JPS62156B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は、以下「Ｍ−331物質」と称する新規
な抗生物質、とくにシユードモナス属微生物
（Pseudomonas sp.）に対して有効な新規抗生物
質に関する。 発明の構成 本発明のＭ−331物質の理化学的性質は次の通
りである。 (1) 実験式：C₄₀H₄₉N₉O₁₁S（高分解能フアース
ト アトミツク ボンバードメント マススペ
クトロメトリー法による） (2) 分子量：863（マススペクトロメトリー法に
よる） (3) 元素分析値（％）：C₄₀H₄₉N₉O₁₁S・6H₂Oと
して 実測値
炭素：49.12、水素：5.94、窒素：13.24 計算値
炭素：49.43、水素：6.32、窒素：12.97 (4) 比旋光度：〔α〕^２５ _Ｄ＝＋58.9゜（ジメチルス
ルホキシド） (5) 赤外線吸収スペクトル： KBr錠としてのチヤートを第１図に示す。主
なν_nax（cm^-1）値は次の通りである。 3375、1660、1590、1535、1460、1385、1340、
1260、1175、1100、1065、960、880、815、
745、700、630、580、545 (6) 紫外線吸収スペクトル： 酸性もしくは中性メタノール中におけるチヤ
ートを第２図に示す。主なλ_nax（ｎｍ）は次
の通りである。 290（ε＝4600）、258（ε＝19500）、221（ε＝
41000）、205（ε＝37500） また塩基性メタノール中における主なλ_nax
（ｎｍ）は次の通りである。 290（ε＝7400）、262（ε＝20400）、245（ε＝
25000）、223（ε＝43100） (7) 物質の性質：白色粉末の両性物質 (8) 溶媒に対する溶解性：水、メタノール、ジメ
チルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド
等の極性溶媒に可溶。クロロホルムおよびエー
テル等の無極性溶媒に難溶。 (9) 呈色反応：モーリツシユ、塩化第二鉄−フエ
リシアン化カリウム、フオリン、エールリツヒ
およびパウリの各反応はそれぞれ陽性、ビウレ
ツト、アンスロン、坂口、ドラゲンドルフおよ
びニンヒドリンの各反応はそれぞれ陰性。 (10) 融点：204〜209℃ (11) pKa（66％（ｖ／ｖ）水性ジメチルホルムア
ミド中）：5.8、7.9、10.3、11.8 (12) 薄層クロマトグラフイー：逆相C₁₈シリール
化シリカゲルをけい光指示薬（254nｍ）およ
び0.5Mクエン酸緩衝液（PH＝4.0）：メタノー
ル＝１：１と共に用いた時のRf値がほぼ0.45で
ある。 Ｍ−331物質は新規な抗生物質群に属する。即
ちこれは特開昭54−163502号公報およびカレント
ケモテラピー アンド インフエクチアウス、
デイシーズ〔Current Chemotherapy and
Infectious Disease、（第11回国際化学療法学会
講演要旨集）、１、473〜475（1979）〕に記載の抗
生物質Ａ−38533因子Ｂに類似するが、以下の理
化学的性質において本質的に異なつている。 抗生物質Ａ−38533因子Ｂは、実験式が
C₃₉H₄₅N₉O₁₂Sであり、元素分析値は炭素54.4〜
55.1％、水素5.3〜5.6％及び窒素13.4〜13.9％
で、融点187〜190℃を有し、呈色反応はフオリン
反応が陰性であり、しかも薄層クロマトグラフイ
ーでのRf値が0.38であり、この点でＭ−331物質
とは明確に区別される。 本発明のＭ−331物質は該Ｍ−331物質生産菌を
培地に培養し、得られる培養物から分離・採取す
ることにより製造できる。 Ｍ−331物質生産菌としてはストレプトミセス
属に属する微生物を利用できる。そのうち、発明
者らが中華人民共和国貴州省安順縣の土壌から新
たに分離した菌株（Ｍ−331）は次のような菌学
的性質を有する。 (1) 形態学的性質 ａ 胞子形成菌糸の分枝法：単純分枝 ｂ 胞子形成の形態：鎖実状、RF（Rectus−
Flexibilis）−型 ｃ 胞子の数：数10個 ｄ 胞子の表面構造及び大きさ：平滑、1.6〜
2.1×1.3〜1.8μｍ ｅ 鞭毛胞子の有無：認められない ｆ 胞子のうの有無：認められない ｇ 胞子柄の着生位置：気菌糸上 (2) 各種培地上の性状および生態学的性質 下記表１に示す。

【表】 (3) 生理的諸性質 ａ 生育温度範囲 15〜40℃ ｂ ゼラチンの液化（28℃） 陰性 ｃ スターチの加水分解 陽性 ｄ セルロースの分解 陰性 ｅ 脱脂乳の凝固 陽性 ｆ 脱脂乳のペプトン化 陽性 ｇ 硝酸塩の還元 陽性 ｈ メラニン様色素の形成 陰性 ｉ 硫化水素の産生 陰性 (4) 各炭素源の同化性（プリドハム・ゴードリー
