JPH0314429B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化酵素の製造方法に関する。 酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれば
反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給
したり、また、反応後に酵素を失活させることな
く、生成物と酵素を分離することが非常に困難で
あり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反
応が回分式であるから生産性に劣る。 このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られている
しかし、従来、この方法において用いられている
担体は、通常、セルロース、デキストラン、アガ
ロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミド
ゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒子で
あり、このような粒子に酵素が固定化された固定
化酵素は、通常、カラムに充填され、固定され
て、基質溶液と接触されるので、基質が高分子量
の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長
時間を要すると共に、反応収率が低いという問題
がある。 本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。 本発明による固定化酵素は、(a)酢酸ビニル及び
プロピオン酸ビニルから選ばれる少なくとも１種
のビニルエステル単量体30〜98重量％、(b)この単
量体と共重合し得る第１の単量体０〜68重量％、
(c)多官能性内部架橋用単量体１〜20重量％、及び
(d)第２の単量体としてのアクリロニトリル又はメ
タクリロニトリル１〜60重量％とからなる単量体
組成を乳化共重合させ、得られる水分散性高分子
重合体粒子をケン化して水酸基を生成させ、次い
で、この水酸基を介して酵素を共有結合にて固定
化することを特徴とする。 本発明においては、ビニルエステル単量体を１
成分とする２以上の単量体組成を、好ましくは乳
化剤の不存在下で乳化共重合し、かくして得られ
る水分散性高分子重合体粒子が側鎖に有するエス
テル基をケン化することにより、その表面に高い
密度で水酸基を生成させ、この水酸基を介して酵
素の共有結合により固定化するのである。 ここに、ビニルエステル単量体としては、酢酸
ビニル及び／又はプロピオン酸ビニルが用いら
れ、これと共重合させる第１の単量体としては、
アクリロニトリル及びメタクリロニトリルを除い
て、上記ビニルエステルと共重合性を有し、且
つ、得られる共重合体が酵素反応の行なわれる温
度よりも高いガラス転移点を有する限りは特に制
限されるものではないが、好ましくは、エチレ
ン、プロピレン、塩化ビニル、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチルス
チレン、ビニルトルエン、ブタジエン、イソプレ
ン、アクリルアミド、メタクリルアミド等の１種
又は２種以上が用いられる。特に、アクリル酸及
びメタクリル酸のアルキルエステルやスチレンが
好ましく用いられる。但し、この第１の単量体
は、必ずしも単量体成分として単量体組成に含有
される必要はない。 尚、本発明においては、重合時の安定化が得ら
れる高分子重合体粒子の水分散性安定化のため
に、全単量体組成の５重量％以下の範囲でイオン
性基を有する単量体を用いてもよい。かかるイオ
ン性基としては、例えば、スルホン酸基、カルボ
キシル基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、
第４級アミノ基等の塩基性基等を挙げることがで
きる。このようなイオン性基を有する単量体の具
体例としては、スチレンスルホン酸、スルホプロ
ピルメタクリレートのようなスルホン酸基を有す
る単量体、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン
酸のようにカルボキシル基を有する単量体、アシ
ツドホスホキシエチルメタクリレート、３−クロ
ロ−２−アシツドホスホキシエチルメタクリレー
トのようなリン酸基を有する単量体、ジメチルア
ミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロ
ピルメタクリルアミドのような第３級アミノ基を
有する単量体、メタクリルアミドプロピルトリメ
チルアンモニウムクロライド、メタクリロイルオ
