JPS6251105B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素反応方法に関し、詳しくは固定化
酵素の分散液を用いて酵素反応を連続的に行なう
方法に関する。

酵素反応は、その基質特異性や常温常圧での高
反応性のために、食品、医薬品の製造の過程で利
用されているが、従来は水溶液中で反応を行なわ
せている。しかし、このような方法によれば、反
応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給し
たり、また、反応後に酵素を失活させることな
く、生成物と酵素を分離することが非常に困難で
あり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反
応が回分式であるから生産性に劣る。このような
問題を解決するため、既に種々の方法にて酵素を
担体に固定化した固定化酵素を用いて基質と連続
的に反応させることが提案されている。しかし、
従来の方法は、多くの場合、粒状固定化酵素を反
応容器に充填し、この反応容器に基質溶液を供給
するものであり、固定化酵素が反応系内で固定さ
れているため、特に基質が高分子等であるとき、
基質の拡散性が悪く、反応に長時間を要すると共
に、固定化酵素の充填層が目詰まりを起こしやす
い問題がある。一方、中空繊維膜外に遊離の酵素
と基質の混合液を流し、中空繊維膜内に水のよう
な透析液を流し、中空繊維膜外で酵素反応によつ
て生じた反応生成物を透析作用により中空繊維膜
を透過させ、透析液と共に取出すようにした連続
酵素反応も提案されている（特開昭53−29994
号）。しかし、この方法によれば、中空繊維膜は
反応生成を透過されても、酵素は透過させないよ
うに、限定された比較的小さい孔径の微孔を有し
なければならず、特に反応生成物が高分子量の場
合は膜透過性が良好でなく、結果として、反応生
成物の取得に長時間を要する。また、中空繊維膜
外に酵素溶液を流し、中空繊維膜内に基質溶液を
流す場合も、基質が高分子量のときは、その拡散
が良好でない。そして、いずれの方法において
も、遊離の酵素を用いる限りは、生成物中への酵
素の混入が避けられないと共に、酵素活性が漸次
失なわれるので、酵素反応を長期間にわたつて安
定して行ない得ない。

本発明は上記した種々の問題を解決するために
なされたものであつて、酵素反応を速やかに行な
わせることができると共に、生成物に酵素が混入
せず、しかも、酵素が安定化されているため、酵
素反応を長期間にわたつて安定して行なうことが
できる連続酵素反応方法を提供することを目的と
する。

本発明による第一の酵素反応方法は、水分散型
高分子重合体粒子に酵素を固定化した固定化酵素
の分散液を、この固定化酵素を透過させない透過
膜の一方側に流通させ、上記透過膜の他方側に基
質溶液を流通させ、かくして、基質に透過膜を透
過させて、固定化酵素分散液側で酵素反応を行な
わせ、生成した反応生成物に透過膜を透過せしめ
て、基質溶液中に移行させるようにしたことを特
徴とし、第二の酵素反応は、水分散型高分子重合
体粒子に酵素を固定化した固定化酵素と基質溶液
の混合液を、この固定化酵素を透過させない透過
膜の一方側に流通させ、上記透過膜の他方側に透
析液を流通させ、かくして、生成した反応生成物
に透過膜を透過せしめて、透析液中に移行させる
ようにしたことを特徴とする。

本発明において用いられる固定化酵素は水分散
型高分子重合体粒子（以下、単に粒子又は担体粒
子ということもある。）に酵素が固定化された固
定化酵素であり、酵素は共有結合法、イオン結合
法又は物理吸着法のいずれかで担体粒子に固定化
されている。従つて、担体粒子は、酵素を共有結
合にて固定化させる場合にはそのための官能基を
有することを要し、酵素をイオン結合にて固定化
させる場合にはそのためのイオン交換基を有する
ことを要する。しかし、酵素を物理吸着させる場
合には、粒子は何ら特別な官能基やイオン交換基
を必要とせず、任意の組成の水分散型高分子重合
体粒子を用いることができる。

官能基又はイオン交換基を有する水分散型高分
子重合体粒子は、官能基又はイオン交換基を有す
る単量体を、好ましくはこれらと共重合可能な共
重合性単量体と乳化共重合させることによつて得
られる。

