪｊＪ
！ＦＪ本−表油ヒＮの坑５体！Ｈ什定−（ギ」二々すに
一イ小Ｗ上（Ｄｉ＞ｉｉＬ化 合成ポリペブチノド（分子量３０，０００のｐ−Ｐｈｅ
−［、ｙ ｓ ）で波頂した６、４ｍｍのポリスチレン
球をぺ／り：／−１．５−ノアールの０．５％水溶液で
活性化し得られた小球を０．０５Ｍ／Ｉのリン酸ｉｔｈ
緩ｉ液中ｐ ＋−１７，５〜８，５で、１−エチル−３
−（ジメチル−アミノプロピル）カルｉ＜ノイミド塩酸
塩（Ｅｒ）ＡＣ）を使用してつ／の面清アルブミ／と結
合させたＴ３を使用して得られた精製Ｔ３抗体と混合し
た。生成ソ、フ塩基は、ある場合には水素化ホウ素ナト
リウムで慎重に還元したが、安定性について実質的な差
異は現れなかった。残存する活性基はつ／の血清アルブ
ミンで飽和させた。この飽和は非特異性結合を測定によ
って監視したが、たいていの場合数日後、初めて完結し
た。小球を反復して水洗し空気流中で乾燥するか、ある
いはつ／の血清アルブミンを加えた０、０５Ｍのトリス
／塩酸緩衝液中に保存した。乾燥小球は使用前に出構成
するために同一緩衝液に１時間浸漬した。
ヘルミ不センス標識されたハプテ／」（膜体の使用（Ｔ
のへミルミネセンス測定法におけるトラ／スフェ１．
１７− Ｔ −ノアノ゛ルミｌ−ル）（ａ）固イＪｊＪ
！ＦＪ本−表油ヒＮの坑５体！Ｈ什定−（ギ」二々すに
一イ小Ｗ上（Ｄｉ＞ｉｉＬ化 合成ポリペブチノド（分子量３０，０００のｐ−Ｐｈｅ
−［、ｙ ｓ ）で波頂した６、４ｍｍのポリスチレン
球をぺ／り：／−１．５−ノアールの０．５％水溶液で
活性化し得られた小球を０．０５Ｍ／Ｉのリン酸ｉｔｈ
緩ｉ液中ｐ ＋−１７，５〜８，５で、１−エチル−３
−（ジメチル−アミノプロピル）カルｉ＜ノイミド塩酸
塩（Ｅｒ）ＡＣ）を使用してつ／の面清アルブミ／と結
合させたＴ３を使用して得られた精製Ｔ３抗体と混合し
た。生成ソ、フ塩基は、ある場合には水素化ホウ素ナト
リウムで慎重に還元したが、安定性について実質的な差
異は現れなかった。残存する活性基はつ／の血清アルブ
ミンで飽和させた。この飽和は非特異性結合を測定によ
って監視したが、たいていの場合数日後、初めて完結し
た。小球を反復して水洗し空気流中で乾燥するか、ある
いはつ／の血清アルブミンを加えた０、０５Ｍのトリス
／塩酸緩衝液中に保存した。乾燥小球は使用前に出構成
するために同一緩衝液に１時間浸漬した。
（ｂ） 仝ユえノによ一ネエヤー２−各−（Ａヒ【？−
づｔ光ｉ４１コ−−−ｙとＡ用定−使用する酸化系とし
ては、マイクロベルオキ／ターナ（ングマ社のマイクロ
ベルオキ／ダーゼ ）、４Ｐ１１）、５ＩｚＭ／ｌ、Ｈ
３Ｏ２０，５％およびＮａＯＨ０，８Ｍ／］の混合物を
用いた。使用緩衝液としては、０．１Ｍの塩化ナトリウ
ム、つ／の血清アルブミン４ｇ／ｌおよびＮ ａ Ｎ３
０．０１５Ｍ／ ｌを加えた０、０５Ｍのυノ酸塩緩
衝液を用いた。マイクロベルオキ／ターナおよび緩衝液
は測定の口前に混合した。岐路的な反応溶油のｐＨは１
３であった。このためにヘミルミネセンス速度は漸減し
たが、精度は向１−シた。測定はＨ３Ｏ３の添加による
反応の開始後に実施され、２０〜３０秒間の積分値とし
て発光を測定した。
づｔ光ｉ４１コ−−−ｙとＡ用定−使用する酸化系とし
ては、マイクロベルオキ／ターナ（ングマ社のマイクロ
ベルオキ／ダーゼ ）、４Ｐ１１）、５ＩｚＭ／ｌ、Ｈ
３Ｏ２０，５％およびＮａＯＨ０，８Ｍ／］の混合物を
用いた。使用緩衝液としては、０．１Ｍの塩化ナトリウ
ム、つ／の血清アルブミン４ｇ／ｌおよびＮ ａ Ｎ３
０．０１５Ｍ／ ｌを加えた０、０５Ｍのυノ酸塩緩
衝液を用いた。マイクロベルオキ／ターナおよび緩衝液
は測定の口前に混合した。岐路的な反応溶油のｐＨは１
３であった。このためにヘミルミネセンス速度は漸減し
たが、精度は向１−シた。測定はＨ３Ｏ３の添加による
反応の開始後に実施され、２０〜３０秒間の積分値とし
て発光を測定した。
（ｃ） ｌ −ルミネセンス５ｎ−ｉｌｌｌｌＹｕＦｚ
ど大ｑ轟□それぞれ１００μｍの血清試料または４ Ｌ
の培養緩衝液（ｐＨ７，４のトリス−ＭＣＩ ０．１Ｍ
