JPS5945883A - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に熔解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶性の担体
に酵素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応させる
ことが提案されている。このような酵素の固定化方法の
代表的なものに、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イ
オン結合又は物理吸着によって結合させる担体結合法が
知られている。

しかし、従来、この方法において用いられている担体は
、通常、セルロース、デキストラン、アガロース等の多
糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラス
等の径１龍乃至数龍の粒子であり、このような粒子に酵
素が固定化された固定化酵素は、通常、カラムに充填さ
れ、固定されて、基質溶液と接触されるので、基質が高
分子量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長
時間を要すると共に、反応収率が低いという問題がある
。

また、固定化酵素を結合方法からみれば、酵素を水不溶
性担体にイオン結合にて固定した固定化酵素は、例えば
、イオン強度の高い水溶液中で使用すると、酵素が容易
に脱着して、酵素活性が速やかに低下する欠点を有する
。一方、共有結合法によれば、酵素の脱着のおそれはな
いが、繰返し使用によって、酵素活性が低下することが
知られている。この理由は必ずしも明らかではないが、
酵素表面に何らかの阻害物質が被覆され、このために酵
素反応が阻害されると考えられている。更に、担体に固
定化されている酵素が担体表面に露出しているために、
外来のプロテアーゼにより容易に失活する欠点もある。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移動
でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど問
題にならない高活性の固定化酵素及びその製造方法を提
供することを目的とし、特に、担体に固定化されている
酵素が外来からの有害な影響を受は難く、従って、酵素
活性が長期にわたって高（保持される固定化酵素及びそ
の製造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、官能基を有する水分散型高
分子重合体粒子に酵素が共有結合にて固定化され、この
上にポリアミンとジアルデヒドのシッフ塩基からなる重
合体が沈着されていることを特徴とし、かかる固定化酵
素は、本発明に従って、官能基を有する水分散型高分子
重合体粒子に酵素を共有結合にて固定化した後、上記重
合体粒子の水分散液中でポリアミンとジアルデヒドとを
反応させて、上記重合体粒子の表面に上記ポリアミンと
ジアルデヒドのシッフ塩基からなる重合体を沈着させる
ことによって得られる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ
乃至１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とす
る固定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた
後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、単
位体積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化量
が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難となる
ので好ましくない。

また、本発明において用いられる水分散型高分子重合体
粒子は、官能基を有することを要し、かかる重合体は、
官能基を有する単量体と、これと共重合性を有する単量
体（以下、共重合性単量体ということがある。）とを、
乳化剤を用いて、又は用いずして、通常の方法に従って
乳化共重合させることにより得られる。

このような官能基としては、カルボキシル基、水酸基、
アミノ基、ヒドラジド基、グリシジル基等を挙げること
ができる。かかる官能基を有する単量体として、具体的
には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸のような
カルボキシル基を有する単量体、ヒドロキシルエチルア
クリレート、ヒドロキシルエチルメタクリレートのよう
な水酸基を有する単量体、グリシジルメタクリレートの
ようなグリシジル基を有する単量体を挙げることができ
る。

また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散性高分子
重合体粒子は、アクリルアミドのようなアミド基を有す
る単量体、及びアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル
のようなメチルエステル基を有する単量体をそれぞれ、
好ましくは他の共重合性単量体と共に乳化共重合し、得
られた各共重合体中の上記アミド基をホフマン分解し、
また、メチルエステル基にヒドラジンを作用させること
によって得ることができる。アクリル酸エステルのよう
なエステル基を加水分解することによっても、官能基と
してカルボキシル基を含む水分散性高分子重合体粒子を
得ることができる。

これらの官能基を有する単量体に共重合させる共重合性
単量体は、共重合性を有し、且つ、得られる共重合体が
、酵素反応の行なわれる温度よりも高いガラス転移点を
有する限りは特に制限されることなく、種々のものを用
いることができるが、好ましくは、エチレン、プロピレ
ン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ア
クリル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレン、
メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタジェン、イソプ
レン、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニ
トリル、メタクリロニトリル等の１種又は２種以上が用
いられる。

、更に、本発明においては、官能基を有する単量体及び
これと前記共重合性単量体に加えて、内部架橋用多官能
性単量体を乳化共重合させるのが好ましい。このような
内部架橋用多官能性単量体の具体例としては、エチレン
グリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジ
メタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレ
ート、ジブロピレングリコールジメタクリレ−１・、１
．３−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチ
レングリコールジアクリレ−１−、トリメチロールプロ
パントリメタクリレート ントリアクリレート、テ１ーラメチロールメタンテトラ
アクリレート等のような多価アルコールの（メタ）アク
リレートが好ましく用いられる。ジビニルヘンゼンも好
ましく用いられる。