酵素を共有結合させるための官能基としては、
具体的にはカルボキシル基、水酸基、アミノ基、
ヒドラジド基、グリシジル基等を挙げることがで
きる。かかる官能基を有する単量体として、具体
的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸
のようなカルボキシル基を有する単量体、ヒドロ
キシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタ
クリレートのような水酸基を有する単量体、グリ
シジルメタクリレートのようなグリシジル基を有
する単量体を挙げることができる。このような単
量体を他の共重合性単量体と乳化共重合させるこ
とによつて、カルボキシル基、水酸基又はグリシ
ジル基を有する水分散型高分子重合体粒子を得る
ことができる。

また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散
型高分子重合体粒子は、アクリルアミドのような
アミド基を有する単量体及びアクリル酸メチル、
メタクリル酸メチルのようなメチルエステル基を
有する単量体をそれぞれ好ましくは他の単量体と
共に乳化共重合し、得られた共重合体中の上記ア
ミド基をホフマン転移させ、また、メチルエステ
ル基にヒドラジンを作用させることによつて得る
ことができる。アクリル酸エステルのようなエス
テル基を有する単量体を乳化共重合させた後、エ
ステル基を加水分解することによつても、官能基
としてカルボキシル基を含む水分散型高分子重合
体粒子を得ることができる。尚、カルボキシル基
は次に説明するように、イオン交換基としても機
能する。

次に、イオン交換基としては、スルホン酸基、
カルボキシル基、リン酸基等の酸基、第３級アミ
ノ基、第４級アミノ基等の塩基性基等を挙げるこ
とができ、このようなイオン交換基を有する単量
体の具体例としてスチレンスルホン酸、スルホプ
ロピルメタクリレートのようなスルホン酸基を有
する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、イタコ
ン酸のようなカルボキシル基を有する単量体、ア
シツドホスホキシエチルメタクリレート、３−ク
ロロ−２−アシツドホスホキシプロピルメタクリ
レートのようなリン酸基を有する単量体、ジメチ
ルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノ
プロピルメタクリルアミドのような第３級アミノ
基を有する単量体、メタクリルアミドプロピルト
リメチルアンモニウムクロライド、メタクリロイ
ルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライ
ドのような第４級アミノ基を有する単量体を挙げ
ることができる。

また、グリシジル基を有する単量体を他の単量
体と共に予め乳化重合させて水分散型高分子重合
体粒子を得、この共重合体に第３級アミノを反応
させると、第４級アミノ基をイオン交換基として
有する重合体が得られる。

官能基又はイオン交換基を有する単量体に共重
合させる共重合性単量体は、共重合性を有する限
りは特に制限されないが、好ましくはエチレン、
プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオ
ン酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸
エステル、スチレン、メチルスチレン、ブタジエ
ン、イソプレン、アクリルアミド、アクリロニト
リル、メタクリロニトリル等の一種又は二種以上
が用いられる。これらの共重合性単量体は、得ら
れる共重合体が酵素反応の行なわれる温度より高
いガラス転移点を有するように選ばれる。

本発明においては、官能基又はイオン交換基を
有する単量体とこれに共重合可能な上記単量体に
加えて、更に内部架橋剤としての多官能性単量体
を乳化共重合させて、水分散型高分子重合体粒子
を得ることもできる。内部架橋剤は得られる重合
体粒子のガラス転移点を高めると共に、イオン交
換基を有する単量体の乳化共重合に際して、望ま
しくない水溶性重合体の生成を抑制する。このよ
うな内部架橋剤の具体例として、エチレングリコ
ールジメタクリレート、トリエチレングリコール
ジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメ
タクリレート、１・３−ブチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジアクリ
レート、トリメチロールプロパントリメタクリレ
ート、トリメチロールプロパントリアクリレート
等のような多価アルコールのポリ（メタ）アクリ
レートやジビニルベンゼンが挙げられる。内部架
橋剤は、また、重合の安定性を高めるのにも役立
つ。

