JPH0314430B2

JPH0314430B2 -

Info

Publication number: JPH0314430B2
Application number: JP15698782A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kihara; Yutaka Moroishi; Takeshi Hibino; Isoji Sakai
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1982-09-08
Filing date: 1982-09-08
Publication date: 1991-02-26
Also published as: JPS5945888A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経剤に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
を反応させることが提案されている。このような
酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性の
担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸着
によつて結合させる担体結合法が知られている。
しかし、従来、この方法において用いられている
担体は、通常、セルロース、デキストラン、アガ
ロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミド
ゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒子で
あり、このような粒子に酵素が固定化された固定
化酵素は、通常、カラム充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場
合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間
を要すると共に、反応収率が低いという問題があ
る。

本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、(a)アク
リル酸エステル又はメタクリル酸エステル５〜98
重量％、(b)この単量体と共重合し得る第１の単量
体０〜90重量％、(c)多官能性内部架橋用単量体１
〜20重量％、及び(d)第２の単量体としてのアクリ
ロニトリル又はメタクリロニトリル１〜60重量％
とからなる単量体組成を乳化共重合させ、得られ
る水分散性高分子重合体粒子をケン化してカルボ
キシル基を生成させ、次いで、このカルボキシル
基を介して酵素を共有結合にてて固定化すること
を特徴とする。

本発明においては、アクリル酸エステル及び／
又はメタクリル酸エステル（以下、（メタ）アク
リル酸エステルと称する。）を１成分とする２以
上の単量体組成を、好ましくは乳化剤の不存在下
で乳化共重合し、かくして得られる水分散性高分
子重合体粒子が側鎖に有するエステル基をケン化
するとにより、その表面に高い密度でカルボキシ
ル基を生成させ、このカルボキシル基を介して酵
素を共有結合により固定化するのである。

ここに、（メタ）アクリル酸エステルとしては、
一般式 CH₂＝CR₁COOR₂ （但し、R₁は水素又はメチル基を示し、R₂は炭
素数１〜３のアルキル基又はベンジル基を示す。）
で表わされるものが好ましく用いられ、特に、
（メタ）アクリル酸エステルが好ましく用いられ
る。

かかる（メタ）アクリル酸エステルと共重合さ
せる第１の単量体としては、アクリルニトリル、
メタクリロニトリル、及び上記（メタ）アクリル
酸エステルを除いて、これらと共重合性を有し、
且つ、得られる共重合体が酵素反応の行なわれる
温度よりも高いガラス転移点を有する限りは特に
制限されるものではないが、好ましくは、エチレ
ン、プロピレン、塩化ビニル、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルス
チレン、ビニルトルエン、ブタジエン、イソプレ
ン、アクリルアミド、メタクリルアミド等の１種
又は２種以上が用いられる。特に、スチレンが好
ましく用いられる。但し、この第１の単量体は、
必ずしも単量体成分として単量体組成に含有され
る必要はない。

尚、第１の単量体として、重合体の安定化や重
合体粒子の安定化のために、全単量体組成の５重
量％以下の範囲でイオン性基を有する単量体を用
いてもよい。かかるイオン性基としては、例え
ば、スルホン酸基、カルボルシキル基、リン酸基
等の酸基、第３級アミノ基、第４級アミノ基等の
塩基性基等を挙げることができる。このようなイ
オン性基を有する単量体の具体例としては、スチ
レンスルホン酸、スルホプロピルメタクリレート
のようなスルホン酸基を有する単量体、アクリル
酸、メタクリル酸、イタコン酸のようにカルボキ
シル基を有する単量体、アシツドホスホキシエチ
ルメタクリレート、３−クロロ−２−アシツドホ
スホキシエチルメタクリレートのようなリン酸基
を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミ
ドのような第３級アミノ基を有する単量体、メタ
クリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムク
ロライド、メタクリロイルオキシエチルトリメチ
ルアンモニウムクロライドのような第４級アミノ
基を有する単量体を挙げることができる。

また、内部架橋用多官能性単量体としては、多
価のアルコールのポリ（メタ）アクリレートが好
ましく、具体的には、エチレングリコールジメタ
クリレート、ジエチレングリコールジメタクリレ
ート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、
１，３−ブチレングリコールジメタクリレート、
トリエチレングリコールジアクリレート、トリメ
チロールプロパントリメタクリレート、トリメチ
ロールプロパントリアクリレート、テトラメチロ
ールメタンテトラアクリレート等が用いられる。
ジビニルベンゼンも好ましく用いられる。