／ｌ、ＫＣＩＱ、０２Ｍ／Ｉおよびウソ血清アルブミン
）２００７１１、次に示す第２表には本発明によってｆ
ｌｌｌ＋定された測定値をラジオ免疫測定法の測定値と
共にまとめた。
ど大ｑ轟□それぞれ１００μｍの血清試料または４ Ｌ
の培養緩衝液（ｐＨ７，４のトリス−ＭＣＩ ０．１Ｍ
／ｌ、ＫＣＩＱ、０２Ｍ／Ｉおよびウソ血清アルブミン
）２００７１１、次に示す第２表には本発明によってｆ
ｌｌｌ＋定された測定値をラジオ免疫測定法の測定値と
共にまとめた。
１鷹Ｌ
３種類のＴ の対照血清を使用してのルミネセンス免疫
測定法及びラジオ免疫測定１７：によって得られた測定
時間の相関関係 （各試験で測定された試料数 ｎ＝２０）史胤叶−２一 実施例１に説明の方法と同様にタフ膜体質共役体を次の
ように製造した。リジン残基約８０μｍを何するブタの
チログロブリン３８５■をコハク酸無水物１１５５ｍｇ
（１１，６ｍＭ）と反応させた。このためにチログロブ
リンを水２５Ｉｎ１にかきまぜなから溶解し、ｐＨをｌ
ＮＮａＯＨによってｐＨを７〜８に保ちなから、無水コ
ハク酸を少量ずつ加えた。１時間室温でかきまぜてから
ｌＮ塩酸でｐＨを約２．５に調整すると、約８０１の濃
厚な沈澱を生成した。この懸濁液をアミコンセルに移し
、３０＋＋１に濃縮し、反復して５０１の水に懸濁し、
改めてｌｌ縮した。６回／３１：浄を反復するとｐＨは
５．０となった。
測定法及びラジオ免疫測定１７：によって得られた測定
時間の相関関係 （各試験で測定された試料数 ｎ＝２０）史胤叶−２一 実施例１に説明の方法と同様にタフ膜体質共役体を次の
ように製造した。リジン残基約８０μｍを何するブタの
チログロブリン３８５■をコハク酸無水物１１５５ｍｇ
（１１，６ｍＭ）と反応させた。このためにチログロブ
リンを水２５Ｉｎ１にかきまぜなから溶解し、ｐＨをｌ
ＮＮａＯＨによってｐＨを７〜８に保ちなから、無水コ
ハク酸を少量ずつ加えた。１時間室温でかきまぜてから
ｌＮ塩酸でｐＨを約２．５に調整すると、約８０１の濃
厚な沈澱を生成した。この懸濁液をアミコンセルに移し
、３０＋＋１に濃縮し、反復して５０１の水に懸濁し、
改めてｌｌ縮した。６回／３１：浄を反復するとｐＨは
５．０となった。
セルの内容物を小分けし、凍結し、凍結乾燥した。
この生成物１５０１を３０１の水に溶かした溶融を調製
し、同時にＭＣＤ１８０ｍｇを加えながらメタノール２
１中のＬ−Ｔ エチルエステル３８ａｇと混合し、その
ｐＨをｌＮ塩酸で４に調整した。３０分後にＭ、ＣＩ）
Ｉ８０Ｉ１ｇを再添加し７た。室温で川に２０時間かき
まぜてから懸濁液を透析管に移し、毎日２回ずつ水を取
り換えなから３１１間透併を行った。次に透析管から懸
濁液を取り出して遠心分離した。遠心分離した透明り澄
液を４〜５ｍ１ｆつに小５）１すして凍結し、凍結乾燥
した。沈澱はアンモニアに溶かしから小分けし、凍結し
、凍結乾燥した。実施例１に記載の力法に同様に史に処
理し、ジアゾルミノールとカノブリノグさせてＴ４−ル
ミネセンス免疫測定法を実施した。
し、同時にＭＣＤ１８０ｍｇを加えながらメタノール２
１中のＬ−Ｔ エチルエステル３８ａｇと混合し、その
ｐＨをｌＮ塩酸で４に調整した。３０分後にＭ、ＣＩ）
Ｉ８０Ｉ１ｇを再添加し７た。室温で川に２０時間かき
まぜてから懸濁液を透析管に移し、毎日２回ずつ水を取
り換えなから３１１間透併を行った。次に透析管から懸
濁液を取り出して遠心分離した。遠心分離した透明り澄
液を４〜５ｍ１ｆつに小５）１すして凍結し、凍結乾燥
した。沈澱はアンモニアに溶かしから小分けし、凍結し
、凍結乾燥した。実施例１に記載の力法に同様に史に処
理し、ジアゾルミノールとカノブリノグさせてＴ４−ル
ミネセンス免疫測定法を実施した。
添付の図面は第１表を図示したものである。
弁理＋−（８３３４）砂川 １ｆ部
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ａ）ルミネセンス能のある基 ｂ）結合基及び Ｃ）ハプテン を含イ１− Ｌ 、結合基ｂ）が多数の機能的越を有す