本発明においては、官能基又はイオン交換基を
有する単量体0.2〜30重量％と、これに共重合性
を有する単量体99.8〜70重量％とを乳化重合させ
て、水分散型高分子重合体粒子を得るのが好まし
い。内部架橋剤を併用する場合には、全単量体の
20重量％までの範囲で共重合させるのがよい。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、上記のような単量体を乳化共重合すること
によつて得られるが、重合体粒子中に乳化剤が混
在すると、酵素の固定化時にこれらが失活する等
の有害な影響があらわれることがあるので、乳化
重合に際しては乳化剤を用いないのが好ましい。
しかし、乳化剤が酵素に対して有害な影響を与え
ないときは、安定に水分散型高分子重合体粒子を
得るために用いてよいのは勿論である。

また、本発明において用いる水分散型高分子重
合体粒子は、平均粒径が0.03〜２μ、好ましくは
0.07〜１μである。平均粒径が小さすぎると、透
過膜として微孔孔径の小さいものを用いなければ
ならず、この結果、基質や生成物が膜を透過し難
くなり、反応や生成物の取得に長時間を要するこ
ととなり、一方、大きすぎると、単位体積当りの
粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量が少な
くなり、大きい活性を有する固定化酵素が得難
い。また、水分散型高分子重合体粒子の有する官
能基又はイオン交換基の量は、重合体粒子１ｇ当
り0.001〜５ミリ当量、好ましくは0.01〜２ミリ
当量である。この量が少なすぎるときは、十分な
量の酵素を固定化することができず、一方、多す
ぎるときは、酵素が固定化時に失活する傾向があ
るので好ましくない。

水分散型高分子重合体粒子に酵素を共有結合、
イオン結合又は物理吸着させる方法は特に制限さ
れず、従来より一般に知られている方法が適宜に
採用される。例えば、共有結合させる場合には、
具体的にはジアゾ法、カルボジイミド法、臭化シ
アン法、アジド法等を採用することができるが、
これらに限定されるものではない。また、本発明
においては、必要ならば、重合体粒子にヘキサメ
チレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、グリ
シルグリシルグリシン等のスペーサを介して酵素
を結合させ、固定化された酵素の担体上での自由
運動範囲を拡大することができる。

更に、本発明によれば、前記したような官能基
を有する一又は二以上の単量体に予め酵素を固定
化し、これを他の共重合性単量体と共に乳化共重
合させることによつても、酵素が固定化された水
分散型高分子重合体粒子が得られる。

水分散型高分子粒子に酵素をイオン結合するに
は、酵素の失活が起こらない温度、PH等適当な条
件で重合体粒子の分散液と酵素溶液とを混合すれ
ばよい。例えば、PHは酵素の等電点、イオン交換
基の種類等に応じて適宜に定められるが、一般的
には５〜８が好ましい。

本発明において水分散型高分子重合体粒子に固
定化される酵素は菌体内酵素でもよく、菌体外酵
素でもよい。更に、酵素は必らずしも高度に精製
されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用
いられる。更に、本発明に従つて単一の酵素を固
定化してもよいが、複数の酵素を固定化してもよ
い。酵素の具体例としは、アミノ酸オキシダー
ゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グル
コース・オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナーゼ、
乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラ
ギン酸アセチルトランスフエラーゼ、アスパラギ
ン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシンアミノ
トランスフエラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢
酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−ピ
ルビン酸アミノトランスフエラーゼ、クレアチン
ホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトランスフエ
ラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトラン
スフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのよ
うな転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラー
ゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナー
ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、
ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシ
ン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダ
ーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミ
ン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルヒン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

次に、本発明において用いられる透過膜は、水
分散型高分子重合体粒子に酵素を固定化した固定
化酵素が透過しない孔径の徴孔を有するように選
ばれるが、遊離の酵素を透過させない孔径と異な
り、比較的大きくてもよい。実際には、用いる重
合体粒子の粒径や基質の種類に応じて適宜に選ば
れる。透過膜の素材は特に制限されず、例えば酢
酸セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリロ
ニトリル、ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホ
ン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−
酢酸ビニル共重合体ケン化物等が用いられる。例
えば、エチレン含量80モル％以下のエチレン−酢
酸ビニル共重合体ケン化物からなる透過膜はタン
パク質が膜に付着し難く、目詰まりが少ないため
に好ましく用いられる。

本発明による第一の方法は、固定化酵素の分散
液を透過膜の一方側に循環流通させ、基質溶液を
透過膜の他方側に流通させ、かくして、基質に透
過膜を透過せしめて固定化酵素分散液側に移行さ
せ、ここで酵素反応を行なわせ、生成物を再び透
過膜を透過せしめて基質溶液側に移行させる。必
要ならば、基質溶液も循環させる。