キシエチルトリメチルアンモニウムクロライドの
ような第４級アミノ基を有する単量体を挙げるこ
とができる。 また、内部架橋用多官能性単量体としては、多
価アルコールのポリ（メタ）アクリレートが好ま
しく、具体的には、エチレングリコールジメタク
リレート、ジエチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジメタクリレート、
ジプロピレングリコールジメタクリレート、１，
３−ブチレングリコールジメタクリレート、トリ
エチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート、トリメチロー
ルプロパントリアクリレート、テトラメチロール
メタンテトラアクリレート等が用いられる。ジビ
ニルベンゼンも好ましく用いられる。 更に、本発明においては、水分散性高分子重合
体粒子を得るための単量体として、単量体組成は
第２の単量体成分として、アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリルを含有することが必
須である。 本発明においては、以上のような各単量体を水
媒体中にて通常の方法にて乳化共重合体させるこ
とにより、側鎖にグリシジル基を有する水分散性
高分子重合体粒子を得ることができるが、得られ
る重合体粒子中に乳化剤が混在すると、酵素の固
定化の際に酵素が失活する等の有害な影響が現れ
ることがあるので、乳化共重合体に際しては乳化
剤を用いないのが好ましい。本発明による上記単
量体組成によれば、特に乳化剤を要せずして安定
に共重合させることができるが、乳化剤が酵素に
対して有害な影響を与えなければ、乳化剤を必要
に応じて用いてもよい。 本発明における単量体組成は、酢酸ビニル及び
プロピオン酸ビニルから選ばれる少なくとも１種
のビニルエステル単量体30〜98重量％、好ましく
は50〜93重量％、この単量体と共重合し得る第１
の単量体０〜68重量％、０〜55重量％、多官能性
内部架橋用単量体１〜20重量％、好ましくは２〜
10重量％、及び第２の単量体としてのアクリロニ
トリル又はメタクリロニトリル１〜60重量％、好
ましくは５〜40重量％とからなる。 単量体組成においてビニルエステル単量体の量
は、これから得られる水分散性高分子重合体粒子
をケン化して生じる水酸基量、従つて、この水酸
基に固定化し得る酵素の固定化量とも関連し、少
なすぎるときは酵素を十分な量にて固定化するこ
とができず、多すぎるときは重合の安定性を損な
うと共に、得られる重合体粒子の安定性も損なわ
れるので、好ましくない。 本発明でビニルエステル単量体は疎水性である
ため、水溶性重合体を生じることがなく、しか
も、本発明に従つて、これを（メタ）アクリロニ
トリルと乳化共重合させることにより、重合が非
定に安定に行なわれて、凝集物が殆ど生成しな
い。（メタ）アクリロニトリルの量が上記範囲よ
りも少ないとき、又は多すぎるときは、重合の安
定性が損なわれるおそれがあるので、好ましくな
い。また、内部架橋用単量体は、後述するよう
に、重合体粒子をケン化する際の安定性を高める
のに寄与し、特に、上記範囲で用いるのが好まし
い。 本発明によれば、上記のようにして得られたエ
ステル基を有する水分散性高分子重合体粒子は酸
又はアルカリの水溶液によりケン化され、エステ
ル基は水酸基に変えられる。酸としては、例え
ば、塩酸、硫酸、リン酸等が、また、アルカリと
しては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ア
ンモニア等が、それぞれ適宜に用いられる。これ
ら酸又はアルカリ水溶液の濃度は、通常、0.01〜
５規定、好ましくは0.05〜２規定である。本発明
においては、重合体粒子の表面のみをケン化すれ
ば足り、ケン化条件は適宜に選ばれる。通常、上
記のような酸又はアルカリを用いて、20〜70℃の
温度で数分乃至数十時間ケン化する。酸又はアル
カリの濃度が高すぎるときは、重合体粒子の安定
性が悪くなり、重合体粒子が凝集したり、水溶化
したりする。また、濃度が低すぎるときは、ケン
化に不必要に長時間を要するので好ましくない。
温度が高すぎる場合も、重合体粒子の安定性が悪
くなるので好ましくない。 このようにして得られる水分散性高分子重合体
粒子は表面に高密度にて水酸基を有するが、その
粒子径はケン化の前後で殆ど変わらず、ケン化後
に僅かに大きくなる程度である。 本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03μ〜2μ、好ましくは
0.07μ乃至1μである。粒径が小さすぎると、これ
を担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、
粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積
が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共
に、水中に分散させるのが困難となるので好まし
くない。 水分散性高分子重合体粒子の有する水酸基を介
して酵素を共有結合にて固定化する方法は特に制
限されず、従来より知られている方法が適宜に採
用される。 例えば、一つの方法として、水酸基をエピクロ
ロヒドリンによりエポキシ化した後、このエポキ
シ基に酵素のアミノ基を反応させ、第２級アミノ
基を形成させることにより、酵素を重合体粒子に
結合させることができる。このエポキシ化は従来
知られている通常の条件の下に行なわれ、例え
ば、水分散性高分子重合体粒子の有する水酸基の
１〜10倍当量のエピクロロヒドリンを用い、アル
カリ水溶中、室温で反応させる。このエポキシ基
への酵素の固定化も従来の普通の条件下に行なわ
れる。 第２の方法として、重合体粒子の有する水酸基
にハロゲン化トリアジンを反応させて水酸基をハ
ロゲン化し、このハロゲン基に酵素のアミノ基を
反応させて、共有結合を形成させることができ
る。メチルアミノトリアジン、カルボキシルメチ
ルトリアジン、シアヌルクロライド等が用いられ
る。具体的には、例えば、重合体粒子の有する水
酸基の１〜10倍当量のこれらのハロゲン化トリア
ジンを用い、アルカリ水溶液中、０〜40℃程度の
温度で重合体粒子の水酸基をハロゲン置換した
後、中性条件下で40℃程度の温度で酵素と反応さ
せる。 第３の方法として、重合体粒子の有する水酸基
を、分子内に２個以上のアルデヒド基を有するポ
リアルデヒドと酸触媒の存在下で反応させてアセ
タール化すると共に、このポリアルデヒドの他の
少なくとも１個のアルデヒド基を遊離のままに残
させ、この遊離のアルデヒド基に酵素を反応させ
てもよい。この場合、水酸基とポリアルデヒドと
の反応には、塩酸、硫酸、ｐ−トロエンスルホン
酸等の酸触媒が好ましく用いられる。また、ポリ
アルデヒドには、グリオキザール、マロンジアル
デヒド、マレインジアルデヒド、コハク酸ジアル
デヒド、アジピンジアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ピメリンジアルデヒド、スベリンジアルデ
ヒド、テレフタルジアルデヒド等のジアルデヒド
化合物や、ジアルデヒドデンプン、ポリアクロレ
イン等の高分子ポリアルデヒド等を用いることが
できる。 アルデヒド基を有することとなつた重合体粒子
へ酵素を共有結合させるには、6.5〜８のPHの緩
衝液の酵素を溶解させ、これに上記重合体粒子を
分散させて、通常、０〜40℃の温度範囲で静置又
は撹拌することによつて、反応させればよい。 また、第４の方法として、重合体粒子の有する
水酸基をシランカツプリング剤により活性化し、
これに酵素を反応させて固定化することもでき
る。ここに、シランカツプリング剤は一般式 Ｚ−Ｒ−SiX₃ （但し、Ｚは−NH₂、−C1、−COOH、−CH＝
CH₂、−Ｃ（CH₃）＝CH₂又は−NCOを示し、Ｒは
−（CH₂）ｍ−、

【式】 又は−COO（CH₂）ｒ−（但し、ｍ、ｐ、ｑ及び
ｒはそれぞれ０〜10の整数を示す。）を示し、Ｘ
はアルコキシ基を示す。）で表わされ、好ましい
具体例として、３−アミノプロピルトリメトキシ
シラン、γ−（２−アミノエチル）アミノプロピ
ルトリメトキシシラン、γ−クロロプロピルトリ
メトキシシラン、γ−メタクリルオキシプロピル
トリメトキシシラン、イソシアネートプロピルト
リエトキシシラン、ｐ−アミノフエニルトリメト
キシシラン等が挙げられるが、特に、３−アミノ
プロピルトリメトキシシランが好ましく用いられ
る。この方法により酵素を固定化するには、通
常、重合体粒子の有する水酸基の１〜10倍当量の
シランカツプリング剤を室温で１日反応させると
共に、酵素をそのアミノ基と反応し得る水溶性カ
ルボジイミド等の試薬により活性化し、上記活性
化された重合体粒子に反応させ、固定化する。 以上のようにして、酵素を重合体粒子に共有結
合させた後、用いた反応試薬や固定化されていな
い酵素を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつ
て除去すれば、本発明の固定化酵素を得る。 本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。 本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。 本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコール−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キザロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトラ
ンスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクト
キナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチル
トランスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミ
ラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナ
ーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオ
チダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラス
ミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。 本発明による固定化酵素は以上のように、表面
に高密度に水酸基を有する水分散型高分子重合体
粒子に、上記水酸基を介して酵素が共有結合によ
り固定化されており、従来のセルロース誘導体粒
子等を担体とする場合と異なり、固定化酵素自体
が遊離の酵素と同様に反応系内を自由に移動でき
るため、基質の拡散が反応に殆ど影響を与えず、
従つて、高分子量の基質の場合にも遊離の酵素と
同様の高い反応速度で酵素反応を行なわせること
である。 しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の
担体に固定化されているため、酵素反応後には遠
心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性
膜による膜分離等によつて容易に回収でき、かく
して、長時間にわたつて高い酵素活性を保持させ
つつ、繰返して使用することができる。 更に、一般に水酸基を有する単量体は水溶性で
あるため、他の単量体との乳化共重合が容易では
なく、単独重合体を生成することが多く、また、
共重合体を得ても重合体粒子表面の水酸基の密度
が小さく、重合体粒子における酵素の負荷量を大
きくすることが困難であるが、本発明によれば、
前記単量体組成により、乳化剤を特に用いること
なく、望ましくない重合体の生成を抑えて、安定
に水分散性高分子重合体粒子を得、これをケン化
して水酸基を生じさせるので、水酸基を有する水
分散性高分子重合体粒子を安定に得ることができ
る。更に、（メタ）アクリロニトリルと内部架橋
用単量体を併用することにより、得られる水分散
性高分子重合体粒子は強度が大きいと共に、粒子
相互の粘着も起こらない。 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。 実施例 １ 酢酸ビニル80ｇ、スチレン３ｇ、トリエチレン
グリコールジメタクリレート２ｇ及びアクリロニ
トリル15ｇを蒸留水230ｇに加え、過硫酸カリウ
ム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶液を
70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹拌
しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均粒径
0.5μの重合体粒子の水分散液を得た。重合は非常
に安定に行なわれて、凝集物は0.04％であつた。 次に、上記の重合体粒子水分散液に5Nカ性ソ
ーダ水溶液50mlを加え、50℃で２時間撹拌した
後、5N塩酸水溶液を加えて中和し、重合体粒子
を遠心分離し、洗滌した。 このようにして得られた表面に水酸基を有する
水分散性高分子重合体粒子の水分散液20mlに5N
カ性ソーダ水力液４mlとエピクロロヒドリン２ml
を加え、室温で24時間反応させた後、水洗した。
こうして得たエポキシ基を有する重合体粒子をリ
ン酸緩衝液（0.1M、PH7.0）に再分散させ、これ
にグルコアミラーゼの同じ緩衝液溶液を加え、４
℃の温度で24時間反応させて、グルコアミラーゼ
を重合体粒子に固定化した。 次いで、重合体粒子を遠心分離し、沈降した粒
子を緩衝液で洗滌し、未固定の酵素を除去した
後、再び緩衝液中に分散させて、本発明による固
定化酵素を得た。 この固定化酵素のグルコアミラーゼ固定化量
は、重合体粒子１ｇ当り12mgであり、また、活性
収率は75％であつた。 尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義され