る鎖状ポリマーであり、そのポリマー１モル当たり多数
モルのルミネセンス能のある基及び多数モルのハプテン
か結合されていることを特徴とする特ｉ−請求の範囲１
−４のよるルミネセンス標識ハプテン共役体２）結合基
ｂ）がペプチド、グリコプロティン、グリコリピド又は
炭化水素であることを特徴とする特許請求の範囲６のル
ミネセンス標識ハプテン共役体３）結合基ｂ）対ルミネ
センス能のある基ａ）対ハプテンＣ）のモル比が少なく
とも１：１０：１０であることを特徴とする特許請求の
範１用６−７のルミネセンス標識ハプテン共役体 ４）Ａ）各種ハプテンに特異的な一つの抗体及びａ）へ
ミルミネセノス能のある基 ｂ）結合基及び Ｃ）ハプテン を含有するヘミルミネセンス標識ハプテン共役体からな
り、その結合基ｂ）が幾つもの機能的な基を有する鎖状
ポリマーであり、その鎖に１モル当たり多数モルのへミ
ルミネセンス能の有る多数モルのハプテンが結合されて
いることを特徴とするハプテン用のルミネセンス免疫測
定試薬 ５）Ａ）で使用した抗体が一つのハプテ：／を使用して
収得され、そのハプテンがｂ）で用−シ）られた基とは
別の結合基に結合されていることを特徴とする特許請求
の範囲１のルミネセンス免疫測定試薬 ６）結合基ｂ）がペブチノド、グリコリピド又は炭化水
素であることを特徴とする特許請求の範囲１のルミネセ
ンス免疫測定試薬 ７）結合基ｂ）対ルミネセンス能のある。Ｋａ）対ハブ
・テンＣ）のモル比が少なくとも１：１０：１０であ
ることを特徴とする特許請求の範囲１−３の１つによる
ルミネセンス免疫測定試薬 ８）それぞれのハプテン用の特異的抗体へ）が固形担体
上に結合されていることを特徴とする特許請求の範囲１
−４のルミネセンス免疫前ｊ定試薬 ９）ａ）へミルミネセンス能のある基 ｂ）結合基及び Ｃ）ハプテン を含み、多数の機能基ｂ）を有する鎖状ポリマーを同時
にか又は順次、任意の順序で多数モルのルミネセンス能
のある基ａ）及び多数モルのノーブテンＣ）と化学的に
結合することをを特徴とするヘミルミネセンス標識ハプ
テ／共役体の製造法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3327327.8 | 1983-07-29 | ||
| DE3327327 | 1983-07-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60173469A true JPS60173469A (ja) | 1985-09-06 |
Family
ID=6205194
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59155123A Pending JPS60173469A (ja) | 1983-07-29 | 1984-07-25 | ルミネセンス免疫測定試薬キット及びその為に使用できる化学ルミネセンス標識ハプテン共役体並びにそれらの製造方法 |
| JP59155121A Pending JPS6070359A (ja) | 1983-07-29 | 1984-07-25 | 有機化学物質や生物学的物質を固定する為の活性化合成樹脂被覆体及びその製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59155121A Pending JPS6070359A (ja) | 1983-07-29 | 1984-07-25 | 有機化学物質や生物学的物質を固定する為の活性化合成樹脂被覆体及びその製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4645646A (ja) |
| EP (2) | EP0134307B1 (ja) |
| JP (2) | JPS60173469A (ja) |
| AT (2) | ATE42317T1 (ja) |