内部架橋用多官能性単量体の使用は、官能基を有する単
量体と前記共重合性単量体との乳化共重合において、好
ましくない水溶性重合体の生成を抑えると共に、重合の
安定性を高めるのに役立つ。

特に、これら内部架橋用多官能性単量体と共に、前記し
た共重合性単量体の中でも、アクリル酸エステル、メタ
クリル酸エステル、スチレン、アクリロニトリル及びメ
タクリレートリルの少なくとも１種を、官能基を有する
前記単量体と乳化共重合させるとき、官能基を有する単
量体の好ましくないホモポリマーの生成を抑えて、乳化
共重合における重合安定性と得られる重合体粒子の安定
性を高める。特に、アクリロニトリル及び／又はメタク
リロニトリルを含む単量体組成物が上記共重合性単量体
組成物として好ましく用いられる。

本発明においては、官能基を有する単量体０．２〜３０
重量％と前記共重合性単量体７０〜９９．８重量％とを
乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子を得るのが
好ましいが、上記した内部架橋用多官能性単量体をも共
重合させる場合には、これを全単量体組成の２０重量％
までの範囲で使用するのがよい。余りに多量に使用する
と、却って重合の安定性を損なうおそれがあるからであ
る。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子重合体粒
子に乳化剤が混在すると、酵素の固定化に際して酵素が
失活するおそれがあるので、好まシ＜は、上記のような
単量体を乳化重合させるときに乳化剤を用いないのがよ
いが、しかし、乳化剤が用いる酵素に対して有害な影響
を与えないときは、乳化剤を必要に応じて用いてもよい
のは勿論である。

本発明において、水分散性高分子重合体粒子の有する官
能基の量は、重合体粒子１ｇ当り０．００１〜５ミリ当
量、好ましくは０．０１〜２ミリ当量である。官能基量
が少なすぎるときは、酵素の固定化量が少なく、酵素反
応が十分に行なわれないからであり、一方、多すぎると
きは、酵素の固定化に際して酵素の失活が起こるおそれ
があるからである。

水分散性高分子重合体粒子に酵素を共有結合にて固定化
する方法は特に制限されず、従来より一般に知られてい
る方法が適宜に採用される。かかる方法として、例えば
、ジアゾ法、カルボジイミド法、臭化シアン法、アジド
法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない
。

例えば、水酸基をもつ水分散性高分子重合体粒子に酵素
を共有結合にて固定化するには、水酸基をエピクロロヒ
ドリンによりエポキシ化した後、このエポキシ基に酵素
のアミノ基を反応させ、アミド基を形成させることによ
り、酵素を重合体粒子に結合させることができる。この
エポキシ化は従来知られている通常の条件の下に行なわ
れ、例えば、水分散性高分子重合体粒子の有する水酸基
の１〜１０倍当量のエビクロロヒドリンを用い、アルカ
リ水溶液中、室温で反応させる。このエポキシ基への酵
素の固定化も従来の普通の条件下に行なわれる。

また、カルボキシル基に酵素を固定化する一つの方法と
して、水溶性カルボジイミドを用いて、酵素のアミノ基
と水分散性高分子重合体粒子表面のカルボキシル基とを
直接アミド結合を形成させることにより結合させること
ができる。水溶性カルボジイミドとしては、例えば、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩、１−シクロ、ヘキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエン
スルホネート等を挙げることができる。このような水溶
性カルボジイミドを用いる酵素固定化は従来知られてい
る通常の条件の下で行なわれ、例えば、水分散性高分子
重合体粒子の有するカルボキシル基の３〜５０倍当量の
カルボジイミドの水溶液に酵素を混合し、温度を５℃程
度、ｐＨを４゜５〜６．０に保持して、−夜反応させれ
ばよい。

このようにして酵素を重合体粒子に共有結合した後、こ
の重合体粒子を含有する水分散液中でポリアミンとジア
ルデヒドとを反応させることにより、酵素が固定化され
ている重合体粒子表面にポリアミンとジアルデヒドとか
らなるシップ塩基の重合体が沈着されている固定化酵素
を得ることができる。