ブ寒天培地上） ａ Ｄ−グルコース ＋ ｂ Ｄ−フルクトース ＋ ｃ Ｌ−ラムノース ＋ ｄ Ｄ−マンニトール − ｅ Ｌ−アラビノース ＋ ｆ イノシトール − ｇ ラフイノース − ｈ Ｄ−キシロース ＋ ｉ シユクロース ＋ ｊ セルロース ＋ （＋：利用した、−：利用しなかつた） (5) 細胞壁組成 細胞水解物全体にＬ・Ｌ−ジアミノピメリン
酸及びグリシンが存在する。 以上のような菌学的性質を有する本菌株Ｍ−
331について、ベツカーらのアプリケーシヨンミ
クロバイオロジー〔Application Microbiology、
12、421−423（1964）〕、バージーズ マニユアル
オブ デターミネイテイブ バクテリオロジ
ー、第８版〔Bergey′s Ｍ anual of
Determinative Bacteriology、8th edition
（1974）〕、シヤーリングらのインターナシヨナ
ル・ジヤーナル・システイマテイツク・バクテリ
オロジー〔International Journal Systematic
Bacteriology 18、69−189（1968）〕、同18、279
−392（1968）、同19、391−512（1969）、同22、
265−394（1972）、野々村のジヤーナル・フエル
メンテーシヨン テクノロジー〔Journal
Fermentation Technology、52、78−92
（1974）〕および黒田らのジヤーナル・アンテイバ
イオテイクス〔Journal Antibiotics、33、259−
266（1980）〕により検索すると、本菌株に特に近
縁するものとして、ストレプトミセス・レシフエ
ンシス（Streptomyces・recifensis）、アクチノ
ミセス・アツロオリバセウス（Actinomyces・
atroolivaceus）、ストレプトミセス・キサントシ
デイクス（Streptomyces・xanthocidicus）およ
びストレプトミセス・オミヤエンシス
（Streptomyces・omiyaensis）が挙げられるが、
本菌株は上記のうち三種の菌とは、以下の諸点に
おいて明らかな相異が認められる。 (1) ストレプトミセス・レシフエンシス： 基中菌糸の色はイースト麦芽寒天培地上で灰
黄色であり、オートミール寒天培地上、スター
チ無機塩寒天培地上及び、グリセロール・アス
パラギン寒天培地上では識別できる色素はな
い。Ｌ−ラムノースの利用がないか又は少な
く、一方Ｄ−マンニトールおよびラフイノース
を利用する。 (2) アクチノミセス・アツロオリバセウス： 基中菌糸の色はイースト麦芽寒天培地、オー
トミール寒天培地、スターチ無機塩寒天培地お
よびグリセロール・アスパラギン寒天培地上で
識別できない。シユクロース、イノシトール、
Ｄ−マンニトールおよびラフイノースの利用は
一定してない。 (3) ストレプトミセス・キサントシデイクス： メラノイド色素が変化しやすい。Ｌ−ラムノ
ースを利用せず、ラフイノースの利用は少な
い。 従つて、本菌株は、これら三菌株とは完全に異
なる菌と同定された。 またストレプトミセス・オミヤエンシスとは最
も性質が近似しており、僅かにＤ−フルクトース
およびアラビノースの利用が少なく、シユクロー
スは利用しない、という点で異なつており、従つ
て本菌株Ｍ−331をストレプトマイセス・オミヤ
エンシスの変種と認め、ストレプトミセス・オミ
ヤエンシス・ヴアリアント、アンシユネンシス
（Streptomyces・omiyaensis variant
anshunensis）と命名した。 本菌株Ｍ−331は、工業技術院微生物工業技術
研究所に受託番号 微工研条寄第447号（FERM
BP−447）として寄託されている。 本発明で利用するストレプトミセス属に属する
Ｍ−331物質生産菌としては、上記菌性Ｍ−331の
他、同属に属するＭ−331物質生産菌及びこれら
を例えばＸ線、紫外線等の照射処理や、ナイトロ
ジエンマスタード、アザセリン、亜硝酸、Ｎ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）、２−アミノプリン等の変異誘起剤によ
る処理および形質導入、形質転換、接合等の通常
用いられる変異処理手段によつて変異させたもの
をも利用することができる。之等変異等の処理に
よればＭ−331物質の生産能力を高めることがで
きる。 本発明Ｍ−331物質の製造のための上記ストレ
プトミセス属微生物の培養方法は、基本的には一