| DE (2) | DE3379659D1 (ja) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3582172D1 (de) * | 1985-06-25 | 1991-04-18 | Progen Biotechnik Gmbh | Immuntest zum nachweis von antikoerpern gegen dns. |
| BE902745A (fr) * | 1985-06-26 | 1985-10-16 | Remacle Jose | Methode de dosage par bioluminescence a l'aide d'enzymes immobilisees. |
| US4794002A (en) * | 1985-11-01 | 1988-12-27 | Monsanto Company | Modified polymeric surfaces and process for preparing same |
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
| CA1340590C (en) * | 1986-07-24 | 1999-06-08 | John C. Voyta | Chemiluminescence enhancement |
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| US5160626A (en) * | 1987-09-14 | 1992-11-03 | Gelman Sciences Inc. | Blotting methods using polyaldehyde activated membranes |
| US4992172A (en) * | 1987-09-14 | 1991-02-12 | Gelman Sciences, Inc. | Blotting methods using polyaldehyde activated membranes |
| US4961852A (en) * | 1987-09-14 | 1990-10-09 | Gelman Sciences, Inc. | Polyaldehyde activated membranes |
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| US4933410A (en) * | 1989-03-29 | 1990-06-12 | Applied Immunesciences, Inc. | Covalent attachment of macromolecules on substrate surfaces |
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| US5106762A (en) * | 1990-04-20 | 1992-04-21 | Georgetown University | Ligand-label conjugates which contain polyoxoanions of sulfur or phosphorus |
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| US5279955A (en) * | 1991-03-01 | 1994-01-18 | Pegg Randall K | Heterofunctional crosslinking agent for immobilizing reagents on plastic substrates |
| US5436147A (en) * | 1991-03-01 | 1995-07-25 | Nucleic Assays Corporation | Heterobifunctional crosslinked agents for immobilizing molecules on plastic substrates |
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