本発明において用いるポリアミンは、アルデヒド基と反
応し得るアミノ基を分子内に２個又はそれ以上有するア
ミン化合物又は重合体を意味し、好ましくは芳香族、脂
肪族又は脂環族のジアミンやトリアミンが好ましく用い
られ、具体的にはフェニレンジアミン、キシリし・ンジ
アミン、フェニレントリアミン、トリアミノトルエン、
エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が用いら
れる。また、ポリエチレンイミンも用いることができる
。次に、ジアルデヒドも芳香族や脂肪族のジアルデヒド
が好ましく用いられるが、具体的にはグルタルアルデヒ
ド、コハク酸ジアルデヒド、グリオキザール、マレイン
ジアルデヒド、テレフタルジアルデヒド等が用いられる
。

１ 酵素が固定化された水分散型高分子重合体粒子゛　　の
表面にシッフ塩基重合体を沈着させる反応において、ポ
リアミンとジアルデヒドとの当量比は１０：１〜１：１
０であり、好ましくは５：１〜１；５である。この範囲
を越えていずれか一方を過多に用いるときは、形成され
るシッフ塩基重合体量が少なすぎ、従って、酵素を安定
化し難いので好ましくない。

上記の反応は、例えば、酵素の失活の起こらない温度及
びｐＨにおいて、酵素の固定された水分散型高分子重合
体粒子の分散液にポリアミンとジアルデヒドのそれぞれ
の水溶液を加え、攪拌することにより行なうが、ポリア
ミンとジアルデヒドとのそれぞれの水溶液を加える順序
は特に制限されない。反応は通常、塩酸等による酸性条
件下で行なうことにより日南に進行する。また、反応は
通常、常温で行なうが、酵素が失活するおそれがあるよ
うな場合には、低温で行なう。反応に要する時間は、常
温での反応の場合、通常、数時間乃至１０時間程度であ
る。この反応においては、生成２ するシップ塩基が分子量が大きくなるにつれて、水不溶
性となり、重合体粒子上に薄い層状に沈着するのであろ
う。次いで、未反応のポリアミン及びジアルデヒドを遠
心分離、膜分離等の適宜の手段によって除去すれば、本
発明による固定化酵素を得ることができる。

本発明による固定化酵素は水分散液として用いられ、基
質と接触される。固定化酵素の使用量は、固定化酵素の
粒径や酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度
等により適宜に決定される。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素でもよく
、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必ずしも高度に精
製されている必要はなく、抽出液や部分精製品も用いら
れる。更に、本発明に従って、単一の酵素を固定化して
もよいが、複数の酵素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の酵素が用
いられる。具体例として、アミノ酸オキシダーゼ、カタ
ラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ
、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパラギ
ン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミ
ントランスフェラーゼ、グリシンアミノトランスフェラ
ーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−ピルピン酸アミノトランスフェ
ラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチル
トランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトランス
フェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのような転移
酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−
アラニンラセマ−ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウ
リカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、カリ多レイン、キモトリプシン、トリプシン
、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダーゼ、パ
パイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペクチナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ペプシン、ペクチナーゼ、ペニシリ
ンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、ラク
ターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのよう
な加水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、
アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、フェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フマー
ル酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのようなりア
ーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、
グルコースホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラ
セマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのよ
うな異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタチオ
ンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼのようなりガーゼ
等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、水分散型高分
子重合体粒子に酵素が共有結合により固５ 走化され、更に、この上にポリアミンとジアルデヒドと
からなるシッフ塩基重合体が沈着されているので、従来
のセルロース誘導体粒子等を担体とする場合と異なり、
固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反応系内を自由に
移動できるため、基質の拡散が反応に殆ど影響を与えず
、従って、高分子量の基質の場合にも遊離の酵素と同様
の高い反応速度で酵素反応を行なわせることができる。

特に、従来の固定化酵素においては、酵素が担体表面に
露出しているために、繰返し使用する間に固定化酵素が
何らかの阻害物質により被覆されて、酵素活性が低下す
ることは前記したとおりであるが、本発明の固定化酵素
によれば、重合体粒子表面に固定化された酵素がシッフ
塩基重合体により被覆されているため、酵素表面が直接
に上記阻害物質により被覆されず、また、酵素が外来の
プロテアーゼにより分解されることもないので、この結
果、酵素活性が長期にわたって保持されるのであろう。

同時に、酵素の一部がそのアミノ基により、ジアルデヒ
ドの有するアルデヒド基とも６ 反応して架橋され、このためにプロテアーゼに対する安
定性が大きくなっているとも考えられる。

但し、本発明は何ら理論により制約されるものではない
。尚、従来の固定化酵素において、担体に付着した上記
阻害物質は、食塩水溶液で洗滌することにより除去する
ことができる場合があり、これにより、活性はある程度
まで回復する。