用いる透過膜の形状は特に制限されないが、中
空繊維膜や管状膜が好都合である。例えば、中空
繊維膜を透過膜として用いる場合、中空繊維膜は
図示したようなモジユールに組込んで用いるのが
好都合である。モジユールは管状のケーシング１
の両端部近傍にシール材２が配設され、このシー
ル材間に中空繊維膜３が多数平行に固定されてお
り、軸方向両端に開口する。ケーシングは軸方向
両端に開口４及び５を有し、シール材間に側管６
及び７を有する。

上記した第一の方法においては、例えば、開口
４から固定化酵素の分散液がモジユール内に供給
され、中空繊維膜の内側を通つて開口５から排出
され、必要ならば循環される。基質溶液は側管６
から中空繊維膜の外側に供給され、側管７から排
出される。従つて、基質は膜を透過して膜内で酵
素反応を行ない、再び膜を透過して基質溶液に入
る。酵素は重合体粒子に固定化されているので、
中空繊維膜内に閉じ込められており、基質溶液側
に透過しない。このような方法と反対に、固定化
酵素分散液を側管から導入して中空繊維膜の外側
を循環流通させ、基質溶液を開口から中空繊維膜
内側に供給してもよい。

本発明による第二の方法は、透過膜の一方側に
固定化酵素分散液と基質溶液との混合液を流通さ
せ、透過膜の他方側に水や緩衝液等の透析液を流
通させ、かくして、酵素反応生成物は膜を透過し
て透析液と共に取得される。この方法において
は、特に基質が高分子量であり、反応生成物が低
分子量である場合に、固定化酵素と共に基質をも
透過させない孔径の徴孔を有する透過膜を選択す
ることにより、低分子量の反応生成物のみを選択
的に透析液中に移行させて取得でき、基質と分離
する必要もない。代表的な一例は基質としての澱
粉をα−アミラーゼで分解する酵素反応である。

前記したモジユールを用いる場合、酵素分散液
と基質溶液の混合物を側管から中空繊維膜の外側
に流通させ、中空繊維膜の内側に透析液を流通さ
せる。この方法とは反対に、中空繊維膜の内側に
酵素分散液と基質溶液の混合液を流通させ、中空
繊維膜の外側に透析液を流通させることもでき
る。

以上のように、本発明の方法によれば、酵素は
水分散型高分子重合体粒子に固定化され、この粒
子の分散液として反応系に供されるため、遊離の
酵素と同様に反応系で自由に移動することがで
き、従つて、固定化酵素が反応系で固定されてい
る従来の酵素反応方法と異なり、基質が高分子量
である場合にも基質は容易に拡散することがで
き、酵素反応は速やかに行なわれる。しかも、重
合体粒子に固定化されている酵素は透過膜の孔径
を選択することにより、基質や反応生成物と容易
に完全に分離することができ、遊離の酵素を用い
る場合と異なり、基質や生成物中に溶出して失な
われることもなく、また、酵素が固定化されてい
るので、酵素自体が安定であり、かくして、酵素
反応を長期にわたつて安定に連続して行なうこと
ができる。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

実施例 １ イオン交換基を有する単量体としてメタクリロ
イルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロラ
イド３ｇと、これに共重合可能な単量体としてメ
チルメタクリレート97ｇを蒸留水300ｇに加え、
２・2′−アゾビス−２−アミノジプロパン二塩酸
塩0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶液を
窒素気流下、60℃の温度で加え、120rpmで撹拌
しつつ８時間反応させて、平均粒径0.3μの重合
体粒子の分散液を得た。この分散液100ｇを遠心
分離し、水溶性重合体を含む上澄を除去し、洗降
粒子を0.1Mリン酸水素ニカリウムと0.1Mリン酸
二水素カリウムから調製した緩衝液（PH6.5）100
mlに分散させた。

ウレアーゼ２ｇを上記と同様の緩衝液100mlに
溶解した酵素溶液を上記分散液に加え、５℃で24
時間放置後、遠心分離し、洗降粒子を緩衝液で洗
滌して、未固定のウレアーゼを除去した。この粒
子を再び緩衝液で分散させて、ウレアーゼがイオ
ン結合にて固定化された水分散型高分子重合体粒
子の水分散液を得た。この固定化酵素のウレアー
ゼ固定化量は、重合体粒子１ｇ当り40mgであつ
た。