更に、本発明においては、水分散性高分子重合
体粒子を得るための単量体として、単量体組成は
第２の単量体成分として、アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリルを含有することが必
須である。

本発明においては、以上のような各単量体を水
媒体中にて通常の方法にて乳化共重合体させるこ
とにより、側鎖にエステル基を有する水分散性高
分子重合体粒子を得ることができるが、得られる
重合体粒子中に乳化剤が混在すると、酵素の固定
化の際に酵素が失活する等の有害な影響が現れる
ことがあるので、乳化共重合体に際しては乳化剤
を用いないのが好ましい。本発明による上記単量
体組成によれば、特に乳化剤を要せずして安定に
共重合させることができるが、乳化剤が酵素に対
して有害な影響を与えなければ、乳化剤を必要に
応じて用いてもよい。

本発明における単量体組成は、（メタ）アクリ
ル酸エステル５〜98重量％、好ましくは20〜93重
量％、この単量体と共重合し得る第１の単量体０
〜90重量％、好ましくは０〜80重量％、多官能性
内部架橋用単量体１〜20重量％、好ましくは２〜
10重量％、及び第２の単量体としてのアクリロニ
トリル又はメタクリロニトリル１〜60重量％、好
ましくは５〜40重量％とからなる。

単量体組成において（メタ）アクリル酸エステ
ル単量体の量は、これから得られる水分散性高分
子重合体粒子をケン化して生じるカルボキシル基
量、従つて、このカルボキシル基に固定化し得る
酵素の固定化量とも関連し、少なすぎるときは酵
素を十分な量にて固定化することができず、多す
ぎるときは重合の安定性を損なうと共に、得られ
る重合体粒子の安定性も損なわれるので、好まし
くない。

本発明において用いる（メタ）アクリル酸エス
テルは疎水性であるため、水溶性重合体を生じる
ことがなく、しかも、これを（メタ）アクリロニ
トリルとを乳化共重合させることにより、重合が
非常に安定に行なわれて、凝集物が殆ど生成しな
い。（メタ）アクリロニトリルの量が上記範囲よ
りも少ないとき、又は多すぎるときは、重合の安
定性が損なわれるおそれがあるので、好ましくな
い。また、内部架橋用単量体は、後述する重合体
粒子のケン化の際の粒子の安定性を高めるのに寄
与し、上記範囲で用いることが好ましい。

本発明によれば、上記のようにして得られたエ
ステル基を有する水分散性高分子重合体粒子は酸
又はアルカリの水溶液によりケン化され、エステ
ル基はカルボキシル基に変えられる。酸として
は、例えば、塩酸、硫酸、リン酸等が、また、ア
ルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、アンモニア等が、それぞれ適宜に用いられ
る。これら酸又はアルカリ水溶液の濃度は、通
常、0.01〜５規定、好ましくは0.05〜２規定であ
る。本発明においては、重合体粒子の表面のみを
ケン化すれば足り、ケン化条件は適宜に選ばれ
る。通常、上記のような酸又はアルカリを用い
て、20〜70℃の温度で数分乃至数十時間ケン化す
る。酸又はアルカリの濃度が高すぎるときは、重
合体粒子の安定性が悪くなり、重合体粒子が凝集
したり、水溶化したりする。また、濃度が低すぎ
るときは、ケン化に不必要に長時間を要するので
好ましくない。温度が高すぎる場合も、重合体粒
子の安定性が悪くなるので好ましくない。

このようにして得られる水分散性高分子重合体
粒子は表面に高密度にて水酸基を有するが、その
粒子径はケン化の前後で殆ど変わらず、ケン化後
に僅かに大きくなる程度である。

水分散性高分子重合体粒子の有するカルボキシ
ル基の量は、重合体粒子１ｇ当り0.005〜20ミリ
当量、好ましくは0.01〜５ミリ当量である。負荷
量が小さく、酵素反応が十分に行なわれないから
であり、一方、多すぎるときは、水分散性高分子
重合体粒子の安定性が損なわれることがあるから
である。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03μ〜2μ、好ましくは
0.07μ乃至1μである。粒径が小さすぎると、これ
を担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、
粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積
が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共
に、水中に分散させるのが困難となるので好まし
くない。