また、シッフ塩基の沈着層は極めて薄いものであるため
、包括法のように拡散律速を伴うこともなく、本発明の
固定化酵素は高い反応性を有すると共に、シッフ塩基層
の形成条件が穏やかであるため、この過程で酵素が失活
することもない。

しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の担体に固
定化されているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、
凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によ
って容易に回収でき、かくして、長期間にわたって高い
酵素活性を保持させつつ、繰返して使用することができ
る。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。

実施例１ アクリル酸３ｇ、メチルメタクリレ−Ｉ−８０ｇ。

ｌ・リエチレングリコールジメタクリレート２ｇ及びア
クリロニトリル１５ｇを蒸留水２３０ｇに加え、過硫酸
カリウム０．３ｇを水］Ｏｇに／ｇ解した重合開始剤水
溶液を７０℃の温度で窒素気流下に加え、１２　Ｏｒｐ
ｍで攪拌しつつ８時間重合させて、固形分３０％、平均
粒径０．３μの重合体粒子の水分散液を得た。重合は非
常に安定に行なわれて、凝集物は０．０２％であった。

また、分散液を遠心分離し、上澄について調べたところ
、仕込み量の５％のカルホキシル基しか検出定量されず
、水溶性重合体の副生は僅かであった。

次に、上記の分散液１００ｍ１に１−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドーメ１−
−ｐ　−トルエンスルホネート２０ｇを水２００ｍ１に
熔解した水溶液を加え、攪拌しつつｐｌ＋を５．０に調
整した。αニアミラー上２．５ｇを水５００ｍ１に溶解
してｐＨを５．０に調整した酵素水溶液を上記分散液に
加え、攪拌下にｐＨを５．０に調整しながら、５℃の温
度で２４時間、酵素の固定化反応を行なわせた。

この後、遠心分離によって沈降した重合体粒子を緩衝液
でｆｉ、ＨＨして、未固定のα−アミラーゼ、未反応の
カルボジイミド及び反応副生成物を除去し、再び緩衝液
１００ｍ１に分散させて、固定化酵素を得た。以下、シ
ッフ塩基重合体で被覆される前の固定化α−アミラーゼ
を比較別品１という。

この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量は、重合体粒
子１ｇ当り４０■であり、また、１％デンプン水溶液を
基質として測定した活性収率は４０％であった。

尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の理論量に
対する実際の活性の割合として定義される。ここでは、
１％デンプン水溶液を基質として、固定化酵素を３５°
Ｃで１０分間反応させ、ヨウ素デンプン反応からデンプ
ンの分解量を求めることにより、固定化酵素の活性、即
ち、デンプン分解速度（■／分）を得、これと等しい活
性を有する９ 遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。

次いで、上で得た分散液５０ｍ１に、塩酸でｐｌ＋を６
．０に調整した１％のｍ−キシリレンジアミン水／８液
４．ｍｌを加えて攪拌し、次に、１％のグルタルアルデ
ヒド水溶液５ｍｌを加えて、５℃で５時間攪拌して反応
させた。反応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子
を０．１　Ｍリン酸水素二カリウム及び０．１Ｍリン酸
水二素カリウムからｉＪＩ製した緩衝液（ｐＨ７，０）
で洗滌して、未反応のキシリレンジアミン及びグルタル
アルデヒドを除去し、再び緩衝液５０ｍ１中に分散させ
て、本発明による固定化酵素を得た。この固定化酵素の
α−アミラーゼの活性収率は３６％であった。

次に、本発明の固定化酵素と前記比較別品１の固定化酵
素をそれぞれ用いて、酵素反応を行なった後、反応液か
ら遠心分離にて酵素固定化重合体粒子を沈殿させ、洗滌
し、緩衝液に再分散させた。

この分散液を用いて再び２回目の反応を行ない、以下、
同様にして反応を繰返して行なった。その結果を図面に
示すように、本発明の固定化酵素に０ よれば、反応を繰返して行なっても、活性の低下が殆ど
認められなかったが、比較別品１の固定化酵素の場合は
、活性の低下が顕著であった。

実施例２ ２−ヒドロキシエチルアクリレート３ｇ１メ千゛ルメタ
クリレート８０ｇ、）リエチレングリコールジメタクリ
レート２ｇ及びアクリロニトリル１５ｇを蒸留水２３０
ｇに加え、過硫酸カリウム０゜３ｇを水Ｌｏｇに溶解し
た重合開始剤水溶液を７０℃の温度で窒素気流下に加え
、１２　Ｏｒｐｍで攪拌しつつ８時間重合させて、固形
分３０％、平均粒径０．３μの重合体粒子の水分散液を
得た。重合は非常に安定に行なわれて、凝集物は０．０
２％であった。