透過膜としてエチレン含量30モル％のエチレン
−酢酸ビニル共重合体ケン化物からなる長さ30cm
の中空繊維膜（徴孔孔径0.1μ、外径1000μ、膜
厚150μ）500本を図示したようにモジユールに組
込んだ。中空繊維膜内に上記固定化酵素の分散液
（PH6.5）を30℃の温度で0.5ml／分の割合で循環
させ、一方、中空繊維膜の外側に0.03M尿素緩衝
溶液を0.5ml／分の割合で向流に流通させたとこ
ろ、尿素の分解率が60％の反応生成物が得られ
た。酵素反応は経時的に安定であつて、10時間後
も反応率は変わらなかつた。また、反応生成物中
に酵素の溶出は認められなかつた。

実施例 ２ カルボキシル基を有する単量体としてアクリル
酸３ｇと、これに共重合可能な単量体としてメチ
ルメタクリレート97ｇを蒸留水300ｇに加え、過
硫酸アンモニウム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合
開始剤水溶液を70℃で窒素気流下に加え、
120rpmで撹拌しつつ８時間重合させて、平均粒
径0.25μの水分散型高分子重合体粒子の分散液を
得た。この分散液100ｇを遠心分離し、水溶性重
合体及び開始剤による電解質を含む上澄を除去し
た後、沈降粒子を再び蒸留水100mlで分散させ
た。

Ｎ−シクロヘキシル−N′−〔β−（Ｎ−メチル
モルフオリノ）エチル〕カルボジイミド−ｐ−ト
ルエンスルホネート2.0ｇを水60mlに溶解し、塩
酸でPH5.0に調整したカルボジイミド水溶液を上
記水分散液に加え、更に、α−アミラーゼ1.0ｇ
を水50mlに溶解し、塩酸でPH5.0に調整した酵素
溶液を加え、５℃の温度で24時間反応させた。反
応後、分散液を遠心分離して、未反応のカルボジ
イミドと未固定の酵素を含有する上澄を除いて、
α−アミラーゼが共有結合にて固定化されている
水分散型高分子重合体粒子を得た。この固定化酵
素におけるα−アミラーゼの固定化量は重合体粒
子１ｇ当り20mgであつた。

実施例１と同じ中空繊維膜モジユールを用い、
中空繊維膜内に、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウ
ム及び酢酸カルシウムをそれぞれ0.1M、0.02M及
び0.001Mとなるように溶解し、PHを7.0に調整し
た緩衝液を透析液として、40℃で0.5ml／分の割
合で流通させ、一方、中空繊維膜外に固形分10％
の上記固定化酵素の分散液と緩衝液に溶解した４
％バレイシヨ澱粉溶液の混合液を0.5ml／分の割
合で循環させた。この結果、澱粉分解物３％の透
析液が安定に得られ、10時間経過後も反応率は一
定であつた。また、透析液中には澱粉及び酵素の
溶出は認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の方法を実施するための中空繊維
膜モジユールの一例を示す縦断面図である。 １……ケーシング、２……シール材、３……中
空繊維膜、４，５……開口、６，７……側管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 平均粒径0.03〜２μｍである水分散型高分子
   重合体粒子に酵素を固定化した固定化酵素の分散
   液を、この固定化酵素を透過させない透過膜の一
   方側に流通させ、上記透過膜の他方側に基質溶液
   を流通させ、かくして、基質に透過膜を透過させ
   て、固定化酵素分散液側で酵素反応を行なわせ、
   生成した反応生成物に透過膜を透過せしめて、基
   質溶液中に移行させるようにしたことを特徴とす
   る酵素反応方法。 ２ 平均粒径0.03〜２μｍである水分散型高分子
   重合体粒子に酵素を固定化した固定化酵素と基質
   溶液の混合液を、この固定化酵素を透過させない
   透過膜の一方側に流通させ、上記透過膜の他方側
   に透析液を流通させ、かくして、生成した反応生
   成物に透過膜を透過せしめて、透析液中に移行さ
   せるようにしたことを特徴とする酵素反応方法。