水分散性高分子重合体粒子の有するカルボキシ
ル基を介して酵素を共有結合にて固定化する方法
は特に制限されず、従来より知られている方法が
適宜に採用される。

例えば、一つの方法として、アルボキシル基と
酵素の有する遊離のアミノ基を水溶性カルボジイ
ミド、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ
ルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート
等と反応させて、共有結合を形成させることがで
きる。具体的には、例えば、重合体粒子の有する
カルボキシル基の５〜50倍当量の上記カルボジイ
ミドの水溶液に酵素を加え、温度５℃程度、PHを
4.5〜60程度に保ちつつ、静置又は撹拌すればよ
い。

別の方法として、水分散性高分子重合体粒子表
面のカルボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドをカルボジイミドの存在下に反応させた後、
酵素のアミノ基を反応させ、共有結合を形成させ
ることができる。更に、別の方法として、水分散
性高分子重合粒子表面のカルボキシル基にジアミ
ンを作用させて、重合体粒子表面にアミノ基あ導
入し、このアミノ基により酵素を共有結合にて固
定化することもできる。例えば、前記したカルボ
ジイミドを用いて、酵素のカルボキシル基を重合
体粒子のアミノ基にはさせることができ、また、
グルタルアルデヒドのような架橋試薬を用いて、
酵素のアミノ基を重合体粒子に結合させることが
できる。ジアルデヒドを架橋試薬として用いる場
合には、重合体粒子の有するアミノ基に対して過
剰量を反応させ、重合体粒子に一方のアルデヒド
基により結合したジアルデヒドの他方の遊離アル
デヒド基に酵素のアミノ基を結合させる。

また、更に別の方法として、ジアゾカツプリン
グ法によることもできる。例えば、アミノ基を導
入した重合体粒子にｐ−ニトロベンズアルデヒド
を反応、結合させ、次にニトロ基を通常の方法、
例えば水素化ホウ素ナトリウムと亜二チオン酸ナ
トリウムによつてアミノ基に還元し、このアミノ
基を亜硝酸ナトリウムによつてジアゾニウム基と
し、これを酵素のアミノ基とカツプリングさせる
のである。

以上のようにして、酵素を重合体粒子に共有結
合させた後、用いた反応試薬や固定化されていな
い酵素を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつ
て除去すれば、本発明の固定化酵素を得る。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度により適宜に決定され
る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キザロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトラ
ンスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクト
キナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチル
トランスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミ
ラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナ
ーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダ−ゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオ
チダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラス
ミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコールイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、表面
に高密度にカルボキシル基を有する水分散型高分
子重合体粒子に、上記カルボキシル基を介して酵
素が共有結合により固定化されており、従来のセ
ルロース誘導体粒子を担体とする場合と異なり、
固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反応系内を
自由に移動できるため、基質の拡散が反応に殆ど
影響を与えず、従つて、高分子量の基質の場合に
も遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を
行なわせることができる。

しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の
担体に固定化されているため、酵素反応後には遠
心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性
膜による膜分離等によつて容易に回収でき、かく
して、長期間にわたつて高い酵素活性を保持させ
つつ、繰返して使用することができる。

更に、一般にカルボキシル基を有する単量体は
水溶性であるため、他の単量体との乳化共重合が
容易ではなく、単独重合体を生成することが多
く、また、共重合体を得ても重合体粒子表面のカ
ルボキシル基の密度が小さく、重合体粒子におけ
る酵素の負荷量を大きくすることが困難である
が、本発明によれば、前記単量体組成により、乳
化剤を特に用いることはなく、望ましくない水溶
性重合体の生成を抑えて、安定に水分散性高分子
重合体粒子を得、これをケン化してカルボキシル
基を生じさせるので、カルボキシル基を有する水
分散性高分子重合粒子を安定に得ることができ、
且つ、重合体粒子上のカルボキシル基密度が高い
ので、酵素を高負荷量にて固定化することができ
る。更に、（メタ）アクリロニトリルと内部架橋
用単量体を併用することにより、得られる水分散
性高分子重合体粒子は強度が大きいと共に、粒子
相互の粘着も起こらない。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。