この重合体粒子の水分散液１０ｍ１に５Ｎ力性ソーダ水
溶液２１Ｉ＋１とエピクロロヒドリン１ｍｌを加え、室
温で１時間反応させた後、水洗した。こうして得たエポ
キシ基を有する重合体粒子とウレアーゼ２０（Ｉｇをリ
ン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐｉ（７，０）中、４０℃で
１７時間反応させ、ウレアーゼを固定化した。反応後、
遠心分離して沈降した重合体粒子を緩衝液で洗滌し、緩
衝液に再分散させて、シッフ塩基重合体で被覆される前
の固定化酵素を比較別品２として得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は、重合体粒子
１ｇ当り２５■であり、活性収率は６０％であった。活
性収率は、０．０３　Ｍの尿素水溶液を基質として、３
５°Ｃで１０分間固定化酵素と反応させ、生成したアン
モニア量（μモル／分）を塩酸滴定で求めて活性を測定
し、これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵素固定
化量で除して求めた。

このようにして得られた固定化ウレアーゼの半分を実施
例１と全く同様にして、ｍ−キシリレンジアミンとグル
タルアルデヒドで処理して、そのシッフ塩基重合体を重
合体粒子上に沈着させ、本発明による固定化酵素を得た
。この固定化酵素の活性収率は５３％であった。

上で得られた本発明による固定化酵素と比較別品２の固
定化酵素をそれぞれ５ｍｌずつ採り、バクテリア起源の
プロテアーゼ（シグマ社製、１■／ｍ１リン酸緩衝液、
ｐＨ７，０）　　１ｍｌを添加し、３０°Ｃで３０分間
インキュへ−１−した。反応終了後、重合体粒子を遠心
分離し、洗滌し、ウレアーゼの残存活性を測定した。そ
の結果、比較別品２の固定化酵素の当初の活性を１００
とするとき、この固定化酵素のプロテアーゼ処理後の活
′性は１６であった。これに対して、本発明による固定
化酵素は、処理前は８８、処理後は７３であって、耐プ
ロテアーゼ性にすぐれていることが明らかである。

実施例３ アクリル酸３ｇ、メチルメタクリレート８０ｇ及びアク
リロニトリル１５ｇを実施例１と同様にして乳化共重合
させ、固形分２９％、平均粒径０゜３０　／７の重合体
粒子の水分散液を得た。凝集物は１％であった。この重
合体粒子分散液に実施例１と同様にしてα−アミラーゼ
を固定化したところ、その固定化量は重合体粒子１ｇ当
り２０■であり、また、活性収率は３５％であった。

次いで、上で得た分散液５０ｍ１に、塩酸でｐＨを３ ６．０に調整した１％ｍ−キシリレンジアミン水溶液を
加え、以下、実施例１と同様にして、ポリアミンとジア
ルデヒドとからなるシッフ塩基の重合体を沈着させた。

この固定化酵素のα−アミラーゼの活性収率は３０％で
あった。更に、実施例１と同様にして、繰返し反応実験
を行なったところ、活性の低下は実質的に認められなか
った。

実施例４ アクリル酸３ｇ、メチルメタクリレ−１−９３ｇ及びト
リエチレングリコールジメタクリレ−１−２ｇを実施例
１と同様に乳化共重合させ、固形分２８％、平均粒径０
．４０μの重合体粒子の水分散液を得た。凝集物は６％
であった。

この重合体粒子の水分散液に実施例１と同様にしてα−
アミラーゼを固定化したところ、その固定化量は重合体
粒子１ｇ当り１５ｒｒｇであり、また、その活性収率は
３４％であった。次いで、実施例１と同様にしてポリア
ミンとジアルデヒドとからなるシッフ塩基の重合体を沈
着させた。この固定化酵素のα−アミラーゼの活性収率
は３０％であ４ つた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明による固定化酵素と、シッフ塩基重合体に
より被覆される前の固定化酵素をそれぞれ、繰返し酵素
反応させたときの酵素活性の変化を示すグラフである。 特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に酵素
   が共有結合にて固定化され、この上にポリアミンとジア
   ルデヒドのシッフ塩基からなる重合体が沈着されている
   ことを特徴とする固定化酵素。 （２）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の固定化酵素。 （３）官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に酵素
   を共有結合にて固定化した後、上記重合体粒子の水分散
   液中でポリアミンとジアルデヒドとを反応させて、上記
   重合体粒子の表面に上記ポリアミンとジアルデヒドのシ
   ッフ塩基からなる重合体を沈着させることを特徴とする
   固定化酵素の製造方法。 （４）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の固定化酵素の製造方法。