る。ここでは、10％マルトース水溶液を基質とし
て、固定化酵素を35℃で30分間反応させ、増加し
た還元糖をSomogyi法で求めることにより、固
定化酵素の活性、即ち、マルトース分解速度（μ
モル／分）を得、これと等しい活性を有する遊離
の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。 実施例 ２ 実施例１で得た水酸基を有する水分散性高分子
重合体粒子をグルタルアルデヒド10％を含む1N
塩酸水溶液100mlに再分散させ、40℃の温度で３
時間浸漬してアセタール化した後、炭酸ナトリウ
ム水溶液及び蒸留水の順で洗滌した。次いで、こ
の重合体粒子をリン酸緩衝液（0.1M、PH7.4）
100mlに再分散させ、グルコースイソメラーゼの
実施例１と同じ緩衝液を加え、室温で12時間反応
させて、グルコースイソメラーゼを重合体粒子に
固定化した。 この固定化酵素のグルコースイソメラーゼの固
定化量は、重合体粒子１ｇ当り40mgであり、活性
収率は60％であつた。尚、活性収率は次のように
して求めた。即ち、40％グルコース水溶液を基質
として、酵素を60℃で30分間反応させた後、
0.5N過塩素酸水溶液を加えて酵素を失活させ、
生じたフラクトース量をシステイン−カルバゾー
ル硫酸法を求めて、グルコースの異性化速度（μ
モル／分）を得、これにより活性収率を求めた。 この酵素反応後に遠心分離にて回収した固定化
酵素を再度、基質と反応させたところ、最初の活
性とほぼ同じ活性を示した。 実施例 ３ プロピオン酸ビニル85ｇ、スチレン２ｇ、トリ
エチレングリコールジメタクリレート２ｇ及びメ
タクリロニトリル11ｇ実施例１と全く同様にして
乳化共重合させ、固形分27％、平均粒径0.3μの重
合体粒子の水分散液を得た。凝集物は1.5％であ
つた。 次に、上記の分散液10mlに5Nカ性ソーダ水溶
液２mlとエピクロロヒドリン１mlを加え、室温で
24時間反応させた後、水洗した。こうして得たエ
ポキシ基を有する重合体粒子をリン酸緩衝液
（0.1M、PH7.0）に再分散させ、トリプシンの実
施例１と同じ緩衝液溶液を加え、４℃の温度で24
時間反応させて、トリプシンを重合体粒子に固定
化した。次いで、重合体粒子を遠心分離し、沈降
した粒子を緩衝液で洗滌し、未固定の酵素を除去
した後、再び緩衝液中に分散させて、本発明によ
る固定化酵素を得た。 この固定化酵素のトリプシン固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り26mgであり、また、活性収率は37
％であつた。尚、活性収率は次のようにして求め
た。即ち、１％カゼイン水溶液を基質として、固
定化酵素を35℃で10分間反応させた後、５％トリ
クロル酢酸により高分子量タンパク質を沈殿さ
せ、遊離の非タンパク性分解質量を280nmの吸光
度から求め、この吸光度を１分間に1.0増加させ
る活性を１単位として活性収率を求めた。 比較例 １ 実施例１において、アクリロニトリルを用いな
い以外は実施例１と全く同様にして重合を行なつ
たところ、重合中に凝集を起こして、重合体粒子
の水分散液を得ることができなかつた。 比較例 ２ 実施例１において、トリエチレングリコールジ
メタクリレートを用いない以外は実施例１と全く
同様にして重合を行なつたところ、3.8％の凝集
物が生成した。この凝集物を除いた後の分散液を
実施例１と同じ条件下にケン化し、遠心分離し、
洗滌したところ、全体がゲル状となり、水に再分
散させることができなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a)酢酸ビニル及びプロピオン酸ビニルから選
   ばれる少なくとも１種のビニルエステル単量体30
   〜98重量％、(b)この単量体と共重合し得る第１の
   単量体０〜68重量％、(c)多官能性内部架橋用単量
   体１〜20重量％、及び(d)第２の単量体としてのア
   クリロニトリル又はメタクリロニトリル１〜60重
   量％とからなる単量体組成を乳化共重合させ、得
   られる水分散性高分子重合体粒子をケン化して水
   酸基を生成させ、次いで、この水酸基を介して酵
   素を共有結合にて固定化することを特徴とする固
   定化酵素の製造方法。 ２ 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化酵素の製造方法。 ３ 多官能性内部架橋用単量体が多価アルコール
   のポリ（メタ）アクリレートであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製
   造方法。