実施例１メチルアクリレート80ｇ、トリエチレングリコ
ールジメタクリレート２ｇ及びアクリロニトリル
15ｇを蒸留水230ｇに加え、２，2′−アゾビス−
２−アミジノプロパン二塩酸塩0.3ｇを水10mlに
溶解した重合開始剤水溶液を60℃の温度で窒素気
流下に加え、120rpmで撹拌しつつ８時間重合さ
せて、固形分約30％、平均粒径0.4μの重合体粒子
の水分散液を得た。重合は非常に安定に行なわれ
て、凝集物は0.04％であつた。

次に、上記の重合体粒子水分散液に2Nカ性ソ
ーダ水溶液100mlを加え、室温で一夜撹拌した後、
2N塩酸水溶液を加えて中和し、重合体粒子を遠
心分離し、洗滌した。

このようにして得られた重合体粒子１ｇ（乾燥
重量）当りのカルボキシル基量は3.3ミリモルで
あつた。

上記重合体粒子の水分散液100mlに１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボ
ジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート40ｇ
を水200mlに溶解した水溶液を加え、撹拌しつつ、
PHを5.0に調整した。α−アミラーゼ2.5ｇを水
500mlに溶解し、PH5.0に調整した水溶液を上記重
合体粒子水分散液に加え、撹拌下にPHを5.0に調
整しながら、５℃の温度で24時間反応させた。

この後、重合体粒子を遠心分離し、沈降した粒
子を緩衝液で洗滌し、未固定のα−アミラーゼ、
未反応のカルボジイミド及び反応副生物を除去し
た後、再び緩衝液中に分散させて、本発明による
固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量は、
重合体粒子の１ｇ当り70mgであり、また、活性収
率は40％であつた。

尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義され
る。ここでは、１％デンプン水溶液を基質とし
て、固定化酵素を35℃で30分間反応させ、ヨウ素
デンプン反応からデンプンの分解量をもとめるこ
とにより、固定化酵素の活性、即ち、デンプン分
解速度（mg／分）を得、これと等しい活性を有す
る遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

実施例２実施例１で得た水酸基を有する重合体粒子水分
散液100mlに、１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−ト
ルエンスルホネート20ｇを水200mlに溶解した水
溶液を加え、撹拌しつつ、PHを5.0に調整した。
次に、ｍ−キシリレンジアミン3.0ｇを水30mlに
溶解したPH5.0の水溶液を上記分散液に加え、撹
拌下にPHを5.0に調整しつつ、室温で４時間反応
させた。この後、遠心分離して沈降した重合体粒
子を水洗し、未反応のカルボジイミド及びジアミ
ン、反応副生物を除去し、かくして、アミノ着を
有する水分散性高分子重合粒子を得た。

この重合体粒子を水100mlに再分散させ、グル
タルアルデヒドの５％水溶液60mlを加え、室温で
24時間反応させた後、遠心分離により精製し、ア
ルデヒド基を有する水分散性高分子重合体粒子を
得た。

次に、0.1Mリン酸水素二カリウム及び0.1Mリ
ン酸二水素カリウムから調整した緩衝液（PH7.0）
100mlに上記重合体粒子を分散させ、これにウレ
アーゼ３ｇを緩衝液30mlに溶解した酵素水溶液を
加え、５℃の温合で20時間反応させて、ウレアー
ゼを重合体粒子に固定化した。反応後、遠心分離
して沈降した重合体粒子を緩衝液で洗滌し、緩衝
液に再分散させて、本発明による固定化酵素を得
た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は、重
合体粒子１ｇ当り40mgであり、活性収率は50％で
あつた。活性収率は、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義さ
れ、ここでは、0.03Mの尿素水溶液を基質とし、
35℃で10分間固定化酵素を反応させ、生成したア
ンモニア量（μモル／分）を塩酸滴定で求めて活
性を測定し、これと等しい活性を有する遊離の酵
素量を酵素固定化量で除して求めた。

実施例３実施例２で得られたアミノ基を有する水分散性
高分子重合体粒子の水分散液100mlにｐ−ニトロ
ベンズアルデヒドの１％エタノール溶液200mlを
加え、室温で２時間反応させた後、遠心分離し、
洗滌し、ニトロ基を有する水分散性高分子重合体
粒子を得た。