般の微生物の培養方法に準ずることができ、通常
は液体培地による撹拌通気培養が有利である。培
地としては、ストレプトミセス属に属するＭ−
331物質生産菌が利用する栄養源を含有する各種
の合成培地、半合成培地あるいは天然培地を用い
ることができる。之等培地の組成としては、炭素
源として例えばグルコース、マンノース、グリセ
リン、シユクロース、糖蜜、でん粉、液化でん粉
等を、窒素源として肉エキス、カザミノ酸、ペプ
トン、グルテンミール、コーンミール、棉実油、
大豆粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、リン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素等を、
また必要に応じて、例えば、リン酸水素２ナトリ
ウム、リン酸２水素カリウム、炭酸カルシウム、
塩化マグネシウム等の金属のリン酸塩、炭酸塩、
塩化物等の無機塩等を夫々使用できる。培養中発
泡の著しい時には例えば大豆油、亜麻仁油等の植
物油、オクタデカノール、テトラデカノール、ヘ
プタデカノール等の高級アルコール類およびシリ
コン化合物等の消泡剤を適宜添加すればよい。通
常Ｍ−331物質生産菌は、20〜40℃で生育し、Ｍ
−331物質の生産は、約25〜40℃の範囲で行なわ
れる。本培養の培養時間は50〜100時間程度が適
当であり、培地の濃厚化に従つて、培養時間を更
に延長してもよい。上記培養に当つては撹拌通気
培養で通常行われるように、培地への滅菌空気の
吹き込みを行なうのが好ましく、微生物の効率的
生育のためには、タンク培養に用いる空気量を１
分間あたり、栄養培地１容量部に対して0.3〜0.6
容量部用い、毎分200〜400回転で撹拌するのが望
ましい。 尚、以上述べた培養条件は利用する微生物の特
性に応じてそれぞれ最適の条件を選択して適用さ
れるのが好ましい。 このようにして培養物中にＭ−331物質が生成
蓄積される。これは主に培養液中に含有されてい
るので、遠心分離または過により培養物から菌
体を除去した後、液から一般抗生物質の製造に
用いられる常用の手段によつて分離、精製され
る。 この分離、精製手段としては、具体的には減圧
濃縮；凍結乾燥；溶媒抽出；液性交換例えば強酸
性陽イオン交換樹脂１×３（中国製）、アンバー
ライトCG−120、弱酸性陽イオン交換樹脂122
（中国製）、アンバーライトIRC−50等の陽イオン
交換樹脂やアンバーライトIRA411、アンバーラ
イトIRA400等の陰イオン交換樹脂や非イオン交
換樹脂、アンバーライトXAD−２、ダイヤイオ
ンHP−20等の非イオン性吸着樹脂等による処
理；例えば活性炭、珪酸、シリカゲル、アルミナ
等の吸着剤による処理；結晶化乃至再結晶等を単
独で、又は任意の順序で組み合せて、また反復し
て採用することができる。 かくして本発明のＭ−331物質を収得できる。 本発明はまたＭ−331物質の塩をも提供するも
のであり、該塩は医薬として許容される通常の塩
を意味する。この医薬として許容される塩として
は、例えばナトリウム、カリウム、リチウム等の
アルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等の
アルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエ
チルアミン等の有機アミン塩等を例示できる。 本発明のＭ−331物質及びその塩は、以下の生
物学的性質を有する点においても特徴付けられ
る。 抗菌作用 グラム陽性及びグラム陰性病原菌、特にシユ
ードモナス属の細菌の発育を阻止する。ミクロ
液体希釈法によつて検定したＭ−331物質の各
種グラム陽性及びグラム陰性病原菌に対する最
小発育阻止濃度（MIC）を表２に示した。なお
対照に用いた抗生物質はカルベニシリンであ
る。

【表】

【表】 又、本発明Ｍ−331物質及びその塩は生体内
において実験的感染症に対して、抗菌活性を示
す。試験方法は最新医学・第32巻・1491〜６
（1977）に準じた。Ｍ−331物質を、緑膿菌
PSE1を感染させたマウスに１回投与し、観察
された活性をED₅₀値で検出した（被験動物の
50％を防御する有効投与量をmg／Kgで表わ
す）。それらの結果を表３に示した。なお、対
照に用いた抗生物質はカルベニシリンである。

【表】 急性毒性 Ｍ−331物質のマウスに対する静脈内投与で
のLD₅₀は2400mg／Kgである。 以上のような理化学的性質および生物学的性質
を有する物質は未だ知られておらず、本発明はか
かる抗菌作用を有し、医薬として有用な新規物質
を提供するものである。 実施例 次に本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明す
る。 実施例 グルコース６％（重量％、以下同じ）、デンプ
ン0.5％、ペプトン0.6％、魚粉0.5％、硫酸アンモ
ニウム0.7％、炭酸カルシウム0.4％および消泡剤
としてシリコンＫ−75（信越化学製）0.05％から
成る組成の培地100を200容量の培養タンクに
入れ、115℃で20分間滅菌した。これに上記と同
じ組成の培地で菌株Ｍ−331を培養した培養物を
５％接種し、毎分50の無菌空気を通じ、毎分
200〜250回転のプロペラ撹拌を行ないながら、28
℃で72時間培養した。培養終了後、遠心分離した
後、その上澄液について以下の分離操作を行なつ
た。 培養液をシユウ酸でPH2.0に調製後、水酸化ナ
トリウム水溶液にてPH3.8〜4.0に調製した。沈殿
物を別し、液を強酸性陽イオン交換樹脂１×
３（Na⁺）（中国製）に吸着させて、有効物質を
希水酸化ナトリウム水溶液にて溶出させた。その
溶出液を塩酸溶液にてPH6.5〜7.0に調製し、しば
らく放置後、析出してくる沈殿物を取した。又
液を塩化ナトリウムにて塩析した後、沈殿物を
取し、これを希水酸化ナトリウム水溶液に溶解
後、塩酸水溶液にてPH6.5〜7.0に調製し、しばら
く放置後、析出してくる沈殿物を取し、先の沈
殿物と合わせた。この沈殿物を水に溶解後、陽イ
オン交換樹脂122（Na⁺）（中国製）を充てんした
カラムに通過させ、有効物質を水にて溶出させ
た。溶出液のPHを6.5〜7.0に調製し、析出してく
る沈殿物を取し、乾燥させて、13.3ｇの粉末を
得た。 次に上記で得た粉末13.3ｇを水酸化ナトリウム
水溶液に溶かし、非イオン性吸着樹脂Ｘ−５（中
国製）を充てんしたカラムに通過させ、有効物質
を吸着させた。このカラムから有効物質を20％ア
セトン水溶液にて溶出させ、活性分画を集め、減
圧濃縮し、さらに凍結乾燥を行なつて白色粉末
4.6ｇを得た。 この白色粉末は、前記理化学的性質及び生物学
的性質を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明Ｍ−331物質の赤外線吸収スペ
クトル（KBr錠）分析図であり、第２図は同物質
の中性又は酸性メタノール中での紫外線吸収スペ
クトル分析図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記(1)〜(12)の特徴を有するＭ−331物質およ
   びその塩。 (1) 実験式：C₄₀H₄₉N₉O₁₁S（高分解能フアース
   ト アトミツク ボンバードメント マススペ
   クトロメトリー法による） (2) 分子量：863（マススペクトル法による） (3) 元素分析値（％）：C₄₀H₄₉N₉O₁₁S・6H₂Oと
   して 実測値
   炭素：49.12、水素：5.94、窒素：13.24 計算値
   炭素：49.43、水素：6.32、窒素：12.97 (4)比旋光度：〔α〕^２５ _Ｄ＝＋58.9゜（ジメチルスル
   ホキシド） (5) 赤外線吸収スペクトル：ν^ＫＢｒ _ｎａｘ（cm^-1） 3375、1660、1590、1535、1460、1385、1340、
   1260、1175、1100、1065、960、880、815、
   745、700、630、580、545 (6) 紫外線吸収スペクトル；λmax（ｎｍ） 酸性もしくは中性メタノール中 290（ε＝4600）、258（ε＝19500）、221（ε＝
   41000）、205（ε＝37500）、 塩基性メタノール中 290（ε＝7400）、262（ε＝20400）、245（ε＝
   25000）、223（ε＝43100）、 (7) 物質の性質：白色粉末の両性物質 (8) 溶媒に対する溶解性：水、メタノール、ジメ
   チルスルホキシドおよびジメチルホルムアミド
   の極性溶媒に可溶、クロロホルム、エーテルの
   無極性溶媒に難溶 (9) 呈色反応：モーリツシユ、塩化第二鉄−フエ
   リシアン化カリウム、フオリン、エールリツヒ
   およびパウリの各反応にそれぞれ陽性、ビウレ
   ツト、アンスロン、坂口、ドラゲンドルフおよ
   びニンヒドリンの各反応にそれぞれ陰性。 (10) 融点：204〜209℃ (11) pKa（66％水性ジメチルホルムアミド中）：
   5.8、7.9、10.3、11.8 (12) 薄層クラマトグラフイー： 逆相C₁₈シリール化シリカゲルをけい光指示
   薬（254nｍ）および0.5Mクエン酸緩衝液（PH
   ＝4.0）：メタノール＝１：１と共に用いた時
   のRf値がほぼ0.45である。