この重合体粒子を水100mlに再分散させ、これ
に0.1M亜二チオン酸ナトリウムと0.5M炭酸水素
ナトリウムを含有する水溶液100mlを加え、室温
で２時間反応させて、重合体粒子の有するニトロ
基をアミノ基に還元した。遠心分離後、十分に洗
滌し、アミノ基を有する水分散性高分子重合体粒
子を得た。

この重合体粒子を水100mlに分散させ、これに
0.1Mの亜硝酸ナトリウムの0.5N塩酸水溶液50ml
を加えて、室温で１時間反応させ、重合体粒子の
有するアミノ基をジアゾニウム基に変えた。この
後、重合体粒子を十分に洗滌して、ジアゾニウム
基を有する水分散性高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子を水100mlに再分散させ、これ
にトリプシン0.3ｇを緩衝液30mlに分散させた酵
素溶液を加え、５℃の温度で24時間反応させた
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を緩衝液で
洗滌し、未固定のトリプシンを除去した。これを
再び緩衝液に分散させて、本発明による固定化酵
素を得た。

この固定化酵素におけるトリプシンの固定化量
は、重合体粒子１ｇ当り3.5mgであり、また、活
性収率は40％であつた。

尚、１％カゼイン水溶液を基質として、酵素を
35℃で10分間反応させた後、５％トリクロル酢酸
により高分子量タンパク質を沈澱させ、遊離の非
タンパク性分解質量を280nｍの吸光度から求め、
この吸光度を１分間に1.0増加させる活性を１単
位として、活性収率を求めた。

実施例４エチルアクリレート30ｇ、スチレン40ｇ、ジビ
ニルベンゼン２ｇ及びアクリロニトリル30ｇを蒸
留水230ｇに加え、実施例１と同様に重合し、固
形分約30％、平均粒径0.25μの重合体粒子の水分
散液を得た。重合は非常に安定に行なわれて、凝
集物は0.02％であつた。

上記重合体粒子を実施例１と全く同様にケン化
して、カルボキシル基を有する水分散性高分子重
合粒子を得た。

この重合体粒子の水分散液100mlに１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボ
ジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート20ｇ
を水200mlに溶解した水溶液を加え、撹拌しつつ、
PHを5.0に調整した。ウレアーゼ3.0ｇを水500ml
に溶解し、PHを5.0に調整した水溶液を上記重合
体粒子水分散液に加え、撹拌下にPHを5.0に調整
しながら、５℃の温度で24時間反応させた。

この後、重合体粒子を遠心分離し、沈降した粒
子を緩衝液で洗滌し、未固定のウレアーゼ、未反
応のカルボジイミド及び反応副生物を除去した
後、再び緩衝液中に分散させて、本発明による固
定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼ固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り58mgであり、また、0.03M尿素を
基質として、実施例２と同様に求めた活性収率は
30％であつた。

比較例１実施例１において、アクリロニトリルを用いな
い以外は実施例１と全く同様にして重合を行なつ
たが、重合中に全体が凝集し、重合を円滑に行な
うことができなかつた。

比較例２実施例１において、トリエチレンジメタクリレ
ートを用いない以外は実施例１と全く同にして重
合を行なつたところ、６％の凝集物が生成した。
凝集物を除いた後、この重合体粒子水分散液を実
施例１と同じ条件下でケン化したところ、全体が
ゲル状となり、重合体粒子の水分散液を得ること
ができなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a)アクリル酸エステル又はメタクリル酸エス
テル５〜98重量％、(b)この単量体と共重合し得る
第１の単量体０〜90重量％、(c)多官能性内部架橋
用単量体１〜20重量％、及び(d)第２の単量体とし
てのアクリロニトリル又はメタクリロニトリル１
〜60重量％とからなる単量体組成を乳化共重合さ
せ、得られる水分散性高分子重合体粒子をケン化
してカルボキシル基を生成させ、次いで、このカ
ルボキシル基を介して酵素を共有結合にて固定化
することを特徴とする固定化酵素の製造方法。２水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の固定化酵素の製造方法。３多官能性内部架橋用単量体が多価アルコール
のポリ（メタ）アクリレートであることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製
造方法。４アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステ
ルがメチルエステル又はエチルエステルであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定
化酵素の製造方法。